Krok 3 Přítomnost imunokomplexů (antigen T. gondii, IgG protilátky proti T. gondii, anti-igg konjugát) se prokáže přidáním chromogenu do každé jamky.

Transkript

1 PLATELIA TOXO IgG 1 destička KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ IgG PROTILÁTEK PROTI TOXOPLASMA GONDII V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ POMOCÍ ENZYMOVÉ IMUNOANALÝZY /11 1. POUŽITÍ Platelia Toxo IgG je nepřímá ELISA imunoanalýza určená ke kvantitativnímu stanovení IgG protilátek proti Toxoplasma gondii v lidském séru nebo plazmě. 2. KLINICKÝ VÝZNAM T. gondii je prvok způsobující infekci početných druhů savců a ptáků. Toxoplasmóza, která je častá u lidí a zvířat, se v typickém případě neprojevuje. Prevalence této infekce v populaci, stanovená pomocí sérologických testů, se může lišit v závislosti na zemi původu a věku. Toxoplasmóza v těhotenství je dávána do souvislosti se závažnými kongenitálními abnormalitami (zejména poruchou funkcí mozku) a občas s narození mrtvého plodu. Průkaz protilátek Toxo IgG u ženy před početím poskytuje záruku ochrany plodu od možné toxoplasmózy v průběhu těhotenství. Predispozice k závažné toxoplazmové infekci je obvyklá u osob se známým syndromem získané imunodeficience (AIDS) nebo u osob, které jsou jinak imunokompromitované. Tyto infekce jsou zejména důsledkem reaktivace cyst T. gondii před HIV infekcí. Specifická diagnóza infekce T. gondii může být komplikovaná a izolace parazita je vzácná. Sérologické potvrzení protilátky proti T. gondii znamená kontakt s parazitem a je široce akceptováno jako prostředek pro stanovení imunitního stavu a citlivosti k infekci. Screening několika izotypů umožňuje buď datování infekce T. gondii a provedení příslušné léčby v případě akutní infekce nebo návrh profylaktických doporučení: pokyny týkající hygieny diety pro těhotné ženy a chemoprofylaxe u imunokompromitované populace. 3. PRINCIP Platelia Toxo IgG je test k detekci a titraci IgG protilátek proti Toxoplasma gondii v lidském séru nebo plazmě pomocí nepřímé ELISA imunoenzymatické metody. Pro potažení mikrodestičky je použit antigen T. gondii. Jako konjugát je použita monoklonální protilátka značená peroxidázou specifická pro lidské gama řetězce (anti-igg). Test probíhá dle následujících kroků: Krok 1 Vzorky pacientů a kalibrátory se naředí 1:21 a poté se napipetují do jamek v mikrodestičce. Během této jednohodinové inkubace při 37 C se IgG protilátky proti T. gondii přítomné ve vzorku navážou na antigen T. gondii, kterým jsou potaženy jamky mikrodestičky. Po inkubaci se odstraní nenavázané nespecifické protilátky a ostatní sérové proteiny promytím. Krok 2 Do jamek mikrodestičky se napipetuje konjugát (peroxidázou značená monoklonální protilátka specifická pro lidské gama řetězce). Během této jednohodinové inkubace při 37 C se značená protilátka váže na sérový IgG navázaný na antigen T. gondii. Nenavázaný konjugát se na konci inkubace odstraní promytím. Krok 3 Přítomnost imunokomplexů (antigen T. gondii, IgG protilátky proti T. gondii, anti-igg konjugát) se prokáže přidáním chromogenu do každé jamky. 1

2 Krok 4 Po inkubaci při pokojové teplotě (18 30 C) se enzymatická reakce zastaví přidáním 1N roztoku kyseliny sírové. Hodnota optické denzity získaná spektrofotometrem nastaveným na 450/620 nm je úměrná množství IgG protilátek proti T. gondii přítomných ve vzorku a je převedena na IU/ml pomocí standardní křivky kalibrované proti mezinárodnímu WHO standardu TOX-M. 4. SLOŽENÍ SOUPRAVY Dodávaná množství činidel byla vypočtena tak, aby umožnila 96 testů. Všechna činidla jsou určena výhradně pro diagnostické použití in vitro. Označení SLOŽENÍ REAGENCIE Balení R1 Mikrodestička Mikrodestička: (hotová k použití): 12 stripů s 8 oddělitelnými jamkami potaženými inaktivovaným antigenem T. gondii R2 Koncentrovaný promývací roztok (20x) Koncentrovaný promývací roztok (20x): TRIS-NaCl pufr (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konzervační prostředek: 0,04 % ProClin 300 R3 Kalibrátor 0 Kalibrátor 0: Lidské sérum negativní na IgG protilátky proti T. gondii a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační prostředek: 0,098 % ProClin 300 R4a Kalibrátor 6 Kalibrátor 6 IU/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti T. gondii a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační prostředek: 0,098 % ProClin 300 R4b Kalibrátor 60 Kalibrátor 60 MJ/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti T. gondii a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační prostředek: 0,098 % ProClin 300 R4c Kalibrátor 240 Kalibrátor 240 MJ/ml: Lidské sérum reaktivní na IgG protilátky proti T. gondii a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv Konzervační prostředek: 0,098 % ProClin 300 R6 Konjugát (51x) Konjugát (51x): Myší monoklonální protilátka proti lidským gama řetězcům konjugovaná s křenovou peroxidázou. Konzervační prostředek: 0,159 % ProClin 300 R7 Ředicí roztok Ředící roztok pro vzorky a konjugát (hotový k použití): Tris-NaCl (ph 7,7), glycerol, 0,1% Tween 20, fenolová červeň Konzervační prostředek: 0,148 % ProClin 300 R9 Chromogen TMB Chromogen (hotový k použití): tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2 O 2 (<1 %) R10 Zastavovací roztok Zastavovací roztok (hotový k použití): 1N roztok kyseliny sírové Podmínky uchovávání a datum exspirace jsou uvedeny v nápisech na krabici. 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 1 x 80 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml 2

3 5. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Spolehlivost výsledků závisí na správném dodržování následujících pravidel správné laboratorní praxe: Nepoužívejte činidla po datu exspirace. Během jednoho cyklu nemíchejte ani nepřidávejte činidla z různých šarží. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy), chromogenu (R9, označení na štítku: TMB tyrkysové barvy) a zastavovacího roztoku (R10, označení na štítku: 1N červené barvy) je možné použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že jsou tato činidla zcela stejná a stejné šarže jako ta, která se použijí pro daný běh testu. POZNÁMKA: Není přípustné používat ředící roztok (R7) jiné šarže, než té, která je dodávána v soupravě. Je rovněž nepřípustné používat ředící roztok (R7) dodávaný se soupravami Platelia Toxo IgM (kat. č ). POZNÁMKA: navíc může být promývací roztok (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy) smíchán s 2 jinými promývacími roztoky obsaženými v různých soupravách činidel Bio-Rad (R2, označení na štítku: 10x modré barvy nebo 10x oranžové barvy), jestliže je správně naředěný a za předpokladu, že je během daného cyklu testu použita pouze jedna směs. Před použitím vyčkejte 30 minut, aby činidla dosáhla pokojové teploty (18-30 C). Činidla pečlivě rozpusťte nebo nařeďte tak, abyste zamezili jakékoli kontaminaci. Neprovádějte test v přítomnosti reaktivních výparů (výpary kyseliny, zásady či aldehydu) nebo prachu, které by mohly změnit enzymovou aktivitu konjugátu. Používejte sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo nejlépe materiál pro jednorázové použití. Promytí mikrodestičky je kritickým krokem pracovního postupu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a ujistěte se, že všechny jamky byly zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může způsobit nepřesné výsledky. Nedovolte, aby mikrodestička mezi koncem procesu promývání a pipetování činidla vyschla. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobku pro pipetování konjugátu a chromogenu. Enzymatická reakce je velmi citlivá na kov nebo ionty kovu. Proto nedovolte, aby jakýkoli kovový prvek přišel do kontaktu s různými roztoky, které obsahují konjugát nebo chromogen. Roztok chromogenu (R9) musí být bezbarvý. Vznik modré barvy znamená, že se nesmí činidlo použít a musí být vyměněno. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Zkontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a ostatního vybavení. OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Materiál lidského původu použitý při přípravě činidel byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti viru hepatitidy C (anti-hcv) a viru lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2). Protože žádná metoda nemůže zcela zaručit nepřítomnost infekčních agens, musí být s činidly lidského původu a vzorky pacientů zacházeno tak, jako by byly potenciálně schopné přenést infekční onemocnění: Jakýkoli materiál, včetně promývacích roztoků, který je v přímém kontaktu se vzorky a činidly obsahujícími materiál lidského původu, musí být považován za schopný přenášet infekční onemocnění. Při manipulaci se vzorky a činidly noste rukavice na jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Zabraňte rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Rozlité vzorky musí být omyty chlornanem sodným naředěným na 10 %. V případě rozlití kyseliny musí být tato nejprve neutralizována hydrouhličitanem sodným a poté omyta chlornanem sodným naředěným na 10 % a vysušena adsorpčním papírem. Materiál použitý k čištění musí být odložen do nádoby na kontaminovaný odpad. Pacientské vzorky, činidla obsahující materiál lidského původu a také kontaminovaný materiál a produkty musí být odloženy až po dekontaminaci: - buď ponořením do chlornanu sodného o konečné koncentraci chlornanu sodného 5 % po dobu 30 minut, - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu minimálně 2 hodiny. 3

4 UPOZORNĚNÍ: do autoklávu nevkládejte roztoky obsahující chlornan sodný. Zabraňte jakémukoli kontaktu činidel, včetně těch, které nejsou považovány za nebezpečné, s kůží nebo sliznicemi. S chemickým a biologickým odpadem musí být nakládáno a musí být likvidován v souladu s pravidly správné laboratorní praxe. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 6. VZORKY 1. Doporučenými typy vzorků jsou sérum nebo plazma (EDTA, heparin nebo citrát). 2. Pro manipulaci, zpracování a uchovávání krevních vzorků dodržujte následující doporučení: Při odběru krevních vzorků dodržujte rutinní bezpečnostní opatření pro venepunkci. U séra ponechte vzorky, aby se před odstředěním zcela srazily. Zkumavky udržujte vždy zazátkované. Po odstředění oddělte sérum nebo plazmu od sraženiny nebo červených krvinek do těsně zazátkované skladovací zkumavky. Bude-li test proveden během 7 dnů, mohou být vzorky uchovávány při teplotě 2-8 C. Nebude-li test dokončen během 7 dnů nebo pro přepravu, zmrazte vzorky na teplotu -20 C nebo nižší. Nepoužívejte vzorky, které byly rozmraženy více než pětkrát. Dříve zmrazené vzorky musí být po rozmrazení před testováním důkladně promíchány (třepačka Vortex). 3. U vzorků obsahujících 90 g/l albuminu nebo 100 mg/l nekonjugovaného bilirubinu, lipemických vzorků obsahujících ekvivalent 36 g/l triglyceridu a hemolyzovaných vzorků obsahujících až 10 g/l hemoglobinu, nejsou výsledky ovlivněny. 4. Vzorky nezahřívejte. 7. PROVEDENÍ TESTU 7.1 Potřebný materiál, který není součástí dodávky Třepačka Vortex. Spektrofotometr pro mikrodestičky vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Inkubátor pro mikrodestičky s termostatem nastavitelným na 37±1 C (*). Automatická, poloautomatická nebo ruční promývačka mikrodestiček (*). Sterilní destilovaná nebo deionizovaná voda. Rukavice na jednorázové použití. Brýle nebo ochranné brýle. Savý papír. Automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo fixní pipety nebo multikanálové pipety k měření a pipetování 10 µl až 1000 µl a 1 ml, 2 ml a 10 ml. Odměrné válce o objemu 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml. Chlornan sodný a hydrouhličitan sodný. Nádoba na biologicky nebezpečný odpad. Zkumavky na jednorázové použití. (*) Pokud požadujete detailní informace o doporučeném vybavení, kontaktujte naše technické oddělení. 7.2 Příprava činidel R1: před otevřením sáčku ponechte 30 minut při pokojové teplotě (18-30 C). Vyjměte rámeček, nepoužité stripy okamžitě vraťte do sáčku a zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti. Pečlivě znovu uzavřete sáček a uchovávejte jej při 2 8 C. R2: nařeďte promývací roztok R2 destilovanou vodou 1:20: např. k získání promývacího roztoku hotového k použití smíchejte 50 ml R2 a 950 ml destilované vody. Pro jednu destičku s 12 stripy při ručním promývání připravte 350 ml naředěného promývacího roztoku. 4

5 R3, R4a, R4b, R4c: nařeďte 1 : 21 ředícím roztokem (R7) (např.: 300 µl R µl kalibrátoru). R6+R7: Konjugát (R6) je koncentrován 51x a musí být před použitím promíchán. Nařeďte jej ředicím roztokem (R7) v poměru 1:51. Pro jednu destičku nařeďte 0,5 ml konjugátu (R6) v 25 ml ředicího roztoku (R7). K přípravě objemu potřebného pro jeden strip vydělte tyto objemy Uchovávání a exspirace otevřených anebo naředěných činidel Souprava musí být uchovávána při teplotě 2 8 C. Je-li před otevřením souprava uchovávána při teplotě 2 8 C, může být každá složka použita do data exspirace uvedeného na vnějším obalu soupravy. R1: po otevření jsou stripy stabilní 8 týdnů, jestliže jsou uchovávány při teplotě 2-8 C ve stejném, pečlivě uzavřeném sáčku (zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti R2: po naředění může být promývací roztok uchováván 2 týdny při teplotě 2-30 C. Po otevření je koncentrovaný promývací roztok uchovávaný při 2-30 C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku, pokud nedošlo ke kontaminaci. R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: pokud byla tato činidla po otevření a bez jakékoli kontaminace uchovávána při teplotě 2-8 C, jsou stabilní 8 týdnů. R6+R7: po naředění je pracovní roztok konjugátu stabilní 8 hodin při pokojové teplotě (18-30 C) nebo 2 týdny při teplotě 2-8 C. R9: po otevření a bez jakékoli kontaminace je toto činidlo uchovávané při 2-8 C stabilní 8 týdnů R10: po otevření a bez jakékoli kontaminace je tato reagencie uchovávaná při teplotě 2-8 C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku. 7.4 Pracovní postup Dodržujte přesně pracovní postup testu a zásady správné laboratorní praxe. Před použitím nechte činidla dosáhnou pokojové teploty (18-30 C). Použití oddělitelných jamek vyžaduje při manipulaci zvláštní pozornost. K validaci výsledků testu použijte při každém běhu testu všechny kalibrátory. 1. Pečlivě připravte plán rozmístění a identifikace kalibrátorů a pacientských vzorků. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) [Viz odstavec 7.2]. 3. Vyjměte rámeček a stripy (R1) z ochranného sáčku [Viz odstavec 7.2]. 4. V jednotlivě označených zkumavkách nařeďte kalibrátory R3, R4a, R4b a R4c a pacientské vzorky (S1, S2 ) ředícím roztokem (R7) na ředění 1:21: 300 µl ředicího roztoku (R7) a 15 µl vzorku [Viz odstavec 7.2]. Promíchejte naředěné vzorky. 5. Do každé jamky napipetujte 200 µl naředěných kalibrátorů a pacientských vzorků přesně podle níže uvedeného pořadí: A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Mikrodestičku přelepte samolepící fólií pro destičky a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu 5 minut při 37 C 1 C. 7. Před koncem prvního inkubačního období připravte pracovní roztok konjugátu (R6 + R7) [Viz odstavec 7.2]. 8. Na konci první inkubační doby odstraňte samolepící fólii z destičky. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4 x promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. 9. Do všech jamek okamžitě napipetujte 200 µl pracovního roztoku konjugátu (R6 + R7). Před použitím musí být roztok jemně protřepán. 5

6 10. Mikrodestičku přelepte samolepící fólií a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu 5 minut při teplotě 37 C 1 C. 11. Na konci druhé inkubační doby odstraňte z destičky přilnavou fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4 x promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. 12. Rychle napipetujte do každé jamky mimo dosah přímého světla 200 µl roztoku chromogenu (R9). Reakci nechte probíhat ve tmě 30 ± 5 minut při pokojové teplotě (18-30 C). Během této inkubace nepoužívejte přilnavou fólii. 13. Enzymatickou reakci ukončete přidáním 100 µl zastavovacího roztoku (R10) do každé jamky. Zachovejte stejný sled pipetování a časové intervaly jako při pipetování substrátového roztoku. 14. Opatrně otřete dno destičky. Změřte optickou denzitu na spektrofotometru pro mikrotitrační destičky při 450/620 nm do 30 minut po zastavení reakce. Před měřením musí být stripy vždy uchovávány ve tmě. 15. Před nahlášením výsledků zkontrolujte soulad mezi měřením a distribučním plánem destičky a vzorků. 8. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 8.1 Sestrojení standardní křivky Přítomnost a množství IgG protilátek proti T. gondii v testovaném vzorku se stanoví porovnáním optické denzity (OD) testovaného vzorku se standardem. Test Platelia Toxo IgG je standardizován podle WHO International Standard TOX-M. u stejného séra však mohou být pozorovány určité neshody titrů, jestliže je testováno různými sérologickými metodami. Tato nesrovnalost je důsledkem toho, že T. gondii užívaná v těchto různých metodách obsahuje variabilní proporce rozpustného membránového antigenu. Sestrojte standardní křivku [OD = funkce ( IU/ml)] vynesením hodnot OD kalibrátorů R3, R4a, R4b, R4c na vertikální (Y) osu a poté vynesením jejich příslušných koncentrací v IU/ml na horizontální (X) osu. Pro každý testovaný vzorek vypočtěte titr protilátky anti-t. gondii IgG ze sestrojené standardní křivky stanovením odpovídající koncentrace vůči naměřené OD. Poznámka: je-li hodnota OD testovaného vzorku naředěného v poměru 1:21 > OD R4c, musí být tento testovaný vzorek naředěn 1:210 v ředícího roztoku R7 a test musí být opakován, Odpovídající hodnoty IU/ml musí být poté vynásobeny faktorem Kontrola kvality Začleňte všechny kalibrátory pro každou mikrodestičku a pro každý běh testu a analyzujte získané výsledky. Pro validaci testu musí být splněna následující kritéria: Hodnoty optické denzity: OD R4a 0,200 OD R4b 0,400 Poměry optických denzit: OD R4a / OD R3 5,00 OD R4b / OD R4a 2,20 OD R4c / OD R4b 1,15 Nejsou-li splněna kritéria kontroly kvality, musí být tento běh testu opakován. 6

7 8.3 Interpretace výsledků Titr protilátek anti-t. gondii (mezinárodní jednotky/ml) Výsledek Interpretace Titr < 6 IU/ml 6 MJ/ml titr < 9 MJ/ml Negativní Nejednoznačný Negativní nebo nejednoznačný výsledek naznačuje nepřítomnost získané imunity, ale nemůže vyloučit akutní infekci. Je-li podezření na akutní infekci pacienta, měl by být testován druhý vzorek asi o dva týdny později. Titr 9 MJ/ml Pozitivní Pozitivní výsledek obvykle naznačuje dřívější infekci. Nemůže však být vyloučena akutní infekce, zvláště když jsou přítomné protilátky anti- T gondii IgM. U koncentrací vyšších než 200 IU/ml může být pozorováno větší kolísání titrů. 8.4 Návod k řešení problémů Nevalidované nebo neopakovatelné reakce jsou často způsobeny: Nedostatečným promytím mikrodestičky. Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek. Kontaminací chromogenu chemickými oxidačními agens (chlornan sodný, kovové ionty...). Kontaminací zastavovacího roztoku. 9. ÚČINNOST Účinnost testu Platelia Toxo IgG byla hodnoceny na dvou pracovištích za použití celkem 1310 vzorků od těhotných žen a dárců krve. Na jednom pracovišti byla provedena srovnávací studie pomocí testu Platelia Toxo IgG TMB (72741) při ručním testu. Na druhém pracovišti byla účinnost testu Platelia Toxo IgG porovnána s testem Platelia Toxo IgG TMB (72741) provedeném na automatickém EIA analyzátoru pro mikrotitrační destičky. 9.1 Prevalence Prevalence protilátek proti Toxoplasma gondii pomocí testu Platelia Toxo IgG byla stanovena na panelu 538 vzorků, převážně od těhotných žen, monitorovaných v průběhu jejich těhotenství a pocházejících z oblasti Paříže (Francie). 128 vzorků bylo pozitivních na protilátky anti-toxoplasma IgG. Prevalence měřená testem Platelia Toxo IgG je stanovena na 23,8 % (128/538). 9.2 Srovnávací studie (pracoviště 1) Účinnost testu Platelia Toxo IgG byla stanovena na panelu 745 vzorků seskupených následovně: 606 sér od dárců krve 139 sér od těhotných žen Výsledky byl porovnány s těmi, které byly získány pomocí testu Platelia Toxo IgG TMB (72741), použitém jako referenční test. Platelia Toxo IgG TMB (72741) Platelia Toxo IgG (72840) Negativní Nejistý* Pozitivní Celkem Negativní Nejistý* Pozitivní Celkem Celková shoda: 743/ ,0 % [IS 95 % = 99,5 % -100,0 %] Relativní specificita: 365/ ,0 % [IS 95 % = 99,0 % -100,0 %] Relativní citlivost: 378/ ,0 % [IS 95 % = 99,0 % -100,0 %] *Nejisté vzorky nebyly do výpočtů citlivosti, specificity a shody zahrnuty. [IS 95 %] = 95% interval spolehlivosti 7

8 9.3 Účinnost (pracoviště 2) Byla provedena prospektivní studie na 538 vzorcích převážně od těhotných žen monitorovaných v průběhu jejich těhotenství a testovaných rutinně v laboratoři. Tyto vzorky byly testovány paralelně testy Platelia Toxo IgG a Platelia Toxo IgG TMB (72741). Navíc všechny vzorky neznámých pacientů v laboratorní databázi s titrem pod 100 IU/ml byly kontrolovány druhou metodou: Citlivou aglutinací (laboratorní antigen: T. gondii, kmen RH) pro séra o titru > 10 MJ/ml. Nepřímou imunofluorescencí (laboratorní antigen: T. gondii, kmen RH) pro séra s titrem mezi 3 a 10 IU/ml. Výsledky byl porovnány s těmi, které byly získány pomocí testu Platelia Toxo IgG TMB (72741), který byl použit jako referenční. Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negativní Nejistý* Pozitivní Celkem Negativní Nejistý* Pozitivní Celkem Celková shoda: 517/524 98,7 % [IS 95 % = 97,3 % -99,5 %] Relativní specificita: 406/413 98,3 % [IS 95 % = 96,5 % -99,3 %] Relativní citlivost: 111/ ,0 % [IS 95 % = 96,8 % -100,0 %] *Nejisté vzorky nebyly do výpočtů citlivosti, specificity a shody zahrnuty. [IS 95 %] = 95% interval spolehlivosti. Všechny ze 7 rozporných pozitivních vzorků v testu Platelia Toxo IgG byly potvrzeny jako pozitivní pomocí komplementárních metod užívaných v laboratoři (citlivá aglutinace, nepřímá imunofluorescence). Dále pak 9 sérokonverzních panelů obsahujících každý 3 vzorky bylo také testováno pomocí testů Platelia Toxo IgG (72840) a Platelia Toxo IgG TMB (72741). u každého panelu byl první vzorek negativní jak na protilátky anti-toxoplasma gondii IgG, tak i na protilátky IgM. Oba testy vykázaly podobné výsledky u 8 z 9 sérokonverzních panelů. Na jednom sérokonverzním panelu bylo 2. sérum pozitivní v testu Platelia Toxo IgG, avšak nejisté v testu Platelia Toxo IgG TMB. 9.4 Účinnost u vzorků pupečníkové krve 47 vzorků pupečníkové krve bylo testováno podle protokolu popsaného v odstavci 7.4 (ředění vzorku 1:21). 22 vzorků od konfirmované kongenitální toxoplazmózy 18 vzorků od proběhlé infekce matky 7 vzorků bez žádné infekce Všechny vzorky od kongenitální a proběhlé infekce byly pozitivní v testu Platelia Toxo IgG (72840), se všemi vzorky od proběhlé infekce negativními v testu Platelia Toxo IgM (72841). 7 neinfekčních vzorků bylo konfirmováno jako negativní. Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841) pozitivní nejistý negativní pozitivní nejistý negativní kongenitální toxoplazmóza (n=22) proběhlá infekce matky (n=18) negativní (n=7)

9 9.5 Zkřížená reaktivita Panel 197 vzorků zahrnující 159 vzorků pozitivních na zarděnky, CMV, EBV, HSV, VZV, příušnice, spalničky a HIV a 38 vzorků pozitivních na revmatoidní faktor, autoprotilátky a heterofilní protilátky byl testován pomocí testu Platelia Toxo IgG (72840) a Platelia Toxo IgG TMB (72741). Testem Platelia Toxo IgG bylo prokázáno 141 negativních vzorků, 55 pozitivních vzorků a 1 vzorek jako nejistý. 9.6 Správnost Opakovatelnost Pro vyhodnocení opakovatelnosti byly testovány jeden negativní a tři pozitivní vzorky 32 x v jednom běhu testu. u každého vzorku byla stanovena koncentrace (IU/ml). Průměrná koncentrace ( IU/ml), směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (%VK) pro každý vzorek jsou uvedeny v níže uvedené tabulce: Opakovatelnost N=32 Negativní vzorek Slabě pozitivní Silně pozitivní Pozitivní vzorek vzorek vzorek Koncentrace (IU/ml) Průměr 0,15 16,0 39,8 167,5 SO 0,01 2,3 2,7 23,1 % VK 7,2 % 14,4 % 6,9 % 13,8 % Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost byla hodnocena duplicitním testováním čtyř vzorků (jednoho negativního a tří pozitivních) ve dvou bězích testu denně v průběhu 20-ti denního období. u každého vzorku byla stanovena koncentrace (IU/ml). Průměrná koncentrace (IU/ml), směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (% VK) pro každý vzorek jsou uvedeny v níže uvedené tabulce: Reprodukovatelnost N=80 Negativní vzorek Slabě pozitivní Silně pozitivní Pozitivní vzorek vzorek vzorek Koncentrace (IU/ml) Průměr 0,15 15,2 41,7 166,5 SO 0,05 2,4 4,2 21,0 % VK 32,6 % 15,5 % 10,1 % 12,6 % 9.7 Preciznost a linearita K vyhodnocení přesnosti kalibrace bylo testováno několik ředění WHO International Standard TOX-M. Získané výsledky demonstrují, že test Platelia TOXO IgG je přesně kalibrován podle WHO International Standard TOX-M pro hodnoty až do 30 IU/ml. Nad hodnoty 30 IU/ml jsou získané výsledky podhodnocené o 25 až 50 %. Pomocí sériových ředění 5 pozitivních vzorků bylo stanoveno rozmezí testu Platelia Toxo IgG mezi 7 a 200 IU/ml. 10. OMEZENÍ TESTU Diagnóza infekce T. gondii může být stanovena pouze na základě kombinace klinických a biologických údajů. Výsledek jednoho testu titrace protilátek anti-t. gondii IgG nepředstavuje dostatečný průkaz pro diagnózu akutní infekce Toxoplasma gondii. Diagnóza akutní infekce může být provedena pouze s úplnými pacientovými informacemi včetně klinických a biologických údajů (významný nárůst protilátek anti-t. gondii IgG u 2 sér pacienta odebraných v intervalu 3 týdnů a testovaných ve stejném běhu testu, přítomnost významné hladiny anti- T. gondii IgM, důkaz nízké avidity anti-t. gondii IgG). Přítomnost protilátek anti-t. gondii IgM nepředstavuje dostatečný důkaz k potvrzení akutní infekce, protože IgM mohou přetrvávat několik měsíců nebo dokonce několik let po infekci. Když jsou detekovány IgM, mělo by být provedeno kvantitativní stanovení protilátek IgG proti T. gondii a také kontrola dynamiky hladin protilátek proti T. gondii na nejméně druhém vzorku séra o tři týdny později. 9

10 Je-li vzorek testován příliš brzy v průběhu akutní primoinfekce, protilátky anti-t. gondii IgM nemusí být ještě přítomny. Existuje-li podezření, měl by být asi za 3 týdny odebrán druhý vzorek, u kterého by bylo opět provedeno testování na IgM protilátky. 11. KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému kvality jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u společnosti Bio-Rad. 12. LITERATURA 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome forinfected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. Antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

11 11

12 12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)