Platelia EBV-VCA IgG 1 destička ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA KE KVALITATIVNÍMU STANOVENÍ PROTILÁTEK IgG PROTI VIRU EPSTEIN-BARROVÉ V LIDSKÉM SÉRU

Transkript

1 Platelia EBV-VCA IgG 1 destička ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA KE KVALITATIVNÍMU STANOVENÍ PROTILÁTEK IgG PROTI VIRU EPSTEIN-BARROVÉ V LIDSKÉM SÉRU 2015/04 1. POUŽITÍ Tato imunoanalytická souprava je určena ke kvalitativnímu stanovení IgG protilátek proti kapsidovému antigenu viru Epstein- Barrové (EBV-VCA) v lidském séru. Soupravu PLATELIA EBV-VCA IgG je možné používat spolu s ostatními testy EBV sérologie (PLATELIA EBV-VCA IgM, PLATELIA EBV-EA-D IgG a PLATELIA EB-NA-1 IgG) k diagnóze infekční mononukleózy. 2. KLINICKÝ VÝZNAM Virus Epstein-Barrové (EBV) byl poprvé popsán v r Epsteinem, Achongem a Barrovou při elektronmikroskopických studiích kultur lidských lymfoblastů od pacientů s Burkittovým lymfomem. EBV je klasifikován jako zástupce čeledi herpetických virů, vytvořené na základě jejich charakteristické morfologie. Infekce EB virem se může projevit širokou škálou klinických příznaků. Většina primárních infekcí EBV se přenáší slinami a probíhá v dětském věku jako inaparentní infekce. Ve Spojených Státech 50 % populace vykazuje protilátky proti EBV před dosažením věku 5 let; v dospělosti 80 %. Byly rovněž publikovány údaje o potransfůzních infekcích EBV. U mladých dospělců se může infekce EBV klinicky projevit jako infekční mononukleóza (IM) s relativně atypickými příznaky - horečnatou faryngitidou, tonsilitidou, lymfadenopatií, malátností, bolestí hlavy, bolestí svalstva, spleno- a hepatomegalií, vyrážkou a leukocytózou. Studenti kolejí a vojenský personál jsou často uváděni jako skupiny populace s vysokým výskytem onemocnění IM. Předpokládá se, že po primární infekci mohou B lymfocyty přechovávat genom EBV a nastane latentní infekce, která může přetrvávat po celý život. Reaktivace infekce EBV nebo zvýšená aktivace EBV byla zaznamenána u imunodeficientních nebo imunosuprimovaných pacientů, např. u transplantovaných pacientů, pacientů s malignitami, u těhotných žen a osob pokročilého věku. Stále přetrvávají polemiky týkající se definitivního důsledku EBV jakožto etiologického agens klinického stavu označovaného jako chronická infekce EBV či chronická mononukleóza. Virus Epstein-Barrové souvisí rovněž s patogenezí dvou lidských rakovinných onemocnění, Burkittova lymfomu a nasofaryngeálního karcinomu. Prostřednictvím studií hybridizace DNK byla prokázána přítomnost genomu EBV v bioptických vzorcích, odebraných od jedinců s těmito karcinomy. Burkittův lymfóm se především vyskytuje v zemích subsaharské Afriky, zejména u afrických dětí a na Nové Guinei. U pacientů s Burkittovým lymfomem jsou rovněž diagnostikovány infekce malárie, o kterých se uvažuje, že by mohly být kofaktorem.. Nasofaryngeální karcinom se vyskytuje v Asii, zejména v jižní Číně a jako kofaktor by se mohly uplatňovat genetické vlivy či vlivy prostředí. Lymfómy B-buněk, podobné africkému Burkittovu lymfomu, byly nedávno popsány u pacientů s AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). Uvažuje se, že pacienti s AIDS mohou být predisponováni vůči infekci/reaktivaci EBV vzhledem k jejich celkovému stavu imunosuprese. V současnosti se k průkazu akutní IM nejčastěji používá vyšetření heterofilních protilátek. Avšak více než 20 % pacientů s primární infekcí EBV nevykazuje pozitivní test na heterofilní protilátky. Navíc se uvádí, že až 7 % výsledků testů na heterofilní protilátky, prováděných komerčně dostupnými rychlými sklíčkovými testy, je falešně pozitivních, a to především vzhledem k technickým chybám při subjektivním vyhodnocení aglutinace erytrocytů. 3. PRINCIP TESTU Enzymoimunoanalytické testy Bio-Rad ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) jsou využívají schopnosti biologických látek (např. antigenů) adsorbovat se na povrchy plastických hmot např. polystyrenu (pevná fáze). Souprava PLATELIA EBV- VCA IgG využívá metodu ELISA, ve které je na povrch jamek mikrodestičky navázán purifikovaný antigen (VCA). Když se antigeny navázané na pevné fázi dostanou do kontaktu s pacientským sérem, váží se antigen specifické protilátky (jsou-li přítomny) na antigen navázaný na pevné fázi a vytváří antigen-protilátkové komplexy. Nadbytečné protilátky jsou odstraněny promytím. Následuje přidání kozí protilátky proti lidskému IgG, jež je konjugovaná s křenovou peroxidázou. Konjugát se váže na komplexy antigen-protilátka. Nadbytek konjugátu se odstraní promytím a do jamek se přidá enzymový substrát tetrametylbenzidin (TMB). Je-li v pacientském séru přítomna specifická IgG protilátka proti EBV-VCA, zbarví se obsah jamky do modra. Po zastavení enzymatické reakce přidáním 1N H 2SO 4 se barva změní ve žlutou. Zabarvení, které je proporcionální koncentraci protilátky v séru, lze měřit na vhodném spektrofotometru nebo spektrofotometru pro mikrotitrační destičky pro ELISA.

2 Souprava PLATELIA EBV-VCA IgG je primárně tvořena kapsidovým antigenem viru (VCA) a je určena k průkazu IgG protilátek specifických pro infekci EBV. Protilátky jsou prokazatelné za nepřítomnosti heterofilních protilátek. Hladina protilátek EBV-VCA IgG začíná stoupat brzy na počátku onemocnění, dosahuje vrcholu po 3-4 týdnech, potom klesá a nízké hladiny protilátek přetrvávají po celý život. Citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost testů ELISA je srovnatelná s ostatními sérologickými testy na stanovení protilátek, jako je imunofluorescence, vazba komplementu, hemaglutinace a radioimunoanalýza. 4. SLOŽENÍ PRODUKTU V šechna činidla jsou výlučně pro diagnostické použití in vitro. R1 R2 R3 R4a R4b R5 R6 R7 Štítek Složení reagencie Množství Mikrotitrační destička: 12 stripů (po 8 jamkách) potažených 1 Microplate purifikovaným kapsidovým antigenem (inaktivovaný),uloženo v fóliovém sáčku se sušidlem a indikátorem vlhkosti. Concentrated Koncentrovaný promývací roztok (20 x): 1 x 50 ml Washing TRIS pufr (ph 7.2 ± 0,2) í 1% Tween 20. Solution (20x) Konzervační činidla: Proclin 300 (0,1%). Non Reactive control Positive Control I Positive Control II Calibrator Conjugate Diluent I Kontrola nereaktivní (lidská) na protilátky anti-ebv-vca IgG. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<0,1%) a pen/strep (0,01%). Pozitivní kontrola I (lidská) na protilátky anti-ebv-vca IgG. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<0,1%) a pen/strep (0,01%). Pozitivní kontrola II (lidská) na protilátky anti-ebv-vca IgG. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<0,1%) a pen/strep (0,01%). Kalibrátor (lidský) na protilátky anti-ebv-vca IgG s faktorem specifickým pro danou soupravu, vytištěným na štítku krabičky. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV-1 a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<0,1%) a pen/strep (0,01%). Konjugát (hotový k použití): kozí protilátky proti lidskému IgG konjugované s křenovou peroxidázou. Konzervační činidla: Proclin 300 (0,1%) a gentamicin. Ředící roztok I: Pufr hotový k použití (ph 7,5 ± 0,2). Konzervační činidlo: Proclin 300 (0,1%). 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 1 x 16 ml 1 x 30 ml R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Roztok chromogenu se substrátem (hotový k použití): Tetrametylbenzidin (TMB). Činidlo musí být zavřené, když se nepoužívá; jinak se může v reakčních jamkách vytvořit precipitát. Zastavovací roztok (hotový k použití): 1 N kyselina sírová. 1 x 15 ml 1 x 15 ml Formulář pro záznam testu 1 5. UPOZORNĚNÍ, OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Upozornění Hodnověrnost výsledků závisí na správném dodržování následujících zásad správné laboratorní praxe: Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Nekombinujte reagencie z různých výrobních šarží v jednom běhu testu. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2), roztoku chromogenu se substrátem (R9), a zastavovacího roztoku (R10) je možno použít s danou soupravou i jiné výrobní šarže než ty, které jsou v soupravě obsaženy, za předpokladu, že pro daný běh testu se použije vždy stejná šarže. Tyto reagencie lze použít se soupravami PLATELIA EBV-VCA IgM, PLATELIA EBV-EA-D IgG a PLATELIA EB-NA-1 IgG, které jsou uvedeny v našem katalogu. Ředící roztok I (R7) může být použit se soupravami PLATELIA EBV-EA-D IgG a PLATELIA EB-NA-1 IgG. Podrobné informace vám poskytne naše firma. Před použitím ponechejte reagencie ustálit po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Reagencie pečlivě nařeďte a zabraňte jejich kontaminaci. Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních výparů (kyseliny, alkalické látky, aldehydy) nebo v prašném prostředí, což by mohlo ovlivnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte laboratorní sklo a pomůcky důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo raději materiál pro jednorázové použití. Promyté mikrotitrační destičky nesmí na konci promývacího kroku před napipetováním další reagencie vyschnout. Enzymatická reakce je velmi citlivá na působení kovových iontů. Proto nesmí roztok konjugátu nebo substrátu přijít do kontaktu s kovy.

3 Roztok chromogenu a substrátu musí být bezbarvý. V případě, že dojde k jeho zabarvení, je roztok nepoužitelný a musí být vyměněn. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Promývání je kritickým krokem testu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a přesvědčete se, že během promývání jsou všechny jamky zcela naplňovány a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může vést k chybných výsledků. Pro konjugát a roztok chromogenu se substrátem nikdy nepoužívejte stejnou nádobku. U pipet a ostatních zařízení pravidelně kontrolujte jejich správnou funkci a přesnost. Neměňte pracovní postup. OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny k použití pro diagnostiku in vitro. Při manipulaci s reagenciemi používejte ochranné rukavice pro jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Materiál lidského původu použitý pro přípravu reagencií byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti hepatitidě C (HCV) a proti virům lidské imunodeficience (HIV-1 a HIV-2). Poněvadž žádná metoda nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních agens v materiálu, zacházejte s reagenciemi lidského původu a vzorky jako s potenciálně infekčním materiálem schopným přenášet infekční onemocnění. Za infekční považujte veškerý materiál, který přišel do styku s vyšetřovanými vzorky a reagenciemi lidského původu a rovněž promývací roztok. Zamezte rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Potřísněná místa musí být omyta chlornanem sodným naředěným na 10%. Jestliže je kontaminující materiál kyselina, musí být nejprve neutralizována hydrogenuhličitanem sodným a potom je třeba místo otřít chlornanem sodným a vysušit savým papírem. Použitý úklidový materiál musí být odložen jako infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a rovněž kontaminovaný materiál a produkty musí být před odložením dekontaminovány. Dekontaminace se provádí - buď ponořením do 5 % roztoku chlornanu sodného na 30 minut, - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu nejméně 2 hodin. Autoklávování při teplotě 121 C po dobu nejméně jedné hodiny je nejlepší způsob inaktivace virů HIV a HBV. UPOZORNĚNÍ: ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ SE NESMÍ AUTOKLÁVOVAT! Při zacházení s chemikáliemi a při jejich odkládání je třeba dodržovat zásady správné laboratorní práce. Vyvarujte se potřísnění kůže a sliznic substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem (nebezpečí toxického působení, podráždění či poleptání). Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 6. NEZBYTNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Mixer Vortex Spektrofotometr k měření na mikrotitračních destičkách, vybavený filtry 450 nm (*). Nádoba na nebezpečný biologický odpad. Chlornan sodný a hydrogenuhličitan sodný. Destilovaná nebo deionizovaná voda. Odměrné válce opatřené stupnicí. Ochranné latexové rukavice pro jednorázové použití. Ochranné brýle nebo maska. Savý papír. Automatické či poloautomatické nastavitelné či fixní pipety či multipipety o objemech 10, 100 a 1000 µl. Manuální, poloautomatická či automatická promývačka mikrotitračních destiček (*). Zkumavky pro jednorázové použití. (*) Na vyžádání vám poskytneme další informace o vhodném vybavení doporučeném naším technickým oddělením. 7. PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ REAGENCIÍ Soupravu je možno uchovávat při teplotě +2 až +8 C až do data exspirace uvedeného na obalu (není-li uvedeno jinak). Před použitím nechte reagencie ustálit na pokojovou teplotu (+21 až + 25 C). Ihned po použití je vraťte zpět do chladničky.

4 1) Reagencie hotové k použití Reagencie 1 (R1): mikrotitrační destička. Rámeček obsahující 12 stripů je zabalen v zataveném fóliovém plastovém sáčku. Sáček rozstříhejte nůžkami či odřízněte skalpelem 0,5 1 cm nad spojem. Nepoužité stripy ihned vložte zpět do sáčku. Sáček pečlivě uzavřete a uchovávejte při teplotě +2 až +8 C. Takto uchovávané stripy jsou stabilní po dobu 1 měsíce. Reagencie 3 (R3): nereaktivní kontrola Reagencie 4a (R4a): pozitivní kontrola I Reagencie 4b (R4b): pozitivní kontrola II Reagencie 5 (R5): kalibrátor Reagencie 6 (R6): konjugát Reagencie 7 (R7): ředicí roztok I Reagencie 9 (R9): roztok chromogenu se substrátem Reagencie 10 (R10): zastavovací roztok 2) Reagencie vyžadující přípravu Reagencie 2 (R2): promývací roztok 20x koncentrovaný. Roztok o pracovní koncentraci se připraví naředěním 50 ml 20 x koncentrovaného promývacího roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou do celkového objemu 1,0 l. Dobře promíchejte. Po naředění uchovávejte při teplotě +2 až +8 C 5 dnů. 8. VZORKY Vzorky krve odeberte běžným způsobem. Test se provádí s neředěnými vzorky. Sérum oddělte od staženiny nebo erytrocytů co nejdříve, aby se zabránilo hemolýze. Silná hemolýza může ovlivnit funkčnost testu. Vzorky obsahující shluky je nutno před vyšetřením vyčeřit centrifugací. Suspendované fibrínové sraženiny nebo částice mohou zapříčinit falešně pozitivní výsledky. Jestliže budou vzorky testovány do 5 dnů, mohou být uchovávány při teplotě +2 až +8 C nebo mohou být zamraženy několik měsíců při 20 C. Vzorky opakovaně nezmrazujte a nerozmrazujte. Při transportu musí být vzorky zabaleny podle platných předpisů pro přepravu etiologických agens. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, SILNĚ CHYLÓZNÍ, IKTERICKÁ, SILNĚ HEMOLYTICKÁ NEBO TEPELNĚ INAKTIVOVANÁ SÉRA. 9. PRACOVNÍ POSTUP Přesně dodržujte popsaný pracovní postup. Pro každý běh stanovení používejte kalibrátor a kontroly pro validaci výsledků testu. Dodržujte následující zásady správné laboratorní praxe: 1. Pečlivě sestavte schéma umístění vzorků a identifikační plán. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) (viz článek 7). 3. Vyjměte rámeček mikrotitrační destičky a stripy (R1) z ochranného sáčku. Do rámečku vložte potřebný počet stripů potažených antigenem. Jednu jamku vyhraďte pro reagenční blank, 3 jamky pro kalibrátor, po jedné jamce pro negativní kontrolu, positivní kontrolu I a pozitivní kontrolu II A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9 4. Všechny vzorky, kontroly a kalibrátory je třeba před použitím promíchat na vortexu. Testované vzorky, kalibrátor, negativní a pozitivní kontroly nařeďte ve zkumavkách či ředicí destičce v poměru 1:21 (tj. 10 µl µl) ředicím roztokem I (R7). 5. Do každé jamky napipetujte 100 µl naředěného kalibrátoru, kontroly či testovaného vzorku. Do první jamky napipetujte 100 µl ředicího roztoku I (R7) (reagenční blank). 6. Mikrotitrační destičku inkubujte 20 minut ± 2 min. při pokojové teplotě (21 25 C). 7. Obsah všech jamek odsajte a odstraňte jej do odpadní nádoby na biologický odpad (která obsahuje chlornan sodný). Do každé jamky okamžitě napipetujte minimálně 300 µl promývacího roztoku. Opět odsajte. Tento postup opakujte alespoň 4 x (celkem minimálně 5 promývacích cyklů). Jestliže je to nutné, osušte obrácenou destičku na savém papíru. Podle stejného promývacího postupu postupujte i v případě použití automatické promývačky. 8. Do všech jamek napipetujte po 100 µl konjugátu (R6) hotového k použití. 9. Inkubujte 20 min. ± 2 min. při pokojové teplotě (21 25 C). 10. Obsah všech jamek odsajte a promyjte je 5x výše popsaným způsobem. 11. Do každé jamky rychle napipetujte 100 µl roztoku chromogenu se substrátem (R9).

5 12. Reakci nechte vyvíjet 10 ± 2 min. ve tmě při pokojové teplotě (21-25 C). Během této inkubace nepřekrývejte destičku samolepicí fólií. V jamkách obsahujících detekovatelné hladiny protilátek IgG se roztok chromogenu se substrátem zbarví modře. 13. Do každé jamky napipetujte po 100 µl zastavovacího roztoku (R10). Promíchejte opatrným poklepáním na destičku. Přidání zastavovacího roztoku způsobí změnu barvy z modré na žlutou. 14. Počkejte nejméně 5 minut a změřte. Opatrně otřete dno destičky. K odečtu použijte vlnovou délku 450 nm. Spektrofotometr blankujte na jamku s reagenčním blankem a změřte optickou denzitu každé jamky. Destičku je nutno měřit nejdéle do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku (před měřením musí být stripy vždy uchovávány ve tmě). 15. Zkontrolujte všechny výsledky, jestli se shodují v načtených hodnotách a v distribuci vzorků a s identifikačním plánem. 10. VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 1) Výpočet průměrné hodnoty absorbance 1. Průměrná cut-off O.D. (optická denzita) kalibrátoru vypočtěte průměrnou O.D. kalibrátoru cut-off ze tří stanovení hodnot O.D. pro kalibrátor R5. Jestliže že se některá z hodnot O.D. kalibrátoru liší od průměru o více než 15%, vyřaďte ji a průměr vypočtěte ze zbývajících dvou hodnot. 2. Korekční faktor - aby bylo možno vzít v úvahu každodenní kolísání aktivity testu způsobené laboratorní teplotou a časovým průběhem testu, je pro každou šarži soupravy stanoven korekční faktor. Korekční faktor je uveden na štítku lahvičky s kalibrátorem. 3. Hodnota kalibrátoru cut-off hodnota kalibrátoru cut-off se pro každý test stanoví vynásobením průměru O.D. kalibrátoru cut-off stanoveného podle kroku 1 korekčním faktorem. 4. Hodnota ISR vypočítejte imunní poměr (ISR) pro každý vzorek vydělením hodnoty O.D. vzorku hodnotou kalibrátoru cutoff, stanovenou podle kroku 3. Příklad: O. D. stanovené pro kalibrátor = 0,380; 0,400; 0,420 Průměrná O.D. pro kalibrátor = 0,400 Korekční faktor = 0,5 Hodnota kalibrátoru cut-off = 0,5 x 0,400 = 0,200 O.D. stanovená pro pacientské sérum = 0,600 Hodnota ISR = 0,600/0,200 = 3,00 2) Validace testu 1. Reagenční blank (měření blanku proti vzduchu) při 450 nm musí být < 0,150: O.D. RB < 0, Negativní kontrola R3 při 450 nm (měření proti reagenčnímu blanku) musí být 0,250: O.D. R3 0, Každý kalibrátor R5 při vlnové délce 450 nm (měření proti reagenčnímu blanku) musí být 0,250: O.D. R5 0, Pozitivní kontrola R4b při vlnové délce 450 nm (měření proti reagenčnímu blanku) musí být 0,500: O.D. R4b 0, Hodnoty ISR (imunní poměr) pro negativní kontrolu, pozitivní kontrolu I a pozitivní kontrolu II (R3, R4a, R4b) musí být v příslušných rozmezích, uvedených na štítcích lahviček. Jestliže tato kritéria nejsou v příslušných rozmezích, test je neplatný a musí být opakován. 3) Interpretace výsledků Pacientské hodnoty ISR (Immune Status Ratio) se interpretují následujícím způsobem: Hodnota ISR Výsledky Interpretace 0,90 Negativní Není přítomna signifikantní hladina prokazatelných IgG protilátek proti EBV- VCA. Lze předpokládat, že tito jedinci dosud nebyli infikováni EBV a jsou vnímaví k primární infekci EBV. 0,91 1,09 Neurčité Vzorky je nutno znovu vyšetřit. 1,10 Pozitivní Je přítomna signifikantní hladina prokazatelných IgG protilátek proti EBV- VCA. Výsledek svědčí pro akutní či minulou infekci EBV. Tito jedinci mohou představovat riziko přenosu EBV infekce, ale nemusí v této době přenášet infekci. 1. Doporučuje se hlásit získané výsledky následujícím způsobem: Následující výsledky byly získány testem PLATELIA EBV- VCA IgG. Hodnoty získané různými metodami nelze zaměňovat. Stanovenou hladinu IgG nelze uvádět do korelace s konečným titrem. 2. Přesná interpretace infekce EBV, která poskytuje souhrnný obraz, je založena na výsledcích stanovení čtyř rozdílných protilátek proti EBV: EBV indukovanému nukleárnímu antigenu (EB-NA), IgG EBV indukovanému časnému antigenu (EBV EA), IgG a IgM virovému kapsidovému antigenu (EBV-VCA). Přesná interpretace infekce EBV je založena na výsledcích stanovení všech těchto protilátek a pro diagnózu se zpravidla nelze spoléhat na výsledek jednoho testu. 3. Vzorky, které i po opakovaném vyšetření zůstávají neurčité by měly být vyšetřeny některou alternativní metodou, např. imunofluorescenčním testem (IFA). Jestliže i toto vyšetření vykáže neurčitý výsledek, musí být testován další vzorek. 4. Funkční charakteristiky tohoto testu byly stanoveny při použití jednoho kalibrátoru. Je-li vyžadována lineární kalibrační křivka, měl by zákazník použít nejméně dva další kalibrátory.

6 5. Při hodnocení párových sér za účelem stanovení dynamiky protilátek je nutno obě séra vyšetřovat duplicitně ve stejném běhu testu. Aby bylo možno považovat vzestup hladiny protilátek za signifikantní, musí být průměrná hodnota ISR obou sér (akutního a rekonvalescentního) větší než 1,00. 4) Prevalence V USA je přibližně % dospělé populace séropozitivní na EBV-VCA IgG. Titry protilátek mohou kolísat v závislosti na použité metodě vyšetření. IgG protilátky proti VCA se objevují brzy na počátku IM a jejich tvorba vrcholí za 3-4 týdny po prvopočátku. Titr protilátek potom postupně klesá až na hladinu, která přetrvá po celý život. Zvýšené hladiny protilátek proti EBV se mohou vyskytovat u pacientů s nasofaryngeálním karcinomem, Burkittovým lymfomem, Hodgkinovou chorobou, sarkoidózou a systémovým lupus erythematosus. 5) Omezení testu 1. Použití odlišných pracovních postupů a praktik mimo těch, které jsou uvedeny v příbalovém letáku, může vést ke vzniku pochybných výsledků. Nereprodukovatelné reakce jsou často způsobeny: - Nedostatečným promýváním mikrodestičky. - Nesprávným časovým průběhem inkubačních kroků. - Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou o vysokém titru protilátek. - Kontaminací vyvíjecího roztoku oxidačními činidly (chlornan sodný, kovové ionty atd.). - Kontaminací zastavovacího roztoku. Kontaminovaná, ikterická, chylózní, hemolytická nebo tepelně inaktivovaná séra mohou zapříčinit chybné výsledky a měla by být vyřazena. Funkční charakteristiky nebyly stanoveny pro jiné materiály než sérum. 2. Výsledky tohoto testu by měl lékař interpretovat v souvislosti s ostatními klinickými nálezy a diagnostickými postupy. Tato souprava je určena ke stanovení protilátek IgG v pacientských vzorcích. Pozitivní výsledky u novorozenců je třeba interpretovat velmi opatrně, poněvadž mateřské IgG se pasivně přenáší od matky na plod ještě před narozením. Užitečnějším indikátorem infekce u dětí mladších 6 měsíců jsou obecně testy prokazující protilátky IgM. Hodnoty získané tímto testem by měly sloužit pouze jako pomůcka při diagnóze. Každý lékař musí výsledky interpretovat v souvislosti s anamnézou pacienta, fyzikálními nálezy a jinými diagnostickými postupy. Charakteristiky účinnosti nebyly stanoveny pro pacienty s nasofaryngeálním karcinomem, Burkittovým lymfomem, ostatními přidruženými lymfadenopatiemi a s jinými chorobami asociovanými s EBV, jinými než mononukleóza související s EBV. Výsledky testu PLATELIA EBV-VCA IgG získané od imunosuprimovaných pacientů je třeba interpretovat velmi opatrně. Charakteristiky účinnosti tohoto testu nebyly stanoveny pro pediatrické vzorky. Signifikantní vzestup hladiny protilátek svědčí pro nedávnou antigenní stimulaci. Nepřítomnost signifikantního vzestupu protilátek nevylučuje možnost infekce EBV. Vzorky odebrané velmi brzy v průběhu infekce nemusí ještě obsahovat prokazatelné hladiny IgG protilátek. V těchto případech se doporučuje vyšetřit vzorek na IgM protilátky nebo odebrat další vzorek za dní později a vyšetřit jej současně s původním vzorkem, aby bylo možno prokázat sérokonverzi, která svědčí pro primární infekci. Přítomnost IgG protilátek proti EBV nemusí zajišťovat ochranu před onemocněním. Hodnota ISR získaná při stanovení protilátek u jednoho vzorku nekoreluje se závažností klinických příznaků IM. 11. ÚČINNOST 1) Relativní citlivost a specifičnost založená na charakteristice séra. 205 vzorků náhodně vybraných ze dvou oddělených populací bylo vyšetřeno testem PLATELIA EBV-VCA IgG a komerčně dostupným imunofluorescenčním testem (IFT). Studovaný soubor se skládal ze sér pocházejících od normálních ambulantních dárců z velké Kalifornské univerzity a ze státního zdravotního ústavu na východě Spojených Států. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. PLATELIA EBV-VCA IgG 1. komerční IF test Výsledek Pozitivní Negativní Pozitivní Neurčité 1 0 Negativní 2 9 K vyřešení výsledků 2 testů, které falešně pozitivní v prvním komerčním IF testu byl použit test PLATELIA EBV-VCA IgG. Nejasný výsledek jednoho vzorku při vyšetření testem PLATELIA EBV-VCA IgG je považován za neurčitý a byl z následujících výpočtů relativní specifičnosti a citlivosti vyřazen. Specifičnost: 100 % (11/11) Citlivost: 100 % (193/193)

7 2) Opakovatelnost (přesnost v rámci testu) Přesnost testu PLATELIA EBV-VCA IgG byla hodnocena testováním tří sér (jedno negativní, jedno slabě pozitivní a jedno pozitivní) v deseti opakováních na téže destičce. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Sérum n X S.D. C.V.% Negativní 10 0,392 0, Slabě pozitivní 10 1,195 0,038 3,2 Pozitivní 10 2,252 0,097 4,3 X S.D. C.V. = průměrná hodnota ISR = směrodatná odchylka = koeficient variace 3) Reprodukovatelnost (přesnost mezi testy) Přesnost testu PLATELIA EBV-VCA IgG byla hodnocena testováním tří sér (negativní, slabě pozitivní a pozitivní) v deseti opakováních ve třech různých dnech. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Sérum n X S.D. C.V.% Negativní 30 0,42 0, Slabě pozitivní 30 1,02 0,054 4,2 pozitivní 30 2,44 0,149 6,1 C.V. byl u pozitivních vzorků menší než 10 %. 4) Zkřížená reaktivita Následujících 8 vzorků sér bylo vyšetřeno testem PLATELIA EBV-VCA IgG s negativním výsledkem. Vzorek EBV ANA CMV VZV HSV 1 HSV 2 PLATELIA EBV-VCA IgG Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní Negativní 12. LITERATURA 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma. Lancet. 1: Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong Studies with Burkitt's Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis). In: Principles and Practice of Infectious Diseases, 2nd Edition. Mandell, G. L., R. G. Douglas, and J. E. Bennett. (eds). John Wiley and Sons, New York. pp Sumaya, C.V Serological Testing for Epstein-Barr Virus-Developments in Interpretations. J. Inf. Dis. 151 (6): Tobi, M., and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Disease: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt.1)): Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab Mgmt. Oct., Birx, D.L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) or AIDSRelated Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): Ablashi, D.V., et. al Firsh International Symposium on Epstein-Barr Virus and Associated Malignant Diseases. Cancer Res. 45 (8): Chang, R.S., H. Thompson, and S. Pomerantz Epstein-Barr Virus Infections in Homosexual Men with Chronic, Persistent Generalized Lymphadenopathy. J. Inf. Dis. 151 (3): Bakerman, S Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp

8 11. Engvall, E. and P. Perlmann Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. Peeters. H., ed. Proteins of the Biological Fluids. Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge, Oxford. Pergamon Press. pp Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme- Labelled Antigen and Antibody-Coated tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251: Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs Immunoassay Using Antigen- Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15: CDC/NIH Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3rd edition. Pp Lennette, E.T Epstein-Barr Virus. In: Manual of Clinical Microbiology, Fourth Edition. E.H. Lennette, A. Balows, W.J. Hausler, Jr. and H.J. Shadomy, eds. ASM. 67: Tishchendorf, P., et. Al Development and Persistence of Immunity to Epstein- Barr Virus in Man. J. Infect Dis. 1222: Evans, A.S The Spectrum of Infections with EB Virus: A Hypothesis. J. Infect. Dis. 124: Niederman, J.C., R.W. McCollum, G. Henle, and W. Henle Infectious Mononucleosis, Clinical Manifestations in Relation to EB Virus Antibodies. Jama 203: Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr Virus: The Cause of Infectious Mononucleosis. In: Oncogenesis and Herpesviruses. I.M. Biggs and L.H. Payne, eds. Int Agency Res. Cancer Sci. #2, Lyon, pp

9

10 TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow Ireland Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax. : +33 (0) /04