96 testů HBe Ag - 96 testů HBe Ab. DETEKČNÍ SOUPRAVA PRO STANOVENÍ HBe Ag A HBe Ab ENZYMOVOU IMUNOANALÝZOU

Transkript

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS testů HBe Ag - 96 testů HBe Ab DETEKČNÍ SOUPRAVA PRO STANOVENÍ HBe Ag A HBe Ab ENZYMOVOU IMUNOANALÝZOU IVD Pouze pro diagnostiku in vitro Kontrola kvality prováděná výrobcem Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propuštěna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace vztahující se k výrobě a kontrole každé jednotlivé šarže jsou uchovávány naší společností.

2 OBSAH 1 - POUŽITÍ 2 - KLINICKÝ VÝZNAM 3 - PRINCIP TESTU 4 - SLOŽENÍ SOUPRAVY 5 - POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY 6 - UPOZORNĚNÍ 7 - OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ 9 - PODMÍNKY UCHOVÁVÁNÍ A SKLADOVATELNOST 10 - VZORKY 11 - PRACOVNÍ POSTUP 12 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 13 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A REAGENCIÍ 14 - ÚČINNOST TESTU 15 - LITERATURA 2

3 1 - POUŽITÍ MONOLISA HBe Ag-Ab PLUS se používá ke kvalitativnímu stanovení antigenu hepatitidy B (HBe Ag) nebo protilátky proti antigenu hepatitidy B (Anti-HBe) v lidském séru nebo plazmě enzymovou imunoanalýzou. 2 - KLINICKÝ VÝZNAM Přítomnost HBe Ag obecně odráží aktivní virovou replikaci a indikuje infekční stav vzorku séra. HBe Ag se objevuje v časném stádiu infekce hepatitidou B a jeho přetrvávání (déle než měsíc) je známkou zvýšeného rizika chorobných změn jater způsobených replikací viru. Výskyt protilátky proti HBe Ag ukazuje sníženou virovou replikaci a obecně představuje dobrou klinickou prognózu. 3 - PRINCIP TESTU a) Stanovení antigenu HBe Detekce HBe Ag je založená na dvoustupňové sendvičové enzymové imunoanalýze s použitím lidské protilátky anti-hbe a páru peroxidázou značených myších monoklonálních protilátek anti-hbe (mab1 a mab2) proti různým epitopům. Pevná fáze sestává z 8 polystyrénových jamkových stripů potažených lidskou protilátkou anti HBe. Test sestává z následujících kroků: 1. Inkubace kontrolních a neznámých vzorků s protilátkou anti HBe nanesenou na pevné fázi. 2. Promytí, inkubace imobilizovaných komplexů s monoklonálními peroxidázou značenými protilátkami. 3. Eliminace volného konjugátu vymytím, pak vznik enzymové aktivity vázané na pevnou fázi s přidaným substrátem. 4. Zastavení reakce vyvíjející zbarvení, odečtení absorbance při vlnové délce 450/620 nm a interpretace výsledků. b) Stanovení protilátek anti-hbe Pro detekci anti HBe se používá stejná pevná fáze jako pro HBe Ag. Test je založen na kompetici mezi imobilizovanou protilátkou a protilátkou přítomnou ve vzorku, pro omezené množství HBe Ag použité jako neutralizační činidlo. Detekce je pak dosaženo dalším smícháním s monoklonálními peroxidázou značenými protilátkami (mab1 a mab2). Test sestává z následujících kroků: 1. Inkubace kontrolních a neznámých vzorků s protilátkou anti HBe nanesenou na pevné fázi, a neutralizačního činidla. 2. Promytí, inkubace imobilizovaných komplexů s monoklonálními peroxidázou značenými protilátkami. 3. Eliminace volného konjugátu vymytím, pak vznik enzymové aktivity vázané na pevnou fázi s přidaným substrátem. 4. Zastavení reakce vyvíjející zbarvení, odečtení absorbance při vlnové délce 450/620 nm a interpretace výsledků. 3

4 4 - SLOŽENÍ SOUPRAVY Všechna činidla jsou určena výhradně pro diagnostiku in vitro. Činidla se dodávají v množství dostatečném pro 2 x 96 stanovení v 1 až 12 nezávislých stanoveních a podle následujících kombinací: buď 96 stanovení HBe Ag a 96 stanovení anti-hbe nebo 2 x 48 stanovení HBe Ag a současně 2 x 48 stanovení anti-hbe. OZNAČENÍ SLOŽENÍ ČINIDLA PREZENTACE R1 MIKRODESTIČKA: 12 x 8 mikrojamkových stripů potažených lidskými protilátkami anti-hbe z HBs Ag pozitivní plazmy, inaktivované R2 KONCENTROVANÝ PROMÝVACÍ ROZTOK (10 x) Tris pufr NaCI, ph 7,4 R3 R4 R5 R6 R7a R7b R8 R9 R10 Konzervační látka: ProClin 300 (0,04%) NEGATIVNÍ KONTROLA společná pro HBe Ag a anti-hbe test Lidské sérum, negativní pro HBs Ag, anti-hiv1, anti-hiv2 a protilátky anti-hcv Konzervační látka: 0,1 % azid sodný POZITIVNÍ KONTROLNÍ SÉRUM HBe Ab Defibrinovaná lidská plazma anti-hbe pozitivní, potenciálně HBs Ag pozitivní a negativní pro protilátky anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv, inaktivovaná. Konzervační látka: 0,1 % azid sodný POZITIVNÍ KONTROLNÍ SÉRUM HBe Ag Defibrinovaná lidská plazma HBe Ag a HBs Ag pozitivní, negativní pro anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv, inaktivovaná. Konzervační látka: 0,1 % azid sodný NEUTRALIZAČNÍ HBe ANTIGEN Defibrinovaná lidská plazma HBe Ag a HBs Ag pozitivní, negativní pro protilátky anti-hiv1, anti-hiv2 a anti-hcv, inaktivovaná. Konzervační látka: 0,1 % azid sodný KONCENTROVANÝ ANTI-HBe TESTOVACÍ KONJUGÁT (5X) Pár anti-hbe monoklonálních protilátek (mab1 a mab2)* značený peroxidázou. KONCENTROVANÝ Ag HBe KONJUGÁT (5X) Pár anti-hbe monoklonálních protilátek (mab1 a mab2)* značený peroxidázou. PEROXIDÁZOVÝ SUBSTRÁTOVÝ PUFR Kyselina citrónová a roztok octanu sodného o ph 4,0 obsahující H2O2 (0,015 % ) a DMSO (4 %). CHROMOGEN Roztok obsahující tetramethylbenzidin (TMB). ZASTAVOVACÍ ČINIDLO 1 N kyselina sírová PRÁZDNÁ LAHVIČKA NA NAŘEDĚNÝ ROZTOK R2 * Poměr mab 1/mab 2 je jiný pro konjugáty R7a a R7b. Vzájemně nezaměňujte 2 konjugáty. 5 - POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Destilovaná nebo zcela deionizovaná voda. Chlornan sodný (domácí bělidlo) a bikarbonát sodný. Absorpční papír. Jednorázové rukavice. Jednorázové polystyrénové zkumavky (12 x 75 mm). 2 destičky 235 ml 8 ml 1,5 ml 1,5 ml 8 ml 3 ml 3 ml 60 ml 5 ml 28 ml 25 ml 4

5 Manuální nebo poloautomatické, nastavitelné nebo předem nastavené pipety, které jsou schopny odměřovat a rozplňovat objemy 50 μl, 100 μl, 200 μl a 1 ml. Odměrné válce: 10 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml. Míchačka typu vortex. Nádoby na biologicky nebezpečný odpad. Manuální, poloautomatická nebo automatická promývačka mikrodestiček*. Vodní lázeň termostatem nastavená na teplotu 40 ± 1 C nebo ekvivalentní inkubátor na ohřev destiček*. Čtečka mikrodestiček vybavená filtry 450 a 620 nm*. (*) Detaily ohledně doporučeného zařízení poskytne naše technické oddělení. 6 - UPOZORNĚNÍ Spolehlivost výsledků závisí na dodržování následující správné laboratorní praxe: Během testu nemíchejte činidla různých šarží. POZNÁMKA: Pro promývací roztok (R2, označení štítku: 20x, zelené barvy), substrátový pufr peroxidázy (R8, označení štítku: TMB pufr, modré barvy), chromogen (R9, označení štítku: TMB 11x, purpurové barvy) a zastavovací roztok (R10, označení štítku: 1N, červené barvy), je možné použít při testu také z jiné šarže soupravy, za předpokladu, že se během konkrétního testu použije stejná šarže příslušného činidla. Tato činidla lze použít také s některými dalšími produkty naší společnosti. Navíc, promývací roztok (R2, označení štítku: 20X zelené barvy) může být míchán se dvěma dalšími promývacími roztoky z různých souprav Bio-Rad (R2,označení štítku:10x modré barvy nebo 10X oranžové barvy) jsou-li náležitě připraveny a za předpokladu, že během jednoho běhu bude použita pouze jedna směs roztoků. Ohledně podrobných informací kontaktujte naše technické oddělení. Název testu, spolu se specifickým identifikačním číslem testu, jsou uvedené na rámečku každé mikrotitrační destičky. Toto specifické identifikační číslo je rovněž uvedeno na každém stripu. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS: Specifické identifikační číslo = 56. Před každým použitím zkontrolujte specifické identifikační číslo. Pokud identifikační číslo chybí nebo se liší od výše uvedeného čísla, strip se nesmí použít. Činidla nepoužívejte po uplynutí doby exspirace. Před použitím je třeba počkat 30 minut, aby se činidla stabilizovala na pokojovou teplotu, respektive jednu hodinu u naředěného promývacího pufru R2. Činidla opatrně rozpusťte a zamezte kontaminaci. Test neprovádějte za přítomnosti reaktivních par (kyselina, alkálie, páry aldehydů) nebo prachu, které mohou pozměnit enzymovou aktivitu konjugátů. Skleněné nádobí používejte důkladně vyčištěné a opláchnuté deionizovanou vodou, nebo použijte spíše materiál na jedno použití. Nedovolte, aby mikrodestička vyschla v období mezi ukončením promývání a distribucí činidla. U každého vzorku používejte novou pipetovací špičku. Důkladné promytí je kritickým krokem tohoto postupu: Respektujte doporučený počet promývacích cyklů a zajistěte, aby se všechny jamky zcela zaplnily a poté zcela vyprázdnily. Nesprávné promytí může vést k nepřesným výsledkům. K distribuci konjugátu a vyvíjecího roztoku nikdy nepoužívejte stejnou nádobu. Zkontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a dalšího zařízení. Neměňte postup testu. Vyvíjecí roztok (substrátový pufr + chromogen) musí být růžově zbarvený. Změna této růžové barvy do několika minut po rozpuštění znamená, že činidlo nelze použít a musí se vyměnit. Přípravu vyvíjecího roztoku lze provádět v čistém jednorázovém plastovém podnosu (misce) nebo ve skleněné nádobě, která byla nejdříve opláchnuta v roztoku 1N HCl a poté důkladně propláchnuta destilovanou vodou, a následně vysušena. Toto činidlo je třeba uchovávat v temnu. 7 - OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny výhradně pro diagnostické použití in vitro. Během manipulace s reagenciemi a vzorky používejte ochranné rukavice určené pro jedno použití. Po ukončení práce si důkladně umyjte ruce. Nepipetujte ústy. Biologický materiál lidského původu používaný při přípravě činidla R3 (negativní kontrola) byl testován a shledán nereaktivní pro povrchový antigen proti hepatitidě B (HBs Ag), protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2). Biologický materiál lidského původu používaný při přípravě činidla R1 (mikrodestička) byl testován a shledán nereaktivní pro protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti anti-hiv2)a protilátky proti viru hepatitidy typu C. Je reaktivní na povrchový antigen hepatitidy typu B (HBs Ag). Byl fotochemicky inaktivován. 5

6 Biologický materiál lidského původu používaný při přípravě činidla R4 (pozitivní kontrola anti-hbe), R5 (pozitivní kontrola HBe Ag) a R6 (neutralizační HBe Ag), byl testován a shledán nereaktivní pro protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2) a protilátky proti hepatitidě C (anti-hcv). R5 a R6 byly shledány reaktivní pro povrchový antigen proti hepatitidě B (HBs Ag), R4 je potenciálně reaktivní pro HBs Ag. Byl fotochemicky inaktivován. Protože žádná testovací metoda nemůže nabídnout úplnou záruku nepřítomnosti infekčních agens, zacházejte s činidly a vzorky pacientů jako s materiály, které mohou přenášet infekční onemocnění. Každé zařízení, které je v přímém kontaktu se vzorky a činidly, rovněž tak promývací roztoky, je třeba považovat za kontaminované produkty a podle toho se s nimi musí zacházet. Zamezte rozlití vzorků nebo roztoků se vzorky. Rozlité místo je třeba opláchnout 10% bělidlem. Pokud je kontaminovanou kapalinou kyselina, rozlitou látku nutno neutralizovat bikarbonátem sodným a vysušit savým papírem. Materiál používaný na čištění se musí zlikvidovat v nádobě na kontaminované zbytky. Vzorky a činidla lidského původu, včetně kontaminovaných materiálů a produktů, se musí po dekontaminaci zlikvidovat: - buď ponořením do bělící lázně o finální koncentraci 5 % chlornanu sodného (1 objemové množství bělidla na 10 objemových množství kontaminované tekutiny nebo vody) na dobu 30 minut - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu minimálně 2 hodin. Autoklávování je nejlepší metodou pro inaktivaci virů HIV a HBV. DO AUTOKLÁVU NEVKLÁDEJTE ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ Před vylitím do odpadu nezapomeňte zneutralizovat a/nebo autoklávovat roztoky nebo promývací odpad nebo kapalinu obsahující biologické vzorky. Bezpečnostní list je k dispozici na požádání. Manipulace a likvidace odpadů se musí provádět v souladu se správnou laboratorní praxí. Zamezte kontaktu substrátového pufru, chromogenu a zastavovacího roztoku s kůží a sliznicí (toxicita, podráždění nebo riziko popálení). Azid sodný je obsažený v několika komponentech soupravy jako konzervační látka. Je známo, že azid sodný vytváří azidy olova nebo mědi při kontaktu s laboratorními armaturami. Tyto azidy jsou výbušné. Pro zabránění nahromadění azidů v armaturách, armatury propláchněte velkým množstvím vody, pokud se roztoky obsahující azid po inaktivaci likvidují vyléváním do odpadů. Některé reagencie obsahují ProClin 300 (0,04 %, 0,1 % a/nebo 0,5 %). Xi: Dráždivý R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. S28-37: Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody. Používejte vhodné ochranné rukavice. 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ POZNÁMKA: Před použitím ponechte reagencie ohřát na laboratorní teplotu (18-30 C). Mikrodestička (R1) Každý rámeček obsahující 12 stripů je uzavřen v zataveném plastovém sáčku. Nůžkami odstřihněte nebo skalpelem odřízněte zatavenou část 0,5 až 1 cm nad uzávěrem. Otevřete sáček a vyjměte rámeček se stripy. Nepoužité stripy vraťte zpět do sáčku. Pečlivě uzavřete sáček a vraťte zpět do lednice (+2-8 C). Promývací roztok (20X): R2 V destilované vodě nařeďte roztok v poměru 1:20. Zamíchejte. Pro jeden strip je třeba k použití připravit 75 ml promývacího roztoku. Koncentrovaný konjugát Anti HBe (R7a) Nařeďte R7a v poměru 1: 5 s připraveným roztokem R2 podle počtu použitých stripů: Počet použitých stripů Objem R7a (ml) Doplnit s připraveným R2 na (ml) 1 0, , , , , , , , , ,4 12 6

7 Zamíchejte. Konjugát R7a lze použít i tak jak je, tj. bez předchozího naředění, dodržením navrženého postupu: 80 µl naředěného promývacího roztoku (R2) přidejte do 20 µl konjugátu anti-hbe R7a. Zamíchejte. Koncentrovaný Ag HBe konjugátový test (R7b) Použijte stejný protokol jako pro konjugát R7a. Roztok pro vývoj zbarvení (R8 + R9) Nařeďte činidlo (R9) v poměru 1:11 použitím činidla R8 (například: 1 ml činidla R9 v 10 ml činidla R8). Homogenizujte. Objem 10 ml vystačí na 1 až 10 stripů. 9 - PODMÍNKY UCHOVÁVÁNÍ A SKLADOVATELNOST Soupravu uchovávejte při teplotě +2-8 C. Při této teplotě jsou všechny reagencie stabilní až do data exspirace, vyznačeném na obalu soupravy (s výjimkou zvláštních pokynů). R1: Po rozbalení vakuového balení jsou stripy mikrotitrační destičky použitelné po dobu 1 měsíce, jestliže jsou znovu pečlivě zabaleny a uloženy při +2-8 C. R2: Naředěný promývací roztok může být uchován při C po dobu 2 týdnů. Koncentrovaný promývací roztok (R2) může být skladován při teplotě C. R7a: Naředěný konjugát pro anti-hbe test může být skladován 8 hodin při pokojové teplotě (18-30 C). Naředěný konjugát musí být chráněn před světlem při pokojové teplotě (18-30 C). R7b: Naředěný konjugát pro HBe Ag test může být skladován 8 hodin při pokojové teplotě (18-30 C). Naředěný konjugát musí být chráněn před světlem při pokojové teplotě (18-30 C). R8+R9: Připravená reagencie uložená ve tmě je použitelná po dobu 6 hodin od přípravy při uchovávání za pokojové teploty (18-30 C) VZORKY Odeberte krevní vzorek v souladu s obvyklou praxí. Test je třeba provést na nezředěném séru nebo plazmě (odebrané v antikoagulans obsahující EDTA, citrát, ACD). Extrakci proveďte co nejdříve, aby nedošlo k hemolýze. Vzorky obsahující komplexy je nutno před testováním vyčistit odstředěním. Nerozpuštěné fibrinové komplexy nebo částice mohou vytvářet falešně pozitivní výsledky. Vzorky je třeba uchovávat při teplotě +2-8 C, pokud se screening provedl během 7 dní nebo hluboce zmrazené při teplotě -20 C. Zabraňte opakovanému zmrazení a rozmrazení. Pokud je vzorky třeba přepravovat, zabalte je v souladu s pokyny na přepravu etiologických agens, pokud možno ve zmrazeném stavu. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, HYPERLIPEMICKÁ NEBO HYPERHEMOLIZOVANÁ SÉRA. POZNÁMKA: Vzorky obsahující do 100 mg/l bilirubinu, lipemické vzorky obsahující do 36 g/l trioleinu a hemolyzované vzorky obsahující do 2,5 mg/ml hemoglobinu neovlivňují výsledky. Poměrný stupeň byl pozorován u negativních vzorků obsahujících 45 mg/ml albuminu PRACOVNÍ POSTUP V případě současných testovacích postupů anti-hbe a HBe Ag na stejné destičce postupujte podle navrženého způsobu: Test anti-hbe: řady 1 až 6 Test HBe Ag: řady 7 až 12 a) Postup testu anti-hbe 1. Připravte si promývací roztok. 2. Vezměte jeden nebo několik stripů a vyjměte rámeček z ochranného obalu. Nepoužité stripy vraťte do obalu a obal uzavřete. 3. Do každé jamky přeneste následující množství: A1, B1, C1 : 100 µl negativní kontroly (R3) D1 : 100 µl pozitivní kontroly (R4) E1, F1, G1 : 100 µl vzorku V závislosti na použitém systému je možno modifikovat pořadí kontrol nebo pořadí dávkování. Poznámka: Mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující vzorek (žlutý) je jasný rozdíl ve zbarvení. Přítomnost vzorku v jamkách je možné ověřit spektrofotometrickým odečtem při vlnové délce 490 nm (jedna vlnová délka). Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 4. Do jamky neprodleně přidejte 50 µl neutralizačního antigenu HBe (R6). Zamíchejte Přikryjte adhezívním fólií a inkubujte 3 hodiny ± 10 minut při teplotě 37 C ± 1 C. Poznámka: Distribuci neutralizačního antigenu HBe (R6), který je růžově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Přítomnost neutralizačního antigenu HBe v jamkách je možné ověřit 7

8 spektrofotometrickým odečtem při vlnové délce 490 nm (jedna vlnová délka). Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 5. Před dokončením kroku 4 si připravte naředěný roztok konjugátu R7a. 6. Odstraňte adhezívní fólii. Odsajte obsah každé jamky do odpadního zásobníku na biologicky nebezpečnou látku. Poté 4x promyjte. 7. Neprodleně rozplňte 100 µl naředěného roztoku konjugátu R7a (viz část 8: ROZPUŠTĚNÍ ČINIDEL) do každé jamky nebo, konjugát R7a lze použít tak jak je, tj. dodržením navrženého postupu: 80 µl naředěného promývacího roztoku (R2) přidejte do každé jamky, poté přidejte 20 µl konjugátu R7a anti-hbe (5X). Zamíchejte. Přikryjte adhezívním fólií a inkubujte po dobu 30 minut při teplotě 37 C ± 1 C (minimálně 25 minut, maximálně 40 minut). Odstraňte adhezívní fólii, nasajte obsah každé jamky do odpadního zásobníku na biologicky nebezpečnou látku a 5x promyjte. POZNÁMKA: Distribuci naředěného roztoku konjugátu R7a, který je fialově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Přítomnost naředěného roztoku konjugátu R7a v jamkách je možné ověřit spektrofotometrickým odečtem při vlnové délce 620 nm (jedna vlnová délka). Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 8. Těsně před použitím připravte roztok pro vývoj zbarvení (R8 + R9). Viz část 8: REKONSTITUCE ČINIDEL. 9. Do každé jamky neprodleně přeneste 80 µl roztoku pro vývoj zbarvení. Destičku umístěte na 30 minut (± 5 minut) do temna při pokojové teplotě ( C). POZNÁMKA: Distribuci vyvíjecího roztoku, který je růžově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující růžově zbarvený roztok je jasný rozdíl ve zbarvení. Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 10. Do každé jamky neprodleně přidejte 100 µl zastavovacího (fixačního) roztoku (R10). POZNÁMKA: Distribuci roztoku zastavovacího roztoku, který není zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Po přidání zastavovacího roztoku se růžově zbarvený substrát změní na bezbarvý u negativních vzorků a modře zbarvený roztok zůstane žlutý u pozitivních vzorků. 11. Spodek destičky opatrně otřete. Odečet proveďte při optické denzitě při 450/620 nm pomocí čtečky destiček nejméně 4 minuty po přidání zastavovacího roztoku a do 30 minut po zastavení reakce. b) Postup testu HBe Ag 1. Připravte promývací roztok. 2. Vezměte jeden nebo několik stripů a vyjměte podnos z ochranného obalu. Nepoužité stripy vraťte do obalu a obal uzavřete. 3. Do každé jamky přeneste následující množství: A1, B1, C1: 100 µl negativní kontroly (R3) D 1: 100 µl pozitivní kontroly (R5) E1, F1, G1: 100 µl vzorku V závislosti na použitém systému je možno modifikovat pořadí kontrol nebo pořadí dávkování. POZNÁMKA: Mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující vzorek (žlutý) je jasný rozdíl ve zbarvení. Přítomnost vzorku v jamkách je možné ověřit spektrofotometrickým odečtem při 490 nm (jedna vlnová délka). Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 4. Přikryjte adhezívním fólií a inkubujte po dobu 3 hodin ± 10 minut při teplotě 37 C ± 1 C. 5. Před dokončením kroku 4 si připravte roztok konjugátu R7b. 6. Odstraňte adhezívní fólii. Odsajte obsah každé jamky do odpadního zásobníku na biologicky nebezpečnou látku. Poté 4x promyjte. 7. Do každé jamky neprodleně nadávkujte 100 µl naředěného roztoku konjugátu (R7b) nebo lze konjugát R7b použít přímo, tj. dodržením navrženého postupu: 80 µl naředěného promývacího roztoku (R2) přidejte do každé jamky, poté přidejte 20 µl konjugátu R7b anti-hbe (5X). Zamíchejte. Přikryjte adhezívním fólií a inkubujte po dobu 30 minut při teplotě 37 C ± 1 C (minimálně 25 minut, maximálně 40 minut). Odstraňte adhezívní fólii, odsajte obsah každé jamky do odpadního zásobníku na biologicky nebezpečnou látku a 5x promyjte. POZNÁMKA: Distribuci naředěného roztoku konjugátu R7b, který je tyrkysově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Přítomnost naředěného roztoku konjugátu R7a v jamkách je možné ověřit spektrofotometrickým odečtem při vlnové délce 620 nm (jedna vlnová délka). Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 8. Těsně před použitím připravte roztok pro vývoj zbarvení (R8 + R9)(viz část 8: Rekonstituce činidel ). 9. Do každé jamky neprodleně přeneste 80 µl roztoku pro vývoj zbarvení (R8 + R9). Destičku umístěte na 30 minut (± 5 minut) do temna při pokojové teplotě (18 30 C). POZNÁMKA: Distribuci vyvíjecího roztoku, který je růžově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující růžově zbarvený roztok je jasný rozdíl ve zbarvení. Viz část 13: SPEKTROFOTOMETRICKÁ VERIFIKACE PIPETOVÁNÍ VZORKU A ČINIDLA. 8

9 10. Do každé jamky neprodleně přidejte 100 µl zastavovacího roztoku (R10). POZNÁMKA: Distribuci roztoku zastavovacího roztoku, který není zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku manipulace. Po přidání zastavovacího roztoku se růžově zbarvený substrát změní na bezbarvý u negativních vzorků a modře zbarvený roztok změní barvu na žlutou u pozitivních vzorků. 11. Spodek destičky opatrně otřete. Odečtěte optickou denzitu při 450/620 nm pomocí čtečky destiček nejméně 4 minuty po přidání zastavovacího roztoku a do 30 minut po zastavení reakce. c) Současné testovací postupy anti-hbe a HBe Ag (na stejné destičce) Postup je stejný jak byl dříve popsán. Liší se pouze schématem rozplnění vzorku, který je následující: Test Anti HBe: řady 1 až 6 Test Hbe Ag: řady 7 až VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ a) Test anti-hbe 1. Výpočet průměrné absorbance (= optická denzita - OD) v replikátech negativní kontroly: Střední (OD R3) Příklad: Negativní kontrola R3 OD 1 1, , ,552 OD celkem = 4,569 Průměr (OD R3) = OD celkem / 3 = 4,569 / 3 = 1,523 Nelze eliminovat více než jednu hodnotu absorbance R3, pokud se liší od průměrné hodnoty o více než 25 %. Poté přepočítejte průměrnou absorbanci s dalšími dvěma hodnotami. 2. Výpočet hodnoty cut-off Pro každou destičku se hodnota cut-off vypočítá podle následujícího vzorce: hodnota cut-off = průměr (OD R3) x 0,4 Příklad: Průměr (OD R3) = 1,523 Hodnota cut-off = 1,523 x 0,4 = 0, Validace testu pro anti HBe test Průměr (OD R3) > 0,900 OD R4 < 0, Výpočet poměru Pro každý vzorek se poměr vypočítá podle následujícího vzorce: Poměr = OD vzorku/cut-off 5. Interpretace výsledků Vzorky budou považovány za: pozitivní, pokud je hodnota poměru nižší nebo rovna 0,9 (poměr 0,9); negativní, pokud je hodnota poměru vyšší než 1,1 (poměr > 1,1). Pokud však výsledek leží mezi hodnotami 0,9 a 1,1, doporučujeme opakovat postup na zjištění anti-hbe z dalšího odebraného vzorku. Doporučujeme znovu dvojmo otestovat vzorky, které byly na začátku pozitivní. Pokud je po opětovném otestování alespoň jedna hodnota pozitivní, vzorek bude považován za pozitivní. b) Test HBe Ag 1. Výpočet průměrné absorbance ( = optická denzita - OD) v replikátech negativní kontroly: Střední (OD R3) Příklad: Negativní kontrola R3 OD 1 0, , ,026 OD celkem = 0,071 Průměr (OD R3) = OD celkem / 3 = / 3 = Nelze eliminovat více než jednu hodnotu absorbance R3, pokud se liší od průměrné hodnoty o více než 25 %. Poté přepočítejte průměrnou absorbanci s dalšími dvěma hodnotami. 2. Výpočet hodnoty cut-off Pro každou destičku se hodnota cut-off vypočítá podle následujícího vzorce: Hodnota cut-off = průměr (OD R3) x 0,025 Příklad: Průměr (OD R3) = 0,024 Hodnota cut-off = 0, ,025 = 0,049 9

10 3. Validace testu pro test Ag HBe Průměr (OD R3) < 0,060 OD R5 > 0, Výpočet poměru Pro každý vzorek se poměr vypočítá podle následujícího vzorce: Poměr = OD vzorku/cut-off 5. Interpretace výsledků Vzorky budou považovány za: pozitivní, pokud je hodnota poměru vyšší nebo rovna 1 (poměr 1); negativní, pokud je hodnota poměru nižší než 1 (poměr < 1). Doporučujeme znovu dvojmo otestovat zpočátku pozitivní vzorky. Pokud je po opětovném otestování alespoň jedna hodnota pozitivní, vzorek bude považován za pozitivní SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A REAGENCIÍ 1 - Test anti-hbe Přítomnost vzorku a kontroly Přítomnost vzorku a kontroly v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 490 nm. Každá jamka obsahující kontrolní vzorek musí mít OD větší než 0,050. Přítomnost neutralizačního antigenu HBe (R6) Přítomnost neutralizačního antigenu HBe v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 490 nm s výpočtem OD delta. OD delta = (OD490 vzorku (nebo kontroly) s R6) (OD490 vzorku samotného (nebo kontroly)) OD delta musí být větší než 0,150. Přítomnost koncentrovaného testovacího konjugátu anti-hbe (R7a) Přítomnost naředěného konjugátu R7a v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 620 nm. Hodnota OD každé jamky musí být vyšší nebo rovna 0,070 a nižší nebo rovna 0,200. Přítomnost vyvíjecího roztoku (R8 + R9) Přítomnost vyvíjecího roztoku v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 490 nm. Hodnota OD každé jamky musí být větší než 0, Test HBe Ag Přítomnost vzorku a kontroly Přítomnost vzorku a kontroly v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 490 nm. Každá jamka obsahující kontrolu vzorku musí mít OD větší než 0,050. Přítomnost koncentrovaného konjugátu Ag HBe (R7b) Přítomnost naředěného konjugátu R7b v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 620 nm. Hodnota OD každé jamky musí být větší než 0,210. Přítomnost vyvíjecího roztoku (R8 + R9) Přítomnost vyvíjecího roztoku v jamkách lze ověřit automatickým odečtem při vlnové délce 490 nm. Hodnota OD každé jamky musí být větší než 0, ÚČINNOST TESTU Níže sumarizované účinnosti testu Monolisa HBe Ag-Ab PLUS byly vyhodnoceny na 2 místech při použití vzorků od dárců krve, pacientů a sérokonverzních panelů. 1 - Test HBe Ag Specificita Zjištěná specificita u celkem 200 náhodně vybraných dárců krve byla 100 % [98, %], (IC95). Navíc byla specificita vyhodnocena u vzorků pacientů a zjištěna 100 % [99, %] (IC95, 416/416 vzorků). Analýza 195 pacientů s různými patologickými stavy nebo stavy nesouvisejícími s hepatitidou B (těhotné ženy, revmatoidní faktor, anti-nukleární protilátky, anti-.myší Ig nebo jiné virové nebo bakteriální infekce) vykázaly specificitu 99,49 % [97,18 99,99 %] (IC 95, 194/195 negativní zjištěné vzorky). Analytická senzitivita Limit senzitivity testu byl odhadnut na 0,64 IU/ml [0,49 0,84] (IC 95) během vyhodnocení použitím PEI standardu. Senzitivita Senzitivita byla testována u 203 pozitivních vzorků od sledovaných pacientů s chronickou infekci HBV a komerčních séroverzních panelů. Zjištěná senzitivita u těchto vzorků byla 99,51 % [97,29 99,99 %] (IC 95, 202/203 vzorků). Reprodukovatelnost testu Reprodukovatelnost testu Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (HBe Ag) byla určena analýzou 4 vzorků: 1 negativní vzorek, 1 nízko pozitivní vzorek HBe Ag, 1 vysoce pozitivní vzorek HBe Ag a 1 středně pozitivní vzorek HBe Ag. 10

11 Reprodukovatelnost "intra-assay" byla vyhodnocena testováním těchto 4 vzorků 30x ve stejném cyklu; reprodukovatelnost "inter-assay" byla vyhodnocena testováním těchto 4 vzorků dvojmo během 20 dní rychlostí 2 testy za den. Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách: Tabulka 1: Reprodukovatelnost testu intra-assay n = 30 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 střed poměrů ,29 27,24 45,56 standardní odchylka (SD) 0,05 0,35 0,63 2,88 CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 Tabulka 2: Reprodukovatelnost testu inter-assay n = 80 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 střed poměrů 0,51 8,19 27,33 46,35 standardní odchylka (SD) 0,12 1,17 3,26 4,98 CV (%) 23,86 14,27 11,92 10, Test HBe Ab (anti-hbe) Specificita Zjištěná specificita u celkem 200 náhodně vybraných dárců krve byla 100 % [98, %], (IC95). Navíc byla specificita vyhodnocena u vzorků 206 pacientů a zjištěna 98,54% [95,80 99,70 %], IC95 (203/206). U 198 testovaných pacientů se vykázaly různé patologie nebo stavy, které nejsou spojovány s hepatitidou B (těhotné ženy, revmatoidní faktor, anti-nukleární protilátky, anti-myší Ig nebo jiné virové nebo bakteriální infekce). 3 vzorky byly pozitivní (2 HCV vzorky a 1 vzorek s revmatoidním faktorem). Zjištěná specificita u této populace byla 98,48 % [95,64 99,69 %] (IC 95, 195/198 negativní vzorky). Tyto vzorky byly opětovně testovány; revmatoidní faktor byl opakovaně shledán reaktivním. Dva vzorky HCV byly shledány buď negativní nebo sporné (neurčité). Senzitivita Studie senzitivity byly provedeny u 220 pozitivních vzorků od sledovaných pacientů s chronickou infekci HBV a komerčních panelů. Zjištěná senzitivita byla 98,64 % [96,07 99,72 %] (IC 95, 217/220 vzorků). Reprodukovatelnost testu Reprodukovatelnost testu Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (anti-hbe Ac) byla určena analýzou 4 vzorků: 1 negativní vzorek, 1 nízko pozitivní vzorek HBe Ac, 1 vysoce pozitivní vzorek HBe Ac a 1 středně pozitivní vzorek HBe Ac. Reprodukovatelnost "intra-assay" byla vyhodnocena testováním těchto 4 vzorků 30x ve stejném cyklu; reprodukovatelnost "inter-assay" byla vyhodnocena testováním těchto 4 vzorků dvojmo během 20 dní rychlostí 2 testy za den. Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách: Tabulka 1: Reprodukovatelnost testu intra-assay n = 30 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 střed poměrů 3,15 0,69 0,42 0,03 standardní odchylka (SD) 0,05 0,04 0,04 0,00 CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 Tabulka 2: Reprodukovatelnost testu inter-assay n = 80 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 střed poměrů 2,39 0,81 0,59 0,3 standardní odchylka (SD) 0,23 0,077 0,09 0,01 CV (%) 9,6 9,5 14,5 39,3 11

12 15 - LITERATURA 1. MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L ADN du virus de l hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l antigène HBe et l anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1);

13 /2009 code: