UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Vyuţití HPLC ve farmaceutické analýze

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie Vyuţití HPLC ve farmaceutické analýze Diplomová práce Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. vedoucí katedry PharmDr. Ludmila Matysová, Ph.D. vedoucí diplomové práce Hradec Králové 2010 Lucie Bajcurová

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Lucie Bajcurová

3 Děkuji PharmDr. Ludmile Matysové, Ph.D. za její odborné vedení a pomoc při vypracování této diplomové práce. Děkuji všem pracovníkům katedry analytické chemie za ochotu a odbornou a technickou podporu při řešení dané problematiky.

4 Abstrakt Byla vyvinuta HPLC metoda pro stanovení ketoprofenu v léčivých přípravcích PRONTOFLEX 10% koţní sprej, roztok a Ketonal 5% krém. Při vývoji se vycházelo z jiţ vyvinuté a validované metody pro analýzu přípravku KETOPROFEN gel 2,5%, která byla vytvořena na stejném pracovišti. Optimální chromatografické podmínky byly: kolona SUPELCO Discovery C18 (125 mm x 4,6 mm, 5 µm), mobilní fáze acetonitril : voda : fosforečnanový pufr 3,5 (40:58:2, v/v/v), rychlost průtoku mobilní fáze 1,0 ml/min, dávkovaný objem 10 µl, UV detekce při vlnové délce 233 nm. Celkový čas analýzy byl pod 10 minut. Jako vnitřní standard byl uţit ethylparaben.

5 Abstract The HPLC method for determination of ketoprofen in therapeutic preparations PRONTOFLEX a 10% skin spray and Ketonal a 5% cream has been developed. This method was based on already developed and validated method for analyzing the preparation KETOPROFEN a 2.5% gel. Both of the methods have been developed in the same department. The chromatographic separation was performed on SUPELCO Discovery C18 column (125 mm x 4.6 mm, 5 µm). The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile, water and a phosphate buffer ph 3.5 (40:58:2, v/v/v). At a mobile phase flow rate of 1.0 ml/min, injection volume of 10 μl and UV detection at a wavelength of 233 nm, the total time of analysis was less than 10 minutes. Ethylparaben was used as an internal standard.

6 Obsah 1 ÚVOD ÚVOD A CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST HPLC VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) PRINCIP METODY VYUŢITÍ HPLC V ANALÝZE LÉČIV TYPY HPLC HPLC s normálními fázemi (NP HPLC) HPLC s obrácenými fázemi (RP HPLC, RPLC) Iontově výměnná chromatografie (IEX) Vylučovací chromatografie (SEC) ZÁKLADNÍ POJMY V HPLC Chromatogram Faktor symetrie Retenční čas Mrtvý retenční čas Retenční objem Mrtvý objem Retenční faktor (kapacitní faktor, hmotnostní distribuční poměr) Citlivost Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater Rozlišení Isokratická eluce Gradientová eluce Metoda vnějšího standardu Metoda vnitřního standardu KAPALINOVÝ CHROMATOGRAF... 23

7 Zásobníky Čerpadlo Dávkovač (injektor) Kolona Stacionární fáze Detektor FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ ANALÝZU Kolona a stacionární fáze Velikost a tvar částic Povrch a póry Délka kolony Vliv teploty Nástřik vzorku na kolonu Předkolona Mobilní fáze Organická rozpouštědla Acetonitril vs. Methanol ph a pufry Viskozita mobilní fáze Rychlost průtoku mobilní fáze VALIDACE VALIDAČNÍ PARAMETRY Správnost Přesnost Selektivita, specificita Detekční limit (LOD) Kvantitativní limit (LOQ) Linearita Rozsah Robustnost TEST VHODNOSTI SYSTÉMU (TEST ZPŮSOBILOSTI, SST) KETOPROFEN CHEMICKÉ A FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI... 32

8 2.3.2 FARMAKOLOGICKÉ VLASTNOSTI PARABENY METHYLPARABEN Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti ETHYLPARABEN Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti PROPYLPARABEN Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti METODY HODNOCENÍ KETOPROFENU LÉKOPISNÉ METODY JINÉ HPLC METODY OSTATNÍ METODY ZPŮSOBY PŘÍPRAVY VZORKŮ SPREJ KRÉM ZHODNOCENÍ REŠERŠE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ CHEMIKÁLIE A VZORKY CHEMIKÁLIE VZORKY PŘÍPRAVA ROZTOKŮ PŘÍPRAVA VZORKŮ SPREJ KRÉM STANOVENÍ OBSAHU KETOPROFENU A KONZERVAČNÍCH LÁTEK VÝSLEDKY A DISKUSE METODA MOBILNÍ FÁZE... 55

9 4.2 SPREJ KRÉM VLIV DÉLKY KOLONY NA ANALÝZU VLIV VELIKOSTI NÁSTŘIKU SHRNUTÍ A ZÁVĚR SHRNUTÍ A ZÁVĚR PRONTOFLEX 10% KOŢNÍ SPREJ, ROZTOK KETONAL 5% KRÉM POUŢITÉ ZDROJE... 78

10 Seznam zkratek ACN CE CRL ČL EP FIA GC HPLC IEX IUPAC KP LOD LOQ MEKC MeOH MF MP NP PP RP SEC SF SST USP UV/VIS acetonitril kapilární elektroforéza chemická referenční látka Český lékopis ethylparaben Flow Injection Analysis průtoková injekční analýza Gas Chromatography plynová chromatografie High Performance Liquid Chromatography vysokoúčinná kapalinová chromatografie iontově výměnná chromatografie The International Union of Pure and Applied Chemistry ketoprofen limit of detection limit of quantitation micelární elektrokinetická chromatografie methanol mobilní fáze methylparaben Normal-Phase propylparaben Reversed-Phase (systém obrácených fází) Size-Exclusion Chromatography vylučovací chromatografie stacionární fáze System Suitability Test test vhodnosti systému United States Pharmacopoeia Ultra Violet (ultrafialová/viditelná oblast spektra)

11 1 ÚVOD 11

12 1.1 Úvod a cíl práce Hlavním cílem farmacie je zabezpečit kvalitní, účinný a bezpečný léčivý přípravek v poţadovaném mnoţství, v potřebný okamţik, pro potřebného pacienta a s potřebnými informacemi. Důleţitým předpokladem pro zajištění kvality, účinnosti a bezpečnosti léčivých přípravků je jejich hodnocení vhodnou analytickou metodou. V dnešní době zaujímá ve farmaceutické analýze přední místo mezi analytickými metodami HPLC, zejména pak HPLC s obrácenými fázemi. Díky řadě předností můţe být tato metoda aplikována na většinu analyzovaných vzorků. Důleţité je při hodnocení léčivých přípravků zjistit, jaké látky a v jakém mnoţství jsou v přípravku obsaţeny. Z toho lze usuzovat, zda léčivý přípravek obsahuje deklarovaná mnoţství uváděných léčivých nebo pomocných látek a zda neobsahuje nečistoty, které mohou svědčit o kontaminaci nebo nestabilitě léčivého přípravku. Cílem této práce je nalézt vhodnou metodu pro stanovení obsahu ketoprofenu v léčivých přípravcích PRONTOFLEX 10% koţní sprej, roztok a Ketonal 5% krém. Metodu bude moţné po validaci pouţít pro kontrolně-analytické hodnocení těchto léčivých přípravků. 12

13 2 TEORETICKÁ ČÁST 13

14 2.1 HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) V současnosti je HPLC jednou z nejprogresivnějších analytických metod. Nachází uplatnění ve všech oblastech analýzy léčiv a v řadě lékopisných monografiích [1]. Jedná se o vysoce účinnou separační metodu, která slouţí k oddělení analyzovaných sloţek směsi a zároveň k jejich kvalitativnímu i kvantitativnímu hodnocení [2]. Mezi hlavní přednosti této metody patří rychlost analýzy, citlivost stanovení v závislosti na pouţitém detektoru, moţnost automatizace a to, ţe analýzu lze provést s minimálním mnoţstvím vzorku [1]. Tato metoda také odstraňuje hlavní nedostatek plynové chromatografie tím, ţe umoţňuje analýzu tepelně nestálých nebo netěkavých látek a polymerů [2]. Z HPLC záznamu chromatogramu lze získat informace o identitě, obsahu a čistotě analyzovaného léčiva [3] Princip metody Principem této separační metody je mnohonásobné ustavování dynamické rovnováhy součástí analyzované směsi mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Stacionární (nepohyblivá) fáze různou měrou zadrţuje jednotlivé součásti analyzované směsi a mobilní (pohyblivá) fáze pak tyto jednotlivé součásti směsi vymývá (eluuje) z nepohyblivé fáze a odnáší je ve směru toku různou rychlostí, čímţ dojde k jejich oddělení. Separační účinnost kapalinové kolonové chromatografie závisí na velikosti částic stacionární fáze. Čím menší a stejnoměrnější jsou jednotlivé částice stacionární fáze, tím větší je účinná plocha a separační účinnost. Dostatečně rychlý průtok mobilní fáze je zajišťován jejím protlačením kolonou pomocí čerpadla pod vysokým tlakem [2]. 14

15 2.1.3 Vyuţití HPLC v analýze léčiv Díky svým přednostem je HPLC vyuţívána především pro kontrolně-analytické hodnocení léčivých přípravků pro identifikaci léčiv, stanovení obsahu a čistoty. Dále je tato metoda vyuţívána k hodnocení stability léčiv, k analýze přírodních léčiv v rostlinném materiálu nebo pro monitorování léčiv a jejich metabolitů v tělních tekutinách [1] [3] Typy HPLC Existuje mnoho způsobů, jak klasifikovat HPLC. Na základě působení molekulárních sil rozlišujeme čtyři hlavní typy HPLC: NP (Normal-Phase Chromatography), RP (Reversed-Phase Chromatography), IEX (Ion-Exchange Chromatography) a SEC (Size-Exclusion Chromatography) [4] HPLC s normálními fázemi (NP HPLC) NP HPLC je zaloţena na polárních interakcích. Jedná se o kompetitivní proces, kdy molekuly analytu soutěţí s molekulami mobilní fáze o adsorpční místa na povrchu stacionární fáze. Čím silnější je interakce mezi analytem a stacionární fází, tím pomaleji analyt v chromatografickém systému postupuje [4]. IUPAC Compendium of Chemical Technology definuje Normal-Phase jako proces vymývání, ve kterém je stacionární fáze více polární neţ mobilní fáze [6]. Stacionární fázi v tomto systému představují hydrofilní, polární materiály. Povrch této fáze je pokryt velkým mnoţstvím OH skupin. Mobilní fáze je tvořena nepolárními rozpouštědly [4] HPLC s obrácenými fázemi (RP HPLC, RPLC) RP HPLC je v současné době jedním z nejpopulárnějších typů kapalinové chromatografie. Aţ 90 % všech analýz vzorků s malou molekulovou hmotností se uskutečňuje právě pomocí této metody [4]. Jedná se o systém obrácených fází, který je vhodný k dělení méně polárních látek [2]. 15

16 RP HPLC je zaloţena na hydrofobních, disperzních (Van der Waals) silách, které patří k nejslabším molekulárním interakcím [4]. Dle IUPAC je Reversed-Phase definovaná jako proces vymývání, kdy mobilní fáze je podstatně více polární neţ stacionární fáze [6]. Polarita fází je zde oproti NP HPLC opačná. Povrch stacionární fáze je hydrofobní, nepolární. Mobilní fázi tvoří hydrofilní rozpouštědlo [4] Iontově výměnná chromatografie (IEX) Iontově výměnná chromatografie je zaloţena na iontových interakcích. Zadrţení analytu a selektivita této metody silně závisí na ph a iontové síle mobilní fáze [4]. Stacionární fází jsou zde iontoměniče (anexy a katexy) a dělit je moţné elektrolyty schopné existence v iontové formě [2] Vylučovací chromatografie (SEC) Z historického hlediska existují pro tuto metodu další dva odlišné názvy: gel- -filtration chromatography (GFC) a gel-permeation chromatography (GPC). Jedná se o metodu separace molekul podle jejich velikosti. Hydrodynamický poloměr molekuly analytu je hlavním faktorem, který určuje její retenci. Obecně vyšší poloměr znamená kratší zadrţení [4]. Princip metody je zaloţen na vynuceném transportu molekul analytu skrz pórovitou stacionární fázi za podmínek, ţe nedochází ke vzájemným interakcím mezi analytem a povrchem stacionární fáze. Menší molekuly pronikají do pórů stacionární fáze a jejich pohyb kolonou je tak zpomalen. Větší molekuly do pórů nevstupují, prostupují okolo částic stacionární fáze a jsou eluovány rychleji [4] Základní pojmy v HPLC Chromatogram Chromatogram je grafický nebo jiný záznam odezvy detektoru ve formě píků [10], ze kterého lze vyčíst údaje pro kvalitativní i kvantitativní analýzu [2]. Kaţdá 16

17 sloţka analytu je na chromatogramu reprezentována samostatným píkem [4]. Ideální chromatogram představují gaussovské píky na základní linii [10]. Pík můţe být definován plochou píku (A) nebo výškou píku (h) a šířkou v poloviční výšce (w h ) nebo výškou píku (h) a šířkou píku mezi body inflexe (w i ). Pro gaussovské píky platí, ţe: w 1, 18 [10] h w i Faktor symetrie Faktor symetrie píku (A s ) nebo téţ faktor chvostování píku je definován jako míra asymetrie píku [8]. Lze vypočítat podle vzorce: A s w0, 05, [10] 2 d kde w 0,05 značí šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky a d vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky [10]. Za ideálních podmínek budou mít píky gaussovský tvar a budou souměrné. Ve skutečnosti však řada píků tzv. chvostuje. Faktor symetrie můţe nabývat různých hodnot [8]. U většiny píků by měly být tyto hodnoty v rozmezí 0,8 1,5 [10]. A s = 1 úplná (ideální) symetrie píku [10] A s > 1 tailing A s < 1 fronting [8] Tailing píku můţe být způsoben adsorpcí nebo jinými silnými interakcemi analytu se stacionární fází. Fronting píku zas můţe být důsledkem přesycení (přetíţení) kolony, chemickou reakcí či izomerizací během chromatografického procesu [8] Retenční čas Retenční čas (t R ) je doba od nástřiku vzorku po maximum daného píku. Tento údaj lze vyčíst z chromatogramu a je základní kvalitativní charakteristikou v HPLC. Právě shoda retenčních časů píků analytu a standardu je nejčastějším důkazem totoţnosti [1]. 17

18 Retenční čas analytu je závislý na rychlosti průtoku mobilní fáze kolonou. Čím rychlejší průtok, tím kratší retenční čas analytu. Důleţitá je proto neměnnost rychlosti průtoku mobilní fáze během analýzy [4]. Retenční čas dále závisí na rozměrech kolony a dalších parametrech [8] Mrtvý retenční čas Mrtvý retenční čas (t 0 ) je retenční doba nezadrţené komponenty [8]. Tato komponenta se v koloně pohybuje stejnou rychlostí jako mobilní fáze [9]. Z chromatogramu lze tento čas odečíst jako dobu od nástřiku po první narušení základní linie způsobené vymýváním nezadrţené komponenty [8]. Mrtvý retenční čas společně s mrtvým objemem kolony jsou velmi důleţitými parametry a jejich správné určení by mohlo být rozhodující pro interpretaci experimentálních výsledků. V současné době je však tato otázka sporná a je předmětem řady diskuzí ve vědecké literatuře. Sporné je především to, jak nalézt nezadrţenou komponentu a jaká jsou kritéria nepřítomnosti retence [4] Retenční objem Retenční objem (V R ) je důleţitou charakteristikou v kvalitativní analýze [2]. Lze ho vyjádřit pomocí vzorce: V R t F, [7] R kde F je rychlost průtoku mobilní fáze a t R retenční čas [7]. Retenční objem analytu je pro popis chování analytu v chromatografickém systému více univerzální, protoţe je méně závislý na instrumentálních parametrech [4] Mrtvý objem Mrtvý objem (V 0 ) je objem kapalné fáze v koloně [4]. Mrtvému objemu kolony přísluší mrtvý retenční čas [9]. V praxi to znamená, ţe i kdyţ analyt nebude interagovat se stacionární fází, bude mu určitou dobu trvat, neţ projde kolonou [4]. 18

19 Retenční faktor (kapacitní faktor, hmotnostní distribuční poměr) Retenční faktor (k) je mírou retence analytu v koloně [9]. Je to bezrozměrné číslo, jehoţ hodnota nezávisí na rychlosti průtoku mobilní fáze ani na rozměrech kolony [4]. Čím větší je jeho hodnota, tím více je analyt v koloně zadrţován a je eluován později [9]. čas. k V V V R 0 R 0, [4] 0 t kde V R je retenční objem, V 0 mrtvý objem, t R retenční čas a t 0 mrtvý retenční t t 0 k = 0 komponenta není zadrţována k > 0 komponenta je zadrţována k > 20 citlivost měření se sniţuje a doba analýzy se prodluţuje [8] Citlivost Citlivost (α) je schopnost chromatografického systému rozlišovat různé komponenty [4]. Lze také říci, ţe se jedná o míru rozlišení zadrţení dvou analytů, která je definována jako poměr retenčních faktorů dvou píků, kde pro dostatečnou separaci dvou vedle sebe leţících píků musí být α > 1 [8]. k k 2 R2 0, [4] 1 t t R1 kde k 1,2 jsou retenční faktory dvou vedle sebe leţících píků, t R1,2 retenční časy dvou vedle sebe leţících píků a t 0 mrtvý retenční čas. Citlivost je závislá na povaze stacionární fáze a na sloţení mobilní fáze [8]. Vliv na citlivost má také analyt a jeho interakce s povrchem stacionární fáze. Citlivost obecně není ovlivněna sloţením eluentu nebo teplotou, pokud tyto parametry neovlivní povahu analytu (solvataci, ionizaci, tautomerizaci atd.) [4]. t t 0 19

20 Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater Účinnost je vlastnost kolony. Analyt je vstříknut na kolonu ve formě velmi malé zóny. Jejím posunem kolonou však dochází k rozšiřování této zóny [4]. Na chromatogramu lze pozorovat závislost šířky píku na retenčním čase. Čím delší retenční čas (t R ), tím větší šířka píku (w). To vše je způsobeno skupinou rozšiřujících efektů působících uvnitř kolony [8]. Účinnost kolony pak lze vyjádřit jako míru těchto efektů [4]. Účinnost kolony je závislá především na kinetických faktorech chromatografického systému: molekulární difúzi, vlastnostech kolony a její náplně, rychlosti průtoku mobilní fáze atd. Účinnost kolony je tím vyšší, čím je náplň kolony homogennější a její částice menší [4]. Účinnost kolony se můţe vypočítat jako zdánlivý počet teoretických pater (N) [10]. Tento termín je kvantitativní mírou účinnosti kolony [8] a je vyjádřen vzorcem: 5 t,54 R N wh, [10] kde t R je retenční čas a w h šířka píku v polovině jeho výšky [10]. Důleţitým parametrem pro výpočet účinnosti kolony je výška patra (H), neboli výškový ekvivalent teoretického patra (HETP), který lze vypočítat podle vzorce: L HETP, [8] N kde L je délka kolony a N je počet teoretických pater. HETP je určen rozměrem částic stacionární fáze, kterou je kolona naplněna a v menší míře rychlostí průtoku a teplotou. Výška teoretického patra je zhruba 2,5krát rozměr částice. Z toho vyplývá, ţe výška patra u kolony naplněné částicemi o rozměru 5 µm bude 12,5 µm. Při srovnání stejně dlouhých kolon o různé velikosti částic dojdeme na základě výše uvedených skutečností k závěru, ţe kolony naplněné menšími částicemi jsou obvykle účinnější [8]. Citlivost a účinnost jsou velmi důleţité chromatografické parametry. Kombinace těchto parametrů umoţňuje celkovou charakterizaci separace konkrétního chromatografického systému. Optimalizací výše uvedených parametrů, buď samostatně nebo současně, lze docílit dostatečné separace jednotlivých sloţek analytu (Obr. 1) [4]. 2 20

21 citace [4] vysoká citlivost nízká citlivost vysoká účinnost nízká účinnost Obr. 1: Vliv citlivosti a účinnosti na separaci Rozlišení Rozlišení (R S ) je míra separace dvou sousedních píků [8] a lze vypočítat dle vzorce: R 1,18 t w t R2 R1 S, kde t R2 > t R1, [10] h1 wh 2 v němţ t R jsou retenční časy nebo vzdálenosti podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmicím spuštěným z vrcholů dvou sousedních píků a w h značí šířky píků v poloviční výšce. Tento vzorec ale nemusí být pouţitelný, nejsou-li píky rozděleny na základní linii [10]. Cílem většiny HPLC analýz je dosaţení rozdělení na základní linii u všech klíčových komponent. Rozlišení větší neţ 1,5 signalizuje dosaţení rozdělení píků na základní linii. Nejideálnější je však rozlišení větší neţ 2,0, coţ umoţňuje přesnější kvantitativní stanovení [8] Isokratická eluce Většina farmaceutických analýz vyuţívá právě isokratickou eluci [8]. Jedná se o vymývání (eluci) jedinou mobilní fází, jejíţ sloţení se během chromatografie nemění. Lze ji uţít při dělení směsi látek, jejichţ eluční parametry se příliš neliší [2]. Tato metoda má určité nevýhody, jako omezenou píkovou kapacitu [8], coţ je maximální počet píků, které jsou během definovaného časového rozpětí dostatečně 21

22 rozlišeny [7], nebo problémy při analýze vzorků obsahující různě polární sloţky ve směsi [8] Gradientová eluce Při gradientové eluci se k jedné mobilní fázi plynule přimíchává rostoucí mnoţství druhé mobilní fáze s větším elučním účinkem, čímţ se vytváří plynulý gradient mobilní fáze (koncentrační, ph gradient). Tento typ eluce se vyuţívá pro optimální dělení sloţek směsi, které se významně liší svými elučními parametry [2]. Nevýhodou této metody jsou větší poţadavky na přístrojové vybavení [8] Metoda vnějšího standardu Metoda vnějšího standardu probíhá ve dvou krocích. Na kolonu se nejprve nastříkne roztok analyzovaného vzorku a teprve po registraci jeho chromatografického záznamu se na kolonu nastříkne roztok vnějšího standardu a registruje se jeho chromatogram. Koncentrace stanovovaných sloţek směsi se poté vypočítá z poměru ploch (výšek) píků jednotlivých stanovovaných látek a plochy píku vnějšího standardu [3]. U substancí se jako vnější standard pouţívá zpravidla standard stanovované látky CRL (chemická referenční látka), u sloţených lékových přípravků je pak jako vnější standard vyuţita jedna z analyzovaných sloţek směsi [3] Metoda vnitřního standardu Metoda vnitřního standardu je zaloţena na přidání definovaného objemu roztoku vhodného vnitřního standardu ke známému objemu vzorku. Směs se po promíchání nastříkne na kolonu. Koncentrace stanovovaných látek se vypočítá z poměru ploch (výšek) píků jednotlivých separovaných sloţek a plochy píku vnitřního standardu [3]. Tato metoda je oproti metodě vnějšího standardu méně časově náročná a je přesnější, jelikoţ není zatíţena chybou dvojího nástřiku na kolonu [3]. Je velmi důleţité zvolit vhodný vnitřní standard. Vnitřní standard nesmí reagovat se zkoušenou látkou, musí být tedy chemicky inertní, musí být chemicky stálý, musí být eluován v blízkosti píků, které budou vyhodnocovány, musí mít podobnou koncentraci 22

23 jako látky, jejichţ obsah je zjišťován a nesmí obsahovat nečistoty s retenčním časem podobným času zkoušené látky [3] [10] Kapalinový chromatograf Kapalinový chromatograf je přístroj, který se skládá z několika součástí. Mezi hlavní součásti patří: zásobníky s rozpouštědly, čerpadlo, dávkovač, kolona, detektor a zařízení pro sběr dat (počítač) [4] Zásobníky Zásobníky musí obsahovat dostatečné mnoţství rozpouštědel pro kontinuální chod celého systému. Mohou být vybaveny systémem pro odplynění a speciálními filtry, které jsou určeny pro omezení vlivů z okolí [4]. Systém pro odplynění je velmi důleţitý, jelikoţ bublinky vzduchu mohou narušit správný chod čerpadla. Můţe docházet k narušení nebo sníţení průtoku nebo k vytvoření tzv. vzduchové uzávěry v čerpadle. Citlivá na odplynění jsou především čerpadla vyuţívající nízkotlaký mísící systém [8] Čerpadlo Čerpadlo (pumpa) poskytuje stálý a nepřetrţitý tok mobilní fáze systémem [4]. Čerpadla lze třídit několika způsoby: podle rozsahu průtoku, podle hnacího mechanismu nebo podle metody mísení. Typická analytická čerpadla by měla mít rozsah průtoku v intervalu 0, ml/min, který je vyhovující pro většinu farmaceutických analýz. Co se týče hnacího mechanismu, většina čerpadel vyuţívá mechanismus pístový, jehoţ nevýhodou jsou rázy, které ale lze utlumit [8]. Nejmodernější čerpadla umoţňují míchání různých rozpouštědel z různých zásobníků [4] buď nízkotlakým nebo vysokotlakým mísícím systémem. Nevýhodou vysokotlakého mísícího systému jsou jeho pořizovací náklady a údrţba [8]. 23

24 Dávkovač (injektor) Dávkovač (injektor) umoţňuje vpravení přesného mnoţství analytické směsi do toku mobilní fáze před vstupem do kolony. Injektor můţe být buď manuální nebo automatizovaný. Ve farmaceutické analýze jsou dnes manuální injektory vyuţívány jen zřídka [4] [8]. Nejmodernějšími injektory jsou autosamplery. Jedná se o automatizované dávkovače, které umoţňují vpravit různé objemy různých vzorků do toku mobilní fáze z ampulek, tzv. vialek. Ty jsou umístěny v zásobníku autosampleru. Autosamplery umoţňují sníţit náklady a zvýšit produktivitu a přesnost. Výhodou autosampleru je moţnost ho naprogramovat [4] [8] Kolona Kolona je srdcem celého HPLC systému. Právě v koloně totiţ dochází k separaci jednotlivých sloţek analytu. Zde dochází ke kontaktu mobilní fáze s fází stacionární [4]. Jedná se o ocelové, skleněné nebo plastové trubice o různé délce a o různém vnitřním průměru naplněné stacionární fází. Náplň kolony musí být naprosto homogenní a rovnoměrná. Kolona je v podstatě prostředek, který drţí stacionární fázi na místě. Na koncích je kolona navrţena tak, aby poskytovala utěsněné spojení s ostatními komponentami systému [2] [4] [10]. Kolony lze rozdělit na tři základní typy: kapilární, monolitické a náplňové [4] Stacionární fáze V HPLC se pouţívá mnoho různých typů stacionárních fází. V HPLC s normálními fázemi se pouţívá zejména oxid křemičitý, oxid hlinitý nebo porézní grafit. V HPLC s obrácenými fázemi se uţívají především chemicky modifikované nosiče připravené z oxidu křemičitého, polymerů nebo porézního grafitu. V iontově výměnné chromatografii se pouţívají pryskyřice nebo polymery s kyselými nebo zásaditými skupinami a ve vylučovací chromatografii se setkáváme s porézním oxidem křemičitým nebo polymery [1] [10]. V posledních letech se jako alternativa oxidu křemičitého začíná pouţívat oxid zirkoničitý, jehoţ výhodou oproti oxidu křemičitému je jeho stabilita v širokém rozsahu ph (1 14) [4]. 24

25 Velmi často se v HPLC vyuţívá tzv. chemicky vázaných stacionárních fází, kdy se na povrch nosiče naváţí vhodnou chemickou reakcí různé radikály. V případě nepolárních chemicky vázaných fází (reverzních) se jedná převáţně o oktadecyl (C 18 ), oktyl (C 8 ) nebo fenyl (C 6 H 5 ). V případě středně polárních fází pak o tříuhlíkaté řetězce zakončené skupinami aminopropyl ( NH 2 ) nebo kyanpropyl ( CN) [1] [10] Detektor Detektor je zařízení umoţňující nepřetrţitý záznam HPLC analýzy [4]. Nejčastěji se jedná o upravený spektrofotometr, který je vybaven malou průtokovou celou (kyvetou o vnitřním objemu 10 µl a menším), který monitoruje koncentraci eluovaného analytu. Bylo zjištěno, ţe detektory zaloţené na registraci absorbance eluátu protékajícího celou jsou při farmaceutických analýzách vyuţívány aţ z 85 %. Nejčastěji se přitom jedná o UV/VIS spektrofotometry nebo o spektrofotometry s diodovým polem neboli Diod array detektor (3D chromatogram) [2] [8]. Na detektory pro HPLC jsou kladeny zvýšené poţadavky. Jedná se především o vysokou citlivost, kdy detektor by měl být schopen detekce látek v roztoku jiţ v koncentracích ng aţ µg/ml, o reprodukovatelnost a linearitu odezvy, o nezávislost odezvy na změně sloţení mobilní fáze při gradientové eluci a o univerzálnost, kdy by detektor měl detekovat všechny oddělené sloţky vzorku [2]. Spoje mezi kolonou, dávkovacím zařízením a detektorem jsou kapilární (vnitřní průměr 0,5 mm), nejčastěji z nerez oceli [2] Faktory ovlivňující analýzu Kolona a stacionární fáze Základem úspěšné separace jsou interakce analytu s povrchem stacionární fáze. Kaţdá stacionární fáze má své specifické parametry, kterými jsou: velikost povrchu, rozměry pórů, tvar a velikost částic, chemická stabilita, reaktivita povrchu a další [4]. Rychlost separace a její kvalita závisí především na délce kolony a velikosti částic [8]. 25

26 Velikost a tvar částic Kolony naplněné pravidelnými kulovitými částicemi mají významně vyšší účinnost, neţ kolony naplněné nepravidelnými částicemi. Nejvýhodnější je úzká distribuce rozměru částic, protoţe velký velikostní rozdíl mezi částicemi sniţuje celkovou účinnost kolony. Jako obecné kritérium proto platí, ţe 95 % všech částic by mělo velikostně spadat do rozmezí 25 % okolo středního rozměru částic. Rozhodující je především přítomnost velmi malých částic, menších neţ 0,5 µm, coţ jsou úlomky z větších rozdrcených částic. Tyto malé částice se v koloně neustále posouvají ve směru toku mobilní fáze a ucpávají výstup z kolony opatřený fritou, čímţ se výrazně sniţuje účinnost kolony, zvyšuje se zpětný tlak a na chromatogramu je tento jev pozorovatelný jako deformace (zborcení) všech píků [4] Povrch a póry Velikost povrchu přímo souvisí s retencí analytu. Obecně lze říci, ţe čím větší povrch, tím větší zadrţení. Rozměry pórů jsou rozhodujícím parametrem pro přístup k povrchu. Velké molekuly nemusejí být schopné pronikat do všech pórů [4]. Povrch stacionární fáze by měl specificky reagovat s různými analyty, ale zároveň by měl být mechanicky a chemicky stálý. Proto je povrch chemicky modifikován [4] Délka kolony Při testování kolon se stejnou náplní o různé délce, bylo zjištěno, ţe rozlišovací schopnost kolony se zvyšuje s její délkou. Dále bylo zjištěno, ţe uţití kratší kolony sniţuje zpětný tlak [8] Vliv teploty Změna teploty, především její zvýšení, je v dnešní době povaţována za nástroj ve vývoji a optimalizaci různých metod. Zvýšení teploty má za následek pokles viskozity, zvýšení účinnosti kolony, redukci zpětného tlaku a také sníţení retence. Při změně teploty do 10 C poklesne retenční čas při isokratické eluci asi o 20 % [8] [9]. Kvůli moţnému vlivu teploty na výsledky analýzy je důleţité termostatování kolony, a to zejména v těchto případech: a) u dlouhých kolon s malým vnitřním průměrem o malé velikosti částic a při větších průtocích, 26

27 b) u rozpouštědel, u nichţ změna teploty má velký vliv na kapacitní poměry, kdy teplota kolony je nejčastěji okolo 40 C, c) při studiu vlivu teploty na kapacitní poměry rozpouštědel (selektivitu) [9]. Obecně se doporučuje, aby kolony nebyly zahřívány na teplotu vyšší neţ 60 C kvůli nebezpečí degradace stacionární fáze nebo změn ve sloţení mobilní fáze [10] Nástřik vzorku na kolonu Velikost nástřiku můţe mít vliv na účinnost kolony. Tento vliv se projeví především u mikrokolon. Bylo totiţ zjištěno, ţe pokud vzorek zaujme v koloně prostor odpovídající N 2, kde N je počet teoretických pater, velikost nástřiku účinnost kolony neovlivní [9] Předkolona Předkolona je malá kolona obsahující stejnou stacionární fázi jako po ní následující kolona. Na obou koncích je opatřena fritou, která zachytává různý materiál, čímţ předkolona pomáhá předcházet znečištění kolony. Můţe však vést ke sníţení účinnosti kolony, protoţe zvětšuje mimokolonový objem (příspěvek), coţ můţe přispívat k rozšiřování chromatografické zóny. Doporučuje se uţívat předkolonu při analýze proteinů, lipidů a vzorků biologického původu (moč, plazma atd.) [4] [9] Mobilní fáze Sloţení mobilní fáze má vliv na účinnost kolony, retenční faktor, rozlišení, dobu analýzy a citlivost [9]. Dalším důleţitým faktorem je viskozita mobilní fáze a rychlost průtoku mobilní fáze [8]. Velmi významná je rozpustnost vzorku v mobilní fázi. Vzorek by měl být rozpustný v mobilní fázi, aby se zabránilo jeho vysráţení v koloně [4] Organická rozpouštědla Pro analýzu je velmi důleţitá správná volba organického rozpouštědla. Síla rozpouštědla nebo procento organického rozpouštědla obsaţené v mobilní fázi totiţ ovlivňuje retenční čas analytu a různá rozpouštědla mohou mít různý účinek na citlivost [8]. 27

28 V RP HPLC se nejčastěji jako mobilní fáze uţívají vysoce čištěné hydro- -organické směsi. Nejběţnější rozpouštědla jsou methanol, acetonitril nebo jejich směsi [4] Acetonitril vs. Methanol Methanol je polární protické rozpouštědlo a acetonitril je polární aprotické rozpouštědlo. Právě tento rozdíl má vliv na výsledky analýzy. Experimentálně bylo zjištěno, ţe methanol zlepšuje citlivost, zatímco díky acetonitrilu dosahujeme při analýze lepší souměrnosti píků. Horší tvar píků při uţití methanolu je vysvětlován zvýšením viskozity mobilní fáze [5]. Při uţívání methanolu a acetonitrilu bylo dále zjištěno, ţe jejich přítomnost posouvá hodnotu zdánlivého ph směrem k alkalické oblasti. To můţe být problematické zejména v případech, kdy pouţíváme kolony naplněné silikagelem. U těchto kolon musíme dbát na to, aby ph mobilní fáze nepřesáhlo hodnotu 8, kdy jiţ dochází k rozpuštění silikagelu [5] [9] ph a pufry Volba ph a sloţení mobilní fáze patří mezi hlavní faktory ovlivňující retenci analytu. ph mobilní fáze ovlivňuje ionizaci analytu a následně tak i jeho retenci [4]. V RP HPLC má ionizovaná forma vţdy menší retenci [5]. Je to dáno tím, ţe ionizovaná forma méně interaguje s hydrofobní stacionární fází neţ forma neionizovaná a má proto výrazně niţší retenční faktor [8]. Retenci analytu můţe významně ovlivnit volba pufru mobilní fáze [9]. Pufry, neboli tlumivé roztoky, jsou roztoky slabých kyselin a jejich solí se silnou zásadou nebo roztoky slabých zásad a jejich solí se silnou kyselinou [13]. Tyto roztoky jsou uţívány pro regulaci ph mobilní fáze při separaci kyselých nebo bazických analytů [8]. Správná volba ph mobilní fáze je také velmi důleţitá pro zachování co nejdelší ţivotnosti stacionární fáze a kolony [4] Viskozita mobilní fáze Viskozita (η) je míra vnitřního tření v tekutinách, která vyjadřuje odpor prostředí při pohybu jeho některých částí vzhledem k druhým [14]. Viskozita není lineární funkce a je závislá na typu a koncentraci organických rozpouštědel a také na teplotě a tlaku. 28

29 Obvykle viskozita s tlakem stoupá a s teplotou klesá. Vysoká viskozita, např. při uţití methanolu jako mobilní fáze, můţe vést k rozšíření píků [4] [14] Rychlost průtoku mobilní fáze Průtok mobilní fáze má významný vliv na účinnost kolony (počet teoretických pater) a samozřejmě na sníţení hodnoty HETP. Obecně se nedoporučuje průtok, který vyvolává zpětný tlak na úrovni tlakových limitů kolony a systému. Rychlost průtoku mobilní fáze (F) nemá vliv na retenční faktor ani na citlivost, protoţe rychlost průtoku má stejný vliv na retenční čas i mrtvý retenční čas. Rychlost průtoku je nepřímo úměrná pracovnímu tlaku a času analýzy [8]. 29

30 2.2 Validace Validace je proces, jehoţ cílem je stanovit podmínky, při kterých je zkušební postup pouţitelný a zároveň zajistit stejnou spolehlivost při opakovaném pouţití v různých laboratořích. Provádí se vţdy při vývoji nové metody, při změně metody, při přenesení metody do jiné laboratoře nebo při průkazu rovnocennosti dvou metod. Jejím smyslem je demonstrovat, ţe vypracovaná metoda je vhodná pro daný účel [3] Validační parametry Podle účelu, ke kterému má analytická metoda slouţit, se ověřují následující validační parametry [3] Správnost Správnost vyjadřuje shodu mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou [3] Přesnost Přesnost vyjadřuje míru shody mezi jednotlivými výsledky metody opakovaně získanými s jedním homogenním vzorkem. Rozlišují se tři úrovně přesnosti: opakovatelnost, mezilehlá přesnost, reprodukovatelnost [3] Selektivita, specificita Selektivita je vlastnost změřit správně a specificky danou látku v přítomnosti látek jiných, které lze očekávat [3] Detekční limit (LOD) Detekční limit je společně s kvantitativním limitem parametrem citlivosti metody. LOD je nejniţší detekovatelná koncentrace látky [3]. 30

31 Kvantitativní limit (LOQ) Kvantitativní limit je nejniţší koncentrace látky, která je stanovitelná s přijatelnou přesností a správností [3] Linearita látky [3]. Linearita je schopnost dávat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované Rozsah Rozsahem jsou koncentrační hranice, v kterých můţe být metoda pouţívána [3] Robustnost Robustnost je míra vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy [3] Test vhodnosti systému (test způsobilosti, SST) Test vhodnosti systému je nedílnou součástí validace analytické metody a slouţí k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického systému. Zajišťuje, ţe předepsané parametry mají poţadovanou úroveň pro správné provedení metody. Nejčastěji se sledují tyto parametry: účinnost kolony, retenční faktor, rozlišení, relativní retence a faktor symetrie. Pokud některé parametry neodpovídají, je moţné upravit chromatografické podmínky v takovém rozsahu, aby byla splněna kritéria vhodnosti chromatografického systému a aby nedošlo k podstatné změně metody. Rozsah povolených změn je uveden například v příslušných lékopisných monografiích. Při splnění poţadavků testu vhodnosti systému se předpokládá, ţe dříve provedená validace platí [3]. 31

32 2.3 Ketoprofen Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti Ketoprofenum C 16 H 14 O 3 M r 254,28 Absorpční maximum při 255 nm Teplota tání 94 C aţ 97 C Obr. 2: Chemická struktura ketoprofenu Ketoprofen (Obr. 2) je kyselina (2RS)-2-(3-benzoylfenyl)propanová. Jedná se o bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, který je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v ethanolu 96% a v dichlormethanu [10] Farmakologické vlastnosti Ketoprofen je arylpropionátové nesteroidní antiflogistikum s protizánětlivým, analgetickým a antipyretickým účinkem. Lze ho pouţít jak lokálně ve formě roztoku, gelu, krému a náplastí, tak i systémově formou tablet, tobolek, čípků, injekčně nebo infúzí. Indikován je při bolestivých a zánětlivých stavech zejména při revmatických onemocněních, artróze nebo po úrazech [11]. Po aplikaci na intaktní kůţi se vlivem nízké rozpustnosti v tucích málo vstřebává (5 %). Ketoprofen můţe vzácně vyvolat fototoxicitu nebo fotosensitivitu, a proto se doporučuje během terapie a čtrnáct dní po jejím ukončení nevystavovat ošetřovaná místa slunečnímu záření a jiným zdrojům UV záření [11]. Při systémové aplikaci můţe vyvolat gastrointestinální potíţe jako nauzeu, zvracení, bolesti břicha aţ ulcerace s rizikem krvácení nebo perforace. Pro omezení těchto neţádoucích účinků na gastrointestinální trakt se doporučuje uţívání ketoprofenu s jídlem nebo krátce po jídle [11]. 32

33 2.4 Parabeny Parabeny jsou protimikrobní konzervační látky se širokým spektrem účinku. Chemicky se jedná o estery kyseliny 4-hydroxybenzoové. Jejich úkolem je zabránit mnoţení a růstu mikroorganismů, které působí změny ve sloţení léku, pokud jsou v léku přítomny z výroby, anebo pokud je lék kontaminován při skladování nebo pouţívání. Nejslabší protimikrobní účinek z parabenů má methylparaben. Účinek parabenů se zvyšuje s rostoucí délkou řetězce. Rovněţ přítomnost propylenglykolu (2 5 %) účinnost parabenů zvyšuje. Velmi často se pouţívá kombinace methylparabenu a propylparabenu v různých poměrech [12] Methylparaben Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti Methylparabenum Methylis parahydroxybenzoas C 8 H 8 O 3 M r 152,15 Teplota tání 125 C aţ 128 C Obr. 3: Chemická struktura methylparabenu Methylparaben (Obr. 3) je methyl-4-hydroxybenzoát. Jedná se o bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly, které jsou velmi těţce rozpustné ve vodě, snadno rozpustné v ethanolu 96% a v methanolu [10]. 33

34 2.4.2 Ethylparaben Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti Ethylparabenum Ethylis parahydroxybenzoas C 9 H 10 O 3 M r 166,18 Teplota tání 115 C aţ 118 C Obr. 4: Chemická struktura ethylparabenu Ethylparaben (Obr. 4) je ethyl-4-hydroxybenzoát. Jedná se o bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly, které jsou velmi těţce rozpustné ve vodě, snadno rozpustné v ethanolu 96% a v methanolu [10] Propylparaben Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti Propylparabenum Propylis parahydroxybenzoas C 10 H 12 O 3 M r 180,20 Teplota tání 96 C aţ 99 C Obr. 5: Chemická struktura propylparabenu 34

35 Propylparaben (Obr. 5) je propyl-4-hydroxybenzoát. Jedná se o bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, který je velmi těţce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v ethanolu 96% a v methanolu [10]. 35

36 citace hodnoceno rozměry kolony stacionární fáze mobilní fáze F (ml/min) nástřik (µl) detekce λ (nm) vnitřní standard ČL 2009 [10] -on, kyselina 3-[(1RS)-1-1-(3-benzoylfenyl)ethan-1- -on, kyselina 3-[(1RS)-1- -karboxyethyl]benzoová, ketoprofen 150 mm x 4,6 mm C18; 5 µm fosforečnanový pufr 3,5: ACN : voda 2:43:55 1, ne British Pharmacopoeia 2004 [15] 1-(3-benzoylfenyl)ethan-1- -karboxyethyl]benzoová, ketoprofen 150 mm x 4,6 mm C18; 5 µm fosforečnanový pufr 3,5: ACN : voda 2:43:55 1, ne USP 32 [16] kyselina 3-benzoylbenzoová, ketoprofen 150 mm x 4,6 mm C18; 3 µm fosforečnanový pufr 3,5: ACN : voda 2:43:55 1, ne 2.5 Metody hodnocení ketoprofenu Lékopisné metody Tab. 1: Lékopisné metody hodnocení ketoprofenu (výsledky rešerše) 36

37 citace hodnoceno materiál rozměry kolony předkolona stacionární fáze mobilní fáze F (ml/min) nástřik (µl) detekce λ (nm) vnitřní standard [17] ketoprofen, methylparaben, propylparaben gel 150 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm isokratická eluce: acetonitril : 0,01 M fosforečnanový pufr ph 3,0 (40:60, v/v) 1, ne [18] ketoprofen gel 150 mm x 4,6 mm 4,6 mm x 5 mm a 5 mm x 4,6 mm C18; 5 µm isokratická eluce: fosforečnanový pufr ph 3,5 : voda: acetonitril (8:43:49, v/v) 1, ne Jiné HPLC metody Následující tabulky (Tab. 2 aţ Tab. 5) uvádí výsledky rešerše ze článků, ve kterých byla HPLC vyuţita ke stanovení ketoprofenu, případně dalších látek z různých materiálů. Rešerše je zaměřena především na chromatografické podmínky. Tab. 2: HPLC metody hodnocení ketoprofenu a dalších látek (výsledky rešerše) 37

38 citace hodnoceno materiál rozměry kolony předkolona stacionární fáze mobilní fáze F (ml/min) nástřik (µl) detekce λ (nm) vnitřní standard [19] ketoprofen gel, ampule 100 mm x 3,9 mm ne C18; 5 µm isokratická eluce: 0,01 M fosforečnanový pufr ph 2,2: acetonitril (60:40, v/v) 1, ne [20] ketoprofen plazma neuvedeno ne C18 isokratická eluce: 0,01 M fosforečnanový pufr ph 7,0: acetonitril (80:20, v/v) 1, naproxen [21] ketoprofen, 3-acetylbenzofenon, kyselina 2-(3-karboxyfenyl)- propionová, methylparaben, propylparaben gel 125 mm x 4 mm 20 mm x 4 mm C18; 5 µm isokratická eluce: acetonitril : voda : fosforečnanový pufr ph 3,5 (40:58:2, v/v/v) 1, ethylparaben Tab. 3: HPLC metody hodnocení ketoprofenu a dalších látek (výsledky rešerše) 38

39 citace hodnoceno materiál rozměry kolony předkolona stacionární fáze mobilní fáze F (ml/min) nástřik (µl) detekce λ (nm) vnitřní standard [22] ketoprofen roztok po penetraci skrz kůţi krysy 250 mm x 4 mm ne C18; 5 µm isokratická eluce: acetonitril : 0,01 M fosforečnanový pufr ph 1,5 (60:40, v/v) 1, ibuprofen [23] diklofenak, ketoprofen, ibuprofen, naproxen, kyselina klofibrová, 17b- -estradiol, ethynylestradiol, estron, 150 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm gradientová e.: A: acetonitril B: ACN : 6,9 mm kyselina octová ph 4,0 (30:70, v/v) isokratická eluce: 6,9mM kyselina octová ph 4,0 s 35 % v/v ACN 1,0 20 estriol vodný roztok 230 ne 150 mm x 2,1 mm ne C18; 5 µm gradientová e.: A: acetonitril B: 6,9 mm octan amonný ph 4,0 s 25 % v/v ACN 0,35 10 [24] etorikoxib, kyselina salicylová, valdekoxib, ketoprofen, nimesulid, celekoxib plazma 250 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm gradientová eluce: A: 0,05 M kyselina mravenčí ph 3,0 B: voda : ACN (5:95, v/v) C: voda : methanol (10:90, v/v) 1, DRF-4367 Tab. 4: HPLC metody hodnocení ketoprofenu a dalších látek (výsledky rešerše) 39

40 citace hodnoceno materiál rozměry kolony předkolona stacionární fáze mobilní fáze F (ml/min) nástřik (µl) detekce λ (nm) vnitřní standard [25] antipyrin, metoprolol, ketoprofen, furosemid, fenol střevo krysa 150 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm (a další: C8 atd.) gradientová eluce: A: 0,01 M fosforečnanový pufr ph 5,5 B: methanol 1, ne [26] naproxen, ketoprofen, ibuprofen, diklofenak, piroxicam, nimesulid, A: acetonitril paracetamol homeopatické preparáty 150 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm gradientová eluce: B: voda s kyselinou octovou 0,1% ph 3,16 1, kyselina benzoová [27] ketoprofen, naproxen, phenylbutazon, oxyphenylbutazon, kyselina acetylsalicylová, kyselina salicylová, kyselina tolfenamová, diklofenak, nimesulid hovězí plazma 25 mm x 4,6 mm ne C18; 5 µm gradientová eluce: A: 0,017 M kyselina fosforečná s diethylaminem, ph 2,8 B: acetonitril : voda (80:20, v/v) 1, a 280 ne Tab. 5: HPLC metody hodnocení ketoprofenu a dalších látek (výsledky rešerše) 40

41 2.5.3 Ostatní metody Vedle HPLC existují i jiné metody, kterými byl ketoprofen hodnocen. V následující tabulce (Tab. 6) jsou uvedeny vybrané příklady ostatních metod. citace metoda hodnoceno materiál [10] alkalimetrie ketoprofen ketoprofen [28] CE ketoprofen sérum [29] FIA ketoprofen moč, kapsle [30] spektrofotometrie ketoprofen kapsle, ketoprofen [31] GC ibuprofen, naproxen, ketoprofen, kyselina tolfenamová, diklofenak [32] MEKC ketoprofen, methylparaben, propylparaben odpadní vody gel Tab. 6: Ostatní analytické metody hodnocení ketoprofenu a dalších látek (výsledky rešerše) 41

42 2.6 Způsoby přípravy vzorků Sprej V následující tabulce jsou uvedeny výsledky rešerše ze článků, v nichţ je analyzovaná látka obsaţena ve spreji. Nejedná se však o spreje obsahující ketoprofen. citace materiál příprava vzorku [33] sprej - potřebné mnoţství vzorku přesně naváţit do odměrné baňky - přidat přiměřené mnoţství roztoku vnitřního standardu - doplnit acetonitrilem (součást mobilní fáze) na poţadovaný objem - nástřik na kolonu [34] sprej - potřebné mnoţství vzorku rozpustit v acetonitrilu (součást mobilní fáze) - směs promíchat 1 min v mixéru - poté centrifugace 5 min při 3200 otáčkách - nástřik supernatantu na kolonu Tab. 7: Způsob přípravy vzorků sprej (výsledky rešerše) Krém V následující tabulce jsou uvedeny výsledky rešerše ze článků, v nichţ je analyzovaná látka obsaţena v krému. Nejedná se však o krémy obsahující ketoprofen. citace materiál příprava vzorku [35] krém - potřebné mnoţství vzorku přenést do dělicí nálevky - přidat methanol (součást mobilní fáze) - směs 10 min protřepávat - opakovat 2krát - získané extrakty přefiltrovat a doplnit methanolem na poţadovaný objem - centrifugace 20 min při 3000 otáčkách - supernatant dále ředěn methanolem - nástřik vzniklého roztoku na kolonu 42

43 [36] krém - potřebné mnoţství vzorku přesně naváţit do centrifugační zkumavky - doplnit potřebným mnoţstvím roztoku vnitřního standardu v acetonitrilu (součást mobilní fáze) - umístit na 10 min do ultrazvukové lázně - centrifugace 15 min při 3000 otáčkách - nástřik supernatantu na kolonu [37] krém - potřebné mnoţství vzorku přesně naváţit do odměrné baňky - doplnit methanolem (součást mobilní fáze) - protřepat 10 min a zfiltrovat - nástřik filtrátu na kolonu [38] krém - potřebné mnoţství vzorku přesně naváţit do centrifugační zkumavky - přidat potřebné mnoţství roztoku vnitřního standardu v acetonitrilu (součást mobilní fáze) a přidat malé mnoţství kyseliny fosforečné (85%) - umístit směs na 15 min do ultrazvukové lázně - centrifugace 15 min při 2600 otáčkách - nástřik supernatantu na kolonu [39] krém - potřebné mnoţství vzorku přesně naváţit do centrifugační zkumavky - přidat 2,0 ml chloroformu - směs umístit na 20 min do vodní lázně o teplotě 75 C - přidat roztok vnitřního standardu - umístit směs na 20 min do ultrazvukové lázně - centrifugace 15 min při 6000 otáčkách - filtrace supernatantu přes 0,45 µm filtr - nástřik filtrátu na kolonu Tab. 8: Způsob přípravy vzorků krém (výsledky rešerše) 43

44 2.7 Zhodnocení rešerše Z údajů získaných při zpracování rešerše vyplývá, ţe HPLC je jednou z velmi často uţívaných metod při analýze léčiv. Velmi populární je zejména HPLC s obrácenými fázemi, kde stacionární fázi tvoří především oxid křemičitý s navázanými osmnáctiuhlíkovými řetězci. Mobilní fází jsou směsi vody, pufru a rozpouštědel v různém poměru. Jako organická rozpouštědla jsou nejčastěji pouţívány acetonitril, methanol nebo jejich směsi. Jako pufr je velmi často volen fosforečnanový pufr o různém ph. Pokud se hodnotí více sloţek ve vzorku s významně odlišnými elučními parametry, vyuţívá se gradientová eluce. Jedním z nejčastějších způsobů detekce je detekce pomocí UV záření. Je zajímavé, ţe i kdyţ je hodnocen pouze ketoprofen, není jako vlnová délka detekce vyuţíváno absorpční maximum ketoprofenu 255 nm. Při přípravě vzorků jsou vyuţívány různé postupy v závislosti na charakteru vzorku. 44

45 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 45

46 3.1 Přístrojové vybavení Kapalinový chromatograf Čerpadlo Waters 1525 Autosampler Waters 717 plus UV detektor Waters 2487 Kolona A SUPELCO Discovery C18 rozměry kolony 125 mm x 4,6 mm velikost částic 5 µm Kolona B SUPELCO Discovery C18 rozměry kolony 150 mm x 4,6 mm velikost částic 5 µm Vyhodnocení chromatografická stanice Breeze, verze 3,30 Ultrazvuková lázeň Bandelin SONOREX, Berlín, Německo Centrifuga EBA 21, Hettich Zentrifugen, Německo Laboratorní ph metr HANNA Instruments, USA Analytické váhy Sartorius GENIUS, Německo Filtrace filtrační zařízení na mobilní fáze Millipore filtr ze skleněných vláken o velikosti pórů 0,45 µm membránový filtr o velikosti pórů 0,45 µm 46

47 3.2 Chemikálie a vzorky Chemikálie Ketoprofen Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Methylparaben Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Ethylparaben Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Propylparaben Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Acetonitril CHROMASOLV Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Methanol CHROMASOLV Sigma-Aldrich s. r. o., Německo Kyselina fosforečná 85% p. a. Merck, Německo Dihydrogenfosforečnan draselný p. a., 99,5% Merck, Německo Ultračištěná voda, čištěná systémem Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) filtrováno před pouţitím pomocí filtračního zařízení na mobilní fáze, Millipore Vzorky PRONTOFLEX 10% (Ketoprofenum) koţní sprej, roztok průhledný naţloutlý roztok s vůní máty léčivé látky ketoprofen pomocné látky roztok sójového lecitinu (sójový lecitin, bezvodý ethanol), izopropylalkohol, propylenglykol, dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného, dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného, hydroxid sodný, silice máty peprné, čištěná voda Ketonal 5% krém (Ketoprofenum) bílý aţ téměř bílý homogenní krém léčivé látky ketoprofen pomocné látky methylparaben, propylparaben, propylenglykol, isopropyl- -myristát, bílá vazelína, kopolymer makrogolu 2000 s dodekandiolem, glycerosorbitanester, heptahydrát síranu hořečnatého, čištěná voda 47