Bílkoviny (=proteiny) (vztah struktury a funkce) DNA RNA protein modifikovaný protein
Chemické složení Jednoduché Složené - polypeptidová + neproteinová část Složené: metaloproteiny fosfoproteiny glykoproteiny lipoproteiny nukleoproteiny
BÍLKOVINY = PROTEINY, Kde je hranice mezi bílkovinami a (poly)peptidy? DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY globulární - albuminy (rozp. ve vodě) - globuliny (rozp. v roztocích solí) fibrilární membránové
Vznik peptidové vazby Zjednodušené schema níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč? + H 3 N CH R1 COO - N CH COO - + + H N CH OO - 3 C NH CH C H 3 + R2 R1 O R2 Peptidy 2 několik desítek AK
Úrovně struktur
Struktury bílkovin
Struktury bílkovin
Primární struktura bílkovin ( + kovalentní) pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci (kódováno v DNA)
Lze pohlížet jako na text >gi 307229470 ref ZP_07515881.1 putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQI VKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKD VALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLV NTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVV NWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYG DWADKPWRGTGEYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVT REARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPV YGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQ DDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETINQIGKNPDIEKQMY GKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG
Určování primární struktury (aminokyselinové složení) 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. Dvě nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců 8. Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie
Určení N-koncové aminokyseliny
Určení C-koncové aminokyseliny Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy) Redukce -COOH LiBH 4 na -OH, identifikace aminoalkoholu
Princip petidového mapování
Určování primární stuktury
I. Štěpení proteinu(ů) (malá variabilita; volba enzymu, reakčních podmínek) 1. Chromatografické a elektroforetické metody II. Analýza vzniklých peptidových fragmentů (značná variabilita) 2. Hmotnostní spektrometrie na principu MALDI-TOF 3. Hmotnostní spektrometrie na principu LC-MS/MS
Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1-3: jednoduché bílkoviny 4-8: složené bílkoviny
Konformace peptidového řetězce
Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech * Střední hodnota energie vazby C - H v molekule methanu je 416 kj.mol -1. ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, přibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule.
Hydrofobní interakce
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin
Sekundární struktury bílkovin Alfa helixy v hemoglobinu
Terciární struktura
Terciární struktura
Obecné znaky prostorového uspořádání organisovaných" biopolymerů 1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. 2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).
Vlastnosti proteinů Nábojové vlastnosti Rozpustnost - v závislosti na ph Denaturace - ztráta nativní konformace Kooperativita (denaturační přechod) Optické
Kvarterní struktura
Příklady bílkovin s kvarterní strukturou
Struktury bílkovin
Svinování (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-isomerasa, proteindisulfid-isomerasa) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?
Svinování (folding)
Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin (O 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (+další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy
Kovalentní modifikace proteinů aneb translací to nekončí
translací to nekončí DNA RNA protein modifikovaný protein Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů? Ano. Nejedná se jen o kosmetické změny Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)
Čím jsou determinovány možné kovalentní modifikace? typem, pořadím a prostorovou lokalizací aminokyselinových zbytků aparátem enzymů realizujících modifikace
KOVALENTNÍ MODIFIKACE (enzymové i neenzymové) IN VIVO IN VITRO VRATNÉ NEVRATNÉ PŘIROZENÉ UMĚLÉ
1. Posttranslační modifikace role v řadě různých buněčných procesů svinování proteinů stabilizace prostorové struktury proteinů lokalizace proteinů v buňce přenos signálu exprese genů regulace aktivity enzymů mezibuněčné interakce
Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy) obvykle na OH skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu významný regulační prvek: aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14 regulace transkripce role při přenosu signálu
Regulace transkripce fosforylací CREB (camp - responsive element binding protein) transkripční faktor fosforylace na serin 133 asociace s CBP; (CREB binding protein) CREB CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů
Glykosylace připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny role glykosylace: často nutná pro správné svinutí proteinu stabilizace proteinu regulace rozpoznávání molekulové mezibuněčné obrovská variabilita řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby
Místa připojení sacharidů na protein (N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů (O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny (C) (přes tryptofan) (P) (fosfothreonin, fosfoserin)
Mechanismus glykosylace na asparagin dolichol
Regulace transkripce glykosylací glykosylace CREBu brzda transkripce - působí opačně než fosforylace modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem
Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů farnesylace Acylace připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu
Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein) SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres
Acetylace - obvyklá na N koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou acetylace Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K) Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mononebo di- methylován methylace
Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku Sulfatace různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein protein interakce) Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby Aktivace zymogenů
2. Enzymová modifikace (in vitro) Defosforylace kaseinů ve zrajících sýrech (fosfatasa) vliv na štěpení a následně chuťové vlastnosti sýrů; vstřebávání vápníku možnost ovlivnění procesu (přídavek fosfatasy)
3. Neenzymové modifikace (in vivo i in Oxidativní poškození vitro) působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species) vodíku (H 2 O 2 ), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O 2. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO 3 ; vznik: H 2 O 2 + NO 2 ONOO + H 2 O), oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze oxidovaných zbytků zpět na methionin oxidace methioninu chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku
Glykace navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově Příklady: in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách) obsahujících jak proteiny, tak sacharidy in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace
4. Umělé modifikace proteinů Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys itraq (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) Kovalentní imobilizace enzymů možnost opakovaného použití stabilizace enzymu vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho autokatalytickými produkty (proteasy)
Eupergit C kopolymer vážící proteiny přes oxiranové skupiny reakcí s -NH 2 s volnými skupinami zbytků lysinu více bodové kovalentní připojení stabilizace vysoká stabilita při ph 1 až 12 penicilin amidasa na Eupergitu C - 60% původní aktivity po 800 cyklech
Význam kovalentních modifikací proteinů pro funkci živých organismů (setkání s medvědem) v potravinářství (výroba sýrů) biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů) diagnostické metody v medicíně (glykace) proteomika (kvantifikace proteinů)
Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie
Gelová chromatografie Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru Rozdělovací chromatografie v systému kapalina kapalina Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu nemísitelnost s mobilní fází Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později Isokratická eluce Objem vzorku < 2 % objemu kolony Chromatografické materiály zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid Možnost stanovení molekulových hmotností Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)
Gelová permeační chromatografie Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula
Gelová permeační chromatografie
Gelová chromatografie
Gelová chromatografie
Gelová chromatografie
Gelová chromatografie
Gelová chromatografie
Příklad Pokuste se vysvětlit pořadí, ve kterém se budou vymývat z kolony Sephadexu G-200 následující bílkoviny: cytochrom c (RMH = 96 000), ATPsulfurylasa (RMH = 154 000) a xantinoxidasa (RMH = 300 000).