Biologická aktivita obsahových látek rostlin XI. Alkaloidy Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) a jejich

UNIVERZITA KARLVA V PRAZE, FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BTANIKY A EKLGIE DIPLMVÁ PRÁCE Biologická aktivita obsahových látek rostlin XI. Alkaloidy Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) a jejich účinek na acetylcholinesterasu. Biological aktivity of plant metabolites XI. Alkaloids of Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) and their activity on acetylcholinesterase. Školitel : Doc. RNDr. Lubomír pletal, CSc. Hradec Králové, 15. května 2009 Jan Průša 1

PRHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe tato diplomová práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Hradec Králové, 15. května 2009.. podpis 2

PDĚKVÁNÍ Chtěl bych poděkovat panu Doc. RNDr. Lubomíru pletalovi, CSc. za tolik potřebnou pomoc, trpělivost, veškeré poskytnuté materiály a odborné vedení mé diplomové práce. Rovněţ bych chtěl poděkovat Ing. Lucii Cahlíkové, PhD. za vypracování a interpretaci MS spekter a poznámky k NMR spektrům, Prof. RNDr. Janu Schramlovi, DrSc. a Ing. Milanovi Kurfürstovi, Ph.D. z Ústavu chemických procesů AV ČR v Praze za provedení NMR spekter a jejich interpretaci. Dále bych chtěl poděkovat Ing. Kateřině Macákové za pomoc se stanovením aktivity na AChE a BuChE. V neposlední řadě také kolektivu katedry farmaceutické botaniky a ekologie za příjemné prostředí a pomoc při řešení technických a teoretických problémů. A také svým rodičům, kteří mi byli vţdy oporou. 3

BSAH 4 1. ÚVD 7 2. CÍL PRÁCE 9 3. TERETICKÁ ČÁST 11 3.1. Corydalis cava (L.) Schweigg. Et Koerte -Dymnivka dutá 12 3.1.1. Synonyma 12 3.1.2. Systematické zařazení 12 3.1.3. Botanický popis 13 3.1.3.1. Botanický popis čeledi 13 3.1.3.2. Botanický popis rostliny 13 3.1.4. Ekologie 14 3.1.5. Areál rozšíření 14 3.1.5.1. Celkové rozšíření 14 3.1.5.2. Rozšíření v ČR 15 3.1.6. Popis drogy 17 3.2. bsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. Et Koerte 17 3.2.1. Rozdělení alkaloidů podle chemické struktury 17 3.3. Farmakologické účinky obsahových látek 24 3.4. Biologická aktivita obsahových látek 26 3.4.1. Popis a působení enzymu acetylcholinesterasy 26 3.4.2. Metoda pro primární screening potenciálních AChE a BuChE inhibitorů 27 3.4.3. Inhibice AChE a BuChE alkaloidy izolovanými z Corydalis cava 27 4. Experimentální část 28 4.1. Všeobecné postupy 29 4.1.1. Destilace a odpařování 29 4.1.2. Chromatografie 29 4.1.2.1. Tenkovrstvá chromatografie 29 4

4.1.2.2. Sloupcová chromatografie 29 4.2. Materiál a vybavení 29 4.2.1. Rozpouštědla a chemikálie 29 4.2.2. Chemikálie a materiál ke stanovení účinku erytrocytární AChE (IC 50 ) 30 4.2.3. Přístroje 31 4.2.4. Detekční činidla 31 4.2.5. Chromatografické adsorbenty 31 4.2.6. Vyvíjecí soustavy pro tenkovrstvou chromatografii 32 4.2.7. Vyvíjecí soustavy pro preparativní TLC 32 4.3. Příprava a zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava 32 4.3.1. Původ drogy 32 4.3.2. Příprava a čistění výtřepku Corydalis Cava 32 4.3.3. Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 34 4.4. Zpracování frakce 2 35 4.5. Určení struktury izolované látky 36 4.5.1. Měření hmotnostního spektra 36 4.5.2. Měření NMR spektra 36 4.6. Stanovení účinku alkaloidu na erytrocytární AChE (IC 50 ) 36 4.6.1. Podmínky měření 36 4.6.2. Stanovení hodnot IC 50 37 4.6.3. Matematické zpracování experimetalních dat 37 4.6.4. Výpočet poklesu ΔA 37 5. Výsledky 38 5.1. Hmotnostní spektrometrie izolované látky 39 5.2. NMR 40 5.2.1. 1 H-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 41 5.2.2. 13 C-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 42 5

5.3. Výsledky testu vlivu látky na aktivitu AChE 43 6. Diskuze 45 7. Použitá literatura 47 8. Abstrakt 50 6

1. ÚVD Alzheimerova choroba patří mezi závaţné demence, onemocnění postihující zejména osoby vyššího věku. Vzhledem k jasnému trendu prodluţování průměrné délky ţivota je pravděpodobné, ţe se v budoucnu stane závaţným sociálním, zdravotnickým a ekonomickým problémem. Současná medicína nezná přesnou příčinu choroby, ale soudobé poznatky naznačují, ţe se jedná o onemocnění multifaktoriální. Jedná se o progresivní onemocnění CNS, postihující kognitivní, senzorické a motorické funkce, postupně vedoucí k úmrtí pacienta. Neznalost příčin neumoţňuje kauzální terapii, léčba se proto zaměřuje mimo jiné na cesty ovlivnění aktivity AChE, BuChE a zvýšení hladin ACh v postiţených oblastech CNS, protoţe právě cholinergní systém je onemocněním nejvíce postiţen. Poměrně velké mnoţství látek vykazuje slibné cholinomimetické vlastnosti, ale většina z nich není vhodná pro uvedení do terapie, protoţe vykazují příliš vysoké periferní účinky a s tím související účinky neţádoucí. V současné době se z přírodních látek vyuţívá k terapii pouze galanthamin. Tento alkaloid vykazuje dvojí mechanismus účinku, inhibuje AChE a zároveň zesiluje účinky ACh na nikotinových receptorech 1. Mezi další perspektivní přírodní látky můţeme zařadit huperzin A (Huperzia serrata, Huperziaceae) vykazující dlouhodobou inhibiční aktivitu, neuroprotektivní a kognitivní efekt 2, zeatin (Fiatoua villosa, rchidaceae, Zea mays, Poaceae) vedle inhibiční aktivity téţ blokující tvorbu β-amyloidu 2,3, ursolová kyselina izolovaná z různých rodů čeledi Lamiaceae (Majorana hortensis, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis), dekursinol (Angelica gigas, Apiaceae) s vysokou inhibiční aktivitou vůči AChE in vitro 2, α-onocerin (Lycopodium clavatum, Lycopodiaceae, nonis spinosa, Fabaceae ) 2. V současnosti se však nezdá, ţe by se uvedené nealkaloidní látky dostaly do klinického studia. Současné moţnosti terapie neposkytují uspokojivé výsledky, proto je nutný další výzkum a hledání látek schopných inhibovat AChE v CNS. Analyzujeme-li strukturu sloučenin, které jsou inhibičně účinné vůči mozkovým esterasám (a to zejména u látek, které jsou terapeuticky pouţívány anebo se zdají být pro další výzkum perspektivní) predikčními matematickými modely s metodami konformační analýzy, nenalezneme překvapivě ţádné významné strukturní podobnosti, které by umoţnily teoreticky uvaţovat o vztahu k aktivitě cholinesteras na receptory v mozku; významné je toto zjištění zejména v oblasti biologicky aktivních látek přírodního původu. Je tedy zřejmé, ţe nelze provést uţší predikci, ale jen širší výběr strukturního typu látek, in vitro metodami vybrat rostlinné taxony, které jsou z hlediska inhibiční aktivity aktivní na cholinesterasy, izolovat biologicky aktivní látky, určit jejich strukturu, stanovit jejich 7

inhibiční aktivitu vůči cholinesterasám a dalšími studiemi sledovat vliv těchto látek na jiné biologické systémy, které jsou v tomto ohledu významné. Z přírodních látek byly zhruba do 90. let minulého století intenzívně sledovány především alkaloidy, v současnosti se začíná rozšiřovat výzkum i na látky nealkaloidní. Významně jsou studovány rostliny orientální medicíny a je zajímavé, ţe inhibice AChE byla nalezena u směsi terpenových sloţek z Mentha arvensis var. piperascens, Cinnamomum cassia, Amomum cardamomum, Cnidium officinale, Angelica genuflexa, Agastache rugosa a Pogostemon cablin 5. 8

2. CÍL PRÁCE 9

Cílem mé diplomové práce bylo: 1. Provést preparativní sloupcovou chromatografii výtřepku B získaného vytřepáním upraveného základního vodného extraktu při ph 12, z něhoţ byly předem odstraněny terciární alkaloidy při ph ~ 9-10. 2. Získání minimálně jedné látky v čistém stavu, určení jejích základních fyzikálně-chemických charakteristik. 3. Podílet se na stanovení inhibiční aktivity vůči lidské erytrocytární acetylcholinesterase a lidské sérové butyrylcholinesterase (stanovení IC 50 ). 10

3. TERETICKÁ ČÁST 11

3.1. CRYDALIS CAVA (L.) SCHWEIGG. ET KERTE - DYMNIVKA DUTÁ 3.1.1. Synonyma 6 : Fumaria bulbosa a cava L., Fumaria cava (L.) Mill., Pistolochia cava (L.) Bernh., Corydalis tuberosa DC. br. 1: Corydalis cava (L.) Schweigg. Et Koerte celá rostlina 7 3.1.2. Systematické zařazení Tab. 1. Systematické zařazení Corydalis cava 8 Říše rostliny Plantae Podříše vyšší rostliny Cormobionta ddělení rostliny krytosemenné Magnoliophyta Třída vyšší dvouděloţné rostliny Rosopsida Řád pryskyřníkotvaré Ranunculales Čeleď zemědýmovité Fumariaceae Rod dymnivka Corydalis 12

3.1.3. Botanický popis 3.1.3.1. Botanický popis čeledi Jednoleté aţ vytrvalé byliny bez mléčnic se střídavými listy. Trojčetné nebo zpeřené listy jsou řapíkaté, bez palistů, vyrůstají střídavě. boupohlavné souměrné květy se skládají do hroznů nebo do lat. Kalich je tvořen dvěma malými lístky, které jsou opadavé nebo chybí. Korunu tvoří čtyři plátky ve dvou kruzích. V květu jsou dvě tyčinky na širokých nitkách, nahoře se dělí na tři části. Prostřední část tyčinky nese dvoupouzdré prašníky, okrajové části mají prašníky jednopouzdré. Svrchní semeník srůstá ze dvou plodolistů. Plody jsou naţky nebo tobolky, které mají dvě chlopně. Řadí se sem asi 18 rodů se 450 druhy. blast rozšíření hlavně v mírném pásmu na severní polokouli. Čeleď Fumariaceae je příbuzná s čeledí mákovitých (Papaveraceae). d čeledi Papaveraceae se liší několika znaky. Čeleď Fumariaceae nemá ve svých pletivech mléčnice, ale jen idioblasty obsahující alkaloidy. Semeník u čeledi Papaveraceae můţe srůstat z většího počtu plodolistů (aţ z devatenácti) 9. 3.1.3.2. Botanický popis rostliny Vytrvalá bylina dorůstající výšky 10-30 cm. Z velké a duté podzemní hlízy vyrůstá lysá, přímá lodyha, která není pokrytá šupinami. Silná lodyha nese pouze dva listy, které mají sivozelenou barvu. Vyrůstají na krátkých řapících, v obrysu mají tvar široce trojboký. Listy jsou 2 trojčetné. Lístky mají v obrysu tvar klínovitě obvejčitý, jsou nepravidelně laločnaté, někdy aţ dělené do zašpičatělých podlouhlých úkrojků. boupohlavné souměrné květy, které vyrůstají v úţlabí celokrajných a vejčitých listenů, se skládají do přímého a bohatého hroznu. Šupinkatý kalich je tvořen dvěma volnými lístky, je prchavý. Koruna je tvořena čtyřmi plátky. Vnější horní plátek se protahuje v ostruhu, ale vnější dolní plátek se na vzniku ostruhy nepodílí. Dva vnitřní plátky mají podlouhlý tvar, v přední části jsou černé. Barva koruny bývá růţová se šedým nádechem nebo ţlutavě bílá. struha je dlouhá, na konci dolů ohnutá. Celý květ i s ostruhou pak měří 18-28 mm. V květech se nacházejí pouze dvě tyčinky, svrchní semeník srůstá ze dvou 13

plodolistů. Plody jsou tobolky, které se zuţují v přímý zobánek a dosahují délky aţ 25 mm. Semena jsou lesklá a mají černou barvu. Rostlina kvete od března do května 9. br. 2: Corydalis cava (L.) Schweigg. Et Koerte květ 10 3.1.4. Ekologie Dymnivku dutou najdeme v luţních lesích, smíšených listnatých lesích a humózních hájích, někdy i na loukách. Roste na vlhčích, humózních, na minerály bohatších kyprých půdách. Přednost dává teplejším stanovištím a roste za příznivých podmínek většinou pospolitě 11. 3.1.5. Areál rozšíření 3.1.5.1. Celkové rozšíření ASIE Západní Asie: Írán, Turecko Kavkaz: Ázerbájdţán, Georgie, Rusko EVRPA Severní Evropa: Dánsko, Švédsko Střední Evropa: Rakousko, Belgie, Česká Republika, Slovensko, Německo, Maďarsko, Polsko, Švýcarsko 14

Východní Evropa: Lotyšsko, Litva, Rusko, Ukrajina Jihovýchodní Evropa: Albánie, Bulharsko, bývalá Jugoslávie, Řecko, Itálie, Rumunsko Jihozápadní Evropa: Francie, Portugalsko, Španělsko Rostlina je rozšířená od níţin do podhůří. Vyskytuje se hlavně ve střední Evropě. Na území České republiky roste hojně. Zavlečena byla i do Anglie 12. 3.1.5.2. Rozšíření v České republice Tab. 2: blasti výskytu Corydalis cava v České republice 13 15

Lokalita Bělýšov (přírodní rezervace) Břestský les Čertův kámen (přírodní památka) Děvín (národní přírodní rezervace) Hády (národní přírodní rezervace) Hluchov (přírodní památka) Javořina (národní přírodní rezervace) Jenerálka (přírodní památka) Koda (národní přírodní rezervace) Libický luh (národní přírodní rezervace) Na Hornické (přírodní rezervace) Niva Pokratického potoka Polanský les (přírodní rezervace) Radotínské údolí (přírodní rezervace) Starojický kopec Stránská skála (národní přírodní památka) Tolštejn kres Klatovy Kroměříţ Zlín Břeclav Brno-město Praha-východ Uherské Hradiště Praha Beroun Nymburk Kutná Hora Litoměřice strava-město Praha Nový Jičín Brno-město Děčín Údolí Kunratického potoka (přírodní památka) Praha Vlčnovský háj (přírodní rezervace) Vrbice vrch Poustevník Volská homole (přírodní rezervace) Uherské Hradiště Břeclav Děčín Praha-západ 16

3.1.6. Popis drogy Celá droga chutná hořce a je bez zápachu. Hlízy jsou kuţelovité aţ nepravidelnělaločnaté, šedohnědé barvy, v terminální se zbytky stonku, bazální část má dovnitř zahnutou dutinu opatřenou obrubou, hladkou, jakoby zalomenou rovinou zelenoţluté barvy 14. 3.2. bsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. Et Koerte Hlavními obsahovými látkami dymnivky duté jsou alkaloidy, jejichţ obsah je 4 6 %. Tento obsah je kolísavý, přičemţ závisí především na místě výskytu rostliny a ekologických podmínkách. 3.2.1. Rozdělení alkaloidů podle chemické struktury V droze se vyskytují isochinolinové alkaloidy různých strukturních typů, z nichţ nejdůleţitější jsou alkaloidy 1.) protoberberinového typu - koptisin, (+)-korydalin, (+)-korybulbin, (+)- korypalmin, korysamin, (+)-isokorypalmin, (±)-isokorypalmin, dehydrokorydalin, (+)-kanadin, (+)-tetrahydroberberin, ( )-skoulerin, (+)-skoulerin, (+)-stylopin,(+)- a (±)-tetrahydropalmatin, (+)- a (±)-thaliktrikavin, podle novějších výzkumů také (+)-tetrahydrokorysamin, dehydrokorybulbin, dehydroapokavidin, palmitin, berberin, kolumbamin, jatrorrhizin, dehydrothaliktrikavin, α-methohydroxid, (+)-stylopin a tetrahydrocorysamin, 2.) protopinového typu - protopin, korykavamin, (+)- a (±)-korykavidin, allokryptopin), 3.) aporfinového typu - (+)-bulbokapnin, (+)-korydin, (+)-korytuberin, (+) bulbokapnin methohydroxid a magnoflorin 14 4.) morfinanového typu salutaridin, sinoakutin 17

Ad. 1.) Protoberberinový typ - alkaloidy tohoto typu se v droze poměrově vyskytují v největším mnoţství a jsou zde zastoupeny: tetrahydroprotoberberiny (např. tetrahydrokorysamin) H H 3 C N tetrahydrokorysamin protoberberiny (např. (+)-korydalin) H 3 C H 3 C H H 3 C N CH 3 (+)-korydalin CH 3 Ad. 2.) Protopinový typ do této skupiny náleţí např. protopin, coţ je typický zástupce pro čeleď Papaveraceae, dále pak korykavamin, (+)- a (±)-korykavidin allokryptopin. N CH 3 allokryptopin 18

Ad. 3.) Aporfinový typ do této skupiny patří alkaloidy bulbokapnin, korydin, korytuberin, bulbokapnin methohydroxid a magnoflorin Me H H + N CH 3 CH 3 X Me magnoflorin Ad. 4.) Morfinanový typ: do této skupiny patří např. salutaridin (důleţitý meziprodukt při biosyntéze morfinu) 15 Me H N CH 3 H Me salutaridin Hlíza rostliny představuje velmi bohatý zdroj různých alkaloidů, ze kterých bylo doposud izolováno a popsáno okolo třiceti isochinolinových alkaloidů 16,17,18. Primární extrakt alkaloidů se obecně často připravuje perkolací usušené drogy ethanolem. Pro izolaci a čištění jednotlivých alkaloidů je velmi výhodné rozdělení sumárního extraktu na alkaloidy dle jejich pka. Tato metoda přípravy jednotlivých výtřepků alkaloidů byla v 70. letech vypracována Slavíkem 19. Jednotlivé výtřepky jsou za účelem izolace čistých alkaloidů poté zpracovány prostřednictvím sloupcové chromatografie za pouţití gradientové eluce, nejčastěji směsí chloroformu a ethanolu. Pro konečné dočistění alkaloidů se s výhodou pouţívá krystalizace a preparativní TLC. 19

Při přípravě extraktů pro analytickou metodu HPLC-MS a GC-MS se alkaloidy nejčastěji izolují z malého mnoţství suché drogy zředěnou minerální kyselinou (2% H 2 S 4, 2% HCl) ve formě solí. Ty jsou prostřednictvím Na 2 C 3 převedeny na volné báze do organického rozpouštědla, odpařeny a aplikovány do HPLC či GC systému. Takto byly analyzovány profily (fingerprint) alkaloidů celé řady rostlin. Z rodu Corydalis byl detailně analyzován profil alkaloidů u druhu Corydalis Yanhusuo pomocí HPLC-MS (ionizace ESI) 20. S objevením důleţitých farmakodynamických vlastností některých aporfinových a protoberberinových alkaloidů, alkaloidy z dymnivky duté jsou čím dál tím víc zajímavé pro účely medicíny 21,22. Také alkaloidy z nadzemní části rostliny byly zkoumány velmi podrobně 23. Zastoupení alkaloidů v podzemní a nadzemní části rostliny se liší jak kvalitativně, tak kvantitativně. Velký přínos, co se týká objevení alkaloidů a jejich charakterizace, má J. Slavík, který ve své studii uvádí výzkum dvou vzorků z okolí Brna. Z materiálu bylo izolováno 37 jednotlivých alkaloidů a identifikováno dalších šest do té doby neznámých 24. Z hlízy obdrţeli celkem 4,82 % (vzorek 1) a 4,21 % (vzorek 2) alkaloidů, které rozdělili v laboratoři. Z frakce terciárních bazí 4,72 % a 3,81 % z hlízy byl izolován bulbokapinin jako hlavní alkaloid. Pouţitím přímé krystalizace získali menší mnoţství korydalinu a tetrahydropalmatinu, korykavinu, thaliktrikavinu, korybulbinu, korypalminu, isokorypalminu, korykavidinu, korydinu, kanadinu, stylopinu a kapnoidinu, které jiţ byly v droze známy. Hmotnostní spektrum korykavidinu s velkou pravděpodobností nebylo ještě publikováno 24. Dále izolovali protopin, který nebyl v hlíze popsán a byl popsán pouze v nadzemních částech rostliny, také thaliktrikavin, isokorypalmin, (-)-skoulerin, (zatím byl v hlízách popsán jen (+)-skoulerin) allokryptopine a (+)-tetrahydrokorysamin. Dva posledně zmiňované alkaloidy byly z dymnivky duté izolovány poprvé 24. Všechny 13-methyltetrahydroprotoberberiny izolovány z dymnivky duté byly zobrazeny Bohlmannovými pásmy mezi 2700-2800 cm -1 v oblasti IR spektra. Byly indikovány cis pozice hydrogenovaných atomů na C13 a C14 a chinolizidinový systém v trans konformaci 25. Další terciární alkaloidy byly získány z frakce bazí extrahovatelných v chloroformu 26. Z frakce kvarterních nefenolických protoberberinů ze vzorku 1 (0,073 %) byl oddělen chlorid 20

dehydrokorydalinu jako hlavní komponenta a dehydrothaliktrikavin. Menší mnoţství korysaminu a palmatinu bylo téţ izolováno a byla téţ prokázána přítomnost malého mnoţství berberinu a koptistinu. 48 Ţádný z těchto čtyř alkaloidů nebyl zatím v hlíze dymnivky duté nalezen. Stejná frakce ze vzorku 2 (0,156 %) obsahovala palmatin jako hlavní alkaloid, a pak menší mnoţství korydalinu, koptistinu, berberinu a pouze stopová mnoţství dehydrokorydalinu 24. Z frakce jodidů kvarterních alkaloidů byl izolován nový alkaloid jako hlavní komponent, který byl identifikován pomocí UV a IR spektra, optické rotaci, hmotnostní spektrometrii a chromatografického chování, jako bulbokapnin methoiodid s přímým srovnáním se vzorkem připraveným z bulbokapninu. Ze stejné frakce byla izolována velmi malá mnoţství α-stylopinu methoiodidu a další alkaloid, který byl identifikován hmotnostní spektrometrií a R f hodnotami jako α-tetrahydrokorysamin. Jako další alkaloidy byly izolovány z této frakce dehydrokorybulbin jodid a dehydroapokavidin jodid 24. Po redukci pozdějších alkaloidů borohydridem sodným byl získán apokavidin. Tetrahydrokorysamin methohydroxid a dehydroapocavidin zatím nebyly nalezeny jako přírodní alkaloidy. Z matečného louhu bylo získáno zanedbatelné mnoţství jodidu kvarterních alkaloidů označených CC2. Mohly by být charakterizovány pouze t.t. 162 C a R f hodnotami. Vzorek malého mnoţství jatrorrhizinu, kolumbaminu, magnoflorinu a dalších doplňkových neidentifikovaných alkaloidů byl také prokázán. Alkaloidy z nadzemní části (0,46 % a 0,84 %) byly studovány z důvodu určení absolutní konfigurace a byly nalezeny stejné alkaloidy jako v hlízách rostliny 23 - bulbokapnin, protopin, stylopin, kapnoidin, domestin (nantenin), predicentrin, isoboldin, koptistin a korysamin. Byl nalezen také glaucin, který byl izolován dříve neţ korysamin, stopová mnoţství bulbokapninu methoiodidu a některé další neidentifikované alkaloidy. Také se objevilo zanedbatelné mnoţství nefenolického aporfinového alkaloidu označeného CCl 23, který vzhledem ke své stavbě je velmi pravděpodobně dehydrodomestin. Tento alkaloid byl nedávno detekován v Nandina domestica Thunb. S vyuţitím plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. V nadzemních částech rostliny a v hlízách jsem byla sledována přítomnost 1,2-methylendioxy-6a,7-dehydroaporfin- 21

10,11-chinonu, který byl izolován z nadzemních částí rostlin dymnivky duté 23. Tato modře zbarvená látka je ovšem důsledek vzdušné oxidace roztoku bulbokapninu a jedná se tedy o izolační artefakt. Z porovnání výsledků studie J. Slavíka vyplývá, ţe se sloţení alkaloidů z obou vzorků prakticky kvalitativně neliší, podstatné rozdíly ovšem byly v relativním zastoupení alkaloidů v hlízách. Zatímco byl poměr mezi C13- methylovanými a C13- nemetylovanými tetrahydroprotoberberiny v hlízách vzorku 1 okolo 1:0,6 ve vzorku 2 to bylo 1:5,5. Tyto rozdíly jsou evidentní s přihlédnutím k existenci různých chemotypů v druzích Corydalis cava 27. N koptistin + X Me Me Me N palmatin + X Me 22

Me Me + N Me Me Me X Me N-methyllaudanidin Me Me Me Me glaucin N Me Me H bulbokapnin N Me Me Me N Me Me tetrahydropalmatin 23

Me Me Me N thaliktrivacin 3.3. Farmakologické účinky obsahových látek rostliny Rostlina obsahuje ve všech částech, především v hlízách, alkaloidy korydalin, korybulbin, bulbokapnin, korytuberin, korydin aj. Jejich mnoţství závisí na ţivotních podmínkách rostliny. Extrakt z rostliny sniţuje krevní tlak a tlumí střevní peristaltiku. Působí na ústřední nervovou soustavu, tlumí činnost předního mozku a prodlouţené míchy. Větší dávky vyvolávají stavy podobné zánětům mozkových blan. Z hlíz izolovaný bulbokapnin se aplikuje při třesu, např. u paralysis agitans 28. Berberin, jatrorrhizin a palmatin v malém mnoţství nevyvolávají příznaky otravy, ale v mnoţství větším dráţdí nervový systém, mohou způsobit ochrnutí dýchacích center a tedy i smrt. Takové fatální otravy však u člověka nebyly pozorovány, byly zaznamenány jen otravy lehčí doprovázené omámením, zvracením a průjmem, ale u zvířat, jako jsou ovce a kozy, byly smrtelné otravy zaznamenány kvůli příliš vysokému poţeru rostlin rodu Corydalis. Stylopin byl uţíván v orientálních státech na odstranění bradavic, papilomat, kondylomat, a také na léčbu jaterních onemocnění. Stylopin nemá cytotoxické působení, ale v závislosti na koncentraci redukuje produkci N (oxid dusnatý-endoteliální relaxační faktor), PGE 2 (prostaglandin), TNFα (tumor nekrotizující faktor), a interleukinů IL-1b a IL-6 a aktivitu CX-2 (indukovatelný typ cyklooxygenasy). Tento biologický efekt pravděpodobně podporuje protizánětlivé působení rostliny 29. Protopinové alkaloidy, např. protopin a allokryptopin, patří k nejrozšířenějším alkaloidům v rostlinách, zejména v čeledi makovitých (Papaveraceae) 30. V poslední době je 24

zvýšený zájem o protopin z hlediska farmakologie pro jeho příznivé účinky na kardiovaskulární systém 31 a antitrombotickou aktivitu 32. V čínské tradiční medicíně se běţně pouţívá druh Corydalis yanhusuo, který se z důvodu klinicky zdokumentovaných vedlejších účinků nepouţívá v těhotenství. Tato droga při dlouhodobém uţívání působí hepatotoxicky. Můţe mít za následek aţ dýchací, nervové a srdeční deprese. Corydalis yanhusuo můţe být s opatrností pouţita u pacientů s hypothyreózou. Je tradičně pouţívána v léčbě hyperaktivity a nespavosti a můţe být také pouţita ke kontrole třesu spojeného s úzkostí nebo jiného nespecifického třesu i jako diuretikum 33. Velice často se tato droga téţ vyskytuje ve směsích proti menstruačním bolestem. Dymnivka kromě toho uklidňuje a působí relaxačně na svaly. Napomáhá dilataci cév a hojí ţaludeční vředy. Pouţívá se při náladovosti a proběhly pokusy zapojit tuto bylinu do léčby Parkinsonovy choroby. Její účinné alkaloidy totiţ blokují receptory dopaminu v mozku, a tím pádem zklidňují. Na centrální nervový systém působí jako hypnotikum a sedativum 34. Hlavní pouţití je ve směsích s jinými drogami. Pouţívání těchto drog ve směsích ve východní medicíně je výhodnější po všech stránkách, hlavně z pohledu vedlejších účinků, které látky jako např. tetrahydropalmatin způsobují. Tetrahydropalmatin, jenţ má sedativní, analgetické, utišující a hypnotické vlastnosti, působí na centrální nervový systém a zdá se, ţe příznivě ovlivňuje srdeční rytmus a krevní tlak a tím sniţuje riziko infarktu a mrtvice 35. Tetrahydropalmatin také působí proti přilnavosti krevních destiček, mírně zlepšuje srdeční arytmii a má také protikřečové působení, protoţe inhibuje uvolňování dopaminu z amygdoidálního tělíska v mozku. Denní dávka pro dospělého člověka se pohybuje od 3 do 6 g sušené hlízy Corydalis v odvaru, prášku nebo pilulce 36. 25

3.4. Biologická aktivita obsahových látek 3.4.1. Popis a působení enzymu acetylcholinesterasy Enzym acetylcholinestersa (AChE) působí v lidském těle na nervových synapsích tak, ţe rozkládá neurotransmiter acetylcholin (ACh) na kyselinu octovou a cholin a má klíčovou roli v přenosu nervového signálu. Jeho inhibicí, ať uţ reversibilní nebo ireversibilní, dochází k nahromadění ACh na muskarinových a nikotinových receptorech a tím k jejich hyperstimulaci 37. Důleţitou částí AChE, která napomáhá při štěpení ACh, je anionické centrum. ACh se váţe k anionickému centru enzymu kvartérním dusíkem a poté je rozloţen deprotonizovaným hydroxylem aminokyseliny serinu esteratického centra. Strukturně podobné látky obsahující kvartérní dusík vykazují rovněţ zvýšenou afinitu k AChE. Jejich navázáním k enzymu dochází k reversibilní nejčastěji kompetitivní inhibici enzymu 38. Inhibitory AChE jsou v současnosti uţívány jako pesticidy (parathion, malathion), léčiva Alzheimerovy choroby (takrin, donepezil, rivastigmin, galantamin), k léčbě myastenia gravis (neostigmin, pyridostigmin), k premedikaci před otravou nervově paralytickými látkami (SAD- 128) či v oftalmologii 39. V posledních několika letech znalosti o struktuře, vlastnostech či mechanismu inhibice a reaktivace AChE značně pokročily. Rychlý vývoj výkonných počítačů a nových metod teoretické chemie umoţnil studovat chování látek bez toho, aniţ by se musel uskutečnit jediný experiment, coţ je velice výhodné z hlediska jak finanční, tak časové náročnosti 40. Alzheimerova choroba je nejvíce převládající příčina demence u seniorů. Podle cholinergní hypotézy jsou paměťová zhoršení u pacientů trpící Alzheimerovou chorobou důsledkem sníţené hladiny acetylcholinu (ACh) v kůře mozkové 41. Ve zdravé mozkové tkáni je acetylcholinesterasa nejdůleţitější enzym regulace hladiny acetylcholinu a butyrylcholinesterasa hraje menší roli. U pacientů s AD úroveň aktivity acetylcholinesterasy klesá za vzrůstu aktivity BuChE. V současné době je inhibice cholinesteras nejvíce pouţívaným způsobem léčby Alzheimerovy choroby a AChE stejně jako BuChE jsou léčebným cílem pro zlepšování cholinergního deficitu 42. 26

3.4.2. Metoda pro primární screening potenciálních AChE a BuChE inhibitorů Pro primární screening potenciálních inhibitorů AChE a BuChE z rostlinných extraktů byla vyvinuta jednoduchá a rychlá bioautografická metoda na TLC deskách. Inhibiční aktivita je detekována přeměnou 1-naftyl-acetátu na naftol, která je doprovázena odpovídající barevnou reakcí fialového diazonia s Fast Blue B solí. Látky inhibující cholinesterasy zanechávají bílé zóny na fialovém pozadí TLC desek. Jako standardy citlivosti této metody se pouţívají alkaloidy galanthamin a fysostigmin, v praxi známé inhibitory AChE 43. 3.4.3. Inhibice AChE a BuChE alkaloidy izolovanými z Corydalis cava Tři benzylisoquinolinové alkaloidy bulbokapnin, korydalin a korydin izolované z Corydalis cava 19 byly testovány jako potenciální inhibitory AChE a BuChE 44. Výsledky této studie jsou shrnuty v následující tabulce. Tab. 3: Inhibiční aktivita bulbocapninu, corydalinu a corydinu in vitro IC50 (μm) AChE BChE Bulbokapnin 40 ±2 83±3 Korydalin 15±3 >100 Korydin >100 52±4 Galantamin 1,4 ± 0,2 4,0 ± 1,4 Z těchto výsledků plyne, ţe jejich inhibiční aktivity vůči AChE a BuChE jsou menší, neţli je aktivita galanthaminu, který se vyuţívá v terapii Alzheimerovy choroby. becně jsou protoberberinové alkaloidy slabými inhibitory AChE a BuChE 45. 27

4. Experimentální část 28

4.1. Všeobecné postupy 4.1.1. Destilace a odpařování Rozpouštědla byla před pouţitím destilována, nejprve byl zachycen předek (asi 5%; většinou s vodným azeotropem), poté bylo vydestilováno zbylých cca 90 % rozpouštědla. Rozpouštědla byla uchovávána v hnědých nádobách. dpařování chromatografických frakcí bylo prováděno na vakuové odparce při 40 C za sníţeného tlaku. 4.1.2. Chromatografie 4.1.2.1. Tenkovrstvá chromatografie Chromatografie na tenké vrstvě byla pouţita v systému normálních komor. Ty byly pouţity nasycené mobilní fází. V případě uţití malých komor (válcových), průměr 10 cm, trvalo sycení asi 30 minut. U klasických komor (18 18 cm) pak asi hodinu. Chromatografie byla prováděná vzestupně. 4.1.2.2. Sloupcová chromatografie Sloupcová chromatografie byla prováděna systémem gradientové eluce na silikagelu L, 0,1-0,2 mm, desaktivovaném 10 % vody. Sloupec byl plněn obvyklým způsobem nalitím suspenze adsorbentu v rozpouštědle do sloupce. Vzorek byl po vysušení v exsikátoru nanesen na roztěru s malým mnoţstvím silikagelu. 4.2. Materiál a vybavení 4.2.1. Rozpouštědla a chemikálie Rozpouštědla: Cyklohexan, p. a. Diethylamin, p. a. Diethylether, p. a. bez stabilizátoru 29

DMS 5 mm DTNB Ethanol 95%, denaturovaný methanolem, p. a. n-hexan, p. a. Chloroform p. a. Toluen, p. a. Chemikálie: 10 mm acetylcholin jodid 10 mm butyrylcholin jodid 0,1 M fosfátový pufr ph 7,4 Dusičnan bismutitý zásaditý, p. a. Hemolyzát červených destiček z lidské krve Hydroxid sodný, p. a. Kyselina octová 99%, p. a. Kyselina sírová 96%, p. a. Kyselina vinná Plazma z lidské krve Uhličitan sodný bezvodý, p. a. Vodný roztok chlorovodíku 36%, p. a. 4.2.2. Chemikálie a materiál ke stanovení účinku erytrocytární AChE (IC 50 ) Chemikálie: Acetylthiocholinjodid, 99% (Sigma-Aldrich) 5,5 -Dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina), 98% (Sigma-Aldrich) Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného, p.a. (Lachema) Dodekahydrát hydrogenfosfrečnanu disodného, p.a. (Lachema) Ethanol, (Sigma-Aldrich) Eserin 30

Fast Blue B, (Sigma-Aldrich) Galanthamin Materiál: Hemolyzát lidských erytrocytů, který slouţil jako zdroj acetylcholinesterasy: plná krev byla odstředěna po dobu 15 minut při 10000 ot./min, získaná erytrocytární masa byla 3 promyta 0,1 M fosfátovým pufrem, ph 7,4 aby byly odstraněny zbytky plazmy; 10% (v/v) hemolyzát byl připraven ve vodě. Plastové kyvety DISPLABKARTELL 1937 PS MICRCUVETTES 4.2.3. Přístroje Centrifuga typ MPW-340 (Mechanika precyzyjna, Varšava, Polsko) ph metr Ф 72 METER (Beckmann, USA) UV - spektrofotometr UVIKN 942 (Kontrol instruments, Švýcarsko) 4.2.4. Detekční činidla D 1: Dragendorffovo činidlo modifikované podle Muniera - pro alkaloidy a ostatní sloučeniny obsahující dusík. - roztok A: se připraví rozpuštěním 1,7 g zásaditého dusičnanu bismutitého a 20 g kyseliny vinné v 80 ml vody. - roztok B: se připraví rozpuštěním 16 g jodidu draselného ve 40 ml vody. - zásobní roztok: připravíme smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Ten můţe být uloţený i několik měsíců v lednici. - činidlo pro analýzu: bylo připraveno tak, ţe se k roztoku 5 ml kyseliny vinné rozpuštěné v 50 ml vody přidalo 5 ml zásobního roztoku. 4.2.5. Chromatografické adsorbenty A 1: Kieselgel 60 F 254, Merck, 5 10 cm 31

Hliníková deska s vrstvou silikagelu pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagel 60 F 254, tloušťka vrstvy 0,2 mm. A 2: xid hlinitý neutrální, 0,1-0,2 mm A 3: Silikagel L, 0,2-0,4 mm Komerční adsorbent zrnitosti 0,2-0,4 mm, se na suchém sloupci promyje nejprve chloroformem, poté destilovaným ethanolem. Po vyjmutí ze sloupce se vyčištěný adsorbent suší několik dní na bezprašném místě. Po vytěkání rozpouštědel se aktivuje na tenké vrstvě (do 2 cm výšky) 4 hodiny při 160 C. Po zchladnutí na 80 C se adjustuje do dobře uzavíratelných lahví. A 4: Silufol UV 254, Kavalier Votice, 20 10 cm 4.2.6. Vyvíjecí soustavy pro tenkovrstvou chromatografii S 1: Toluen + CHCl 3 + EtH + Et 2 NH 70:20:10:3 S 2: Toluen + Et 2 NH 9:1 4.2.7. Vyvíjecí soustavy pro preparativní TLC S 1: Toluen + n-hexan + Et 2 NH 45:45:10 4.3. Příprava a zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava 4.3.1. Původ drogy Dodavatel drogy: Megafyt s. r. o., Vrané nad Vltavou, 04/2006; droga pochází ze sběru v Chorvatsku, dodáno firmou Jugodrvo. 4.3.2. Příprava a čistění výtřepku Corydalis Cava Příprava extraktu 32

Extrakt byl připraven z 11,3 kg suchých hlíz, které byly nejprve extrahovány 95% etanolem, po běţném čištění byly nejprve odstraněny terciární baze při ph 9-10 (extrakt A- diethylether), dále terciární baze při ph 12 (extrakt B-diethylether). Inkriminovaný výtřepek B- chloroform byl připraven vytřepáním zbylého vodného extraktu; přešly do něho alkaloidy málo rozpustné v diethyletheru (80 g tmavě hnědého, velmi viskózního odparku). Čištění výtřepku B - chloroform 80 g odparku bylo rozpuštěno v 800 ml 1% kyseliny sírové, vyloučily se pryskyřičnaté podíly, roztok byl zfiltrován, zalkalizován na ph 12 20% NaH a vytřepán 11 250 ml chloroformu, organické výtřepky byly spojeny, vysušeny bezvodým síranem sodným a roztok odpařen. Vzniklo 68,6 g hnědého, velmi viskózního odparku. Pozn. Příprava výtřepku B byla mimo rámec diplomové práce. br. 3 Detekce výtřepků z Corydalis cava rhizoma (Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), To+Chf+EtH+Et 2 NH = 70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 1, detekce Dragendorffovým činidlem podle Muniera). L - výtřepek éterem z kyselého roztoku alkaloidů - primárního extraktu A - vyčištěný éterový výtřepek (alkalizace 25% amoniakem, ph 9), B-Et 2 - surový výtřepek éterem (alkalizace 50% louhem, ph 12) B-Chf - surový výtřepek chloroformem (po vytřepání éterem, ph 12) J - kvartérní jodidy po vytřepání silných bazí (okyselení HCl, ph 3) 33

4.3.3. Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 68, 6 g výtřepku B/chloroform (viz. obr. 3) bylo rozpuštěno v chloroformu naneseno na kolonu a chromatografováno za účelem získání čistých alkaloidů (bliţší popis viz tab. 4 a 5). Tab. 4: Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis/B/CHCl 3 značení vzorku Hmotnost vzorku Druh a množství adsorbentu Vrstva s extraktem Dělicí vrstva Frakce (ml)/doba toku B-Chf, předčištěný. 68,0 g, temně hnědý, velmi viskózní Silikagel L, 0,2-0,4 mm, 1880 g, desaktivovaný 10 % vody 7,4 10 cm 7,4 92 cm 500 ml/35-40 minut Tab. 5: Výsledky sloupcové chromatografie výtřepku Corydalis/B/CHCl 3 Spoj. fr. Frakce Eluční systém značení na TLC Popis Hmotnost (g) 1-2 1-2 Chf 1 Hnědý, s náznakem 0,15 krystalů 3-5 3-5 Chf 2 Zelenobělavý, práškovitý 1,88 (drobně kryst.) 6-8 6-8 Chf 3 Zelený, velmi viskózní 0,32 9-15 9-12 Chf 13-15 Chf + 2 % EtH 4 Hnědý, krystalický 0,87 16-25 16-24 Chf + 2 % EtH 25 Chf + 5 % EtH 5 Hnědý, velmi viskózní 1,98 26-29 26-29 Chf + 5 % EtH 6 Černý, velmi viskózní 6,74 30-33 30-33 Chf + 5 % EtH 7 Černý, velmi viskózní 0,98 34-37 Chf + 5 % EtH 34-53 38-51 Chf + 10 % EtH 8 Černý, velmi viskózní 9,18 52-53 Chf + 25 % EtH 54-58 54-58 Chf + 25 % EtH 9 Černý, velmi viskózní 0,52 59-64 59-64 Chf + 25 % EtH 10 Černý, velmi viskózní 4,4 65-80 66-67 Chf + 25 % EtH 68-80 Chf + 50 % EtH 11 Černý, velmi viskózní 9,02 34

br. 4: Corydalis cava hlízy/b/chcl 3 (popis viz tab. 5) (Pozn. Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), Toluen+CHCl 3 +EtH+Et 2 NH=70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 2, detekce D1) 4.4. Zpracování frakce 2 dparek z frakce 2 (1,88 g) byl nanesen na sloupec s dostatečným mnoţstvím Al 2 3. Kolona byla promyta chloroformem. Všechny nazelenalé nečistoty byly zachyceny na Al 2 3. Podle sloţení vytékajícího eluentu jsme najímali 4 frakce, které byly podrobeny MS spektrometrii. Jako zdroj alkaloidu na základě MS interpretace byla zpracována podfrakce 2C. Podfrakce 2C byla za horka rozpuštěna v CHCl 3 a po kapkách přidáván toluen aţ do slabého zákalu, poté byla podfrakce prudce ochlazena a uloţena v lednici (48 hod.) do vyloučení ţlutých krystalů. Bylo získáno 692 mg ţlutých krystalů s bodem tání 194-196 C. Tab. 6. Výsledky zpracování frakce 2 frakce 2/A 2/B 2/C 2/D odparek 60 mg 743 mg 921 mg 176 mg oranţový prášek tmavě ţlutý prášek naţloutlý prášek oranţový prášek 35

4.5. Určení struktury izolované látky 4.5.1. Měření hmotnostního spektra Spektra byla měřena na LC/MS Thermo Finningan LCQDuo, iontová past, ionizace elektrosprejem v kladném módu (ESI+). Látka byla rozpuštěna v metanolu. 4.5.2. Měření NMR spektra Spektra byla měřena na spektrometru Varian Inova 500 s pracovní frekvencí 499.9 MHz pro 1 H a 125.7 MHz pro 13 C jádra. 13 C NMR spektra byla měřena v 5 mm SW širokopásmové sondě, 1 H a všechna 2D spektra v inverzní 5mm ID PFG sondě s vyuţitím standardních pulzních sekvencí. Experimenty byly měřeny v deuterochloroformu při 25 C. Hodnoty chemických posunů jsou v ppm a jsou vztaţeny k internímu standardu (hexamethyldisilan, 0,04 ppm, v 1 H spektrech) nebo signálu solventu (76,99 ppm, v 13C spektrech). (Dr. M. Kurfürst, Ph.D., Ústav chemických procesů, AV ČR, Praha). 4.6. Stanovení účinku alkaloidu na erytrocytární AChE (IC 50 ) 4.6.1. Podmínky měření Experimenty byly prováděny za těchto podmínek: při teplotě 25 C v prostředí PB při ph 7,4 při vlnové délce spektrofotometru 436 nm v jednorázových plastových kyvetách o tlouštce 1 cm 36

4.6.2. Stanovení hodnot IC 50 Pro stanovení inhibiční aktivity látek byla pouţita Ellmanova kolorimetrická metoda s pouţitím 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB) modifikovaná podle Bajgara 46. Jako substráty se pouţívají estery thiocholinu, které jsou cholinesterasami štěpeny na thiocholin a příslušnou kyselinu. Stanovuje se SH- skupina thiocholinu, která se naváţe na DTNB. Výsledkem je ţlutě zbarvený produkt, který se stanovuje spektrofotometricky při vlnové délce 436 nm. Sleduje se nárůst absorbance za 1 minutu. Slepý vzorek do kyvety je postupně přidáváno 10-25 μl hemolyzátu nebo plazmy, 200 μl DTNB, 25 μl rozpouštědla, ve kterém jsou rozpuštěny vzorky (DMS) a doplní se na objem 900 μl pufrem. Následně je přidáno 100 μl substrátu (acetylcholin jodid nebo butyrylcholin jodid). Nárůst absorbance je měřen při vlnové délce 436 nm. Měření je prováděno ve třech opakováních. Pro výpočet poklesu nárůstu absorbance byla pouţita průměrná hodnota. Měření vzorku - do kyvety je postupně přidáváno 10-25 μl hemolyzátu nebo plazmy, 200 μl DTNB, 25 μl měřeného vzorku v různých koncentracích a doplní se na objem 900 μl pufrem. Následně je přidáno 100 μl substrátu (acetylcholin jodid nebo butyrylcholin jodid). Nárůst absorbance je měřen při vlnové délce 436 nm. Měření je prováděno ve třech opakováních. 4.6.3. Matematické zpracování experimetalních dat Hodnoty IC 50 byly vypočítány z naměřených hodnot poklesu aktivity acetylcholinesterasy nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce Graph PaD Software, San Diego, CA, USA). 4.6.4. Výpočet poklesu ΔA % poklesu ΔA = 100 - ( ΔA SA /ΔA BL 100) ΔA SA nárůst absorbance za 1 minutu u měřeného vzorku ΔA BL nárůst absorbance za 1 minutu u slepého vzorku 37

5. Výsledky 38

Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byla izolovaná látka identifikována jako 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin 47 (5,8-dihydro-2,3,9,10-tetramethoxy- 8-(trichloromethyl)-6H-dibenzo[a,g]quinolizine). 5.1. Hmotnostní spektrometrie izolované látky ESI-MS m/z 471,5 [M+H] + (0,1), 435 [M-Cl] + (0,5), 352 [M-CCl 3 ] + (100). Data byla porovnána s hodnotami v literatuře 47. br. 5 MS spektrum isolované látky 39

5.2. NMR studie izolované látky Struktura izolované látky byla určena na základě interpretace 1 H- a 13 C-NMR spekter a jejich porovnání s daty v literatuře 47. 3 2 4 1 5 4a 6 13b N 13a 13 12a 8 8a Cl Cl Cl 9 12 10 11 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin 40

5.2.1. 1 H-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 1 H NMR (CDCl 3, 25 C): 1-H 7,18 s; 4-H 6,63 s; 5 -H 2,74 m; 5-H 3,41 m; 6 -H 3,74 m; 6-H 3,86 m; 8-H 5,64 s; 11-H 6,98 d; 12-H 6,89 d; 13-H 6,15 s; 2 (CH 3 ) 3,93 s; 3 (CH 3 ) s; 9 (CH 3 ); 10 (CH 3 ) 3,89 s. br.6 1 H-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 41

5.2.2. 13 C-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 13 C NMR (CDCl 3, 25 C): 1-C 107,12; 2-C 147,85; 3-C 149,23; 4-C 111,00; 4a-C 127,34; 5-C 29,98; 6-C 51,72; 8-C 73,63; 8a-C 114,86; 9-C 146,48; 10-C 149,63; 11-C 114,70; 12-C 118,48; 12a-C 129,51; 13-C 97,01; 13a-C 137,56; 13b-C 123,58; 2 (CH 3 ) 56,11; 3 (CH 3 ) 55,93; 8 (CCl 3 ) 105,60; 9 (CH 3 ) 60,95; 10 (CH 3 ) 56,30. br. 7 13 C-NMR spektrum 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu 42

decrease of A decrease of A 5.3. Výsledky testu vlivu látky na aktivitu AChE eserine 100 BuChE 80 AChE 0.001616 0.002168 60 40 20 0-8 -6-4 -2 0 log c 100 galanthamine 80 60 40 20 BuChE AChE 0.1560 0.006898 0-8 -6-4 -2 0 log c 43

decrease of A 100 80 60 01-09-FaF BuChE 115.0 AChE 0.08292 40 20 0-6 -4-2 0 log c Tab.7. Výsledky hodnocení účinku 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu na BuChE 8-trichloromethyl-7,8- dihydropalmatinu + BuChE IC 50 > 0,745 mm c original mm 29,8 2,98 0,298 0,0298 c result mm 0,745 0,0745 0,00745 0,000745 log c result -0,12784-1,12784-2,12784-3,12784 average decrease of ΔA 6,715873 2,627156 0 0 Tab. 8. Výsledky hodnocení účinku 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatinu na AChE 8-trichloromethyl-7,8- dihydropalmatinu + AChE IC 50 = 0,08292 mm c original mm 29,8 2,98 0,298 0,0298 0,00298 0,000298 c result mm 0,496667 0,049667 0,004967 0,000497 4,97E-05 4,97E-06 log c result -0,30393-1,30393-2,30393-3,30393-4,30393-5,30393 average decrease of ΔA 61,33491 52,22619 24,38934 8,644784 2,421189 0,032499 44

6. Diskuze Alkaloid 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin, označený pracovně jako 01-09-FaF, se v droze jako takové nevyskytuje. Vzniká během extrakce a sloupcové chromatografie za pouţití chlorovaných organických rozpouštědel, která mohou obsahovat rezidua vody, svých rozkladných produktů nebo jiných organických rozpouštědel. Rozpouštědla obsahující halogeny, např. chloroform, dichloromethan, jsou obecně nestálé. Chloroform můţe urychlit rozkladné procesy sloučenin, zvláště v případě, kdy není skladován za nepřístupu světla. V literatuře byl popsán vznik artefaktů při extrakci protoberberinových alkaloidů, jmenovitě berberinu a palmatinu. Vznik artefaktů palmatinu a berberinu byl pozorován také při jejich sloupcové chromatografii na silikagelu, při eluci chloroformem a methanolem (99:1, v/v). Bylo popsáno, ţe chloroform můţe přímo reagovat s molekulou alkaloidu, v tomto případě protoberberinového typu 47 za vzniku trichloromethyl-derivátů. Další artefakty izolované při chromatografii palmatinu na silikagelu chloroformem byly salautin, puntarenin a magallanesin. Me Me N Me saulatin Me N Me puntarenin Me 45

N Me magallanesin Me Struktura izolované látky nebyla na základě literární rešerše překvapující. Přestoţe se nejedná o látku přírodně se vyskytující, byla provedena studie její inhibiční aktivity vůči AChE a BuChE a stanoveny hodnoty IC 50. Tyto hodnoty byly výrazně vyšší, neţli hodnoty IC 50 standardů (galanthamin, eserin). Z výsledků tedy vyplývá, ţe izolovaná látka je spíše nezajímavá z hlediska dalšího vyuţití jako léčiva. 46

7. Pouţitá literatura 1 Pydychová, E.: Alzheimerova nemoc. Solutio 2002/2003, 2002, 21-28. 2 pletal, L., pletalová, V.: Současné uplatnění některých přírodních látek v terapii demencí Alzheimerova typu; Sborník abstraktů z 34. konference: Syntéza a analýza léčiv; Brno 12. 2005, 14.9.2005, 26. 3 Chung, Y. K.,Heo, H. J., Kim, E. K., Kim, H.K., Huh, T.L., Lim, Y., et all.: Mol. Cell. 2002,13, 113-117. 4 rphan, I., Terzioglu, S., Sener, B.: Planta Med. 2003, 69, 265-267. 5 Kim H. M.: Korean Konga Taeho Kongo 2004, CDEN:KRXXA7 KR 2004064485 A 20040719 Patent written in Korea. Application: KR 2003-2111 20030113. Priority: Chem. Abstr. 2006: 740561 6 http://botany.cz/cs/corydalis-cava/, vystaveno 3. 2. 2009. 7 http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id15565/?taxonid=3475, vystaveno 3. 2. 2009. 8 http://en.wikipedia.org/wiki/corydalis, vystaveno 3. 2. 2009. 9 http://rostliny.prirodou.cz/?rostlina=corydalis_cava, vystaveno 3. 2. 2009. 10 http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id19687/?taxonid=3475, vystaveno 3. 2. 2009. 11 Hejný S., Slavík B.: Květena ČSR 1. Díl, Academia Praha: 497 (1988). 12 Tutin, T. G. et al., eds.: Flora europaea, second edition. (F Eur ed2) 1993. 13 http://www.lokality-rostlin.cz/?rostlina=corydalis_cava, vystaveno 3. 2. 2009. 14 HagerRM 2006 Springer Medizin Verlag Heidelberg, 2006, Page 1-3. 15http://kanaya.naist.jp/knapsack_jsp/information.jsp?mode=r&word=C00001916&key=1, vystaveno 3. 2. 2009. 16 Henry T. A.: The Plant Alkaloids, 4th Ed. Churchill, London 1949. 17 Manske R. H. F., Holme H. L.: The Alkaloids, Vol. IV. Academic Press, New York 1954. 18 Šantavý F.: The Alkaloids (R. H. F. Manske, Ed.) Vol.XII, Academic Press, New York 1970. 19 Slavík, J., Slavíková, L.: Coll. Czech. Chem. Comm. 44, 2261 22741979. 20 Bo Ding,Tingting Zhou.: J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 45, 219-226. 47

21 Preininger V.: The Alkaloids (R. H. F. Manske, Ed.) Vol. XV, Academic Press, New York 1975. 22 Kondo Y.: Heterocycles 4, 197; 1976. 23 Preininger V., Thakur R. S., Šantavý F.: Pharm. Sci. 1976, 65, 294. 24 Slavík J., Slavíková L.: Coll. Czech. Chem. Comm., 1979, 44, 2262. 25 Bohlmann, F.: Chem. Ber., 1958, 91, 2157. 26 Novák, V. Slavík, J.: Czech. Chem. Comm., 1974, 39, 3352. 27 Slavík, J. Slavíková, L.: Coll Czech. Chem. Comm., 1979, 44, 2265. 28 http://www.platinum.wu.cz/schola/alkaloidy.htm,, vystaveno 3. 2. 2009. 29 Jang, S. Kim, B.H. Lee, W.-Y., An, S.J., Choi, H.G., et all.: Arch. Pharm. Res. 2004, 27(9), 923-929. 30 Guinaudeau, H. Shamma, M.: J. Nat. Prod. 1982, 45, 237. 31 Song, L.S. Ren, G.J. Chen, Z.L. Chen, Z.H. Zhou, Z.N. Cheby, H.: Br. J. Pharmacol. 2000, 129, 893. 32 Saeed, S.A. Gilani, A.H. Majoo, R.U. Shah, B.H.: Pharmacol. Res. 1997, 36, 2. 33 Lai, Chan 1999, Horowitz, Feldhaus, Dart et al. 1996. 34 Tierra, M.: The Way of the Chinese Herbs, Pocket Books, 228, New York, 1998. 35 Horowitz RS, Feldhaus K, Dart RC et al. The clinical spectrum of Sin Bu Huan toxicity. Arch. Intern. Med., 1996, 156:899-903. 36 Lai CK, Chan AY.: Clin Chem., 1999, 45, 229-236. 37 Taylor P.: Anticholinergic agents., The Pharmacological Basis of Therapeutics. (J.G. Hardman & L.E. Limbird, eds), McGraw Hill, New York, 1996. 38 Lullmann H., Mohr K., Wehling M.: Farmakologie und Toxikologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1999. 39 Quinn D. M.: Chem Rev. 1987, 87, 955. 40 Lushington, G. H. Jian-Xin, Guo. Hurley, M. M.: Curr. Top. Med. Chem. 2006, 6, 57. 41 Lahiri, D.K. Farlow, M.R. Greig, N.H. Sambamurti, K.: Drug Dev. Res. 2002, 56, 267 281. 42 Greig, N.H. Lahiri, D.K. Sambamurti, K.: Inter. Psychoger. 2002, 14, 77 91. 48

43 Marston, A. Kissling, J. Hostettmann, K.: Phytochem. Anal., 2002, 13(1), 51-54. 44 Halbsguth, C. Meissner,. Häberlein, H.: Planta Medica, 2003, 69, 305 309. 45 Adsersen, A. Kjølbye, A. Dall,. Jäger, A.K.: J. Ethnopharmacol. 2007, 113, 179-182. 46 Bajgar, J.: Voj. Zdrav. Lis. 1972, 41(2), 78-80. 47 Marek, R. Sečkářová, P. Hulová, D. Marek, J. Dostál, J.: J.Nat. Prod. 2003, 66, 481-486. 49

8. ABSTRAKT 50

Průša, J.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin XI.; Alkaloidy Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) a jejich účinek na acetylcholinesterasu a butyrylcholinesterasu. Diplomová práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, Hradec Králové 2009, 52 stran. V rámci screeningu rostlin s obsahem alkaloidů, které inhibují aktivitu lidské erytrocytární acetylcholinesterasy byla podrobena Dymnivka dutá (Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte, Fumariaceae). K izolaci alkaloidů bylo pouţito 11,3 kg sušených hlíz; z vyčištěného ethanolového extraktu byly získány směsi isochinolinových alkaloidů různých strukturních typů. Práce spočívala v dělení alkaloidů chloroformového výtřepku B (68,6 g), z této směsi byl pomocí sloupcové chromatografie a krystalizace izolován 8-trichloromethyl-7,8- dihydropalmatin, coţ je izolační artefakt palmatinu, vznikající při extrakci chlorovanými rozpouštědly (na základě výsledků z 1 H-NMR spekter, ESI-MS a porovnáním fyzikálně chemických charakteristik izolované látky s údaji v literatuře). Biologická inhibice lidské erytrocytární acetylcholinesterasy byla IC 50 = 0,08292 mm a butyrylcholinesterasy IC 50 > 0,745 mm. V porovnání s biologickou aktivitou standardních alkaloidních inhibitorů acetylcholinesterasy (galnthaminu a eserinu) se jedná o látku spíše nezajímavou z hlediska dalšího studia přírodních látek, které by se mohli uplatnit jako léčiva Klíčová slova: Corydalis cava, 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin, alkaloidy, acetylcholinesterasa. 51

Průša, J.: Biological aktivity of plant metabolites XI.;Alkaloids of Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) and their activity on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. Diploma thesis, Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Botany and Ecology, Hradec Králové 2009, 52 pages. Within the screening of plants that contains alkaloids inhibiting activity of the human erythrocytic acetylcholinesterase Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte, (Fumariaceae) was studied. 11,8kg of the roots served for the isolation of alkaloids. Mixtures of various structurally types of isochinolic alkaloids were obtained from the purified ethanolic extrakt. My task was to separate alkaloids of the B extract in chloroform (68,6 g). Using both column chromatography and crystallization 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin was isolated. The 8-trichloromethyl- 7,8-dihydropalmatin is an artefact of palmatin rising during extraction by chlorinated solvents (with help of 1 H-NMR, ESI-MS and comparing its physico-chemical characteristics with the published data). The isolated compound inhibited the human erythrotic acetylcholinesterase with IC 50 = 0,08292 mm and butyrylcholinesterase IC 50 > 0,745 mm. Comparing its biological activity with the standard of alkaloid inhibitors (galanthamine, eserine) the isolated substance is not very useful regarding further studies of natural products that could serve as lead compounds for the developtment of potencial drugs. Keywords: Corydalis cava, 8-trichloromethyl-7,8-dihydropalmatin, alkaloids, acetylcholinesterase. 52