SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU Nikola Burianová Experimentální biologie 2.ročník navazujícího studia Katedra Fyziky Ostravská univerzita v Ostravě
OBSAH Rubisco Tok CO2 do chloroplastu Obsah Rubisco a [CO 2 ] Metody studia obsahu a aktivity enzymu Rubisco SDS-PAGE Spektrofotometrické stanovení aktivity Gazometrie
RUBISCO Enzym ribulóza -1,5- bisfosfát karboxyláza/oxygenáza Až 50% všech rostlinných proteinů 2 funkce -karboxylační(co 2 ) -oxygenační(o 2 ) Společná akceptorová molekula = ribulóza - 1,5 bisfosfát Karboxylázová aktivita = Calvinův cyklus Oxygenázová aktivita = fotorespirace Obrázek č.1: Struktura enzymu Rubisco (dostupné z http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/038/)
FOTORESPIRACE Oxygenátová aktivita enzymu Rubisco Vznik 1molekuly 3 - fosfoglycarátu a 1 molekuly fosfoglykolátu Fosfoglykolát vstupuje do procesu fotorespirace Probíhá na třech místech: peroxyzomy, mitochondrie a chloroplasty = snížení účinnosti fotosyntetické fixace CO 2 Významný je poměr koncentrací CO2 a O2 v chloroplastu Chrání rostlinu před fotoinhibičním poškozením Obrázek č.2: Fotorespirace (dostupné z http://www.tutorvista.com/content/biology/bio logy-iv/photosynthesis/photorespiration.php#)
[CO2] TOK CO 2 DO CHLOROPLASTU Koncentrace CO 2 v atmosféře 380ppm. Difúzní cesta oxidu uhličitého = C a, C s, C i, C ias, C c Koncentrace CO 2 se na jednotlivých úrovních postupně snižuje Koncentrace O 2 je všude stejná 400 300 200 100 Koncentrace CO2 na jednotlivých úrovních difúzní cesty z okolní atmosféry do chloroplastu 0 Ca Cs Ci Cias Cc Obrázek č. 3: Tok CO 2 z atmosféry do chloroplastu (převzato od J. Flexas et al., 2008) Snižování koncentrace oxidu uhličitého je dáno řadou odporů v jednotlivých částech listu (hraniční vrstva, průduchy, mezibuněčné prostory, mezofyl) Opakem odporu je vodivost g=1/r g m = mezofylová vodivost
OBSAH RUBISCO A [CO 2 ] Rubisco x [CO 2 ] Množství Rubisca u stinných a slunných listů se liší. Slunné listy mají větší množství tohoto enzymu. A N = g m (C i C c ) C c = C i A N/gm Obrázek č.4: Vztah mezi obsahem enzymu Rubisco na plochu chloroplastů a koncentrací oxidu uhličitého v chloroplastech (převzato a upraveno od I. Terashima et al., 2011)
CÍL PRÁCE Množství a aktivita klíčového enzymu fotosyntézy musí být optimalizována na danou koncentraci CO 2 v chloroplastu z důvodu maximálního využití energie generované v rámci primárních fotochemických reakcí.
METODY STUDIA OBSAHU A AKTIVITY ENZYMU RUBISCO SDS-PAGE stanovení obsahu Spektrofotometrické stanovení aktivity Gazometrie
SDS-PAGE Nejefektivnější a nejužívanější metoda pro dělení makromolekul Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu = elektromigrační metoda Nosič gel (koopolymerace dvou monomerů akrylamidu a N,N -methylen-bis(akrylamidu) za účasti peroxodisíranu amonného) Stabilizátor volných radikálů - N,N,N,N tetramethylethylendiamin (TEMED)
SDS-PAGE V našem případě se jedná o elektroforézu s přídavkem SDS=dodecyl sulfát sodný Váže se na bílkoviny v určitém poměru a udává jim záporný náboj Bílkoviny jsou separovány pouze na základě jejich molekulové hmotnosti Diskontinuální elektroforéza = zaostřovací a separační gel Zaostřovací gel zkoncentrování bílkovin do tenké lajny Separační gel samotná separace bílkovin Obrázek č.5: Schéma SDS-PAGE (dostupné z http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/b Course_Information/4581/techniques/gel_ elect/page_protein.html)
VYHODNOCENÍ SDS-PAGE Elektroforéza probíhá při 80V cca 1h 45min Po ukončení elektroforézy je třeba bílkoviny zviditelnit Gel postupně vkládáme do: - stabilizační roztok (5min) - barvící roztok (30min) - odbarvovací roztok
OBSAH ENZYMU RUBISCO 25 Obsah Rubisco [mg * g-1] 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 Line
KALIBRACE METODY 100 R 2 = 9.886 R 2 = 9.934 R 2 = 9.9119 Obsah Rubisco [mg * g-1] 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Ředění [%] Ředění [%] Ředění [%]
OBSAH RUBISCA U VÍCE A MÉNĚ OZÁŘENÝCH LISTŮ
AKTIVITA RUBISCO ribosa-5-fosfát...(ribosa -5- fosfátisomerasa) ribulosa-5-fosfát (I) ribulosa-5-fosfát + ATP (ribulosa -5- fosfátkinasa).ribulosa-1,5-bisfosfát + ADP + H+ (II) ribulosa-1,5-bisfosfát + CO 2 + H 2 O. (Rubisco).. 2(3-fosfoglycerát) + 2H+ (III) 3-fosfoglycerát + ATP (fosfoglyce rátkinasa).. 1,3-bisfosfoglycerát + ADP (IV) 1,3-bisfosfoglycerát + NADH + H +.(glyceralde hyd-3- fosfátdehydrogenasa ) glyceraldehyd-3- fosfát + NAD+ + HPO 4 (V) 2-fosfokreatin + 2 ADP. (kreatinfos forkinasa ).2-kreatin + 2 ATP (VI) Založeno na spřažení prvních tří reakcí Calvinova cyklu Jako substrát byla použita ribosa-5-fosfát, která se v reakční směsi transformuje na ribulosa-1,5-bisfosfát enzymy obsaženými v extraktu (rovnice I a II) Do reakční směsi byly přidány enzymy, které katalyzují reakce (III V), NADH a ATP Konečným produktem reakce je glyceraldehyd-3-fosfát (reakce III-V) Aby se zabránilo hromadění ADP je,který inhibuje enzym fosfoglycerátkinázu, je ATP fosforylováno v reakci (VI) Aktivita Rubisca byla stanovena z úbytku absorbance při oxidaci NADH
SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMU RUBISCO Změna absorbance při oxidaci NADH při 340nm, kdy dochází k oxidaci NADH na NAD+ Měříme rychlost oxidace NADH Obrázek č. 6: Oxidace NADH na NAD sledováno poklesem absorbance (dostupné z http://www.wikiskripta.eu/index.php/spektr ofotometrie)
GAZOMETRIE Měření asimilace CO 2 Změna koncentrace CO 2 v okolní atmosféře listu pomocí IRGA A N = g m (C i C c ) --------> C c = C i A N/gm
GAZOMETRIE A N = F *(c I c o )/S E = F (w o w I )/S g sw = E/(w s Tl w O ) c i = c a (1.6A N /g sw ) Výsledkem jsou A/C i křivky
METODA VARIABILNÍHO ELEKTRONOVÉHO TRANSPORTU A N = g m (C i C c ) --------> C c = C i A N /g m Závisí na základním vztahu mezi rychlostí fotosyntetického elektronového transportu(fluorescence), rychlostí asimilace CO 2 a koncentrací CO 2 v místě karboxylace (gazometrie). 4e/ CO 2
NÁVRH EXPERIMENTU Mezidruhové změny Adaptace struktury listu na různou ozářenost Rostliny: - řepeň durkoman - špenát - fazol - slunečnice - paprika nebo tabák
DĚKUJI ZA POZORNOST