VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENSKÁ PRÁCE

VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENSKÁ PRÁCE Praha 2015 Eliška Horáková

Vyšší odborná škola zdravotnická a střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Absolventská práce Eliška Horáková Klinické aplikace a disoluce Niaspanu - ověření postupného uvolňování niacinu metodou HPLC za různých podmínek disoluce Clinical Application and Niaspan Dissolution the gradual release check of the Niacin by HPLC method in the diverse Conditions of Dissolution Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Datum odevzdání práce: 20. 4. 2015 Datum obhajoby: červen 2015 Praha 2015

Prohlášení Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité parametry jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 20. dubna 2015 Podpis

Poděkování Děkuji Mgr. Barboře Staňkové, za odborné vedené absolventské práce.

Souhlasím s tím, aby byla moje absolventská práce půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

Abstrakt Jméno: Eliška Horáková Název práce: Klinické aplikace a disoluce Niaspanu - ověření postupného uvolňování niacinu metodou HPLC za různých podmínek disoluce Název anglicky: Clinical Application and Niaspan Dissolution the gradual release check of the Niacin by HPLC method in the diverse Conditions of Dissolution Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2015, 59 stran Kyselina nikotinová (niacin) podávaná ve vysokých dávkách má prokazatelné hypolipidemické účinky. Příznivě ovlivňuje hladiny krevních lipidů (snižuje triacylglyceroly, LDL cholesterol a lipoprotein (a) za současného zvýšení HDL cholesterolu). V posledních letech byly popsány také její extrahypolipidemické účinky. K léčbě dyslipidémií se používá více než 50 let, jejímu širokému klinickému využití ovšem brání některé nežádoucí účinky, zejména flush. Jeho odstranění lze dosáhnout podáváním niacinu ve formě tablet s řízeným (zpomaleným) uvolňováním. V České republice momentálně není kyselina nikotinová jako hypolipidemikum k dispozici, používání preparátu Tredaptive bylo pro své nežádoucí účinky pozastaveno. V USA se běžně farmakoterapeuticky používá preparát Niaspan v lékové perorální formě s postupným uvolňováním. Cílem předkládané práce bylo určit rychlost uvolňování kyseliny nikotinové z preparátu Niaspan zkouškou disoluce in vitro v prostředí ph 1,2; 4,5 a 6,8 po dobu 24h a porovnat ji s rychlostí uvolňování niacinu z tablet Tredaptive. Celkem bylo studováno 36 tablet Niaspanu s obsahem 500 mg a 1000 mg niacinu a 18 tablet preparátu Tredaptive s obsahem 1000 mg niacinu. Koncentrace uvolněné kyseliny nikotinové byla stanovena metodou HPLC se spektrofotometrickou detekcí v UV oblasti. Disoluční křivky Niaspanu a Tredaptive se významně lišily. U přípravku Tredaptive došlo po čtyřech hodinách k uvolnění veškerého niacinu ve všech ph. Za stejnou dobu se u Niaspanu v ph 1,2 uvolnilo 50% niacinu, v ph 4,5 a 6,8 dokonce jen 30%. Rychlost uvolňování niacinu z obou dávek Niaspanu byla stejná. Příliš rychlé uvolňování niacinu z tablet Tredaptive může mít za následek sníženou bezpečnost přípravku. Klíčová slova: niacin, flush, hypolipidemické účinky, postupné uvolňování, disoluce, Niaspan, Tredaptive

Abstract Jméno: Eliška Horáková Název práce: Klinické aplikace a disoluce Niaspanu - ověření postupného uvolňování niacinu metodou HPLC za různých podmínek disoluce Název anglicky: Clinical Application and Niaspan Dissolution the gradual release check of the Niacin by HPLC method in the diverse Conditions of Dissolution Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2015, 59 stran Nicotinic acid (niacin) at high doses has been proven to have hypolipidemic effects. Positively influences levels of blood lipids (lowers triglycerides, LDL cholesterol, lipoprotein (a) and increases HDL cholesterol). Recently, there have also been discovered extrahypolipidemic effects. It has been used for the treatment of dyslipidaemia for more than 50 years; however its broad clinical usefulness is limited by side effects, particularly the flush. His elimination can be achieved by administration of niacin tablets with controlled (delayed) release. Currently in the Czech Republic there is not available nicotinic acid as the hypolipidemic agent, the administration of Tredaptive was for its side effects suspended. In the USA there is commonly used pharmacotherapeutic agent Niaspan in the form of oral tablet with extended release. The aim of the present study was to determine the rate of nicotinic acid release from Niaspan tablets by dissolution test in vitro in environment of ph 1.2; 4.5 and 6.8 for 24h and compare them with a release rate of niacin from Tredaptive. There was studied 36 tablets of Niaspan containing 500 mg and 1000 mg of niacin and 18 tablets of Tredaptive containing 1000 mg of niacin. Concentration of released nicotinic acid was determined by HPLC method with spectrophotometric detection in the UV region. Dissolution curves of Niaspan and Tredaptive were significantly different. In Tredaptive was observed release of all niacin in all ph after four hours of dissolution. In Niaspan released 50% of niacin at ph 1.2 and even only 30% of niacin at ph 4.5 and 6.8 during the same time. The rate of release of niacin from both dosages of Niaspan was identical. Extremely fast release of niacin from Tredaptive tablets can be the cause of product reduced safety. Keywords: niacin, Niaspan, Tredaptive, flush, hypolipidemiceffects, extended release, dissolution

Obsah 1 Úvod... 10 2 Literární přehled... 11 2.1 Dyslipidémie... 11 2.1.1 Lipidy... 11 2.1.2 Apolipoproteiny... 12 2.1.3 Lipoproteiny... 13 2.1.4 Klasifikace hyperlipoproteinémií... 14 2.2 Léčba hyperlipidémií... 16 2.2.1 Statiny... 17 2.2.2 Fibráty... 17 2.2.3 Pryskyřice (sekvestranty žlučových kyselin)... 18 2.2.4 Omega 3 polynenasycené mastné kyseliny... 18 2.3 Kyselina nikotinová... 18 2.3.1 Chemická struktura a fyziologické funkce... 19 2.3.2 Metabolismus... 20 2.4 Klinické aplikace niacinu... 22 2.4.1 Mechanismus hypolipidemického účinku... 22 2.4.2 Pleiotropní působení kyseliny nikotinové... 25 2.4.3 Nežádoucí účinky... 26 2.4.4 Indikace kyseliny nikotinové... 27 2.4.5 Lékové formy... 28 2.5 Disoluční studie... 29 3 Materiál a metodika... 31 3.1 Použité přístroje a chemikálie... 31 3.2 Příprava roztoků... 32 3.2.1 Lékopisná disoluční média... 32 3.2.2 Mobilní fáze pro HPLC... 33 3.2.3 Kalibrační standardy... 33 3.3 Parametry testovaných tablet... 34 3.4 Zkouška disoluce... 38 3.5 Stanovení koncentrace niacinu... 38

4 Výsledky... 40 4.1 Kalibrace kyseliny nikotinové... 40 4.2 Zkouška disoluce Niaspanu 500... 42 4.3 Zkouška disoluce Niaspanu 1000... 45 4.4 Zkouška disoluce Tredaptive... 48 5 Diskuze... 51 6 Závěr... 53 7 Seznam obrázků a tabulek... 54 8 Seznam zkratek... 55 9 Seznam použité literatury a zdrojů informací... 57

1 Úvod K nejvýznamnějším rizikovým faktorům kardiovaskulárních onemocnění (KVO) patří poruchy lipidového metabolismu označované jako dyslipidémie (DLP) či dyslipoproteinémie. Stavy spojené se zvýšenou plazmatickou koncentrací jedné nebo více lipoproteinových tříd označujeme jako hyperlipoproteinémie, stavy spojené se zvýšením koncentrace plazmatických lipidů jako hyperlipidémie. Hypolipidemická léčba zahrnuje jak nefarmakologická opatření (úpravu životního stylu a diety), tak farmakologickou léčbu. Léky ovlivňující hladiny plazmatických lipidů (hypolipidemika) je možné rozdělit na farmaka ovlivňující především celkový a LDL-cholesterol (statiny) a léky ovlivňující především triacylglyceroly (TAG) a HDL-cholesterol (fibráty). Prakticky všechny parametry lipidového spektra ovlivňuje kyselina nikotinová, která se od ostatních skupin hypolipidemik odlišuje mechanizmem hypolipidemického účinku (1,2). Kyselina nikotinová (niacin) ve farmakologických dávkách (0,5 4,5 g/den) příznivě ovlivňuje hladiny všech krevních lipidů. Inhibuje bazální lipolýzu, snižuje uvolňování volných mastných kyselin z tukové tkáně, inhibuje syntézu TAG a zpomaluje katabolizmus částic HDL v játrech. Snižuje tak hladiny celkového cholesterolu, aterogenního LDLcholesterolu, lipoproteinu (a) a TAG za současného zvýšení HDL-cholesterolu. Popisovány jsou také pleiotropní (extrahypolipidemické) účinky niacinu, jako například antioxidační působení, vzestup koncentrace adiponektinu, antitrombotické a antiaterogenní působení (1,2). Nutným předpokladem léčby niacinem je respektování vedlejších účinků i možných rizik spojených s jejím užíváním (flush, hepatotoxicita, aj.). Minimalizované nežádoucí účinky mají preparáty ve formě tablet s řízeným uvolňováním aktivní látky. Cílem předkládané práce bylo určit rychlost uvolňování kyseliny nikotinové z preparátu Niaspan obsahujícího 500mg a 1000mg niacinu zkouškou disoluce in vitro v prostředí ph 1,2; 4,5 a 6,8 a výsledky porovnat s uvolováním niacinu z preparátu Tredaptive. 10

2 Literární přehled 2.1 Dyslipidémie Poruchy lipidového metabolismu dyslipidémie, patří vedle obezity mezi nejčastěji se vyskytující metabolické poruchy v naší populaci. Jejich hlavním rysem je odchylka ve složení plazmatických lipidů a lipoproteinů, ke které dochází v důsledku zvýšené syntézy nebo sníženého odbourávání lipoproteinových částic. Původně pojem DLP označoval poruchy charakterizované poklesem koncentrace HDL, a to izolovaným nebo v kombinaci s jinou lipoproteinovou poruchou. Dnes se termín DLP používá jako synonymum hyperlipidémie, či hyperlipoproteinémie, a označuje nejen změnu koncentrace cholesterolu a/nebo TAG, ale současně i kvalitativní změnu poměrů lipidů a apolipoproteinů v celém jejich spektru (3,4). Příčina vzniku HLP bývá většinou komplexní a multifaktoriální. Vzniká jako důsledek poruchy metabolismu LP na úrovni syntézy a sekrece z hepatocytů, jejich přeměny nebo zpomaleného katabolismu, či kombinací těchto mechanizmů. Na manifestaci HLP se podílejí jak endogenní (genetické odchylky, chorobné stavy), tak exogenní faktory (životní styl, dietní návyky, kouření) (3,4). 2.1.1 Lipidy Lipidy jsou vedle bílkovin a sacharidů jedním ze základních stavebních kamenů živé hmoty. Představují heterogenní skupinu látek, které spojuje více jejich úloha v organismu než chemická struktura. Jsou důležitou částí všech buněk organizmu, kde fungují především jako zdroj a zásobárna energie (3). Mastné kyseliny Neesterifikované (volné) mastné kyseliny jsou karboxylové kyseliny s dlouhými uhlovodíkovými řetězci. Většina mastných kyselin má sudý počet uhlíkových atomů a nerozvětvený řetězec. V plazmě kolují vázané na albumin a jsou jedním ze základních energetických substrátů, jako součást fosfolipidů tvoří strukturu všech buněčných membrán (5). 11

Cholesterol Cholesterol je součástí biologických membrán, prekurzor pro syntézu steroidních hormonů vitamínu D nebo žlučových kyselin. V nervové tkáni se podílí na tvorbě myelinových pochev (3,5). Estery cholesterolu Estery cholesterolu představují transportní a zásobní formu cholesterolu. Jsou obsaženy především v jádře plazmatických lipoproteinů, kde umožňují regulovaný transport lipidů v organizmu, a jako zásobní forma v intracelulárním prostoru (5). Triacylglyceroly Triacylglyceroly jsou estery glycerolu a mastných kyselin, pro organismus jsou kvantitativně nejdůležitějším energetickým zdrojem. Exogenní TAG přijaté z potravy převládají v chylomikronech a endogenní TAG převládají v částicích VLDL. Zvýšená plazmatická koncentrace je riziková pro vznik aterosklerózy (3). Fosfolipidy Fosfolipidy jsou hlavní složkou všech buněčných membrán. Jsou to estery glycerolu, kde v pozici 1 a 2 je esterifikována mastná kyselina, v pozici 3 přes kyselinu fosforečnou organická baze (cholin, etanolamin, inositol) nebo aminokyselina (serin) (3). 2.1.2 Apolipoproteiny Apolipoproteiny jsou specifické bílkoviny lipoproteinových částic se strukturálními i jinými biochemickými funkcemi (např. zajišťují vazbu lipoproteinů na receptory buněčných membrán a enzymů, působí jako aktivátory či inhibitory enzymů lipidového metabolizmu). V každé třídě lipoproteinů se vyskytuje několik apoproteinů, které jsou pro daný lipoprotein charakteristické. Jsou značeny velkými písmeny A-M (mimo G), jejich vzájemné poměry v rámci jednotlivých lipoproteinů se za různých patofysiologických stavů liší (6). Dále jsou uvedeny pouze dva, které charakterizují částice HDL a LDL. Apolipoprotein AI (ApoA-I) je hlavní proteinovou složkou částic HDL, účastní se reverzního transportu cholesterolu, vyšší hladiny apo A-I působí antiaterogenně (6). 12

Apolipoproteiny B jsou hlavní proteinovou složkou chylomikronů, VLDL, IDL a LDL částic. Sestávají se ze dvou forem označených apob 100 a apob 48 (6). Stanovení koncentrace apoa-i a apob100 patří mezi základní vyšetření parametrů lipidového metabolismu. 2.1.3 Lipoproteiny Lipidy jsou hydrofobní sloučeniny, a proto musí být pro transport ve vodném prostředí, jako je krev, asociovány s apoproteiny (apolipoproteiny). Tak vznikají lipoproteiny (LP), které jsou nejdůležitější transportní formou plazmatických lipidů. Hydrofobní jádro LP je složeno z TAG a esterů cholesterolu. Povrch lipoproteinů tvoří amfifilní obal složený z proteinů, fosfolipidů a cholesterolu. Lipoproteiny dělíme podle hustoty do pěti tříd (3,5). Chylomikrony mají vysoký obsah exogenních TAG a nízký obsah bílkovinné složky. U zdravých osob se v plazmě na lačno neobjevují. Jsou syntetizovány v buňkách tenkého střeva. Transportují TAG ze střeva do periferní tkáně (3,5). Lipoproteiny o velmi nízké hustotě (very low density lipoprotein, VLDL) podobně jako chylomikrony obsahují vysoké procento TAG a nízké procento bílkovinné složky. Syntetizují se v játrech a částečně ve střevech. Hlavní funkcí VLDL je transport endogenních TAG z jater do tkání (3,5). Lipoproteiny o střední hustotě (intermediate density lipoprotein, IDL) vznikají katabolismem VLDL částic v krevním řečišti, ze kterých byla odebrána část TAG. Jsou vychytávány receptorem na povrchu hepatocytů. IDL částice mají dobrou afinitu k endoteliálním buňkám, fibroblastům a makrofágům a mohou výrazně urychlovat proces aterosklerózy (3,5). Lipoproteiny o nízké hustotě (low density lipoprotein, LDL) představují hlavní transportní formu cholesterolu v krvi. Vznikají v játrech z IDL, na jejich odbourávání, a tím i na regulaci metabolizmu cholesterolu, se významně podílejí periferní tkáně vybavené specifickými LDL receptory. Tyto receptory se nacházejí v membráně buněk a specificky vážou apob100. Po navázání částice LDL na receptor následuje metabolická degradace, kdy po vchlípení částice do buňky se nejprve spojí s lysozomem, v němž je apob degradován na aminokyseliny. Estery cholesterolu jsou hydrolyzovány a uvolněný cholesterol je využit především pro 13

syntézu buněčných membrán. Jeho zbývající část ovlivňuje nitrobuněčný metabolismus cholesterolu jednak inhibicí HMG-CoA reduktázy, jednak aktivací acyl-coa acyltransferázy (ACAT) a inhibicí syntézy specifických LDL receptorů. Porucha tohoto odbourávání má za následek hypercholesterolemii (3,5). Lipoproteiny o vysoké hustotě (high density lipoprotein, HDL) jsou syntetizovány nejen v játrech, ale také v buňkách střevní sliznice. Skládají se převážně z proteinů, fosfolipidů a esterifikovaného cholesterolu. HDL částice hrají důležitou úlohu v reversním transportu cholesterolu z periferních tkání do jater, kde je cholesterol dále metabolizován. HDL částice jsou považovány za projektivní vzhledem k riziku aterosklerózy (3,5). Lipoprotein (a), Lp(a), představuje třídu lipoproteinových částic, jejichž bílkovinnou složku tvoří apob100 a specifický glykoprotein apolipoprotein (a), apo(a). Podle hustoty a struktury se řadí k částicím LDL. V plazmatických hladinách Lp(a) existují mezi jedinci výrazné rozdíly (řádově až 1000násobné), zatímco u téhož jedince jsou hodnoty relativně stálé - hladina Lp(a) prakticky nepodléhá působení zevních vlivů (kouření, fyzické aktivitě, přírůstku na váze atd.). Apo(a) vykazuje značnou homologii se strukturou plasminogenu, základní bílkovinou fibrinolytického systému. Díky této analogii Lp(a) působí výrazně antifibrinolyticky a zároveň podporuje proliferaci buněk hladkého svalstva cévní stěny, čímž se řadí k důležitým rizikovým faktorům rozvoje aterosklerózy kardiovaskulárního aparátu (3,5). 2.1.4 Klasifikace hyperlipoproteinémií Hyperlipoproteinémie se dříve rozdělovaly podle Fredricksona do šesti tříd (I, IIA, IIB, III, IV a V), které odpovídaly jednotlivým fenotypům odrážejících aktuální stav metabolismu lipidů v době vyšetření. V dnešní době se tato klasifikace již nepoužívá. Mezi další kritéria, podle kterých můžeme hyperlipoproteinémie klasifikovat patří: mechanizmus jejich vzniku (etiologie), genetické predispozice a typ lipidové abnormality (7,8,9). 14

Podle etiologie rozlišujeme: primární (familiární) dyslipoproteinémie - geneticky podmíněné poruchy metabolismu lipidů (odchylkami v genech pro apoproteiny, enzymy a receptory, které zprostředkovávají metabolismus plazmatických lipoproteinových částic), častější výskyt (60 70%); sekundární dyslipoproteinémie jsou důsledkem jiných onemocnění či stavů (například diabetes mellitus, hypotyreóza, nefrotický syndrom) nebo jsou asociovány s podáváním léčiv, které významně ovlivňují metabolismus lipidů a lipoproteinů (thiazidová diuretika, kortikoidy, beta-blokátory) (7,8,9). Rozpoznání sekundární HLP je důležité zejména při rozhodování o volbě léčebné strategie, pokud to umožňuje charakter základního onemocnění, měla by být léčba kauzálně zaměřená na odstranění jeho příčiny. Sekundární HLP lze kauzálně ovlivnit terapií základního onemocnění. Primární HLP podle genetické dispozice dělíme na: monogenní podmíněné mutací jednoho genu (například deficience lipoproteinové lipasy či acyltransferasy lecitin:cholesterol (LCAT), jsou podstatně méně časté než polygenní typ; polygenní podmíněné mutací několika genů kontrolujících hladinu lipidů v organizmu (10). Nejrozšířenější je dnes jednoduchá klasifikace doporučená Evropskou společností pro aterosklerózu, podle níž na základě stanovení plazmatické koncentrace cholesterolu a TAG, rozlišujeme tři skupiny HLP: izolovanou hypercholesterémii (zvýšený obsah LDL, vzácně HDL); izolovanou hypertriglyceridémii (zvýšený obsah VLDL, zřídka chylomiker); kombinovanou hyperlipidémii (zvýšený obsah LDL i VLDL, zřídka IDL). Tato klasifikace je základem pro rozhodování o terapeutickém postupu (7,8,9). Famliární hypercholesterolémie se projevuje výrazným zvýšením LDL cholesterolu, ke klinickým projevům patří šlachové i tuberozní xantomy a xantelasmata. Příčinou je porucha funkce specifických receptorů pro LDL na membránách fibroblastů, hladkých svalových buněk cév a lymfocytů. Komplikací je vysoký výskyt ICHS (8,9,10). 15

Polygenní (primární) hypercholesterolémie se projevuje mírným zvýšením cholesterolu ve frakci LDL, nemá výrazné klinické projevy a její komplikací je ICHS. Prevalence je velmi častá (10). Primární hypertriacylglycerolémie se projevuje zvýšenou produkcí a sníženým odbouráváním VLDL částic z plazmy. Tento typ onemocnění se projevuje kardiovaskulárními chorobami (8,9,10). Polygenní hypertriacylglycerolemie se projevuje zvýšenou hladinou TAG ve frakci VLDL někdy doprovázenou sníženou hladinou cholesterolu ve frakci HDL. Bývá asociována s nadváhou případně obezitou a poruchou glukozové tolerance. Je nejčastějším projevem poruchy metabolismu lipidů, která je důsledkem nepoměru mezi kalorickým příjmem a výdejem (10). Familiární kombinovaná hyperlipidémie patří k nejčastějším primárním HLP. Má podklad v geneticky podmíněné zvýšené tvorbě apob100. projevuje zvýšeným obsahem cholesterolu a TAG ve frakcích LDL, resp. VLDL. Nejčastější komplikací je ICHS (8,9,10). 2.2 Léčba hyperlipidémií Léčba hyperlipidémií je důležitá pro snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění. Nefarmakologická léčba Nefarmakologická léčba zahrnuje vhodnou skladbu stravy s převahou rostlinných tuků a úpravu životosprávy (dostatek pohybu, zákaz kouření). S touto léčbou se zahajuje u všech osob s hyperlipidémií. Pacient by měl změnu životosprávy dodržovat alespoň tři měsíce. Pokud po této době nedojde k normalizaci hladiny lipidů v krvi, je potřeba zahájit medikamentózní léčbu (1,7). Farmakoterapie hyperlipidémií Léky s hypolipidemickým účinkem podáváme, pokud dieta a úprava životosprávy nevede k úpravě hladin plazmatických lipidů na fyziologické hodnoty. Podle přednostně ovlivňované lipidové složky se hypolipidemika dělí na: látky působící na celkový a LDL cholesterol (statiny, pryskyřice), látky ovlivňující hladinu TAG a HDL cholesterolu (fibráty, PUFA n-3) (1,10). 16

Prakticky všechny parametry lipidového spektra ovlivňuje kyselina nikotinová podávaná ve vysokých dávkách (až 3g/den) (2). 2.2.1 Statiny Statiny kompetitivně inhibují biosyntézu enzymu 3-hydroxy-3-methylglutarylkoenzym A (HMG-CoA) reduktázu (EC 1.1.1.34), což je klíčový enzym syntézy cholesterolu. Vzniklý deficit cholesterolu je pak provázen zvýšením aktivity LDL receptorů a tím i zvýšeným vychytáváním lipoproteinů z krve a následným poklesem koncentrace cholesterolu. Nevhodným, avšak typickým, na lipidech nezávislým účinkem statinů je inhibice migrace a proliferace svalových buněk v cévní stěně (1,10). Indikační oblastí statinů je především familiární hypercholesterolemie. Novější preparáty (např. atorvastatin), které mají i hypotriacylglycerolemický efekt, mohou být využity i při léčbě kombinované hyperlipidemie (1,10). Léčba statiny je kontraindikována u dětí a gravidních žen, při aktivním onemocnění jater nebo zvýšených hodnotách jaterních transamináz (1). 2.2.2 Fibráty Z chemického hlediska jsou fibráty deriváty kyseliny fibrové. Mechanismus účinku fibrátů spočívá v ovlivnění nukleárních transkripčních faktorů. Fibráty působí jako ligand nukleárních receptorů PPAR-α (perisome proliferator activated receptor, receptor aktivovaný peroxizomálními proliferátory), které jsou exprimovány převážně v játrech. Po vazbě fibrátu s PPAR se komplex spojuje s RXR (receptorem pro kyselinu 9-cis-retinovou) a výsledný heterodimer se váže na odpovídající sekvenční element DNA s následnou aktivací nebo represí příslušných genů a odpovídajících enzymů. Aktivovaný PPAR zvýšením exprese genu pro apoai a apoaii zajišťuje zvýšenou tvorbu HDL cholesterolu. Hypotriacylglycerolemický účinek fibrátů je důsledkem urychleného katabolismu CM a VLDL, v důsledku zvýšené exprese lipoproteinové lipázy (LPL) a poklesu syntézy apociii, který LPL inhibuje. Při snížené tvorbě TAG a současné represi genu pro apociii se preferenčně syntetizují malé VLDL částice. Metabolická kaskáda malých VLDL končí tvorbou velkých LDL částic, které jsou fyziologicky vychytávány LDL receptory (7,11). Fibráty jsou lékem první volby u pacientů s primární poruchou metabolismu TAG, sníženou hladinou HDL a přítomností malých denzních LDL při současně fyziologických nebo hraničně zvýšených koncentracích LDL cholesterolu. 17

Fibráty snižují především koncentrace plazmatických TAG (o 20-50%), mírně redukují hladiny celkového a LDL cholesterolu (o 15-25%, resp. o 5-15%) a výrazně zvyšují koncentraci HDL cholesterolu (o 10-20%) (7,10,12). 2.2.3 Pryskyřice (sekvestranty žlučových kyselin) Pryskyřice ireverzibilně vážou žlučové kyseliny do nerozpustného komplexu, čímž dochází k přerušení jejich enterohepatální cirkulace. Důsledkem toho dojde ke zvýšené expresi LDL receptorů, urychlenému katabolismu částic LDL a oxidaci cholesterolu na žlučové kyseliny. Nežádoucím vedlejším účinkem sekvestrantů žlučových kyselin je indukce hypertriacylglycerolémie, což limituje jejich podávání u DLP se zvýšenými hladina TAG. Účinkem pryskyřic dochází ke snížení celkového a LDL cholesterolu a jsou proto indikovány u hypercholesterolémie (v monoterapii nebo i v kombinaci se statiny) (6,11). 2.2.4 Omega 3 polynenasycené mastné kyseliny Polyenové (vícenenasycené) mastné kyseliny (polyunsaturated fatty acids, PUFA) jsou organické kyseliny, které mají v molekule alespoň dvě nebo více dvojných vazeb. Poslední uhlík řetězce, počítáno od karboxylového konce molekuly je označován omega. Vyskytují se 4 řady PUFA: n-3, resp. omega-3 řada, odvozená z kyseliny alfa-linolenové (ALA) 18:3 n-3, n-6 řada, odvozená z kyseliny linolové (LA) 18:2 n-6, n-9 řada z kyseliny olejové, OA, 18:1 n-9, a n-7 řada, odvozená z kyseliny palmitolejové (PA) 16:1 n-7. PUFA n-3, jejichž nejvýznamnějšími představiteli jsou kyselina eikosapentaenová (EPA, 20:5 n-3) a dokosahexaenová (DHA, 22:6 n-3), snižují koncentraci triacylglycerolů v plazmě, a to v závislosti na dávce a výchozích koncentracích o 20-30% (12). 2.3 Kyselina nikotinová Kyselina nikotinová, neboli niacin (NIcotinic Acid vitamin), bývá někdy zařazována do skupiny komplexu vitaminu B jako vitamin B3. Toto označení by mělo být vyhrazeno spíše pro kyselinu pantotenovou. V užším slova smyslu totiž niacin není vitamínem, protože může být syntetizován in vivo z esenciální aminokyseliny tryptofanu. Pro syntézu 1 mg niacinu je třeba zhruba 60 mg tryptofanu (1,13). Kyselina nikotinová bývá také známá pod zkratkou PP, či PPF (pelagra preventive factor). Termín niacin zahrnuje dvě sloučeniny kyselinu nikotinovou a nikotinamid. Obě mají biologickou funkci vitamínu a také stejnou biologickou aktivitu (1,13). 18

Zdrojem kyseliny nikotinové jsou potraviny rostlinného i živočišného původu např. ryby, maso, obiloviny a kávové boby (2). 2.3.1 Chemická struktura a fyziologické funkce Kyselina nikotinová je monokarboxylová kyselina odvozená od pyridinu. Strukturní vzorce kyseliny nikotinové a jejich derivátů jsou zobrazeny na Obrázku 1. Obrázek 1 Chemické vzorce kyseliny nikotinové, nikotinamidu, NAD a NADP (2) Fyziologicky plní niacin zhruba dvě funkce: je prekursorem dvou esenciálních koenzymů - nikotinamid adenin dinukleotidu (NAD) a nikotinamid adenin dinukleotid fosfátu (NADP), obě sloučeniny mohou být redukovány na NADH a NADPH a jako koenzymy se účastní oxidačně-redukčních reakcí, které jsou katalyzovány dehydrogenázami a oxidoreduktázami a ovlivňují tak četné metabolické procesy (převážně reakce spojené se získáváním energie); NAD je prekursorem ADP-ribosy (adenozindifosfát, ADP) pro ADP-ribosylaci a poly( ADP)-ribosylaci proteinů a pro syntézu cadp-ribosy, která spolu s NADPH plní funkci druhých poslů a zvyšuje intracelulární koncentrace vápníku (13). Doporučená denní dávka kyseliny nikotinové je v řádech desítek mg (10-20mg/den). Vyšší potřebu niacinu mají lidé s onemocněním ledvin, při horečkách, u žen v těhotenství a při laktaci, ve stáří a při zvýšené psychické a fyzické námaze. Nedostatek niacinu se převážně vyskytuje v populacích, které mají jako hlavní zdroj přísunu živin kukuřici a kukuřičné výrobky. Lehký nedostatek se v organismu projevuje nespavostí, 19

nechutenstvím, a dalšími nespecifickými symptomy. Závažný nedostatek niacinu a tryptofanu se pak projevuje pelagrou. Pro pelagru jsou charakteristické tři projevy: fotosenzitivní dermatitis (podobná slunečnímu opálení) na místech expozice slunečnímu záření a mechanickému tlaku (kolena, lokty, zápěstí a kotníky); demencí (typická v pokročilejším stadiu); poruchami trávení, průjmy a následným hubnutím. V rozvinutých zemích je toto onemocnění popisováno u alkoholiků, u pacientů léčených antituberkulotiky, antiparkinsoniky a u osob trpících chronickým onemocněním zažívacího ústrojí (1,13). 2.3.2 Metabolismus Niacin je metabolizován dvěma drahami. V první metabolické dráze je kyselina nikotinová konjugována s glycinem na kyselinu nikotinurovou. Ve druhé metabolické dráze vzniká sledem několika oxidačně redukčních reakcí nikotinamid a pyrimidinové metabolity. První metabolická dráha se uplatňuje, jakmile je druhá metabolická dráha saturována. Na rozdíl od první dráhy, která je nízkoafinitní a vysokokapacitní, má druhá dráha vysokou afinitu a nízkou kapacitu (2). Metabolické dráhy niacinu jsou přehledně zobrazeny na Obrázku 2 na následující straně. 20

Obrázek 2 Metabolismus niacinu (2) V první dráze (I) je niacin konjugován s glycinem za vzniku kyseliny nikotinurové. Ve druhé dráze (II) sledem oxidačně-redukčních reakcí vzniká nikotinamid a řada pyrimidinových metabolitů. Zvýšení koncentrace kyseliny nikotinurové první metabolickou dráhou indukuje syntézu a uvolnění prostaglandinu (PG) D2, který je odpovědný za nežádoucí kožní příznaky flush, pocity horka a zrudnutí. Flush je indukován PGD2, syntetizovaným v Langerhansových buňkách epidermis po navázání niacinu na receptor HM74A. Druhou metabolickou drahou vzniká řada potenciálně hepatotoxických sloučenin. 21

2.4 Klinické aplikace niacinu K léčbě hyperlipidémií jsou nutné podstatně vyšší dávky niacinu, než je možné dosáhnout potravou (dietní příjem plní funkci vitamínu). Farmakologické účinky niacinu se dostavují při dávkách nad 500 mg za den, zpravidla po aplikaci účinné látky v množství 1 3 g denně (13,14). Jako hypolipidemikum je niacin užíván od poloviny 50. let (15). Příznivě ovlivňuje prakticky všechny aterogenní charakteristiky lipoproteinového spektra. Kyselina nikotinová jako jediná ze všech hypolipidemicky působících farmak snižuje hladinu lipoproteinu (a) a nejúčinněji zvyšuje koncentraci HDL-cholesterolu (14,15). 2.4.1 Mechanismus hypolipidemického účinku Přesný mechanismus hypolipidemického účinku niacinu není doposud zcela objasněn. Pravděpodobně se však jedná o mnohočetný zásah na různé úrovni metabolismu lipoproteinů a lipidů, které není omezeno pouze na jaterní tkáň. Hypolididemický účinek niacinu zahrnuje také jeho působení v tukové tkáni či periferních buňkách. Nově jsou popisovány také další příznivé účinky niacinu, které zahrnují např. jeho antioxidační působení či potenciaci reverzního transportu cholesterolu (16). Mnohočetné účinky niacinu ovlivňující metabolismus lipidů a lipoproteinů jsou schematicky znázorněny na Obrázku 3 na následující straně. Většina niacinových účinků je spojená s aktivací specifických niacinových receptorů, které patří do skupiny receptorů, spojených s proteinem G (GPCR). U člověka jsou známy dva typy těchto receptorů: HM74 (GPR109B) a HM74A (GPR109A) (17). Receptor HM 74 odpovídá zejména za účinky ovlivňující metabolismus lipoproteinů. Naproti tomu receptor GPR109A je exprimován v adipocytech, neutrofilních leukocytech, makrofázích a Langerhansových buňkách epidermis (18). 22

Obrázek 3 Mechanismus účinku niacinu (2) V tukové tkáni se niacin se váže na specifický membránový receptor adipocytů (HM74), který inaktivuje hormonálně-senzitivní lipázu. Potlačení lipolýzy tukové tkáně zpomalí tok volných mastných kyselin (FFA) do hepatocytu. V játrech niacin inhibuje jaterní diglyceridovou acyltransferázu (DGAT2) a syntézu acyl-coa z acetyl-coa. Blokádou katabolického receptoru pro HDL inhibuje vychytávání částic HDL, a tím usnadňuje reverzní transport cholesterolu cestou specifických receptorů SR-B1. V periferních endoteliálních buňkách niacin aktivuje ABCA1 transportér, což je první krok v aktivaci reverzního transportu cholesterolu. Antioxidační účinky zahrnují sníženou tvorbu reaktivních kyslíkových sloučenin a tím brání následné oxidaci částic LDL. HSL hormonálně senzitivní lipáza; TG triglyceridy; FFA volné (neesterifikované) mastné kyseliny; DAG diglycerid; SR-B1 scavenger receptor B1; VLDL lipoprotein o velmi nízké hustotě; HDL lipoprotein o vysoké hustotě; LDL lipoprotein o nízké hustotě; oxldl oxidativně modifikovaný LDL; CE estery cholesterolu; ABCA1 ATP-dependentní kazetový cholesterolový transportér; apo B apolipoprotein B100; MTP mikrosomální triglyceridový transferový protein. 23

Působení kyseliny nikotinové v játrech Účinkem niacinu v játrech dochází ke snížení syntézy TAG a tím i ke snížené sekreci částic VLDL. Snížená syntéza TAG je důsledkem: omezení dostupnosti substrátu (poklesem koncentrace volných mastných kyselin inhibicí lipolýzy tukové tkáně); inhibicí syntézy TAG blokádou jaterní izoformy diacylglycerol acyltrasferasy (DGTA- 2). Zpomalené sestavení částic VLDL z TAG a apob se podílí na snížené sekreci VLDL z hepatocytů. Snížená dostupnost apob v jaterní buňce je důsledkem jeho snížené translokace přes endoplasmatické retikulum, či v důsledku zvýšené degradace (19). Dalším důležitým účinkem kyseliny nikotinové je zvyšování koncentrace HDL a efluxu cholesterolu z buněk. Niacin v játrech brzdí katabolismus HDL blokádou specifických katabolických receptorů pro částice HDL. Tímto mechanismem se zvyšuje koncentrace částic HDL, které jsou nezbytné pro reversní transport cholesterolu. Účinkem niacinu také dochází ke zvýšené expresi transportéru ABCA-1 (ATP-dependentní kazetový cholesterolový transportér A1, ATP binding cassette transporter A1), který je prvním z protagonistů reversního transportu cholesterolu, a tím potencuje eflux cholesterolu z buněk (19,20). Působení kyseliny nikotinové v tukové tkáni Inhibiční účinek niacinu na lipolýzu tukové tkáně je znám již více než padesát let (21). V jeho důsledku dochází ke zpomalenému uvolňování volných mastných kyselin z tukové tkáně s následným poklesem koncentrace volných mastných kyselin a jejich toku do jater. Po podání kyseliny nikotinové dojde zhruba do 60 minut k poklesu hladiny (přibližně 60%) volných mastných kyselin. Studie in vitro dokazují, že niacin potlačuje bazální i noradrenalinem stimulovanou lipolýzu tukové tkáně (20). V tukové tkáni se niacin váže na specifický receptor (HM74), který je spřažen s G proteiny (14). Pravděpodobně se jedná o specifický receptor pro kyselinu nikotinovou (20). Tato vazba vede k inhibici adenylátcyklázy a poklesu koncentrace cyklického AMP (c-amp). Pokles koncentrací c-amp desaktivuje hormonálně senzitivní lipázu (HSL). 24

2.4.2 Pleiotropní působení kyseliny nikotinové Niacin vedle zásahu do metabolismu lipidů a lipoproteinů příznivě ovlivňuje několik tzv. nových rizikových faktorů aterosklerózy. Z extrahypolipidemického působení kyseliny nikotinové byly především studovány účinky na subklinický zánětlivý proces, prokoagulační stav, oxidační stres a hladiny sérového adiponektinu. Ovlivnění zánětu Protizánětlivé účinky kyseliny nikotinové v aterosklerotickém procesu jsou spojeny s jejím působením na C reaktivní protein (CRP) a produkci zánětlivých cytokinů. Niacin snižuje koncentraci CRP a inhibuje expresi a sekreci zánětlivých cytokinů indukovanou TNFα (tumor necrosisfactor α), čímž příznivě ovlivňuje zánětlivou aktivitu v tukové tkáni (22). Ovlivnění faktorů koagulace a trombolýzy Prokoagulační a protrombotický stav niacin ovlivňuje snižováním aktivity faktoru srážlivosti VII, hladiny fibrinogenu, inhibitoru-1 aktivátoru plasminogenu (PAI-1) i tkáňového aktivátoru plasminogenu (tpa) (16). Pokles tendence k trombóze navozená podáváním niacinu je také důsledkem snížení koncentrace Lp(a). Vedle PUFA n-3 a estrogenů je niacin jedinou sloučeninou, která koncentrace Lp(a) účinně snižuje (16). Antioxidační působení Významný pokles úrovně oxidačního stresu (pozorovaný zvláště u hypercholesterolemických pacientů s nízkou koncentrací HDL cholesterolu) souvisí se zvýšením plazmatické koncentrace částic HDL působením niacinu (23). Na koncentraci HDL v krvi je závislá sekrece antioxidačního enzymu paraoxonázy 1. Působení na hladiny adiponektinu Hormon adiponektin se řadí mezi nové rizikové faktory aterosklerózy. Součástí antiaterogenního působení kyseliny nikotinové je zvyšování jeho sérové koncentrace. Sekrece adiponektinu z adipocytů se snižuje se stoupajícím množstvím tukové tkáně. Působení adiponektinu je spojeno s poklesem hladiny TAG a zvýšením koncentrace HDL cholesterolu (12). 25

2.4.3 Nežádoucí účinky Nevýhodou podávání kyseliny nikotinové je řada nežádoucích, jako jsou bolesti hlavy, zažívací potíže, svědění a zejména flush (kožní zrudnutí) (1,2). Mezi nejčastější a nejzávažnější vedlejší účinky léčby kyselinou nikotinovou dostavují se po vyšších dávkách niacinu (nad 3 g/den) patří kromě flushe i insulinová rezistence a hepatotoxicita. Ta je v ojedinělých případech komplikována jaterní nekrózou (2). Řada potenciálně hepatotoxických sloučenin vzniká druhou metabolickou drahou kyseliny nikotinové, dalším možným vysvětlením hepatotoxického účinku farmakologických dávek niacinu je deplece metylových skupin (CH3-) v játrech a pokles jaterní koncentrace S adenosylmethioninu (SAM) (24). Za příčinu poklesu inzulínové senzitivity se většinou považuje tzv. rebound fenomén, ke kterému dochází po vzestupu hladin volných mastných kyselin v séru po jejich přechodném poklesu po odeznění antilipolytického působení niacinu (2). Frekvence i závažnost vedlejších účinků roste se zvyšováním dávky účinné složky (14). Mezi vzácné vedlejší účinky patří méně časté kožní změny (například svědění), dyspepsie, relaps vředové choroby gastroduodenální, zhoršení anginózních příznaků u osob s ischemickou chorobou srdeční, myopathie a hyperurikémie. Proto je použití niacinu kontraindikováno například u hyperurikémie, vředové choroby gastroduodenální, diabetes melittus a poruchy glukózové homeostázy (poruchu glukózy nalačno, porušenou glukózovou toleranci), arteriální hypotenze či idiopatických střevních zánětů (1,2,16). Absolutní kontraindikací léčby niacinem je alergie na aktivní látku, aktivní jaterní léze (ikterus) a dna (2). Špatná tolerance farmakologických dávek niacinu je patrná především u preparátů s bezprostředním nástupem účinku, novější preparáty s řízeným uvolňováním aktivní látky vykazují lepší toleranci a sníženou frekvenci nežádoucích účinků (mimo hepatotoxicity) (2). 26

2.4.4 Indikace kyseliny nikotinové Niacin se může používat v monoterapii nebo v kombinační léčbě s ostatními hypolipidemiky. Kyselina nikotinová je nejúčinnějším hypolipidemikem pro zvyšování koncentrací HDL cholesterolu. Její podávání je proto indikováno u dyslipoproteinémie s izolovaným snížením koncentrace HDL cholesterolu (2). V kombinační léčbě s hypolipidemiky snižujícími primárně koncentraci LDL cholesterolu (statiny nebo sekvestranty žlučových kyselin) je kyselina nikotinová indikována u pacientů se současným zvýšením koncentrace LDL cholesterolu s TAG a poklesem koncentrací HDL cholesterolu (16). Podávání niacinu je také vhodné v primární i sekundární prevenci u nemocných s ischemiskou chorobou srdeční s vysokým rizikem kardiovaskulárních onemocnění. Pro účinnou inhibici lipolýzy tukové tkáně niacin splňuje definiční kritéria patogenetické léčby DLP u metabolického syndromu (2). Kyselina nikotinová patří mezi léčiva, která nejen příznivě ovlivňují metabolismus lipoproteinových částic, ale i aterosklerotické komplikace. Na základě analýz klinicky kontrolovaných studií lze konstatovat, že niacin jednoznačně patří mezi hypolipidemika (spolu se statiny, sekvestranty žlučových kyselin a PUFA n-3) s prokázaným příznivým účinkem nejen na kardiovaskulární mortalitu a morbiditu, ale i celkovou mortalitu (25). Niacin je účinné hypolipidemikum, které chybí v paletě léků dostupných v současné době v České republice. Dávkování Farmakologické dávkování kyseliny nikotinové se liší podle použité lékové formy (viz níže). Ve formě tablet s okamžitým nástupem účinku je obvyklá dávka 1,5 až 3,0 g/den, s maximální dávkou 4,5 g/den. Niacin se podává ve 2 až 3 denních dávkách. Začíná se s dávkou 3 x denně 100 mg a maximální dávky se dosahuje s odstupem 4 6 týdnů (2). Podáním kyseliny nikotinové v dávce 1,0 g vede k téměř její absorpci. Během cca půl hodiny až hodiny je dosaženo maximální koncentrace v plazmě (asi 300 mg/l). Významnější podíl léku se z těla dostává močí v nezměněné podobě nebo po konjugaci (jako kyselina 27

nikotinurová). Vylučování ledvinami napomáhá k rychlé eliminaci niacinu, který vymizí z oběhu asi do 6 hodin od podání (2). Preparáty s prodlouženým nástupem účinku jako je Niaspan se podávají 1 x denně na noc a jeho dávka musí být opatrně zvyšována až do očekávaného hypolipidemického účinku. Začíná se s dávkou 375 mg/den a zvyšuje se o 500 mg denně ve 4 týdenních intervalech (2). 2.4.5 Lékové formy Z farmakologického hlediska je možné kyselinu nikotinovou užívat ve dvou tuhých perorálních lékových formách: v krystalické formě s bezprostředním nástupem účinku (IR, immediate release); ve formě s postupným (prodlouženým či tzv. řízeným) uvolňováním (ER, extended release). Preparáty s bezprostředním nástupem účinku, rychle saturují druhou metabolickou dráhu a většina niacinu je metabolizována na kyselinu nikotinurovou. Zvýšení jejích koncentrací indukuje syntézu a uvolnění PGD2, který působí flush, pocity horka a zrudnutí. Na druhé straně niacin, který je součástí preparátů s řízeným uvolňováním, je metabolizován druhou metabolickou drahou, jejíž cestou vzniká řada potenciálně hepatotoxických sloučenin (24). Hepatotoxicita však patří k vzácnějším nežádoucím účinkům. Preparáty s řízeným uvolňováním v nízkých a středních dávkách, jsou z klinického hlediska téměř stejně účinné jako niacin charakteru IR. Léčba preparáty s řízeným uvolňováním má nižší frekvenci kožních projevů, vede k menšímu vzestupu urikémie, méně výrazným patologickým změnám aktivit jaterních enzymů a jejich nižší frekvenci (16). Niaspan Prodloužené uvolňování je charakteristické například pro preparát Niaspan, používaný k hypolipidemické léčbě například v USA, u něhož absorpce účinné látky probíhá zhruba 12hod. Preparáty s uvolňováním trvajícím nad 12 hod, jsou obvykle méně účinné. Snaha o zachování stejné účinnosti jako mají léky charakteru IR zvyšováním denní dávky preparátů s řízeným uvolňováním, potencuje u geneticky vnímavých jedinců riziko jaterní toxicity (16). 28

Tredaptive Jak bylo uvedeno výše, mezi nejčastější nežádoucí účinky léčby kyselinou nikotinovou, patří kožní flush, ke kterému dochází zvláště u preparátů s okamžitým uvolňováním. Flush působí PGD2 po aktivaci svých receptorů DP1. Antagonisté těchto receptorů, jako je například laropiprant, snižují intenzitu flushe, působeného niacinem, přičemž nesnižují jeho působení na plasmatické lipidy (26). V České republice byl dříve farmakologicky používán přípravek niacinu Tredaptive v lékové formě s řízeným uvolňováním kombinovaný s laropiprantem. 2.5 Disoluční studie Disoluční (rozpouštěcí) studie představují jednu z hlavních charakteristik pevných lékových forem s postupným uvolňováním. Stanovuje se jimi in vitro rychlost uvolňování účinné složky z pevné perorální lékové formy (např. tablet a tobolek) v předepsaném disolučním médiu a v předepsaném čase. Disoluční testy se používají především k hodnocení kvality léčivých přípravků, při vývoji nových léčiv se používají i k odhadu chování lékové formy v organizmu. Pokud je rychlost rozpouštění léčivé látky limitujícím stupněm pro její absorpci používají se disoluční studie jako významná lékopisná kontrolní metoda a jsou nezbytnou součástí registrační dokumentace léku (27,28). Požadavky pro disoluční testování jsou přesně uvedeny v českém, evropském i americkém lékopise. Český lékopis povoluje provádět disoluční studie na čtyřech typech přístrojů - přístroj s košíčkem, pádlem (míchadlem), vratným válcem nebo průtokovou celou. Volba přístroje závisí na fyzikálně-chemické charakteristice lékové formy (28). U disoluční zkoušky je potřeba specifikovat použitý přístroj, složení, objem a teplotu disolučního roztoku; rychlost otáčení pádel nebo průtok disoluční kapaliny; dobu a množství zkoušeného roztoku pro vzorkování a metodu analýzy (27,28). Vzorky rozpuštěného léčiv se odebírají v určitém časovém intervalu a nahrazují se stejným množstvím nového disolučního roztoku o teplotě 37 ºC, nebo se počítá s jeho úbytkem. Rozpustnost obalů matricových tablet zabezpečujících zpožděné uvolňování léčivé látky a její opožděný účinek závisí na ph. Ideální disoluční kapalina má napodobovat hodnoty ph v gastrointestinálním traktu (ph 1,2 nebo 3 pro žaludek; 4,5 5,5 pro dvanáctník a 6,8 pro 29

proximální tenké střevo či kolon). Většina metod nezohledňuje dobu, kterou léčivý přípravek setrvává v jednotlivých částech GIT (27,28). Hodnocení disoluční zkoušky použité ke stanovení shody generických léků (zvláště u lékových forem s prodlouženým uvolňováním) se provádí na základě faktoru podobnosti (f 2 ), jehož hodnota zohledňuje celou disoluční křivku. Základním kritériem je hodnota f 2 nad 50 ve všech ph (27,28). Vzorec pro výpočet faktoru podobnosti, kde n je počet měření, R a T je kumulativní hodnota disoluce pro referenční a testovaný produkt v čase t: 30

3 Materiál a metodika 3.1 Použité přístroje a chemikálie Přístrojové vybavení: Laboratorní úprava vody Direct Q 3 UV (Millipore, Česká republika) Laboratorní váhy KERN EMB 2000-2 (KERN, Německo) Analytické váhy Discovery 2150D (Ohaus Corporation, Švýcarsko) ph metr PHM 62 (Radiometr Copenhagen, Dánsko) Disoluční linka ERWEKA (ERWEKA, Německo) Laboratorní míchačka: LabDancervario (IKA, Německo) Vysokotlaká pumpa Delta Chrom SDS 030 (Watrex, Česká republika) Spektofotometrický UV-VIS detektor CHROMPACK (CHROMPACK, Holandsko) Kolona Alltima C18 (GRACE, Belgie) Teploměr TESTO 926 (TESTO, Německo) Teplotní sonda TESTO (TESTO, Německo) Chemikálie: Kyselina chlorovodíková 35%, p.a. (PENTA, Česká republika) Kyselina octová, ledová 99,8%, p.a. (PENTA, Česká republika) Dihydrogenfosforečnan draselný bezvodý, p.a. (PENTA, Česká republika) Chlorid sodný, p.a. (LACHEMA, Česká republika) Citronan sodný dihydrát, p. a. (PENTA, Česká republika) Hydroxid sodný, p.a. (PENTA, Česká republika) Acetonitril, Chromapur G (CHROMSERVIS, Česká republika) Kyselina nikotinová čistoty 99,5% (Sigma Aldrich, Česká republika) Octan draselný, p.a. (PENTA, Česká republika) 31

Kyselina citrónová bezvodá, p.a. (PENTA, Česká republika) Testované preparáty: NiaspanNiacin ExtendedRelease 500 (AbbottLaboratories, USA) NiaspanNiacin ExtendedRelease 1000 (AbbottLaboratories, USA) Tredaptive 1000 mg/20 mg s řízeným uvolňováním (MERCK, VELKÁ BRITÁNIE) 3.2 Příprava roztoků 3.2.1 Lékopisná disoluční média Zásobní roztoky pro přípravu fosforečnanového pufru - ph 6,8 A) 0,2M KH 2 PO 4 (Mr 136,09): do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 27,22 g KH 2 PO 4 a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. B) 0,2M NaOH (Mr 40): do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 8 g hydroxidu sodného a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Příprava 1 l pufru: Do odměrné baňky o objemu 1000 ml převést 250 ml roztoku A a 112 ml roztoku B a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Zásobní roztok pro přípravu acetátového pufru - ph 4,5: A) 2M kyselina octová (Mr 60,05): do odměrné baňky o objemu 1000 ml převést 114 ml kyseliny octové a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Příprava 1 l pufru: Do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 3,58 g CH 3 COOK (Mr 98,14), přidat 14 ml roztoku A a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Zásobní roztoky pro přípravu dissolučního média s kyselinou chlorovodíkovou ph1,2 A) 0,2M HCl (Mr 36,46): do odměrné baňky o objemu 1000 ml převést 17,65 ml HCl a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. 32

B) 0,2M NaCl (Mr 58,443): do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 11,69g NaCl a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Příprava 1 l pufru: Do odměrné baňky o objemu 1000 ml převést 425 ml roztoku A a250 ml roztoku B a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. 3.2.2 Mobilní fáze pro HPLC Zásobní roztoky A) 0,05M kyselina citrónová monohydrát (Mr 210,14): do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 10,507 g kyseliny citrónové a doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. B) 0,5M citronan sodný dihydrát (Mr 294,05): do odměrné baňky o objemu 1000 ml navážit 14,7025 g citronanu sodného doplnit na 1000 ml destilovanou vodou. Příprava 3 l pufru: Smíchat 1 l roztoku A s 2 l roztoku B. Příprava mobilní fáze: Smíchat 0,05M citrátového pufru s acetonitrilem v poměru 2:3. 3.2.3 Kalibrační standardy Pro stanovení koncentrace uvolněné kyseliny nikotinové bylo potřeba určit kalibrační závislosti pro všechny použité disoluční média. Byly připraveny tři zásobní standardní roztoky (ph 1,2; 4,5 a 6,8) kyseliny nikotinové o koncentraci 1 g/l. Příprava zásobních roztoků: do odměrné baňky navážit 100 mg kyseliny nikotinové a doplnit do 100 ml disolučním médiem o hodnotě ph 1,2; do odměrné baňky navážit 100 mg kyseliny nikotinové a doplnit do 100 ml acetátovým pufrem o hodnotě ph 4,5; do odměrné baňky navážit 100 mg kyseliny nikotinové a doplnit do 100 ml fosforečnanovým pufrem o hodnotě ph 6,8. 33

Všechny připravené roztoky byly důkladně promíchány a následně z nich byly připravené šestibodové kalibrační řady. Pipetovací schéma je uvedeno v Tabulce 1. Tabulka 1 Kalibrace kyseliny nikotinové Bod c NA (g/l) ZR NA DM ZR NA DM ZR NA DM ph 1,2 ph 1,2 ph 4,5 ph 4,5 ph 6,8 ph 6,8 1 0,1 100 (µl) 900 (µl) 100 (µl) 900 (µl) 100 (µl) 900 (µl) 2 0,2 200 (µl) 800 (µl) 200 (µl) 800 (µl) 200 (µl) 800 (µl) 3 0,4 400 (µl) 600 (µl) 400 (µl) 600 (µl) 400 (µl) 600 (µl) 4 0,6 600 (µl) 400 (µl) 600 (µl) 400 (µl) 600 (µl) 400 (µl) 5 0,8 800 (µl) 200 (µl) 800 (µl) 200 (µl) 800 (µl) 200 (µl) 6 1 1(ml) - 1(ml) - 1(ml) - c koncentrace, NA kyselina nikotinová, ZR zásobní roztok, DM disoluční médium 3.3 Parametry testovaných tablet Rychlost uvolňování kyseliny nikotinové byla sledovaná u preparátů v lékové formě s řízeným uvolňováním. Byly testovány tablety Niaspan, které obsahovaly jako účinnou složku pouze kyselinu nikotinovou a to v množství 500 a 1000 mg, a dále tablety Tredaptive, které jako hypolipidemickou složku obsahovaly 1000 mg kyseliny nikotinové a jako složku ovlivňující symptomy zrudnutí 20 mg laropiprantu. Parametry testovaných tablet jsou uvedeny v Tabulkách 2, 3 a 4 na stranách 35, 36 a 37. 34

Tabulka 2 Charakteristika tablet Niaspan 500 Označení tablety Hmotnost tablety (g) Deklarovaná hmotnost účinné složky (g) 1 - NIA 0,5 0,7146 0,5 2 - NIA 0,5 0,7202 0,5 3 - NIA 0,5 0,7158 0,5 4 - NIA 0,5 0,7151 0,5 5 - NIA 0,5 0,7189 0,5 6 - NIA 0,5 0,7132 0,5 7 - NIA 0,5 0,7128 0,5 8 - NIA 0,5 0,7152 0,5 9 - NIA 0,5 0,7183 0,5 10 - NIA 0,5 0,7147 0,5 11 - NIA 0,5 0,7170 0,5 12 - NIA 0,5 0,7151 0,5 13 - NIA 0,5 0,7128 0,5 14 - NIA 0,5 0,7149 0,5 15 - NIA 0,5 0,7183 0,5 16 - NIA 0,5 0,7117 0,5 17 - NIA 0,5 0,7213 0,5 18 - NIA 0,5 0,7191 0,5 NIA - Niaspan 35

Tabulka 3 Charakteristika tablet Niaspan 1000 Označení tablety Hmotnost tablety (g) Deklarovaná hmotnost účinné složky (g) 1 - NIA 1 1,2504 1,0 2 - NIA 1 1,2007 1,0 3 - NIA 1 1,2600 1,0 4 - NIA 1 1,2609 1,0 5 - NIA 1 1,2040 1,0 6 - NIA 1 1,2571 1,0 7 - NIA 1 1,2579 1,0 8 - NIA 1 1,2650 1,0 9 - NIA 1 1,2642 1,0 10 - NIA 1 1,2410 1,0 11 - NIA 1 1,2998 1,0 12 - NIA 1 1,2486 1,0 13 - NIA 1 1,2856 1,0 14 - NIA 1 1,2682 1,0 15 - NIA 1 1,2713 1,0 16 - NIA 1 1,2653 1,0 17 - NIA 1 1,2853 1,0 18 - NIA 1 1,2598 1,0 NIA - Niaspan 36

Tabulka 4 Charakteristika tablet Tredaptive Označení tablety Hmotnost tablety (g) Deklarovaná hmotnost účinné složky (g) 1 - TRE 1,5338 1,0 2 - TRE 1,5352 1,0 3 - TRE 1,5412 1,0 4 - TRE 1,5725 1,0 5 - TRE 1,5004 1,0 6 - TRE 1,5381 1,0 7 - TRE 1,5299 1,0 8 - TRE 1,5335 1,0 9 - TRE 1,5374 1,0 10 - TRE 1,5332 1,0 11 - TRE 1,5368 1,0 12 - TRE 1,5303 1,0 13 - TRE 1,5298 1,0 14 - TRE 1,5370 1,0 15 - TRE 1,5395 1,0 16 - TRE 1,5363 1,0 17 - TRE 1,5315 1,0 18 - TRE 1,5274 1,0 TRE - Tredaptive 37

3.4 Zkouška disoluce Rychlost uvolňování kyseliny nikotinové z preparátů Niaspan 500, Niaspan 1000 a Tredaptive byla určena in vitro zkouškou disoluce na přístroji ERWEKA s pádly. Jako disoluční média byly použity lékopisné purfy o ph 1,2; 4,5 a 6,8. Testovalo se najednou vždy 6 tablet při teplotě 37±1 C v 900 ml disolučního média. Rychlost otáčení pádel byla 50 otáček/minutu, objem odebíraných vzorků byl 200 µl v časech 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 2 hod, 4 hod, 8 hod, 12 hod, 16 hod, 20 hod a 24 hod. Vzorek byl odebírán z místa uprostřed mezi hladinou disolučního média a dolní hranou rotujícího míchadla, a poloviční vzdáleností mezi osou otáčení míchadla a vnějším koncem pádla (viz Obrázek 4). Během disoluce byly všechny nádoby přikryty víkem zabraňujícím odparu disolučního média. V časových intervalech (30min) byla kontrolovaná teplota média. Výpočet rychlosti uvolňování kyseliny nikotinové zohledňoval úbytek disolučního média odpovídající objemu odebíraných vzorků v daném čase. Obrázek 4 Disoluční nádoba s pádlem Šipkou je vyznačeno místo odběru vzorku 3.5 Stanovení koncentrace niacinu Stanovení koncentrace kyseliny nikotinové bylo provedeno metodou vysokoúčinné (vysokotlaké) kapalinové chromatografie (high performance/presure liquid chromatogramy, HPLC) se spektofotometrickou detekcí v UV oblasti při 234 nm. 38