Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici VYUŽITÍ SSR METODY PŘI STUDIU NEREGISTROVANÝCH GENOTYPŮ RODU VITIS Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Mgr. Jana Raddová, Ph.D. Diplomant: Andrea Štefková Lednice 2013

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Využití SSR metody při studiu neregistrovaných genotypů rodu Vitis vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne Podpis diplomanta..

Chtěla bych poděkovat vedoucí své diplomové práce Mgr. Janě Raddové, Ph.D. za odbornou pomoc, čas a především trpělivost při jejím vypracování. Ráda bych poděkovala i Mgr. Miroslavu Baránkovi, Ph.D. za cenné rady a pomoc při vedení mé diplomové práce.

OBSAH 1. ÚVOD... 7 2. CÍL PRÁCE... 8 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 3.1.1 Historie interspecifického křížení... 11 3.1.2 Využití interspecifických odrůd... 12 3.1.3 Šlechtění interspecifických odrůd... 13 3.1.4 Historie interspecifických odrůd na území ČR... 15 3.2 KVALITA VÍN Z INTERSPECIFICKÝCH ODRŮD... 16 3.3 POPIS VYBRANÝCH ODRŮD... 19 3.3.1 Isabella... 19 3.3.2 Othello... 20 3.3.3 Delaware... 21 3.3.4 Concord... 22 3.3.5 Catawba... 23 3.3.6 Noah... 24 3.4 IDENTIFIKACE NEZNÁMÝCH GENOTYPŮ RODU VITIS... 25 3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR)... 25 3.4.2 Metoda SSR (Simple Sequence Repeat)... 28 3.4.3 Struktura mikrosatelitních sekvencí... 29 4. MATERIÁL A METODA... 30 4.1 ROSTLINNÝ MATERIÁL... 30 4.2 IZOLACE DNA Z ROSTLINNÝCH PLETIV POMOCÍ DNEASY PLANT MINI KIT QIAGEN... 30 4.3 FLUOROMETRICKÉ STANOVENÍ KONCENTRACE DNA... 32 4.4 SSR... 33 4.4.1 SSR reakční směs... 33 4.4.2 Teplotní program termocykleru... 34 4.4.3 Elektroforetická separace SSR produktů... 34 4.4.4 Vizualizace pomocí transiluminátoru... 35 4.5 SEPARACE SSR PRODUKTŮ NA KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE... 36 4.6 STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ... 37

5. VÝSLEDKY... 38 5.1 IZOLACE DNA, KONTROLA ČISTOTY A KONCENTRACE... 38 5.2 SSR ANALÝZA... 38 5.3 VÝSLEDKY SSR ANALÝZY... 42 6. DISKUZE... 47 7. ZÁVĚR... 49 8. SOUHRN A RESUMÉ... 50 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 51 10. SEZNAM PŘÍLOH... 59 11. PŘÍLOHY... 61

1. ÚVOD Člověk je již od pradávna tvor přirozeně zvědavý. Není tedy divu, že jeho pozornost padla i na drobnou neznámou rostlinku, kterou podle pověsti objevil ve stínu tamaryšku sám mladý Dionýsos cestou na ostrov Naxos (Hauft, 1973). Byla to právě jeho zvědavost, která ho přiměla vzít si rostlinku s sebou a zasadit na zahrádce. Od doby Dionýsa uběhla spousta let a z původně neznámé rostlinky je rostlina známá a pěstovaná po celém světě. Rostlina, která provází lidstvo od jeho počátků, až do dnešních dnů. Mnozí lidé jejímu poznání zasvětili celý život. Výsledkem lidské snahy je známý původ, systematika, fyziologie i morfologie čeledi révovitých. I tato rostlinka si ale nadále uchovává svá tajemství a je kolem ní mnoho neprobádaných oblastí. Čeleď révovitých je velmi rozsáhlá a obsahuje mnoho druhů, které mají rozmanité způsoby využití. Některé jsou využívány k produkci hroznů a vína, jiné čistě k okrasným účelům, další nacházejí využití ve šlechtění. Pro porozumění takto velké a rozmanité čeledi je proto nezbytné využít všech dostupných možností. Objevem vědců Watsona a Cricka roku 1953, kam se datuje rozluštění struktury DNA a objevem polymerázové řetězové reakce (PCR) roku 1983 biochemikem Kary Mullisem, byla odstartována nová éra genetiky. V dnešní době proto máme možnost využití nejrůznějších biotechnologických metod, které nám umožňují bádat v dalších oblastech a rozšiřovat tak naše znalosti. S jejich pomocí můžeme identifikovat neznámé odrůdy rostlin, zjistit vzájemné příbuzenské vztahy a na jejich základě rekonstruovat rodokmeny a mnohé další. Princip metody SSR (Simple Sequence Repeat) je založen na amplifikaci mikrosatelitních oblastí s výskytem krátkých opakujících se motivů, které jsou stálé v rámci jedné odrůdy, ale vysoce odlišné ve srovnání mezi odrůdami. Tyto krátké motivy se proto dají využít jako klíč k identifikaci neznámých odrůd. Závěrem bych ráda podotkla, že to byla právě zvědavost, která inspirovala následující diplomovou práci. lidskou existencí. Zvědavost, která se táhne jako pomyslná nit celou 7

2. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo analyzovat neznámé genotypy odrůd rodu Vitis pomocí vhodné genetické analýzy a zpracované výsledky vyhodnotit odpovídající správnou statistickou metodou. Dalším cílem byl komplexní pohled na původ a problematiku lokálně pěstovaných odrůd na jižní Moravě označovaných jako Chorváty, mající svoje stálé místo ve vinohradech na našem území. Získané výsledky byly použity k upřesnění zařazení sledovaných genotypů a jejich vzájemných genetických vztahů v rámci rodu Vitis. 8

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3. 1 BOTANICKÉ ZAŘAZENÍ ČELEDI VITACEAE Vývoj révovitých rostlin probíhal na nejrůznějších stanovištích naší planety. Jako každý živý organismus se i révovité rostliny přizpůsobily svému okolí a naučily se ve svém prostředí přežít. Pod vlivem podmínek (klimatických, půdních) jednotlivých lokalit, působením rostlinných společenstev či vlivem nejrůznějších škůdců a chorob, se při biologickém procesu adaptace utvářely morfologické a fyziologické znaky rostlin. Přizpůsobením se svým specifickým stanovištním podmínkám se utvářely skupiny rostlin se stejnými znaky. Adaptace se ubírala v různých lokalitách různými směry, ale základní vlastnosti rostlin zůstaly společné (Kraus, 2000). Začátkům systematiky a botaniky čeledi révovitých se věnoval mezi prvními Karl Linné. Soudobý botanický název Vitaceae Juss navrhl roku 1830 britský botanik John Lindley (Pavloušek, 2008). Révovité (Vitaceae) je jediná čeleď řádu révotvaré (Vitales) vyšších dvouděložných rostlin (Kutina et al., 1991). Téměř kosmopolitní čeleď Vitaceae má svoje největší druhové zastoupení v tropických a subtropických oblastech, méně potom v mírných pásech obou polokoulí (Pavloušek, 2008). Základy systematiky položil Jules Émile Planchon (1887). Další dílčí klasifikaci révovitých se věnovali francouzští botanici Foex (1895), Ravaz (1902), Levadoux (1968). Dnes se nejvíce využívá členění dle Galeta (1967), (Mullins et al., 1992). Tabulka 1. Klasifikace čeledi Vitaceae do rodů dle Galeta (1967) ( Galet in Pavloušek, 2008) Vitaceae 1. Vitis (Tournef.) L. 10. Rhoicissus PLANCH. 2. Cissus L. 11. Cayratia PLANCH. 3. Ampelopsis PLANCH. 12. Acareosperma GAGNEP. 4. Pterisanthes BL. 13. Pterocissus URB. et EKM. 5. Tetrastigma PLANCH. 14. Cyphostemma PLANCH. 6. Ampelocissus PLANCH. 15. Puria NAIR. 7. Clematicissus PLANCH. 16. Nothocissus LATIFF 8. Landukia PLANCH. 17. Cissites HEER. 9. Parthenocissus PLANCH. 18. Paleovitis REID et CHANDLER Rod Vitis L. je velmi rozmanitý a zahrnuje 40-60 asijských druhů, 25 druhů pocházejících ze Severní Ameriky a pouze jeden evropský druh Vitis vinifera L. Posledně jmenovaný se těší největšímu hospodářskému významu, 9

zatímco ostatní druhy rodu Vitis L. se používají především ke šlechtění podnoží a nových odolných odrůd, či k dekorativním účelům (Cissus L., Ampelopsis PLANCH., Ampelocissus PLANCH) (This et al., 2004). Systematika rodu Vitis byla kontroverzním tématem po celá století. Francouzský botanik Planchon roku 1887 uvádí ve své klasifikaci čeledi Vitaceae Juss. významné rozdělení druhu Vitis L. na dva podrody Muscadinia a Euvitis (Kutina et al., 1991). Odlišnosti mezi podrody jsou definovány na základě lišících se anatomických a morfologických znaků (Pavloušek, 2008). Tabulka 2. Rozdíly mezi podrody Euvitis a Muscadinia dle Galeta (1998) (Galet in Pavloušek, 2008) Podrod Euvitis Podrod Muscadinia Počet chromozomů 2n = 38 Počet chromozomů 2n = 40 Borka se v období zralosti odlupuje v celých Letorosty mají nápadné lenticely, borka se pásech neodlupuje Na letorostech nejsou lenticely Dřevo se vyznačuje malou plochou dřeně Dřevo je měkké s velkými cévami Dřevo je bez velkých cév Dřeň v nodech přerušuje diafragma Dřeň výhonu nemá diafragmu Vegetativní orgány bývají pokryté vlásky Vegetativní část rostliny bývá vždy lysá Hrozny vyzrávají rovnoměrně Hrozny vyzrávají nerovnoměrně Bobule na hroznu se drží stopky i po dosažení Bobule z hroznu po dosažení zralosti plné zralosti opadávají Semena jsou hruškovitá Semena jsou loďkovitá Hrozny jsou díky obsahu cukrů a kyselin Hrozny jsou vhodné pro přímý konzum, vhodné k výrobě šťáv a vína nevhodné pro výrobu vína Listy bývají dlanité s pěti žílami Listy bývají dlanité, slabě laločnaté Podrod Muscadinia obsahuje jen tři divoké druhy a tvoří přechod mezi rody Vitis a Ampelopsis (Kraus et al., 2000). Do podrodu Muscadinia patří druhy V. rotundifolia (MICHX.) SMALL, V. munsoniana (SIMPSON) SMALL a málo známý V. popenoi FENNEL., vyskytující se především v Mexiku (Mullins et al., 1992). Podrod Euvitis čítá přibližně 70 druhů, které pochází ze tří významných center a právě proto se dělí do tří následujících skupin: severoamerická, východoasijská a euroasijská (Dohnal et al., 1975). Do euroasijské skupiny patří pouze druh Vitis vinifera L., který se dále dělí do dvou poddruhů: (Dohnal et al., 1975) 10

Vitis vinifera subsp. sativa (D. C.) HEGI réva vinná pravá Vitis vinifera subsp. silvestris (C. C. GMEL) HEGI réva vinná lesní Druh Vitis vinifera L. zahrnuje kolem 6000 odrůd, ze kterých má význam pro komerční využití méně jak 400 odrůd (This et al., 2004). Odrůdy Vitis vinifera L. rozdělil A. M. Negrul (1946) do tří skupin podle ekologicko-geografických podmínek, za kterých vznikaly (Pavloušek, 2008). Nejstarší skupinou odrůd je černomořská skupina (Proles pontica Negr.), která se dělí na podskupinu balkánskou a gruzínskou. Druhou skupinou jsou západní odrůdy (Proles occidentalis Negr.), do které patří většina u nás pěstovaných odrůd. Poslední skupinu tvoří odrůdy východní (Proles orientalis Negr.), které se dále dělí na podskupiny kaspickou a maloasijskou (Kutina et al., 1991). Mezi významné druhy rodu Vitis L. patří: V. rotundifolia Michaux (réva okrouhlolistá), V. labrusca L. (réva liščí), V. aestivalis Michaux (réva letní), V. berlandieri Planchon (réva Berlandierova), V. riparia Michaux (réva poříční), V. rupestris Scheele (réva skalní), V. amurensis Ruprecht (réva amurská) a další (Kutina et al., 1991). Samostatně nacházejí druhy využití při šlechtění nových odrůd. Jejich kříženci se využívají při šlechtění podnoží, odolných proti mšičce révokazu (Dactylosphaera vitifolii SHIM.), nebo se využívá dalších pěstitelských vlastností (Kutina et al., 1991). 3.1.1 Historie interspecifického křížení K interspecifickému křížení, tedy křížení mezi různými druhy rév, docházelo především na americkém kontinentu, protože se v místních lesích vyskytovalo velké množství rozmanitých druhů révy. V Evropě, kde se vyskytoval pouze jediný druh - réva lesní (Vitis vinifera subsp. silvestris (C. C. GMEL) HEGI.), docházelo ke křížení jen mezi lesní révou a kulturními odrůdami (Vitis vinifera subsp. sativa (D. C.) HEGI), tudíž jen uvnitř jednoho druhu (Kraus et al., 2000). Je tedy zcela jasné, že první kříženci vznikali na území Severní Ameriky právě z odolné divoké révy americké, která se zde vyskytovala přirozeně a z ušlechtilé révy evropské, která byla dovezena osadníky. Rostliny, které vznikly z mezidruhového křížení, se nazývají interspecifické odrůdy (Kraus, 2004). Počátky objevů mezidruhových kříženců sahají do roku 1802, kdy byla objevena odrůda Catawba s růžovo fialově zbarvenými bobulemi, kterou si oblíbil a rozšiřoval generál Lévy (Kraus, 2004). V roce 1816 Isabelle Gibbs objevila v Jižní Karolíně 11

aromatickou a zajímavou rostlinu, která tvoří velké fialovomodré plody s jahodovou příchutí. Rostlina se dále šířila do Evropy pod názvem Isabella, jako okrasná popínavá réva (Prince, 1827). Následoval objev přirozeně vzniklého křížence V. labrusca L. a V. riparia Michaux., pojmenovaný Clinton. Další byla objevena odrůda Delaware v New Jersey roku 1849. K nově vzniklým odrůdám patří Diana a Concord, které vznikly již zcela záměrným křížením člověka (Kraus, 2004). Tyto odrůdy stály na samotném počátku šlechtění množství dalších odrůd a to z cíleného křížení především druhů V. vinifera L., V. labrusca L. a V. aestivalis Michaux. K nejznámějším patří odrůda Othello (Clinton x Trolínské modré) která byla vyšlechtěna Charlesem Arnoldem. Roku 1869 byla představena nová odrůda, která vznikla výsevem semen z druhé filiální generace křížení V. labrusca L. x V.riparia Michaux., zvaná Noah. Rozšířená byla především v Evropě. Na našem území se zachovala pod názvem Chorvát, Charvát (Kraus, 2004). Díky Vitis labrusca L. vzniklo hned několik stolních odrůd, některé i bezsemenné s velmi zajímavou chutí. Příkladem můžou být stolní odrůdy Alden, Ananasnyj, Lakemont seedless či Remaily seedless. Mezi nejznámější severoamerické šlechtitele patřil T. V. Munson (1843 1913) z Texasu, který využíval divoké druhy jako V. candicans Engelmann, V. champinii Planchon, V. lincecumii Buckley, V. rupestris Scheele a vytvořil přes 60 nových stolních odrůd (Fischer, 2000). 3.1.2 Využití interspecifických odrůd Na rozdíl od sazenic ušlechtilé révy štěpovaných na odolné podnože, plodí tyto odrůdy přímo hrozny odrůdy, která byla vysazena. Odrůdy se proto velmi dobře pěstují a nemusí se tedy štěpovat. Ve vegetačním období se nemusejí ošetřovat proti plísni a padlí (Kraus et al., 2005). Odtud pochází název přímoplodé hybridy (Kraus, 2004). V Americe jsou označovány termínem primary hybrids, v Evropě jako americké přímoplodé hybridy, samorodáky (Hauft, 1988), dnes se nejčastěji užívá termín interspecifické odrůdy. Odrůdy byly dováženy do Evropy, jako okrasné rostliny do parků a zahrad. Spolu s nimi však byla ze Severní Ameriky dovezena také mšička révokaz a houbové choroby padlí révy (Erysiphe necator Schwein) a plíseň révy [Plasmopara viticola (Berk&Curt.) Berl.&De Toni] (Hauft, 1988). Domácí evropské odrůdy, patřící k druhu 12

Vitis vinifera L. jsou vysoce citlivé k těmto chorobám, naopak většina druhů rodu Vitis ze Severní Ameriky jsou nositeli genů k odolnosti vůči těmto chorobám. Snaha odborníků byla proto zaměřena na šlechtění odrůd s kombinací pozitivních vlastností rezistence proti houbovým chorobám a mrazuodolnosti amerických druhů s jakostními vlastnostmi evropských odrůd Vitis vinifera L. (Kraus et al., 2000). V Evropě byly následně odrůdy využity pro svoji odolnost v boji vůči révokazu (Dactylosphaera vitifolii SHIM.) v šedesátých letech 19. století (Kraus et al., 2000). Odrůdy vznikaly náhodným i úmyslným křížením druhů Vitis vinifera L. s jinými, nejčastěji americkými druhy za tím účelem, aby bylo možné pěstovat révu vinnou i v lokalitách zamořených révokazem, nebo tam, kde se ušlechtilé révě nedaří (Blaha, 1961). V Evropě se staly tyto odrůdy kvůli boji proti révokazu natolik populární, že v roce 1955 byly pěstovány na zhruba jedné třetině francouzských vinic na úkor evropských odrůd. Tento úspěch a jejich zcela odlišný a typický aromatický charakter spolu s nízkou kvalitou vína, začal být proslulými vinařskými regiony, jako je Bordeaux a Burgundy vnímán jako hrozba (Jackson, 2008). Ve Francii byl proto vyhlášen zákaz pěstování interspecifických odrůd a následovala s tím spojená snaha o jejich likvidaci, ve prospěch evropských odrůd naštěpovaných na odolných podnožích (Sotolář, 2011a). Vína z amerických hybridů musela být použita k destilaci nebo pro výrobu octa (Kraus, 2004). Podobná omezení proběhla i v ostatních evropských zemích. Vše pokračovalo následnou prohibicí interspecifických vín a udělováním pokut za jejich výsadbu a naopak udělováním prémií za jejich vyklučení (Jackson, 2008). O tehdejší oblíbenosti těchto odrůd v Evropě svědčí i fakt, že pěstitelé založili sdružení FENAVINO, které publikovalo časopis La Viticulture Nouvelle, což svědčí o tehdejší oblíbenosti těchto odrůd v Evropě (Kraus et al., 2005). Na našem území zabránila vinohradníkům v pěstování interspecifických odrůd vyhláška ministerstva zemědělství č. 384 ze dne 28. 2. 1949, s. 306 (Kraus, 2004). 3.1.3 Šlechtění interspecifických odrůd Vzhledem k nízké chuťové jakosti vín z kříženců, byly jejich plochy postupně omezovány, mimo jiné i zákonnými předpisy. Časem se ukázalo, že odrůdy nebyly plně resistentní vůči révokazu ani proti houbovým chorobám a byly proto nahrazovány kříženci novějšími (Blaha, 1961). 13

Až do první čtvrtiny 20. století vznikaly ve Francii tzv. francouzské přímoplodé hybridy první generace. Jedná se o křížení amerických druhů a evropských francouzských odrůd. S tímto křížením je spojováno především šlechtitelské jméno Adalbert Seibel (1844-1936), (Rombough, 2002). K dalším význačným šlechtitelům patřili Ganzin, Oberlin, Couderc a Baco, jehož odrůda Baco noir se pěstuje dodnes i na našem území (Kraus, 2009). V první polovině 20. století se objevila nová vlna mezidruhových kříženců. Označují se jako tzv. francouzské přímoplodé hybridy druhé generace. Většina šlechtitelů těchto odrůd využívalo práce A. Seibela, který vypracoval širokou a zajímavou základnu pro práci dalších šlechtitelů. Ti následně křížili jeho odrůdy mezi sebou nebo s dalšími evropskými odrůdami (Kraus et al., 2000). Hybridy první generace obsahovaly méně jak polovinu genomu z evropských odrůd a vyznačovaly se nízkou kvalitou vína. Hybridy druhé generace obsahovaly už 55 68 % genomu evropských odrůd, čímž došlo ke zvýšení jakosti vína (Kraus, 2004). S hybridy druhé generace je spojován hlavně šlechtitel Seyve-Villard. Mezi jeho nejznámější a nejrozšířenější odrůdy patří Villard blanc a Villard noir (Kraus et al., 2005). Šlechtitelské sdružení Vinselekt M. Michlovského v Perné, L. Glos, V. Kraus, V. Peřina a jiní současní šlechtitelé pokračují v trendu křížení již předešlých vyšlechtěných mezidruhových odrůd s nejkvalitnějšími evropskými odrůdami. Mezi nejnovější vyšlechtěné odrůdy dnes označované jako interspecifické nebo PIWI, z německého pilzwiderstandsfähige Rebsorten (odrůdy révy vinné odolné proti houbovým chorobám), zapsané ve Státní odrůdové knize patří: Hibernal, Malverina, Erilon, Rinot, Savilon, Nativa, Sevar, Fratava a Laurot. Ze stejného křížení jako je Laurot pochází i další modré odrůdy Cerason a Kofranka. K stolním PIWI odrůdám registrovaným ve Státní odrůdové knize patří odrůda Arkadia (Pavloušek, 2012). V genomu těchto odrůd je již 85 % zastoupení podílu odrůd evropských (Kraus, 2004). Všechny jmenované odrůdy se vyznačují zvýšenou odolností k houbovým chorobám a bývají hojně využívány v podmínkách biologického vinohradnictví. Vhodné jsou zejména kvůli eliminaci množství pesticidů používaných k jejich ochraně proti houbovým chorobám (Pavloušek, 2012). Pro výrobu jakostního vína je v České Republice od roku 2010 možné pěstovat odrůdy registrované v ostatních zemích EU, které u nás řízením o registraci odrůdy 14

neprošly. V minulosti bylo možné z těchto odrůd produkovat pouze víno zemské, nesoucí zeměpisné označení (české/moravské) (Pavloušek, 2011). 3.1.4 Historie interspecifických odrůd na území ČR Místní označení Chorvát/Charvát vzniklo pravděpodobně s příchodem Chorvatů na jižní Moravu v 16. a 17. století. Toto označení tu zůstalo jako pozůstatek chorvatského hospodaření na našem území. Chorvaté migrovali přes různá území a odrůdy, které znali a pěstovali, putovaly spolu s nimi (Sotolář, 2011b). Hlavním důvodem masových migrací Chorvatů byla turecká expanze na Balkánský poloostrov. Součástí turecké taktiky boje bylo neustálé pustošení krajiny, vesnic a měst. Obyvatelstvu nezbývalo nic jiného, než se podvolit, či utéci. Takto vznikla rozsáhlá migrace obyvatelstva z chorvatského území směrem na sever. Chorvati na Moravě představovali nejsevernější výběžek migrace jižních Slovanů. Hlavní obživou chorvatského obyvatelstva byla práce v zemědělství. Kolonizována byla především území Mikulovska, Břeclavska a Hodonínska. Ve 20. století zde žilo přibližně 1800 Chorvatů a udrželi se tu až do násilného rozsídlení po roce 1945 (Dorovský, 1996). Charvát/Chorvát je tedy mezidruhový kříženec, kdy jedním z rodičů je vždy V. labrusca Linné, vyskytující se na celém území Severní Ameriky. Při křížení zvětšuje bobule, zvyšuje odolnost k padlí a přenáší typické jahodové aroma (Sotolář, 2011b). Odrůdy většinou mívají velké listy s minimálními výkroji, vespod silně plstnatými. Slupka je velmi pevná, po zmáčknutí bobule vystřelí pevná rosolovitá dužnina, zcela neporušená (Sotolář, 2011a). V roce 1982 se na území České Republiky pěstovaly interspecifické odrůdy na ploše 3325 ha, z toho bylo na Moravě jen 24 ha a na Slovensku 3301 ha. V roce 1988 se na území Československa pěstovaly tyto odrůdy na téměř 10 % viniční plochy. V této době se na našem území pěstovaly především odrůdy Isabella, dávající hrozny tmavorudé až černé barvy, Noah s hrozny žlutozelené barvy, odrůda Delaware s růžovými hrozny a modrá odrůda Othello (Hauft, 1988). Z novějších odrůd se zde pěstovaly následující: Baco 1 s malými hrozny a drobnými bobulemi, Oberlin 595, 604 a 605, Seibel 880, 1000, 4986, 5213, 5279, 6486 a modrá odrůda Szaszaros pěstovaná především na Slovensku (Hauft, 1988). V dnešní době se na našem území žádné velké výsadby interspecifických odrůd nevyskytují. Naopak se objevují velmi málo právě na území jižní Moravy, v okolí 15

Velkých Pavlovic, Čejkovic, Poštorné, Charvatské Nové Vsi, Hlohovce, Lanžhotu, Kostic, Tvrdonic, na Podluží a Slovácku (Sotolář, 2011b). Dnes jsou tyto odrůdy díky své odolnosti a dekorativnosti velmi oblíbené a vyhledávané především u zahrádkářů, kteří je využívají mimo jiné ke krytí pergol. Výrobou vín se zabývá jen hrstka vinařů. Vína se proto často stávají oživením nabídky vinařských sklepů. V rámci vinařské a vinohradnické legislativy je ze zákona výroba jakostního vína v zemích Evropské unie povolena pouze z odrůd náležících k botanickému druhu Vitis vinifera L. V rámci vinohradnické a vinařské legislativy Evropské unie pojem interspecifická odrůda není vymezen. Druhy patřící do rodu Vitis, ze kterých je povoleno vyrábět jakostní víno jsou jasně vymezeny. Proto je nezbytné, aby byla každá interspecifická odrůda jednoznačně zařazena do botanického taxonu, na základě svých ampelografických a morfologických znaků (Final report EU, 2002). Dle nařízení Evropské komise č. 1493/1999, článek 19, paragraf 3, ve znění: (Úřední věstník EU, 1999) Členské státy zatřídí odrůdy révy určené k výrobě vína. Zatříděné odrůdy révy musí náležet k druhu Vitis vinifera nebo pocházet z křížení tohoto druhu s jinými druhy rodu Vitis. Zatříděny nesmějí být tyto odrůdy révy: Noah (zvaný Charvát, Noe), Othello, Isabella, Jacquez, Clinton, Herbemont 3.2 KVALITA VÍN Z INTERSPECIFICKÝCH ODRŮD Stinnou stránkou starších odrůd je špatná kvalita hroznů i vína. Hrozny i mladé víno z hybridů se vyznačují nežádoucí příchutí po ovoci - maliny, jahody, černý rybíz, moruše, některé voní po různých květinách, jiné zase v chuti připomínají nepříjemnou trávu nebo kov (Hauft, 1988). Nejcharakterističtějším znakem je chuť hroznů po lesních jahodách. Jahodové aroma pak může přejít i do vín vyrobených z těchto hroznů (Sotolář, 2011a). Hlavní nevýhodou těchto vín je zápach po liščině, kterou víno chytne zpravidla do jednoho roku (Hauft, 1988). Ve víně se liščina projevuje zemitými tóny s nepříjemnou hořčinou v dochuti (Sotolář, 2011a). V literatuře se často objevuje pojem fox, foxy, musky grape, v překladu liščina (Sotolář, 2011a). Na původ tohoto spojení se objevuje hned několik teorií. Jedna tvrdí, že tvar listu vypadá jako liščí tlapka. Jiná, že je odvozeno od rezavého 16

ochlupení spodní strany listů. Další tvrdí, že lišky tyto hrozny nerady jedí nebo naopak proto, že jejich vůně vábí malá zvířata, jako jsou právě lišky a skunkové (Pinney, 1989). Dnes již víme, že za specifický výraz mezidruhových kříženců je zodpovědných hned několik chemických látek, které přispívají různou měrou, ale společně dávají vzniknout labruskovému aroma. Látka methyl-anthranilát byla dříve uváděna, jako výhradní původce liščiny u druhů Vitis labrusca L. a Vitis rotundifolia Michaux. (Ribâereau-Gayon et al., 2006). Mezi dalšími byla objevena i látka furaneol (2,5- dimethyl-4-hydroxy-2,3-dihydroxy-3-furanon), projevující se jahodami ve vůni i chuti. Je senzoricky aktivní již ve velmi malém množství (Rapp et al., 1980). Vyšší obsah furaneolu v bobulích je specifický právě pro druh americké révy Vitis labrusca L. a jeho křížence (Rapp, 1998). Další součástí charakteristického aroma je 2-aminoacetophenon, látka, která bývá příčinou vady s názvem netypické tóny stárnutí (Steidl, 2002). Většina těchto látek se vyskytuje i u vín z druhu Vitis vinifera L., ale v nižších koncentracích (Moio et al., 1995). Obrázek 1. Jednotlivé aromatické látky identifikované v hroznech a vínech druhů Vitis labrusca a Vitis rotundifolia (Ribéreau Gayon et al., 2006) Mezidruhoví kříženci se vyznačují velkým množstvím pektinů, ze kterých vzniká při kvašení metanol. Metanol se ve víně vyskytuje ve velmi malých koncentracích 30-35 mg.l -1. Nevzniká během alkoholového kvašení, ale enzymatickou hydrolýzou metylesterových skupin v pektinech (Ribéreau Gayon et al., 2006). 17

-OCH 3 + H 2 O -OH + CH 3 OH Rovnice 1. Enzymatická hydrolýza metylesterových skupin v pektinech Nejspíš právě z období prohibice pochází mýtus o zdravotní závadnosti hroznů a vín. Důvodem měl být právě vyšší obsah metanolu a snížení plodnosti související s požitím těchto vín. Informace publikoval Breider et al. (1964-1973), na základě pokusů s krmením slepic plemena Leghorn hrozny a mošty z euro-amerických kříženců. U těchto slepic se měly objevovat vývojové vady a poškození nervového systému. Jeho závěry byly o něco později vyvráceny hned několika vědci: Leuschner (1966), Schurich et al. (1968), Stoewsand et al. (1969), jak dokazuje zpráva z časopisu Food Science and Technology z ledna roku 1971, prezentovaná v příloze (Příloha 1.). I přes vyvrácení hypotéz utrpěla reputace odrůd velkou újmu a výsledkem bylo ukončení většiny šlechtitelských programů. Ve šlechtění se pokračovalo hlavně v Německu, Rakousku a Maďarsku (Final report EU, 2002). Mezi vyhlášená evropská vína vyrobená z Vitis labrusca L. a jiných kříženců, vyznačující se jahodovou chutí patří Uhudler, rakouské bílé suché víno nebo růžové cuvée z odrůd Concord, Isabella, Elvíra, Clinton, Ripadella a Noah. Název Uhudler je dnes právně chráněn a smí být používán jen v oblasti jižní Burgenland. Dále Lambrusco, mladé a lehce perlivé červené víno z italské oblasti Emilia-Romagna, vyrobené ze stejnojmenné odrůdy Lambrusco. Známé je i další italské sladší červené víno nebo sekt s názvem Fragolino, typické pro oblast severní Itálie, vyznačující se výraznou chutí po lesních jahodách. Pro jeho výrobu se používá hned několik odrůd Vitis labrusca L., jednou z nich je i odrůda Isabella (Sotolář, 2011a). 18

3.3 POPIS VYBRANÝCH ODRŮD 3.3.1 Isabella Původ odrůdy: Odrůda byla vyšlechtěna pány Bushem a Meissnerem v Jižní Karolíně. Odrůdu pojmenovali po Isabelle Gibs, která byla její propagátorkou a šiřitelkou. Dnes je odrůda v Americe poměrně neznámá a ve vinicích se téměř nepěstuje (Blaha, 1961). Jedná se o první importovanou odrůdu ze Severní Ameriky, dovezenou na území Evropy. Odrůda je kříženec americké Vitis labrusca L. a evropské Vitis vinifera L. (Sotolář, 2006). Charakteristika: List je velmi velký až velký, trojlaločnatý, pavézovitý s mírnými horními výkroji. Horní strana listové čepele je mírně vrásčitá, spodní strana je silně plstnatá, u mladších listů bíle, u starších do rezava. Bazální výkroj je otevřený, lyrovitý. Řapík je delší, zelený, mírně načervenalý (Sotolář, 2006). Hrozen je malý až středně velký, válcovitý, volnější na kratší stopce. Průměrná hmotnost hroznu je 105 g. Bobule je středně velká až velká, kulatá až mírně oválná, tmavomodré barvy. Slupka je velmi pevná, kyselá a trpká. Dužnina je masitá, chruplavá, vyniká jahodovou chutí. Během dozrávání hrozny silně voní (Sotolář, 2006). Odrůda se vyznačuje středním až bujnějším růstem. Réví vyzrává dobře, velmi dobře regeneruje a zaplodí i z podoček. Na houbové choroby netrpí, při silném tlaku se může projevit plíseň révová a červená spála. Dozrává na přelomu srpna a září, při přezrání rychle klesá kvalita hroznů. Je vhodnější na úrodnější jílovitohlinité půdy, kde zvětšuje hrozny i bobule, na štěrkovitých půdách plodí málo a hůře roste. Lépe roste jako pravokořenná, ale není odolná vůči révokazu. Vhodné jsou podnože SO 4, CR 2 a 125 AA. Plodnost je spíše vyšší 8-14 t.ha -1. Cukernatost v moštu bývá do 19 NM, obsah kyselin 8-12 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Odrůda se využívá zejména k dekorativním účelům, nebo pro přímý konzum. Víno je zpočátku silně aromatické, zpravidla do jednoho roku získává příchuť po liščině, odrůda je oblíbená i pro výrobu burčáku (Sotolář, 2006). V Holandsku a Portugalsku se používá k výrobě destilátu, který připomíná slivovici (Blaha, 1961). Synonyma: Izabela, Jahodový hrozen, Bellina, Lidia, Constantia, Black Cape, Capwein, Captraube, Amerikanska loza, Uva fraula, Fragola, Raisin de Cassis, Raisin Fraise, Isabelle d Amérique 19

3.3.2 Othello Původ odrůdy: Odrůda byla vyšlechtěna v Ontariu v Severní Americe Ch. Arnoldem, křížením odrůdy Clinton (Vitis riparia Michx. x Vitis labrusca L.) a Trolínské modré (Black Hamburgh Vitis vinifera L.). Prvně se odrůda objevila r. 1875 ve Francii, odkud byla rozšířena po Evropě (Sotolář, 2006). Dnes se pěstuje velmi málo, je rozšířena zejména v Maďarsku. V místě původu a Americe je odrůda téměř neznámá (Blaha, 1961). Charakteristika: Listy jsou velké, pětilaločnaté s výraznými horními laloky. Horní strana listové čepele je hladká až mírně vrásčitá, tmavě zelená, spodní strana je bíle plstnatá, nervatura jemně ochlupená. Bazální výkrojek je úzký, většinou uzavřený. Řapík je středně dlouhý, zelený, ochlupený (Sotolář, 2006). Hrozen je menší až středně velký, válcovitý, volnější, na krátké stopce. Průměrná hmotnost hroznu je 94 g. Bobule je středně velká, kulatá až mírně oválná, fialově modré až černé barvy, velmi lesklá a ojíněná. Slupka je pevná, kyselá a trpká. Dužnina je masitá, mírně sladká, slabě narůžovělá, v plné zralosti se silnou jahodovou chutí (Sotolář, 2006). Odrůda se vyznačuje bujným růstem, réví vyzrává dobře, je charakteristické dobrou regenerací a zaplodí i z podoček. Je velmi odolná vůči plísni šedé, citlivější k plísni révové a padlí. Dozrává koncem září až října. Při přezrátí se v chuti projeví intenzivní liščina. Hodí se na hlubší jílovitohlinité půdy, kde hojně plodí, na štěrkovitých půdách špatně roste. Vhodné jsou podnože SO 4, CR 2 a 125 AA. Plodnost se pohybuje 9 15 t.ha -1. Cukernatost v moštu se pohybuje do 18 NM, s vyšším obsahem kyselin kolem 8 14 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Odrůda našla využití především k dekorativním účelům a při výrobě burčáků. Vína jsou lehká, intenzivně tmavě červená, s vyšší kyselinkou a hořčinkou v dochuti. Víno zvyšovalo barvu a obsah kyselin při scelování méně hodnotných vín (Sotolář, 2006). I přes to, že odrůda má svoje nedostatky, byla hojně užívána ke křížení a produkci nových odrůd (Blaha, 1961). Synonyma: Otelo, Arnold 1, Arnold s hybrid, Canadien Hamburg, Canadian hybrid, Challenge, Mendoza 20

3.3.3 Delaware Původ odrůdy: Odrůda vznikla pravděpodobně křížením botanických druhů Vitis labrusca L. a Vitis aestivalis Michx., prvotně objevená v New Jersey. Odrůdu jako první pojmenoval a přihlásil roku 1850 George Campbell z Delaware. Pro náchylnost k plísni révové se mnozí domnívají, že jedním z rodičů může být i Vitis vinifera L. Odrůda se rozšířila do Evropy i Asie (Sotolář, 2006). Charakteristika: List je středně velký až velký, trojlaločnatý, s mírnými horními výkroji. Horní strana listové čepele je mírně vrásčitá, spodní strana je silně bíle plstnatá, u starších listů rezavá. Bazální výkrojek je otevřený, tvaru V. Řapík je delší, červené barvy (Sotolář, 2006). Hrozen je středně velký, válcovitý, spíše volnější, na krátké stopce. Průměrná hmotnost hroznu je 122 g (Sotolář, 2006). Bobule je středně velká až velká, kulatá, světle červená až kaštanově hnědá (Blaha, 1961). Dužnina je masitá, sladká až pikantní, v plné zralosti jahodové chuti. Má dosti příjemnou a nepříliš silnou příchuť po liščině (Sotolář, 2006). Odrůda má bujný růst, réví vyzrává velmi dobře. Na houbové choroby není příliš citlivá, za silného tlaku se může objevit plíseň révová. Odrůda zraje začátkem září. Je nenáročná na stanoviště i půdy, vhodné jsou půdy hlinitopísčité, dobře zásobené vodou. Je velmi odolná vůči nízkým teplotám v zimě. Jako pravokořenná roste hůře na suchých půdách a není příliš odolná vůči révokazu. Plodnost je vyšší 7-13 t.ha -1, cukernatost v moštu je 15-19 NM, obsah kyselin bývá kolem 7-11 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Odrůda se používala především k přímému konzumu, pro výrobu burčáku i vína. Víno je světle růžové barvy jahodové chuti, s jemnou kyselinkou a minimální hořčinou. V USA a Kanadě se hrozny využívají i pro výrobu vín ledových či šumivých (Sotolář, 2006). Synonyma: Piros Delaware, Rose Delaware, Ruff, Ruff heath, Lady choice, Powell 21

3.3.4 Concord Původ odrůdy: Jedná se o semenáč botanického druhu Vitis Labrusca L., který vyšlechtil roku 1849 Efraim Wales Bull v Concordu (Massachusetts). Odrůda se dodnes dochovala v Evropě i USA, zejména ve státech Washington, New York, Michigan, Pennsylvania, Ohio a Missouri, kde tvoří asi 8 % celkové sklizně hroznů v USA (Sotolář, 2006). Charakteristika: List je velký, troj až pětilaločnatý, s velkými horními výkroji. Horní strana listové čepele je mírně vrásčitá, spodní strana silně bíle plstnatá, u starších listů rezavá. Bazální výkrojek je lyrovitý, otevřený. Řapík je delší, mírně načervenalý (Sotolář, 2006). Hrozen je menší, spíše válcovitý, volnější na krátké stopce. Průměrná hmotnost hroznu je 99 g. Bobule je středně velká, kulatá, tmavě fialovomodrá, později až černé barvy, silně ojíněná. Slupka je pevná, kyselá a trpká. Při konzumaci se dužnina snadno oddělí od slupky. Dužnina je masitá až rozplývavá, s jahodovou chutí (Sotolář, 2006). Odrůda má bujný růst, réví vyzrává a regeneruje dobře, zaplodí i z podoček. Je poměrně odolná k houbovým chorobám, zejména k plísni šedé. Zraje v polovině září, při přezrání je v hroznech intenzivní liščina. Na stanoviště a půdy není náročná, vhodné jsou jílovitohlinité půdy, kde více plodí. Jako pravokořenná na suchých a štěrkovitých půdách málo roste a rychle slábne. Plodnost je vyšší 9-13 t.ha -1, cukernatost v moštu bývá 14-20 NM, obsah kyselin bývá vyšší kolem 7-11 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Odrůda se využívala pro přímý konzum, k dekorativním účelům a výrobě burčáku. V USA se dodnes používá pro výrobu šťáv, marmelád či košer vín. Vína jsou lehká, světle červená, s vyšší kyselinkou a v dochuti s hořčinou, obzvláště u vín z přezrálých hroznů. Vína našla uplatnění při scelování méně hodnotných vín (Sotolář, 2006). Synonyma: Concordo, Dalmadin, Fekete Noah, Feherhatu, Kék Olasz, Bergerac, Gorin, Furmin noir 22

3.3.5 Catawba Původ odrůdy: Původ této odrůdy je dodnes nejasný. Jedná se o křížence Vitis labrusca L. s neznámou révou, případně i evropskou révou vinou Vitis vinifera L. Většina zdrojů uvádí, že odrůdu zpopularizoval John Adlum (Washington) roku 1823. Jiné zdroje uvádí za místo vzniku této odrůdy Severní Karolínu, kudy protéká řeka Catawba, od které dostala odrůda své jméno. Mezi lety 1825-1850 byla odrůda Catawba nejpěstovanější odrůdou v Americe (Sotolář, 2006). Charakteristika: List je velký až velmi velký, pavézovitý, trojlaločnatý, většinou s nápadně vykrojenými horními výkroji. Horní strana listové čepele je mírně vrásčitá, spodní strana je silně bíle plstnatá. Bazální výkrojek je lyrovitý, otevřený. Řapík je delší, načervenalý až do růžova (Sotolář, 2006). Hrozen je středně velký, spíše válcovitý, volnější. Průměrná hmotnost hroznu je 140 g. Bobule je středně velká až velká, kulatá až mírně oválná, tmavorůžové až fialové barvy. Slupka je pevná, kyselkavá, snadno se oddělující od dužniny. Dužnina je masitá, sladká, jahodové chuti (Sotolář, 2006). Odrůda má středně bujný růst až bujnější růst. Je výborně mrazuodolná, réví vyzrává dobře, navíc dobře regeneruje. Odrůda trpí houbovými chorobami, zejména padlím i plísní révovou. Dozrává pozdně, až v druhé polovině září. Na stanoviště i půdy není odrůda příliš náročná. Odrůda se vysazovala jako pravokořenná. Vhodné by mohly být podnože SO 4, CR 2, 125 AA i 5 BB. Plodnost je vyšší 7-15 t.ha -1, cukernatost v moštu je 14-19 NM, obsah kyselin bývá 7-10 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Odrůda se na našem území příliš nerozšířila, kvůli citlivosti k houbovým chorobám a pro své pozdní zrání. Odrůda má nízkou koncentraci barviv i fenolů v bobulích (zejména její mutace Pink Catawba), takže se z odrůdy vyrábí růžové nebo často i čistě bílé víno, s nižším obsahem tříslovin. Vína jsou většinou suchá, s nižším obsahem kyselin a znatelnou hořčinou (Sotolář, 2006). Synonyma: Arkansas, Captraube rot, Catawba Rosa, Catowba Tokay, Cherokee, Fancher, Francher Kells White, Keller's White, Lichigan, Lincoln, Mammoth Catawba, Meads Seedling, Michigan, Munipale red, Red Muncy, Rose of Tennessee, Rote Captraube, Saratoga, Singleton, Tekomah, Virginia Amber 23

3.3.6 Noah Původ odrůdy: V roce 1869 představil Otto Wasserzieher z Nauvoo (Illinois) novou labruskovou odrůdu získanou výsevem semen z druhé filiální generace křížením Vitis riparia Michx. x Vitis labrusca L., kterou nazval Noah. Odrůda se nejvíce rozšířila v Evropě během révokazové kalamity. Dodnes se více pěstuje v USA, Chorvatsku, Rumunsku a Itálii (Sotolář, 2006). Charakteristika: List je středně velký až velký, troj až pětilaločnatý, většinou s mírnými horními výkroji. Horní strana listové čepele je mírně vrásčitá, spodní strana je hladká, s obarvenou nervaturou. Bazální výkrojek je uzavřený. Řapík je delší, zelený až mírně načervenalý (Sotolář, 2006). Hrozen je menší až středně velký, válcovitý, volnější, na krátké stopce. Bobule je středně velká, kulatá, zelenožlutá s hnědým líčkem. Slupka je pevná, kyselkavá a trpká. Dužnina je masitá až rozplývavá, bezbarvá, v plné zralosti jahodové chuti (Blaha, 1961). Odrůda má bujnější růst, réví vyzrává dobře. Houbovými chorobami příliš netrpí, za silného tlaku se může objevit plíseň révová. Odrůda dozrává koncem září. Na stanoviště i půdy není odrůda příliš náročná, vhodné jsou však půdy hlinitopísčité, dobře zásobené vodou. Lze ji pěstovat i pravokořenně, v minulosti se krátce používala i jako podnožová odrůda. Hodí se pro většinu vedení, snáší velmi dobře i krátký řez. Vhodné by mohly být podnože SO 4, CR 2, 125 AA i 5 BB. Plodnost je vyšší, pohybuje se v rozmezí 7-13 t.ha -1, cukernatost v moštu je nízká 13-19 NM, obsah kyselin bývá vysoký 8-12 g.l -1 (Sotolář, 2006). Využití: Používala se na přímý konzum, výrobu burčáku i vína. Víno je zelenkavé barvy, jahodové chuti s výraznější kyselinou. Ve Francii se využívalo víno k obohacení směsných bílých vín a také na výrobu vinného destilátu. Dnes se s touto odrůdou setkáme u vyhlášených známkových vín jako rakouský Uhudler či v menší míře i italské Fragolino (Sotolář, 2006). rizling, Noe Synonyma: Charvát, Chorvat, Bílé Otelo, Belo Otelo, Belyj Charvat, Tatar 24

3.4 IDENTIFIKACE NEZNÁMÝCH GENOTYPŮ RODU VITIS Tradiční identifikace odrůd révy vinné je založena na ampelometrii a ampelografii (z řeckého ampelos réva, graphos - popis). Analýza odrůd probíhá na základě porovnání charakteristických morfologických znaků listů, výhonů, hroznů a bobulí. Identifikace touto metodou má však několik slabin. Projev morfologických charakteristik je závislý na přírodních podmínkách, individuální rostlinné biologii a fázi vývinu rostliny. U rostlin mladších pěti let se neprojevují typické znaky pro dospělé rostliny (Aradhya et al., 2003). Limitující vlastnosti tradičních metod identifikace byly posunuty vpřed pomocí nových biotechnologických metod založených na hybridizaci: RFLP (Restriction fragment length polymorphism) a metod založených na metodě PCR (Polymerase chain reaction): RAPD (Random amplification of polymorphic DNA), SSR (Simple sequence repeat) a AFLP (Amplified fragment length polymorphism), (This et al., 2004). et al. (1996). Srovnáním všech těchto metod RFLP, RAPD, AFLP, SSR se zabýval Powell Metoda RFLP patří ke klasickým metodám založeným na hybridizaci, užívaným ke zjišťování genetického profilu, která se dnes již používá méně. U révy vinné ji využil k identifikaci podnoží a klonů Bourquin et al. (1992). Metodu RAPD použil roku 1994 This et al., k identifikaci podnoží révy vinné a pro studium genetických vztahů mezi druhy rodu Vitis. Analýze rodokmenů pomocí mikrosatelitní DNA se věnoval mezi prvními Thomas et al. (1993), metodu AFLP využil pro individuální rozlišení odrůd (fingerprinting) Vos et al. (1995). 3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Polymerázová řetězová reakce (dále jen PCR, z anglického Polymerase chain reaction) je chemická reakce s mnoha reaktanty. V reakci se využívá běžných chemikálií za účelem výroby velkého množství kopií specifické části DNA. Díky své jednoduchosti a dostupnosti je metoda PCR každodenní součástí dnešních laboratoří (McPherson et al., 2006). PCR je metodou syntézy nukleových kyselin v řízených podmínkách in vitro, při které dochází k namnožení určitých segmentů původní templátové DNA o známých sekvencích. Metoda je založena na opakované polymerizaci žádaného úseku DNA (Mullis et al., 1987). 25

Standartní PCR probíhá za použití dvou specifických primerů (oligonukleotidů), které identifikují žádaný úsek DNA. Tyto primery se naváží na komplementární místa hledaného úseku, kde slouží jako startovací místo, do kterého se připojuje enzym DNA polymeráza. Následně dojde k zabudovávání volných nukleotidů do nově vznikajícího řetězce DNA (Mullis et al., 1986). Reakční směs pro PCR obsahuje: dvojici primerů (forward, reverse), deoxynukleotid-5 -trifosfáty (datp, dctp, dgtp, dttp), sterilní deionizovanou vodu, reakční pufr (často s obsahem MgCl 2 ), termostabilní Taq DNA polymerázu a templátovou DNA. Termostabilní enzym DNA polymeráza byla izolována z bakterie Thermus aquaticus, která je velmi odolná vůči vysokým teplotám, což dovoluje rekaci dosáhnout vyšší specifity. Byla objevena ve vřídlech Yellowstonského národního parku roku 1969. Enzym je pojmenován po bakterii, ze které byl izolován Taq polymeráza (Brock et al., 1969). Objevem termostabilní polymerázy došlo ke snížení výdajů na provedení analýzy, díky snížení používaného množství polymerázy na jednu reakci (McPherson et al., 2006). Životnost termostabilní DNA polymerázy je charakterizována hodnotou poločasu životnosti. Jedná se o dobu, po kterou jedna polovina molekul enzymu vykazuje enzymatickou aktivitu (Bednář et al., 1999). Optimální teplota pro její činnost je 75-80 C (Lawyer et al., 1993). PCR reakce se skládá ze tří po sobě následujících teplotních kroků. Pro rychlé změny teplot a udržení teploty vzorků na požadované hodnotě po stanovený čas se používá naprogramovatelný termocykler. Právě tento přístroj zpřístupnil a zjednodušil technologii PCR reakce. Před zavedením termocyklerů se využívalo vodních lázní temperovaných na potřebné teploty a vzorky se mezi nimi přenášely manuálně (McPherson et al., 2006). Jednotlivé kroky PCR (Mullis et al., 1986): denaturace templátové DNA hybridizace primerů extenze nově vznikajícího řetězce DNA 26

Denaturace templátové DNA Při denaturaci templátové DNA dochází k rozštěpení vodíkových můstků zahřátím na teplotu 92-95 C. Vyšší teplota má za následek oddělení řetězců a vznik jednořetězcových molekul DNA (Sambrook et al., 1989). Při nedostatečné denaturaci může dojít ke snížení výtěžku produktu a naopak příliš vysoká teplota může poškodit aktivitu polymerázy (Bednář et al., 1999). Hybridizace primerů (annealing) Denaturovaná DNA je rychle zchlazena na teplotu 55 75 C. Teplota je v tomto bodu zásadní (Sabmbrook et al., 1989). Dojde k vytvoření krátkého dvouřetězcového úseku s volnou 3 hydroxylovou skupinou, která je nezbytná pro zahájení prodlužovací fáze. Dochází k nasedání primerů na komplementární místa. Teplota musí zaručit vysokou specifitu hybridizace primeru templátová DNA. Při nízké teplotě může dojít k nespecifickému nasednutí primerů, což má za následek tvorbu nespecifických produktů (Bednář et al., 1999). Prodlužování nově vznikajícího řetězce DNA Templátovou DNA je třeba zahřát na optimální teplotu, obvykle 72-78 C, která umožní zahájení enzymatické reakce (Sabmbrook et al., 1989). Pomocí termostabilní Taq polymerázy dochází k zabudovávání volných nukleotidtrifosfátů do nově vznikajícího řetězce DNA (Bednář et al., 1999). Tento cyklus se opakuje celkem 20 40 x. Počet cyklů PCR je závislý na optimalizaci složení reakce a na množství templátové DNA (Bednář et al., 1999). Jako minimální počet cyklů se doporučuje opakování 25x, k dosažení přijatelné úrovně amplifikace (Sabmbrook et al., 1989). S rostoucím počtem cyklů roste exponenciálně počet produktů z PCR, dle vzorce: N = n * (1 + E) C N konečné množství produktu E účinnost amplifikace n počáteční množství cílové sekvence C počet použitých PCR cyklů 27

3.4.2 Metoda SSR (Simple Sequence Repeat) Jednou z metod založených na PCR je i metoda SSR. DNA pro analýzu metodou SSR může být odebrána z jakéhokoliv pletiva rostliny (dřevo, listy, hrozny) a může být provedena v kterémkoliv období během roku. Metoda je vhodná pro identifikaci odrůd, je proto u révy vinné velmi dobře rozvinuta. Princip metody SSR (Simple Sequence Repeat, dále jen SSR) využívá primery specifické k úsekům DNA bezprostředně přiléhající k mikrosatelitní sekvenci. SSR markerovací systém se stal jedním z nejpoužívanějších DNA markerů při identifikaci odrůd révy vinné, mapování genomu, hledání synonym, sestrojování a rekonstrukci rodokmenů (Sefc et al., 2009). Mikrosatelitní markery se vyznačují následujícími vlastnostmi (Vejl et al., 2002) : vykazují vysoký stupeň polymorfismu jsou relativně rovnoměrně zastoupené po celém genomu jsou kodominantní jsou založené na PCR vyžadují minimální množství DNA SSR využívá oblastí repetitivní DNA. Ta se člení na satelitní DNA, minisatelity a mikrosatelity. Mikrosatelity vykazují nejnižší stupeň opakování. Typická mikrosatelitní sekvence se skládá z 5-100 opakování krátkých jednoduchých motivů sekvencí, složených z 1-6 nukleotidů (Sefc et al, 2001). Členění a kategorie repetitivni DNA (Chambers et al., 2000): Satelity (Satellites) jsou vysoce se opakujicí úseky o délce 100 a více nukleotidů, které vytváří uniformní, souvislou řadu o délce v rozmezí 103 až 107 nukleotidů. Minisatelity (Minisatellites) jsou úseky o délce 10-100 nukleotidů, které vytváří uniformní, souvislou řadu o délce v rozmezí 102 až 105 nukleotidů. Mikrosatelity (Microsatellites) jsou krátké úseky o délce 2-6 nukleotidů, které vytvářejí uniformní řadu o délce do 102 nukleotidů. V podmínkách České Republiky hrají v procesu zvyšování kvality produkovaných vín důležitou roli zákonné podmínky a požadavky (odrůdy povolené pro viniční trať, definice odrůdových a přívlastkových vín, prodej moštů a sazenic) s důrazem na dodržení pravosti odrůd. Metoda SSR se proto jeví, jako vhodný nástroj kontroly. 28

3.4.3 Struktura mikrosatelitních sekvencí Většina z autorů se shoduje, že se jedná o jednotky tandemově se opakujících repetic o délce 1-6 nukleotidů (Sefc et al., 2001). Kromě délky a opakujícího se motivu jsou pro klasifikaci mikrosatelitních sekvencí podstatné další dva parametry: složení nukleotidů v opakujících se sekvencích a celkový počet jejich opakování (Bednář et al., 1999). Mikrosatelity lze řadit do následujících kategorií (Oliviera et al., 2006): dokonalé (perfect) u těchto mikrosatelitů není opakujicí se sekvence přerušena žádnou bází, která nepatří do opakujícího se motivu (TATATATATATATATA) nedokonalé (imperfect) tyto mikrosatelity obsahují pár bází, které narušují opakující se motiv (TATATATACTATATA) přerušené (interrupted) u těchto repetic se vyskytuje krátká sekvence nepatřící do opakujícího se motivu (TATATACGTGTATATATATA) složené (composite) jedná se o dvě nebo více sekvencí, lišících se typem opakovaní (TATATATATAGTGTGTGTGT) Mikrosatelitní lokusy jsou velmi spolehlivé a stálé v rámci odrůdy, ale vysoce rozdílné při srovnání mezi odrůdami. V molekulárně genetické laboratoři ústavu Mendeleum Zahradnické fakulty byl sestaven klíč k identifikaci odrůd a podnoží révy vinné na základě analýzy vybraných SSR markerů (Baránek et al., 2006). Při analýze je nejčastěji používána skupina celkem šesti mikrosatelitních lokusů. Tyto lokusy doporučuje přímo ECP/RG (European Cooperative Program for Crop Genetic Resources Network), které byly vybrány jako velmi vhodné pro identifikaci odrůd révy vinné, díky vysokému polymorfismu a stabilitě (Pidra, 2004). Metoda SSR je vhodná pro identifikaci neznámých genotypů a potvrzení správnosti odrůd, byla proto vybrána jako vhodná metoda pro analýzu experimentální části této diplomové práce. 29

4. MATERIÁL A METODA 4.1 ROSTLINNÝ MATERIÁL DNA byla izolována z mladých listů celkem 21 vzorků, z toho 18 vzorků neznámých genotypů rodu Vitis a 3 vzorky referenčních odrůd. Jako referenční odrůdy byly použity odrůdy Chardonnay (vzorek č. 14), Cabernet Franc (č. 15) z kolekce Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Lednici a odrůda Frankovka (č. 21) z lokality Olomouc. Vzorky byly odebrány z různých lokalit jižní Moravy, jako soubor genotypů rodu Vitis, označovaných lokálně jako tzv. Chorvát. Seznam vzorků a lokalit odběru je prezentován v Tabulce 3. Tabulka 3. Seznam vzorků a lokalit odběru, hvězdička označuje referenční odrůdy Číslo vzorku Lokalita odběru 1. Milovice 2. Boršice 3. Velké Bílovice 4. Kostice 5. Hlohovec 6. Valtice 7. Zaječí 8. Zaječí 9. Zaječí 10. Charvatská Nová Ves 11. Charvatská Nová Ves 12. Kyjov 13. Velké Bílovice 14. Lednice* 15. Lednice* 16. Ratíškovice 17. Hlohovec 18. Hlohovec 19. Lednice 20. Lednice 21. Olomouc* 4.2 IZOLACE DNA Z ROSTLINNÝCH PLETIV POMOCÍ DNEASY PLANT MINI KIT QIAGEN U celkem 21 keřů byly provedeny odběry výhonů vyrůstajících z jednoletého dřeva v březnu roku 2012. Následně byly výhony narašeny v laboratorních podmínkách, aby izolace DNA mohla proběhnout z mladých listů. Po odběru byly uloženy listy v mrazicím boxu při teplotě -40 C. K izolaci DNA z listů byl použit komerční kit DNeasy Plant Mini Kit od firmy Qiagen. Během postupu byly použity dva druhy separačních kolon odlišené barvou. Pomocí fialových kolon došlo k mechanické filtraci rozrušených buněčných zbytků, kontaminujících proteinů a polysacharidů. V bílé koloně byla zachycena izolovaná DNA, ze které byla DNA vymyta dalším pufrem. Doba izolace trvala asi 120 minut. 30

Postup izolace dle výrobce (Qiagen): 1. Rostlinné pletivo bylo hluboce zmraženo a rozdrceno na prášek v třecí misce. 2. Maximálně 100 mg rozdrceného pletiva nebo 20 mg suché rostlinné tkáně bylo umístěno do zkumavky, kde bylo předem přidáno 400 µl Buffer AP1 a 4 µl RNasy A (100 mg/ml). Obsah byl intenzivně protřepán na třepačce tak, aby nevznikaly žádné sraženiny nebo nerozmíchané chuchvalce. 3. Směs byla inkubována 10 minut při teplotě 65 C, 3x protřepávána. 4. K lyzátu bylo přidáno 130 µl Buffer AP2, po promíchání byla směs inkubována 5 minut na ledu (za účelem vysrážení proteinů a polysacharidů). 5. Lyzát byl přelit do fialové kolony umístěné v 2 ml mikrozkumavce a po dobu 2 minut centrifugován při maximálních otáčkách. 6. Fáze prošlá kolonou byla opatrně přepipetována do nové mikrozkumavky (bez usazeniny, která vznikla při centrifugaci). 7. Bylo přidáno 1,5 x větší množství Buffer AP3, než vzorku (kolem 650 µl). 8. Po protřepání byla polovina vzorku přelita na bílou kolonu (DNeasy spin column), odstřeďována 1 minutu při 6000x g (8000 rpm). Kapalina, která prošla kolonou, byla odstraněna (DNA se zachytává na koloně). 9. Na kolonu byl přelit zbytek vzorku, provedena centrifugace za stejných podmínek, jako v kroku č. 8. Kapalina prošlá kolonou, byla opět odstraněna. 10. Kolona byla umístěna do nové 2 ml mikrozkumavky. Na kolonu bylo přidáno 500 µl Buffer AW a proběhla centriguface po dobu 1 minuty při 6000x g (8000 rpm). Fáze prošlá kolonou byla odstraněna. 11. Na kolonu bylo opět přidáno 500 µl Buffer AW, centrifugace proběhla při maximálních otáčkách po dobu 2 minut. Fáze prošlá kolonou byla odstraněna. 12. Kolona se zachycenou DNA byla umístěna do nové 1,5 ml mikrozkumavky, bylo přidáno 100 µl předehřátého Buffer AE přímo na membránu kolony. Proběhla inkubace po dobu 5 minut při pokojové teplotě a potom centrifugace po dobu 1 minuty při 6000x g (8000rpm). 31

13. Předchozí krok byl zopakován, fáze prošlá kolonou obsahuje rozpuštěnou DNA. Její koncentrace se obvykle určuje pomocí kontrolní elektroforézy a porovnáním intenzity signálu pro DNA s koncentrační řadou vzorků λ-dna. Použité roztoky a chemikálie: Všechny roztoky a chemikálie (kromě 96-100% etanolu k ředění koncentrovaných Buffer AP3 a Buffer AW) jsou dodány v komerčním kitu. Buffer AP1, Buffer AP2, Buffer AP3 (koncentrovaný), AW (koncentrovaný), Buffer AE, RNase A (100mg/ml) 4.3 FLUOROMETRICKÉ STANOVENÍ KONCENTRACE DNA Pro PCR reakci a další analýzy je nutné určit kvalitu a koncentraci izolované DNA a naředit ji na stejnou alikvotní koncentraci (10 ng.µl -1 ). Tato kontrola byla provedena fluorometricky, podle postupu uvedeného od výrobce kitu PicoGreen (Invitrogen). Postup dle výrobce: 1. Izolovaná DNA byla naředěna v poměru 1:49 (1 µl DNA:49 µl pufr PicoGreen). 2. Dále byla připravena směs 0,25 µl barvy a 49,75 µl pufru PicoGreen. 3. 50 µl naředěné vyizolované DNA (krok 1) bylo smícháno s 50 µl směsi barvy a pufru (krok 2). Vznikla tak směs o objemu 100 µl. 4. Do kyvety bylo napipetováno 100 µl směsi a množství DNA bylo měřeno fluorometricky v ng. ml -1. 5. Z naměřené koncentrace DNA bylo následně vypočítáno ředění alikvot DNA. Použité roztoky a chemikálie: Pufr (PicoGreen), fluorescenční barvivo Použité přístroje: Fluorometr Modulus (Turner BioSystems) 32

4.4 SSR 4.4.1 SSR reakční směs Reakční směs pro PCR reakci obsahovala sterilní deionizovanou vodu, DNA polymerázu (New England Biolabs), 10x Buffer (New England Biolabs), 0,2 mm dntp s (Promega), Primer A, Primer S (New England Biolabs). Tabulka 4. Mastermix pro reakci PCR H 2 O Pufr NEB dntp s Primer S Primer A Polymeráza NEB Templátová DNA Výchozí Koncentrace 1 reakce koncentrace v reakci (µl) 17,1 10 x 1 x 2,5 25 mm 0,2 mm 0,2 10 µm 0,2 µm 0,5 10 µm 0,2 µm 0,5 5 U/µl 1 U 0,2 4 Σ 25 µl MasterMIX 21 x (µl) 359,1 52,5 4,2 10,5 10,5 4,2 Po smíchání všech součástí mastermixu byl do každé z připravených tenkostěnných mikrozkumavek (0,2 µl) odpipetován objem 21 µl mastermixu a přidány 4 µl templátové DNA analyzovaných vzorků. Jako templátová DNA byly použity alikvotní vzorky DNA předem naředěné na stejnou koncentraci 10 ng. µl -1. U všech 21 analyzovaných vzorků, bylo použito celkem 6 mikrosatelitních lokusů, mezinárodně schválených pro identifikaci odrůd révy vinné (Tab. 6). Tabulka 6. SSR lokusy a patřičné primery užívané pro identifikacii odrůd révy vinné (Baránek et al., 2006) 33

4.4.2 Teplotní program termocykleru Amplifikace při SSR reakci proběhla v termocykleru (Biometra). U každého z analyzovaných lokusů byla využita odlišná dvojice primerů (forward, reverse) s různou teplotou tání. Podle práce Moravcová (2005), která se zabývala vytvořením metodiky identifikace odrůd révy vinné pomocí molekulárně genetických metod, byly pro primerové páry jednotlivých analyzovaných lokusů optimalizovány teplotní programy, vytvořené v rámci laboratoře Mendelea. Teplotní programy jsou prezentovány v Tabulce 5. Tabulka 5. Použitý teplotní program termocykleru pro jednotlivé mikrosatelitní lokusy (Baránek et al., 2006) program SSR 44 SSR 51 SSR 47 čas opakování krok teplota ( C) Min sec 1. denaturace 94 3 2. denaturace 94 30 3. hybridizace 44,5 51 47 45 4. elongace 72 45 5. dosyntetizování 72 10 6. chlazení 4 10 35 x 4.4.3 Elektroforetická separace SSR produktů Vizuální separace fragmentů DNA byla provedena prostřednictvím elektroforetické separace na 0,8% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze Agagel Maxi (Biometra), porovnáním s velikostním standardem 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Vizualizace gelu byla provedena barvivem GelRED (Biotium) (Sambrook et al., 1989) v pufru TAE. Jako nanášecí pufr byl použit pufr Orange-G, který zahušťuje dávkovaný vzorek a umožňuje jeho vizualizaci při pohybu gelem. Postup: 1. Bylo naváženo potřebné množství agarózy (1,2 g agarózy na 150 ml TAE u 0,8% agarózy). Po rozmíchání byla agaróza rozvařena v mikrovlnné troubě. 2. Byla sestavena forma s hřebínkem pro tvorbu komůrek při tuhnutí gelu. 3. Rozvařená agaróza byla nalita do formy na gel. Po ztuhnutí gelu (30 minut) byl odstraněn hřebínek a forma byla umístěna do elektroforetického systému, jehož hlavní součástí jsou dvě elektrody, zdroj stálého napětí a elektrolytický pufr. 34

4. Jednotlivé vzorky spolu se 7 µl nanášecího pufru byly dávkovány do jednotlivých komůrek. Nakonec byl dávkován i hmotnostní standard. 5. Po dávkování všech vzorků byla elektroforéza uzavřena posuvným bezpečnostním víkem a zapojena do zdroje stejnosměrného napětí. Separace probíhala 40 minut při napětí 110 V. 6. Po ukončení separace fragmentů byl gel vyjmut a přenesen na transiluminátor. Použité roztoky a chemikálie: agaróza: agaróza pro elektroforézu DNA TAE 50 x: 2 M Tris-octan, 50 mm EDTA TAE 1 x: získáno ředěním 50 x TAE v poměru 1:49 dávkovací pufr: 0,5% Orange G barvivo: GelRED o koncentraci 5 µl barviva na každých 100 ml gelu velikostní standard: 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) Použité přístroje: horizontální elektroforetická jednotka Agagel Maxi Biometra (Biometra) zdroj jednosměrného napětí P 25 Biometra (Biometra) elektromagnetická míchačka T1 A Lavat (Lavat) 4.4.4 Vizualizace pomocí transiluminátoru Ke zviditelnění barviv u separovaných fragmentů byl použit UV transiluminátor (OmniBio), který produkuje světlo o vlnové délce 312 nm. Gely byly vyfoceny digitálním fotoaparátem Kodak DC-120. Fotografie byly upraveny pomocí programu Corel PhotoPaint. Použité přístroje: UV transiluminátor (OmniBio) Digitální fotoaparát Kodak DC 120 + UV filtr Hama a červený filtr Hama HTMC RO4 Software Kodak Picture Transfer pro přenos fotografií do počítače Program Corel PhotoPaint pro úpravu fotografií Osobní počítač 35

4.5 SEPARACE SSR PRODUKTŮ NA KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE Kapilární elektroforéza slouží k detekci a délkové separaci produktů PCR označených fluorescenční značkou. Pro SSR analýzy je výrobcem doporučován systém 4 fluorescenčních barviv FAM, NED, JOE a ROX, přičemž barvivo ROX je vyčleněno pro signál velikostního standardu. Byl navržen systém, ve kterém byly jednou barvou označeny primery příslušející dvěma různým lokusům, poskytující produkty o významně odlišné velikosti, což umožňuje jejich odlišení. Tabulka 7. Systém fluorescenčních barviv pro analýzu na kapilární elektroforéze (Pidra, 2004) Postup: 1. V digestoři byla připravena směs 12 µl formamidu a 0,7 µl velikostního standardu GeneScan HD 400 Rox Size Standard (Applied Biosystems) pro každý sledovaný vzorek. 2. Pro celou skupinu vzorků byly smíchány produkty SSR analýzy všech šesti sledovaných lokusů o objemu 2 µl. 3. Z takto připravené směsi vzorků byly odebrány 2 µl, ke kterým bylo přidáno 12 µl dříve připravené směsi formamidu a velikostního standardu. 4. Vzniklá směs byla denaturována při teplotě 95 C po dobu 5 minut a vzápětí zchlazena na vymrazovacím stojanu. 5. Takto denaturovaný vzorek byl analyzován na kapilární elektroforéze automaticky a přesná délka separovaných PCR produktů v jednotkách párů bází byla odečtena pomocí softwaru GeneScan (Applied Biosystems). 36

Použité roztoky a chemikálie: Velikostní standard GeneScan 400 HD Rox (Applied Biosystems) Hi-Di formamid Polymer POP4 pro separaci (Applied Biosystems) Použité přístroje: ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Software GeneScan (Applied Biosystems) Osobní počítač 4.6 STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Výsledky z kapilární elektroforézy byly zapsány formou binární matice, 1 pro přítomnost alely, 0 pro nepřítomnost alely. Na základě binární matice byl vytvořen dendrogram UPGMA metodou s použitím koeficientu Nei and Li v programu FreeTree (Hampl et al., 2001). Výsledný dendrogram byl konstruován programem TreeView (Page, 1996). 37

5. VÝSLEDKY 5.1 IZOLACE DNA, KONTROLA ČISTOTY A KONCENTRACE Pro stanovení kvality izolované DNA, byla použita kontrolní elektroforéza na 0,8% agarózovém gelu (kapitola 4.4.3. Elektroforetická separace SSR produktů). Získané velikostní produkty byly kontrolovány srovnáváním s velikostním standardem λ-dna o známé koncentraci. Při izolaci kitem DNeasy Plant Mini Kit byla získána vysokomolekulární DNA dobré kvality i koncentrace, jak je patrné z produktů u vzorků č. 1-16 (Obr. 2). Vzorky byly srovnány se standardy o známé koncentraci 100 a 200 ng λ-dna. Obrázek 2. Kontrola čistoty a koncentrace DNA Během fluorometrického stanovení koncentrace DNA byly naměřeny hodnoty v rozsahu 9,7-72,9 ng. µl -1. Naměřené hodnoty byly naředěny na stejnou koncentraci 10 ng. µl -1 (Tab. 8, kapitola 11. Přílohy). 5.2 SSR ANALÝZA Mastermix pro PCR reakci byl namíchán z komponent o koncentracích prezentovaných v Tab. 4. Pro jednotlivé mikrosatelitní lokusy byly zvoleny odpovídající teplotní programy (Tab. 5) (Baránek et al., 2006). Před analýzou na kapilární elektroforéze byly vzorky po SSR reakci zkontrolovány na elektorofréze, kvůli potvrzení správnosti proběhlé PCR reakce. Vzorky byly sledovány na 1,5 % agarózovém gelu. Jako ukázka kontroly na elektroforéze byla vybrána fotografie lokusu VVS 2 s produkty o očekávané velikosti 129 155 bp (Obr. 3), se zvoleným optimálním teplotním programem 44 C. Na fotografii jsou jasně přítomné viditelné produkty o správné velikosti 100 200 bp, ve srovnání s velikostním standardem 1 Kb (Invitrogen). O správnosti zvolené teploty svědčí malé množství získaných produktů o stejné velikosti. 38

Čísla 1 až 16 označují čísla jednotlivých vzorků, písmeno M pak velikostní standard 1Kb (Invitrogen). V pravém dolním rohu je uvedeno jméno primeru a použitá teplota. Obrázek 3. Fotografie gelu lokusu VVS 2 na agarózovém gelu U lokusů VrZAG 62 a VrZAG 79 bylo nutné pozměnit teplotní optimum pro PCR reakci, z důvodu namnožení většího množství produktů o různé velikosti, tedy vzniku nespecifických produktů. Teplota u lokusu VrZAG 62 byla zvýšena z 51 C na 53 C (Obr. 4, 5), u lokusu VrZAG 79 byla teplota taktéž zvýšena ze 47 C na 49 C (Obr. 6, 7). Zvýšení teploty se projevilo zvýšením specifity hybridizace primer - templátová DNA, tedy objevením menšího množství produktů na kontrolním gelu. Tyto produkty odpovídaly počtu alel, který by měl být 2, 1, 0 podle toho, zda se jedná o alely v heterozygotním, homozygotním nebo nevyjádřeném stavu. Z fotografií je patrné, že zvolení správné teploty amplifikace je zásadní pro namnožení požadovaných produktů. U všech ostatních lokusů proběhla amplifikace s odpovídajícím počtem produktů, byla tudíž zvolena správná teplota pro namnožení produktů. 39

Obrázek 4. Fotografie gelu po SSR reakci lokusu VrZAG 62 při teplotě 51 C s velkým množstvím nespecifických produktů o různé velikosti Obrázek 5. Fotografie gelu po SSR rekaci lokusu VrZAG 62 po zvýšení telpoty na 53 C s viditelným zvýšením specifity produktů Obrázek 6. Fotografie gelu po SSR lokusu VrZAG 79 při teplotě 47 C s velkým množstvím nespecifických produktů Obrázek 7. Fotografie gelu po SSR reakci lokusu VrZAG 79 při zvýšení teploty na 49 C s viditelně menším množstvím namnožených produktů 40

Po provedení kontroly výsledků amplifikace, byla vytvořena směs produktů SSR analýz všech šesti sledovaných lokusů o objemu 2 µl (kapitola 4.5. Separace SSR produktů na kapilární elektroforéze). Směs byla použita pro fluorescenční délkovou separaci produktů PCR reakce na kapilární elektroforéze, pomocí systému 4 fluorescenčních barviv. Jednou barvou byly vždy označeny primery patřící dvěma různým mikrosatelitním lokusům. Na následujících obrázcích je uveden výsledek analýzy z kapilární elektroforézy vzorků č. 2, 12. Barvivo ROX (červená barva) značí signál velikostního standardu. Barvivo NED (černá barva) je signálem pro lokusy VVS 2 a VVMD 5. Barvivo JOE (zelená barva) značí signál lokusů VrZAG 62 a VrZAG 79. Lokusy VVMD 7 a VVMD 27 značí signál barviva FAM (modrá barva). Obrázek 8. Analýza na kapilární elektroforéze vzorku č. 2 ( Noah ) Obrázek 9. Analýza na kapilární elektroforéze vzorku č. 12 ( Isabella ) 41

5.3 VÝSLEDKY SSR ANALÝZY Při hodnocení výsledků SSR reakcí pomocí kapilární elektroforézy, byly odečteny velikosti alel jednotlivých produktů SSR analýzy (v bp) a jejich hodnoty zapsány do tabulky. Data v tabulce (v bp) byla dále přepsána pomocí kódování, dostupného z databáze (www.eu-vitis.de). Pro určení kódů v jednotlivých lokusech byly použity zjištěné velikosti (v bp) u referenčních odrůd (This et al., 2004) a odrůd Noah a Isabella, získaných z pracoviště French Nationale Institute for Agricultural Research (INRA) v Montpellier. Tabulka 9. Tabulka přepočtu velikostí alel odrůd Noah a Isabella z INRA Noah Isabella VVS 2 VVMD 5 VVMD 7 VVMD 27 VrZAG 62 VrZAG 79 N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+8:N+32 N+12:N+22 N:N+28 N+16:N+16 N+4:N+18 N+4:N+8 N+28:N+30 N:N+10 Tabulka 10 prezentuje přepočet velikostí alel analyzovaných vzorků. Bylo tak učiněno přes koeficient N, který se získá přepočtem velikostí alel referenčních odrůd (kapitola 11. Přílohy, Tab. 11). Přes koeficient N byly vypočítány hodnoty velikosti obou alel jednotlivých lokusů u všech analyzovaných vzorků. Tento přepočet umožňuje a usnadňuje orientaci a srovnávání v mezinárodních databázích. V následující tabulce (Tab. 10) přepočtu velikostí alel analyzovaných vzorků je celkem devět vzorků zcela shodných ve velikosti alel (podbarveny žlutě). Tyto vzorky se shodují téměř ve všech hodnotách s odrůdou Noah v Tab. 9, kromě menší alely lokusu VrZAG 62 N+8, zatímco u všech devíti vzorků se objevuje alela N+6. K tomuto posunu mohlo dojít sklouznutím DNA polymerázy během amplifikace. Ve všech ostatních lokusech se obě alely shodují, je proto možné tyto vzorky identifikovat jako odrůdu Noah. Vzorky č. 12 a 13 (podbarveny zeleně) se plně shodují se vzorkem v Tab. 9, je proto možné je identifikovat jako odrůdu Isabella. Vzorek č. 17 se liší hodnotově lokusem VrZag 62 o dva páry bazí, pravděpodobně způsobené sklouznutím DNA polymerázy při amplifikaci. Vzorek byl vyhodnocen jako odrůda Noah. Vzorek č. 19, který se liší v lokusu VVMD 27 už o čtyři páry bazí, lze pravděpodobně označit za křížence odrůdy Noah a neznámého druhého rodiče. Všechny ostatní vzorky (č. 1, 8, 9, 18, 20), kromě referenčních odrůd (vzorky č. 14, 15, 21), lze označit jako neznámé genotypy rodu Vitis. U těchto vzorků 42

byly alely vyskytující se u jiných vzorků podbarveny shodnou barvou. Jejich vzájemná příbuznost byla zjištěna pomocí dendrogramu (Obr. 10). Tabulka 10. Přepočet alel neznámých genotypů rodu Vitis N=120 N=220 N=228 N=172 N=173 N=235 VZOREK VVS 2 VVMD 5 VVMD 7 VVMD 27 VrZAG 62 VrZAG 79 1 146:148 228 232:246 176:176 185:201 245:251 N+26:N+28 N+8 N+4:N+18 N+4:N+4 N+12:N+28 n+10:n+16 2 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 3 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 4 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 5 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 6 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 7 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 8 122:130 232:264 232:240 178:180 187:189 245:257 N+2:N+10 N+12:N+44 N+4:N+12 N+6:N+8 N+14:N+16 N+10:N+22 9 122:130 232:264 232:240 178:180 187:189 245:257 N+2:N+10 N+12:N+44 N+4:N+12 N+6:N+8 N+14:N+16 N+10:N+22 10 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 11 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 12 120:148 236:236 232:246 176:180 201:203 235:245 Isabella N:N+28 N+16:N+16 N+4:N+18 N+4:N+8 N+28:N+30 N:N+10 13 120:148 236:236 232:246 176:180 201:203 235:245 Isabella N:N+28 N+16:N+16 N+4:N+18 N+4:N+8 N+28:N+30 N:N+10 14 134:140 232:236 236:240 178:186 187:195 241:243 Chardonnay N+14:N+20 N+12:N+16 N+8:N+12 N+6:N+14 N+14:N+22 N+6:N+8 15 136:144 224:238 236:260 178:186 193:203 245:257 Cabernet Franc N+16:N+24 N+4:N+18 N+8:N+32 N+6:N+14 N+20:N+30 N+10:N+22 16 122:126 248:248 232:252 182:184 179:205 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+6:N+32 N+12:N+22 17 122:126 248:248 232:252 182:184 181:207 247:257 Noah N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+10:N+12 N+8:N+34 N+12:N+22 18 122:130 234:234 232:238 182:184 201:205 235:? N+2:N+10 N+14:N+14 N+4:N+10 N+10:N+12 N+28:N+32 N: 19 122:126 248:248 232:252 178:180 179:205 247:257 N+2:N+6 N+28:N+28 N+4:N+24 N+6:N+8 N+6:N+32 N+12:N+22 20 130:160 248:248 240:248 178:180 187:201 237:245 N+10:N+40 N+28:N+28 N+12:N+20 N+6:N+8 N+14:N+28 N+2:N+10 21 122:140 224:238 236:246 176:192 193:203 235:249 Frankovka N+2:N+20 N+4:N+18 N+8:N+18 N+4:N+20 N+20:N+30 N:N+14 43

Všechny hodnoty z předešlé tabulky byly statisticky zpracovány metodou UPGMA, koeficientem Nei a Dice. Přítomnost alely byla značena jako 1, nepřítomnost jako 0, data byla zapsána do binární matice (kapitola 11. Přílohy, Tab. 12a, b). Pomocí programů FreeTree a TreeView byl vytvořen výsledný dendrogram genetické podobnosti. 18. Hlohovec 19. Lednice 17. Hlohovec 22. Noah datab. 16. Ratíškovice 11. Charvátská Nová 10. Charvátská Nová 7. Zaječí 6. Valtice 5. Hlohovec 4. Kostice 2. Boršice 3. Velké Bílovice 1. Milovice 23. Isabella datab. 12. Kyjov 13. Velké Bílovice 15. Cabernet Franc 21. Frankovka 14. Chardonnay 20. Lednice 8. Zaječí 0.1 9. Zaječí Obrázek 10. Dendrogram genetické podobnosti jednotlivých vzorků neznámých genotypů rodu Vitis na základě SSR analýzy 44

Z dendrogramu je patrné, že celý soubor vzorků byl rozdělen na dva základní shluky. První shluk se dělí na dva podshluky. Početnější podshluk tvoří devět vzorků (č. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 16), které se na základě analýzy plně shodují. Jedná se o odrůdu Noah, jak vyplývá z Tab. 9, Tab. 10. Nejvíce se k těmto vzorkům blíží vzorek č. 22 Noah získaný z databáze, oddělený od předešlých vzorků, z důvodu posunu velikosti menší alely v lokusu VrZAG 62. K této skupině se řadí i vzorek č. 17 a vzorek č. 19. Nejméně geneticky příbuzný v rámci prvního shluku je vzorek č. 18 z lokality Hlohovec, který je zařazen jako jediný v dalším podshluku. Druhý shluk je o hodně členitější. Je rozdělen do dvou podshluků. První z nich je rozdělen do dalších dvou větví. Do první větve se řadí vzorky č. 12 a 13, shodující se s odrůdou Isabella z databáze. Nejvíce je jim příbuzný vzorek č. 1 z Milovic. Druhou větev tvoří modré referenční odrůdy Frankovka a Cabernet Franc. Druhý podshluk tvoří celkem čtyři vzorky. Vyskytují se zde dva shodné vzorky č. 8 a 9 ze Zaječí. K těmto vzorkům má nejblíže vzorek č. 20 a referenční odrůda Chardonnay. Lze předpokládat, že vzorky nacházející se v této skupině jsou příbuzné s Vitis vinifera L., kam patří odrůda Chardonnay. Z původních jednadvaceti vzorků byly známé názvy odrůd u vzorků č. 14 - Chardonnay, č. 15 Cabernet Franc a č. 21 Frankovka. Tyto vzorky byly použity jako referenční odrůdy. Ze zbylých vzorků jich bylo celkem deset srovnáním s dostupnými informacemi z databází identifikováno jako odrůda Noah a dva vzorky jako odrůda Isabella. Jako chorváty tedy může být označeno celkem dvanáct vzorků z původních devatenácti neznámých genotypů. Jako identické byly zjištěny vzorky č. 8 a 9 z lokality Zaječí. Tyto vzorky se liší od výše identifikovaných odrůd, naopak jsou spolu se vzorkem č. 20 geneticky příbuznější s odrůdou Chardonnay a tvoří tak spolu odlišnou skupinu. V následujícím výsečovém grafu je znázorněno procentuální zastoupení všech analyzovaných vzorků. Největší podíl (48 %), tedy téměř polovina všech vzorků byla identifikována jako odrůda Noah, 9 % potom jako Isabella. Chorváty společně tvořily 57 %. Celých 29 %, tedy skoro jedna třetina patřila neznámým genotypům. Celková analýza nebyla zaměřena na identifikaci všech vzorků, byla proto zvolena a posuzována pouze kritéria vedoucí k identifikaci Chorvátů. Neznámé genotypy nebyly proto dále vyhodnocovány. Zbylých 14 % patří referenčním odrůdám. 45

14% 29% 9% 48% Noah Isabella Referenční odrůdy Neznámé genotypy Graf 1. Výsečový graf procentuálního zastoupení výsledků analyzovaných vzorků 46

6. DISKUZE Analýza neznámých genotypů rodu Vitis byla provedena metodou SSR, na základě využití konzervativních oblastí, které přiléhají k repetitivním sekvencím DNA. Bylo využito celkem šesti mikrosatelitních lokusů, mezinárodně schválených pro identifikaci odrůd révy vinné na základě stabilních výsledků a vysoké úrovně jejich polymorfismu. Spolu s lokusy byly použity i doporučené teplotní programy pro amplifikaci, vytvořené v laboratořích Mendelea podle Moravcová (2005), která se zabývala vytvořením metodiky identifikace odrůd révy vinné pomocí biotechnologických metod SSR a RAPD. Pro analýzu v této práci byla z finančních důvodů použita jiná polymeráza (New England Biolabs). Na rozdíl od práce podle Moravcová (2005), došlo u lokusů VrZAG 62 a VrZAG 79 k amplifikaci většího množství nespecifických produktů, způsobené nespecifickou hybridizací primeru s templátovou DNA. Na základě získaných výsledků bylo proto nutné teplotní optimum pro polymerázu (New England Biolabs) upravit zvýšením teploty hybridizace primeru o 2 C u obou lokusů. Důsledkem zvýšení teploty byla zvýšena specifita nasednutí primeru. Na Obr. č. 5, 7 se zvýšení teploty projevilo menším počtem proužků, tedy produktů. Je možné se domnívat, že odlišná polymeráza si vyžádala zvýšení teploty pro hybridizaci primerů lokusů VrZAG 62 a VrZAG 79. U všech ostatních lokusů proběhla amplifikace obdobně, jako v práci Moravcová (2005). Na území České Republiky nebyla doposud podobná analýza provedena, bylo proto potřeba pracovat s výsledky ze zahraničních laboratoří a srovnávat v rámci mezinárodních databází. V mezinárodních databázích jsou ve většině případů dostupné analýzy odrůd Vitis vinifera L., nikoliv kříženců s jinými druhy rodu Vitis. Vzorky byly porovnávány s výsledky z francouzského pracoviště Nationale Institute for Agricultural Research (INRA), kde proběhla obdobná analýza. Tyto výsledky proto byly využity jako základní zdroj informací pro sledování genotypů zahrnutých v této práci. Na základě porovnávání vzorků obou analýz byla zjištěna shoda u většiny neznámých genotypů z této práce s minimálními odchylkami v párech bazí. Odchylky byly pravděpodobně způsobeny sklouznutím DNA polymerázy. Při opakujících se cyklech v programu během PCR reakce dojde ke vzniku odlišného počtu opakujícího se motivu mikrosatelitu. Neznámé genotypy se nepodařilo dohledat v dostupných databázích, jediným zdrojem informací o jejich genetickém pozadí, či příbuznosti analyzovaných vzorků zůstává vytvořený dendrogram. 47

Vzorky č. 8, 9 a 20 z lokality Zaječí a Lednice se v dendrogramu nápadně oddělují od ostatních Chorvátů a geneticky se podle umístění v dendrogramu blíží více odrůdě Chardonnay. Jedná se pravděpodobně o rostliny vzniklé křížením s Vitis vinifera L., kam patří právě odrůda Chardonnay. Na fotografiích (Obr. 11) jsou porovnány listy vzorků (zleva): neznámý genotyp ze Zaječí, odrůda Noah identifikovaná metodou SSR a odrůda Chardonnay z kolekce Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Lednici. V chuti hroznů se u prvních dvou keřů projevuje jahodová chuť, typický výraz hybridních odrůd. Na základě dendrogramu jsou si neznámé genotypy ze Zaječí geneticky mnohem podobnější s odrůdou Chardonnay, i když ve fenotypovém projevu se vzhled keře blíží spíše k Chorvátům. V dostupných databázích nebyly neznámé genotypy ze Zaječí a Lednice nalezeny. Obrázek 11. Fotka listů neznámého genotypu ze Zaječí (č. 8), Noah z Kostic (č. 4) a Chardonnay z Lednice (č. 14) Dendrogram poměrně jasně naznačil příbuznost genotypů č. 8, 9 i 20 s odrůdami Vitis vinifera L. Vznikly pravděpodobně křížením Chorvátů nebo jim podobných odrůd s některou z kulturních odrůd typu Vitis vinifera L. Jelikož vinařský a vinohradnický zákon výrobu jakostních vín z Chorvátů neumožňuje, mají tyto tři odrůdy potenciál být ze zákona vyjmuty, z důvodu zkřížení s evropskou kulturní révou. Je velmi pravděpodobné, že se v genomu s Vitis vinifera L. shodují alespoň z 50 %. Proto pokud se u těchto tří genotypů objevují cílové vlastnosti, jako je zvýšená odolnost vůči houbovým chorobám, mohly by se tyto genotypy dostat do zájmu šlechtitelů a bližšího zkoumání jejich vinařských i vinohradnických vlastností. 48

7. ZÁVĚR K vypracování diplomové práce s názvem Využití SSR metody při studiu neregistrovaných genotypů rodu Vitis byly využity dostupné literární zdroje zabývající se odpovídající problematikou. Dosavadní poznatky týkající se publikované problematiky Chorvátů jsou spíše útržkovité, či formou drobných textů. Cílem této práce bylo proto mimo jiné vytvořit ucelený literární přehled dostupných informací o původu, historii a využití těchto interspecifických odrůd. Byla provedena genetická analýza vybraných vzorků. Celkem 21 vzorků neznámých genotypů rodu Vitis bylo podrobeno genetické analýze metodou SSR, založené na reakci PCR. Pro reakci PCR bylo použito 6 SSR lokusů vhodných pro amplifikaci mikrosatelitních sekvencí, za využití doporučených optimálních teplotních programů. Pomocí kapilární elektroforézy došlo k separaci jednotlivých produktů a pomocí dostupného programu byly zjištěny velikosti všech získaných alel. Na základě velikostí jednotlivých alel vzorků, mohla být provedena identifikace neznámých genotypů. Celkem 57 % analyzovaných vzorků bylo s pomocí zahraničních výsledků identifikováno jako odrůdy Noah a Isabella. 29 % vzorků se nepodařilo identifikovat, z důvodu neexistence jejich profilu v databázích. Lze proto předpokládat, že se jedná o mezidruhové křížence. Výsledky SSR analýzy byly využity pro vytvoření dendrogramu, jakožto nástroje grafického znázornění genetické příbuznosti v rámci všech analyzovaných vzorků. Dosažené výsledky prokázaly, že Chorváty se na našem území stále vyskytují a že mají svoje stálé místo ve vinohradech na jižní Moravě. Ačkoliv se vyskytují pouze lokálně, nacházejí se v povědomí lidí a podílí se tak na zvyšování odrůdové rozmanitosti nejen našich vinic, ale i rozmanitosti české vinařské a vinohradnické kultury. Tato práce částečně zmapovala a vytvořila prostor pro bližší výzkum mezidruhových kříženců na území České Republiky pomocí moderních metod, využívajících DNA. Metoda SSR je rychlým, přesným a spolehlivým pomocníkem, který umožňuje pohyb v dosud neprobádaných oblastech vinohradnictví a je univerzálním nástrojem k potvrzení pravosti odrůd, bez kterého se dnes moderní vinohradnictví a vinařství neobejde. Metoda SSR se spolu s dostupnou metodikou potvrdila, jako vhodná pro identifikaci neznámých vzorků révy vinné. 49

8. SOUHRN A RESUMÉ Název práce (česky): Využití SSR metody při studiu neregistrovaných genotypů rodu Vitis Text souhrnu (česky): Diplomová práce byla zaměřena na použití metody SSR, za účelem genetické analýzy Chorvátů, interspecifických odrůd lokálně se vyskytujících především na jižní Moravě. Cílem práce bylo analyzovat 21 vzorků neznámých genotypů rodu Vitis a získat tak genetický profil všech vzorků, na jehož základě byla provedena samotná identifikace vzorků. Ze získaných výsledků byl vytvořen dendrogram, který slouží k zjištění vzájemné genetické podobnosti jednotlivých vzorků v rámci celého analyzovaného souboru. Součástí práce je i literární přehled týkající se příslušné problematiky. Klíčová slova (česky): SSR, identifikace odrůd, Chorvát, mezidruhový kříženec Název práce (anglicky): The use of SSR method for the study of unregistered genotypes of genus Vitis Text souhrnu (anglicky): The thesis is focused on the use of SSR method for genetic analyses of chorvat, an interspecific cultivar, locally occuring in the area of south Moravia. The aim of this study was to analyze 21 samples of unknown genotypes of genus Vitis to recieve genetic profiles of each sample. Based on these results, an identification of all samples and dendrogram was made. The dendrogram shows genetic similarity among all analyzed samples. Part of the thesis is also a literary summary according to proper topic. Klíčová slova (anglicky): SSR, cultivar identification, chorvat, interspecific hybrid 50

9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ARADHYA, M., DANGL, G., PRINS, B., BOURSIQUOT, J., WALKER, A., MEREDITH, C., SIMON, C. Genetic structure and differentiation in cultivated grape Vitis vinifera L. Genetics Research [online]. 2003, United Kingdom: Cambridge University Press, č. 81, 179 192 s. [cit. 2012-11-05]. ISSN 1469-5073. Dostupné z: http://naldc.nal.usda.gov/download/8870/pdf BARÁNEK, M., BARÁNKOVÁ, K., PIDRA, M. Biotechnologie v zahradnictví: návody pro praktická laboratorní cvičení. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2006, 41 s. ISBN 80-7157-937-8. BEDNÁŘ, J., VYHNÁLEK, T., JEDLIČKOVÁ, D. Cvičení z genetiky rostlin. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 1999, 122-132 s. ISBN 80-7157-388-4. BLAHA, J. Réva vinná. 1. vyd. Praha: Nakladatelství Československé akademie věd. Ovocnická edice. 1961. 37-38 s. BOURQUIN, J. C., TOURNIER, P., OTTEN, L., WALTER. B. Identification of sixteen grapevine rootstocks by RFLP and RFLP analysis of nuclear DNA extracted from the wood. Vitis [online]. 1992, č. 31, 157-162 s. [cit. 2012-10-02]. ISSN 0042-7500. Dostupné z: http://www.vitis-vea.de/admin/volltext/e030919.pdf BOWERS, J. E., DANGL, G. S., MEREDITH, C. P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape. American Journal of Enology and Viticulture [online]. 1999, č. 50, 243-246 s. [cit. 2012-11-12]. ISSN 0002-9254. Dostupné z: http://ajevonline.org/content/50/3/243.short BROCK, T., FREEZE, H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile. Journal of Bacteriology [online]. 1969, č. 98, 289 s. [cit. 2012-11-05]. ISSN 1098-5530. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc249935/pdf/jbacter00390-0321.pdf 51

DOHNAL, T., KRAUS, V., PÁTEK J. Moderní vinař, Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1975, 5-8 s. ISBN. DOROVSKÝ, I. Charváti ještě žijí mezi námi: sborník studií a vzpomínek. Společnost přítel jižních Slovanů. 1996, Brno: Press Brno, 45-65 s. HAMPL V., PAVLÍČEK A., FLEGR J. Construction and bootstrap analysis of DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology [online]. 2001, č. 51, [cit. 2013-03-23]. ISSN 1466-5026. Dostupné z: http://ijs.sgmjournals.org/content/51/3/731.full.pdf HAUFT, J. Brevíř o českém víně. Praha: Středočeské nakladatelství a knihkupectví, 1973, 9-12 s. 42-013-73. HAUFT, J. Nový brevíř o víně. Praha: nakladatelství Svépomoc, 1988, 24-25 s. 38-007-87. CHAMBERS, G. K., MACAVOY E. S. Microsatellites: consensus and controversy. Comparative biochemistry and physiology. Part B. Biochemistry & Molecular Biology [online]. 2000, č. 126 (4), 455-476 s. [cit. 2012-09-15]. ISSN 1608-3202. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0305049100002339 JACKSON, R. Wine science,principles and applications. 3. Vyd. USA: Elsevier, 2008, 30 s. ISBN 978-0-12-373646-8. KRAUS, V., HUBÁČEK, V., ACKERMANN, P. Rukověť vinaře. Praha: ČZS - nakladatelství KVĚT a nakladatelství Brázda s. r. o., 2000, 3-8 s. ISBN 80-85362-34-1 (nakladatelství KVĚT), ISBN 80-209-0286-4 (nakladatelství Brázda). KRAUS, V. Odrůdové bohatství našich vinic. Potravinářský zpravodaj, List potravinářské komory České Republiky. 2004, Agral s. r. o., 12. říjen 2004, V. ročník (10), 34 s. ISSN 1801-9110. 52

KRAUS, V., FOFFOVÁ, Z., VURM, B., KRAUSOVÁ, D. Nová encyklopedie českého a moravského vína, 1. díl. Praha: Praga Mystica, 2005, 187-194 s. ISBN 80-86767-00-0. KRAUS, V., FOFFOVÁ, Z., VURM, B. Encyklopedie českého a moravského vína, 2. díl. Praha: Praga Mystica, 2008, 20-21 s. ISBN 978-80-86767-09-3. KRAUS, V. Vinitorium Historicum. Vydání první. Praha: nakladatelství Radix, 2009, 187 s. ISBN 978-80-86031-87-3. KUTINA J. et al. Pomologický atlas. 1. vyd, Praha: Zemědělské nakladatelství BRÁZDA, 1991, 200-201 s. ISBN 80-209-0089-6. LAWYER, F. C., STOFFEL, S., SAIKI, R. K., CHANG, S. Y., LANDRE, P. A., ABRAMSON, R. D., GELFLAND, D. H. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods and Applications [online]. 1993, č. 2 (4). 275-287 s. [cit. 2013-01-16]. ISSN 1054-9803. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8324500 McPHERSON, M., MOLLER, S. PCR. 2. vyd. UK: Taylor and Francis group, 2006, 1-20 s. ISBN 0-4153-5547-8. MOIO, L., ETIÉVANT, P. Ethyl anthanilate, ethyl cinnamate, 2,3-dihydrocinnamate and methylanthranilate 4 important odorants identified in Pinot Noir wines of Burgundy. American Journal of Enology and Viticulture [online]. 1995, č. 46 (3), 392-398 s. [cit. 2013-01-23]. ISSN 0002-9254. Dostupné z: http://www.ajevonline.org/content/46/3/392.short MORAVCOVÁ, K. Vytvoření metodiky identifikace odrůd révy vinné pomocí molekulárně genetických metod. Lednice, 2005. 165 s. Disertační práce. Mendelova univerzita v Brně. Fakulta zahradnická. Vedoucí práce: Miroslav Pidra. 53

MULLINS, M., BOUQUET A., WILLIAMS, L. Biology of the grapevine. United Kingdom: Cambridge University Press, 1992, 19-25 s. ISBN 0-521-30507-1. MULLIS, K., FALLONA, F., SCHARF, S., SAIKI, R., HORN, G., ERLICH, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology [online]. 1986, č. 51, 263-265 s. [cit. 2013-01-24]. ISSN 1943-4456. Dostupné z: http://symposium.cshlp.org/content/51/263.extract MULLIS, K., FALLONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods in Enzymology [online]. 1987, č. 155, 335 s. [cit. 2013-01-24]. ISSN 0076-6879. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687987550236 OLIVIERA, E. J., PADUA, J. G., ZUCCHI, M. I., VENCOVSKY, R., VIEIRA, M. L. C. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology [online]. 2006, č. 29 (2), 294-307 s. [cit. 2012-11-08]. ISSN 1415-4757. Dostupné z: http://www.scielo.br/pdf/gmb/v29n2/a18v29n2.pdf PAGE, R. D. M. Tree drawing software for Apple Macintosh and Microsoft Windows; Division of Environmental and Evolutionary Biology Institute of Biomedical and Life Sciences [online]. 1996, [cit. 2013-03-23]. Dostupné z: http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html PAVLOUŠEK, P. Encyklopedie Révy vinné, Vydání druhé. Praha: Computer Press, 2008, 13-18 s. ISBN 978-80-251-2263-1. PAVLOUŠEK, P. Pěstování révy vinné. Praha: Grada Publishing, a. s., 2011, 23-24 s. ISBN 978-80-247-3314-2. PAVLOUŠEK, P. PIWI odrůdy českého původu vhodné pro ekologické vinohradnictví. Vinařský obzor. 2012 (11), 557-559 s. ISSN 1212-7884. 54

PINNEY, T. A History of wine in America. University of California Press [online]. 1989, 443-448 s, [cit. 2013-01-15]. ISBN 0-520-06224-8. Dostupné z: http://books.google.cz/books?id=fmcwfk5g_ykc&hl=cs&source=gbs_navlinks_s POWELL, W., MORGANTE, M., ANDRE, CH., HANAFEY, M., VOGEL, J., TINGEY, S., RAFALSKI, A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding [online]. 1996, č. 2 (3), 225-238 s [cit. 2012-10-15]. ISSN 1572-9788. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007/bf00564200#page-1 PRINCE, W. M. The American Farmer. Volume IX. Baltimore: printed by John D. Toy, Editor: John S. Skinner [online]. March 23, 1827, 294 s. [cit. 2013-01-15]. Dostupné z: http://books.google.cz/books?id=yimeqryf3ymc&dq=isabella+gibbs&hl=cs&sourc e=gbs_navlinks_s RAPP, A., KNIPSER, W., ENGEL, L., ULLEMEYER, H., HEIMANN, W. Offflavour compunds in the berry and wine aroma of grapevine hybrids. Vitis [online]. 1980, č. 19, 13 s. [cit. 2012-12-11]. ISSN 0042-7500. Dostupné z: http://www.vitis-vea.de/admin/volltext/e017504.pdf RAPP, A. Volatile flavour of wine: Correlation between instrumental analysis and sensory perception. [online]. 1998, č. 42 (6), 351-363 s. [cit. 2012-10-01]. ISSN 1613-4133. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(sici)15213803(199812)42:06%3c351::ai D-FOOD351%3E3.0.CO;2-2/abstract RIBÉREAU-GAYON, P., GLORIES, Y., MAUJEAN, A., DUBOURDIEU, D. Handbook of Enology. Volume 2. Chichester: John Wiley and Sons, 2006, 222-223 s. ISBN 0-470-01037-1. ROMBOUGH L. The Grape Grower: A Guide to Organic Viticulture. 1. Vyd. Canada: Chelsea Green Publishing Company, 2002, 240-243 s. ISBN 1-931498-30-X. 55

SAMBROOK, J., FRITSCH, E. F, MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2. vyd. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. ISBN 0-87969-309-6 SEFC K. M., LEFORT, F., GRANDO, M. S., SCOTT, K., STEINKELLNER, H., THOMAS M. Microsatellite markers for grapevine: A state of the art. In: Roubelakis- Angelakis K. A. Molecular Biology & Biotechnology of the Grapevine [online]. 2001, Springer Science+Business Media, 565-567 s. [cit. 2012-12-22]. ISBN 978-90-481-2305-6. Dostupné z: http://gvd.biology.uoc.gr/gvd/pdf/chapter%2017.pdf SEFC, K. M., PEJIĆ, I., MALETIĆ, E., THOMAS, M., LEFORT, F. Microsatellite Markers for Grapevine: Tools for Cultivar Identification & Pedigree Reconstruction, In: Roubelakis-Angelakis K. A. Grapevine Molecular Physiology & Biotechnology [online]. 2. vyd. Amsterdam: Kluwer Publishers, 2009 [cit. 2013-01-21], 565-596 s. ISBN 978-90-481-2305-6. Dostupné z: http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-90-481-2305-6_21#page-1 SOTOLÁŘ, R. Multimediální atlas podnožových, moštových a stolních odrůd révy. CD-ROM. 2006 SOTOLÁŘ, R. Labrusky trochu jinak. Vinař sadař. Vydavatelství Baštan, 2011a, č. 2 (2), 13-15 s. ISSN 1804-3054. SOTOLÁŘ, R. Labruskové odrůdy stolního typu - 1. část. Vinař sadař. Vydavatelství Baštan, 2011b, č. 2 (2), 16-17 s. ISSN 1804-3054. STEIDL, R. Sklepní hospodářství, Valtice: Národní salón vín, 2002, 232 s. ISBN 80-903201-0-4. STOEWSAND, G., ROBINSON, W. Review of grape and wine toxicity research. Food Science and Technology [online]. 1971, č. 6, January 1971 [cit. 2012-11-11]. ISSN 0975-8402. Dostupné z: http://fls.cals.cornell.edu/ocrpdf/fls-006.pdf 56

THIS, P., CUISSET, C., BOURSIQUOT, J. M. Development of Stable RAPD Markers for the Identification of Grapevine Rootstocks and the Analysis of Genetic Relationships. American Journal of Enology and Viticulture [online]. 1997, č. 48 (4), 492-501 s. [cit. 2012-11-18]. ISSN 0002-9254. Dostupné z: http://ajevonline.org/content/48/4/492.short THIS, P., JUNG, A., BOCCACCI P., BORREGO, J., BOTTA, R. Development of standard set of microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars. Theoretical and Applied Genetics [online]. 30 September 2004. 1448-1458 s. [cit. 2013-03-10]. Dostupné z: http://www1.montpellier.inra.fr/grapegen06/technical/menu_activities_room_index/pag e_wpi/this-common-ssr.pdf THOMAS, M. R., SCOTT, N. S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites. Theoretical and Applied Genetics [online]. 1993, č. 86, 985-990 s. [cit. 2013-01-17]. ISSN 1432-2242. Dostupné z: http://link.springer.com/content/pdf/10.1007/bf00211051#page-1 VEJL, P., SKUPINOVÁ, S., SEDLÁK, P., BARDOVÁ, M. 2002. Analýza rostlinného genomu. 1. vyd. Praha: Powerprint. Česká zemědělská univerzita v Praze. 38 s. ISBN 80-213-0903-2. VOS, P., HOGERS, R., BLEEKER, M., REIJANS, M., VAN DE LEE, T., HORNES, M., FRIJTERS, A., POT, J., PELEMAN, J., KUIPER. M., ZABEAU M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research [online]. 1995, č. 23(21), 4407-4414 s. [cit. 2012-10-24]. ISSN 1362-4962. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc307397/pdf/nar00021-0189.pdf 57

Ostatní zdroje: Final report EU, Study on the Use of the Varieties of Interspecific Vines, Contract No AGR 30881 of 30/12/2002. Project co-ordinator: PHYTOWELT, Germany [online]. Date of issue of this report 16 th July 2003 [cit. 2013-04-01] Dostupné z: http://ec.europa.eu/agriculture/markets/wine/studies/vine_en.pdf FISCHER, K. H. The development of interspecific grapevine hybrids in Ontario. Canada. Proceedings 6th International Congress on Organic viticulture [online]. 2000, 25-26 August, 205 s. [cit. 2013-02-22]. Dostupné z: http://orgprints.org/548/1/willer-meier-2000-winecongress.pdf PIDRA, M. 2004. Zlepšování biologického potenciálu rostlin a zvířat a jeho efektivní využívání: Metodika SSR Analýzy [online]. Číslo projektu: QC1156, Program I [cit. 2013-01-18] Dostupné: http://www.mendelu.cz/dok_server/slozka.pl?id=18475;download_pdf=7038 Úřední věstník Evropské unie, NAŘÍZENÍ RADY (ES) č. 1493/1999 ze dne 17. května 1999 [online]. O společné organizaci trhu s vínem. 39-40 s. [cit. 2013-02-09] Dostupné z: eur-lex.europa.eu/lexuriserv/lexuriserv.do?uri=dd:03:26:31999r1493:cs:pdf 58

10. SEZNAM PŘÍLOH Seznam obrázků Obrázek 1. Aromatické látky identifikované u Vitis labrusca a Vitis rotundifolia Obrázek 11. Kontrola čistoty a koncentrace DNA Obrázek 12. Fotografie gelu lokusu VVS 2 na agarózovém gelu Obrázek 13. Fotografie gelu po SSR reakci lokusu VrZAG 62 při teplotě 51 C Obrázek 14. Fotografie gelu po SSR rekaci lokusu VrZAG 62 při telpotě 53 C Obrázek 15. Fotografie gelu po SSR lokusu VrZAG 79 při teplotě 47 C Obrázek 16. Fotografie gelu po SSR reakci lokusu VrZAG 79 při teplotě 49 C Obrázek 17. Analýza na kapilární elektroforéze vzorku č. 2 ( Noah ) Obrázek 18. Analýza na kapilární elektroforéze vzorku č. 12 ( Isabella ) Obrázek 19. Dendrogram genetické podobnosti vzorků na základě SSR analýzy Obrázek 11. Fotka listů neznámého genotypu ze Zaječí, Kostic a Lednice 59

Seznam tabulek Tabulka 1. Klasifikace čeledi Vitaceae Tabulka 2. Rozdíly mezi podrody Muscadinia a Euvitis u rodu Vitis Tabulka 3. Seznam odběru vzorků lokalit Tabulka 4. MasterMix pro reakci PCR Tabulka 5. Použitý teplotní program termocykleru pro jednotlivé mikrosatelitní lokusy Tabulka 6. SSR lokusy a patřičné primery užívané pro identifikaci odrůd révy vinné Tabulka 7. Systém fluorescenčních barviv pro analýzu na kapilární elektroforéze Tabulka 8. Fluorometrické stanovení koncentrace DNA a výpočet ředění alikvot Tabulka 9. Tabulka přepočtu velikostí alel odrůd Noah a Isabella z INRA Tabulka 10. Přepočet alel neznámých genotypů rodu Vitis Tabulka 11. Tabulka použitá pro přepočet podle referenčních odrůd Tabulka 12a,b. Binární matice Ostatní přílohy Graf 2. Graf procentuálního zastoupení výsledků analyzovaných vzorků Příloha 1a,b. Článek z časopisu Food Sciences and Technology (1971) 60

11. PŘÍLOHY Příloha 1a. Článek z časopisu Food Sciences and Technology potvrzující zdravotní nezávadnost mezidruhových kříženců

Příloha 1b. Článek z časopisu Food Sciences and Technology potvrzující zdravotní nezávadnost mezidruhových kříženců