Naše NMR spektrometry Varian NMR System 300 MHz Varian INOVA 400 MHz Bruker Avance III 600 MHz
NMR spektrometr magnet průřez supravodičem
NMR spektrometr sonda
Tvar spektra reálná část imaginární část Lorentzova křivka disperzní signál absorpční signál Fázová korekce matematická operace pro separaci absorpčního signálu 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 Chemical Shift (ppm)
Tvar spektra reálná část imaginární část Lorentzova křivka disperzní signál absorpční signál Fázová korekce matematická operace pro separaci absorpčního signálu sfázované spektrum 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 Chemical Shift (ppm)
Koherentní středování Signál/šum 1 8 80 800
Stabilita a homogenita magnetického pole Field-frequency lock Shim stabilita v čase homogenita přes vzorek sledování nezávislého jádra - deuterium
NMR vzorek Rozpouštědlo - deuterované 1 H 13 C CDCl 3 7,27 77,0 DMSO-d 6 2,50 39,5 D 2 O ~4,8 90% H 2 O + 10% D 2 O ~4,8 MeOD 3,31 49,0 C 6 D 6 7,16 128,0 Množství látky 1-5 mg 20-50 mg Standardy chemického posunu interní TMS, DSS, dioxan, (CH 3 ) 3 COH externí v kapiláře
Heteronukleární J interakce Nepřímá spin-spinová interakce scalar coupling interakce zprostředkovaná vazebnými elektrony jádro cítí spinový stav okolních NMR aktivních jader 13 C H 13 C H 2 13 C H 3 m = -1/2 m = +1/2 dublet triplet kvartet 1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1
J interakce 13 C 1 H ( 2 H) 13 C spektrum 13 C spektrum CCl 4 rozpouštědlo deuterium má spin 1 CHCl 3 CDCl 3 CH 2 Cl 2 CD 2 Cl 2 CH 3 Cl CD 3 OD
Dekapling a 13 C spektrum excitace 90 y detekce 13 C: t D1 1 H: CW nebo WALTZ16 saturace vyrovnání obsazenosti hladin nukleární Overhauserův efekt NOE navýšení (až o 199%) rychlé přeskoky efektivně spin 0 zrušení J interakce závisí na relaxaci - lokální pohyblivosti
H 3 C Dekapling a 13 C spektrum O O 67.99 69.59 61.25 20.81 22.41 173.07 CH 3 OH 59.65 24.01 19.21 150 100 50 21.61 68.79 61.25 173.07 150 100 50
APT attached proton test Využití J vazby 90 y 180 x 13 C: t D1 τ τ 1 H: J-vazba aktivní Modulace amplitudy +1 1 0.8 0.6 +0.5 0.4 C CH 2 0.2 0-0.2-0.4-0.5-0.6-0.8-1 0-1 1/2J 1/J CH 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 CH 3.5 3
APT experiment 61.25 C, CH 2 173.07 H 3 C O O 68.79 CH, CH 3 CH 3 OH 21.61 150 100 50
DEPT experiment DEPT distorsionless enhancement by polarization transfer 90 180 Θ 1 H: t D1 1/2J dec. 90 180 přenos polarizace 13 C: 1/2J 1/2J navýšení signálu uhlíků 2 1.5 1 Intenzita signálů uhlíků ve spektru 0.5 0-0.5-1 CH CH 2 CH 3 editace multiplicity dle posledního pulsu -1.5-2 0 90 180 270 360
DEPT experiment CH a CH 3 kladné CH 2 záporné DEPT nezobrazuje kvartérní uhlíky pouze CH všechny protonované uhlíky
DEPT experiment DEPT spektra lze rozdělit podle multiplicity
57 C 5 H 9 BrO 2
1D příprava Princip 2D experimetů detekce FT 2D příprava vývoj směšování detekce I S I 2D FT contour plot
Základní 2D experimenty Homonukleární COSY, NOESY Heteronukleární HSQC, HMQC, HMBC Informace o spojení chemickými vazbami COSY, HSQC, HMQC, HMBC J interakce Informace o blízkosti v prostoru NOESY přímá dipól-dipólová interakce
Experiment COSY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes obvykle 3 chem. vazby vicinální (geminální, další) symetrické kolem diagonály krospík diagonální pík krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy
Experiment COSY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes obvykle 3 chem. vazby 6 5 vicinální (geminální, další) 5 2 6 4 2 5 3 1 6 1 5 6 krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy
Experimenty HSQC a HMQC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes jednu chem. vazbu 6 4 2 6 1 2 5 3 4 5 3 1 spojení vodík - uhlík 1 1
Experimenty HSQC a HMQC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes jednu chem. vazbu 6 4 2 6 1 2 5 3 4 5 3 1 4 3 5 2 1 přenesení přiřazení z 1 H na 13 C 6
Experiment HMBC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes 2 a více chem. vazeb H C C C H H C O C H H O 7 C C C H 6 5 4 vodík vidí sousední uhlíky, 1 3 vidí skrz hetero-atomy 2 8 9 10 přiřazení kvarterních 13 C ověření propojení
Experiment HMBC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes 2 a více chem. vazeb 7 6 1 5 2 8 9 10 4 3 menthol 7 6 1 5 2 8 4 3 9 10
Experiment NOESY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes prostor krospík - - dané vodíky jsou si blízké v prostoru (do cca 5 Angströmů) 13 vidí 12 a 14, nevidí 8 určení prostorového uspořádání
NOESY Nukleární Overhauserův efekt Selektivní NOE CHES β-cd dynamika intenzity krospíku velké molekuly malé molekuly základ řešení prostorové struktury
Chemická výměna jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky k 1 k -1 chemický posun J vazba relaxační čas translační difuze + k 1 k -1 K eq K assoc Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna tautomerizace konformační rovnováha pohyb postranních řetězců proteinu sbalování proteinů struktura nukleových kyselin vazba ligandu protonace/deprotonace výměna labilních vodíků enzymaticky katalyzované reakce
Chemická výměna dimethylformamide k << ν pomalá k π ν = 2 koalescence k >> ν rychlá
Chemická výměna Cone inverted cone transformace kalixarenu analýza tvaru spektra inversion rate ~ 1 s -1 at 30 C G ~ 63 kj.mol -1
Chemická výměna - titrace Změna chem. posunu s ph rychlá výměna průměrný posun určení pk a Změna chem. posunu s koncentrací β-cd CHES určení disociační konstanty K d
Translační difuze DOSY rozdělení směsi podle velikosti molekul
Translační difuze komplexy host-hostitel β-cyklodextrin adamantankarboxylová kyselina Difuze v režimu rychlé výměny 1:1 komplex obs ( p) DF pdb D = 1 + Disociační konstanta ( 1 p)( [H] p[g ) [ H][G] = [HG] p 0 ] 0 K d = K d =0.7 mm
Dynamické procesy a NMR 1ps 1ns 1µs 1ms 1s 1000s librational dynamics fast rotational diffusion local movement slow ligand binging local folding chemical kinetics global auto- and cross-correlated spin relaxation relaxation dispersion spectral shape residual dipolar couplings translational diffusion signal/saturation transfer real time spectroscopy