HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) Ref. 4108 HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) Ref. 4128 2009/12
POUŽITÍ SADY Sady HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) a HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) jsou určeny pro separaci normálního hemoglobinu A, abnormálních hemoglobinů S a C a fetálního hemoglobinu elektroforézou na agarózových gelech. Používají se ve spojení s poloautomatickým systémem HYDRASYS. Výsledné elektroforetické záznamy jsou vyhodnocovány z hlediska abnormalit vizuálně. Elektroforéza na gelech HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) nebo HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) je základem k potvrzení identifikace hemoglobinových variant dříve detekovaných na zásaditých gelech HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) nebo HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), zejména k rozlišení hemoglobinu S od D a E od C. Každý agarózový gel je určen k analýze : 7 vzorků - sada HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), 15 vzorků - sada HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E). Pro diagnostické použití In Vitro. PRINCIP TESTU Hemoglobin je komplexní molekula složená ze dvou párů polypeptidových řetězců. Ke každému řetězci je připojen hem, tetrapyrolový kruh (porfyrin), který chelátuje s dvojmocným atomem železa. Hem je u všech hemoglobinů stejný. Typ hemoglobinu je určen proteinovou částí, zvanou globin. Polypeptidové řetězce alfa, beta, gama a delta tvoří normální lidské hemoglobiny : hemoglobin A... = α 2 ß 2 hemoglobin A 2... = α 2 δ 2 fetální hemoglobin F... = α 2 γ 2 Alfa řetězec je totožný u všech těchto tří hemoglobinů. Prostorová struktura hemoglobinu a ostatní vlastnosti jeho bílkovinné molekuly (stejně jako u ostatních bílkovin) závisí na prostorovém uspořádání a sekvenci aminokyselin, které tyto řetězce tvoří. Substituce aminokyselin jejich mutací je zodpovědná za tvoření variant hemoglobinu, které mají různý povrchový náboj a následně rozdílnou pohyblivost v elektroforetickém poli, jež rovněž závisí na ph a iontové síle pufru. V kyselém prostředí je mobilita rovněž ovlivněna elektrostatickou interakcí mezi pozitivně nabitými molekulami hemoglobinu a negativním nábojem agarózové mřížky. Výsledné kvalitativní (nebo strukturální) abnormality se nazývají hemoglobinopatie. Snížená syntéza jednoho z hemoglobinových řetězců vede ke kvantitativním (nebo regulačním) abnormalitám zvaným talasemie. Test je prováděn s hemolyzovanými propranými erytrocyty. Hemoglobiny jsou separovány elektroforeticky na kyselých gelech a frakce jsou vizualizovány obarvením amidočerní. Suché gely je možno ihned interpretovat. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADÁCH HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) A HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) POLOŽKA KAT. Č. 4108 KAT. Č. 4128 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 10 gelů Pufrované proužky (připraveno k použití) 10 balení po 2 kusech 10 balení po 2 kusech Ředicí roztok pro barvicí roztok (zásobní) 1 lahvička, 60 ml 1 lahvička, 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahvička, 20 ml 1 lahvička, 20 ml Hemolyzační roztok (připraven k použití) 1 lahvička, 20 ml 1 lahvička, 20 ml Aplikátory (připraveno k použití) 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech Filtrační papíry 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agaróza 1.5 g/dl ; kyselý pufr s ph 6.0 ± 0.1 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu hemoglobinu. Skladujte gely v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Během skladování zamezte prudkým změnám teploty (např. skladování v blízkosti oken nebo tepelného zdroje). Gely jsou stabilní do doby expirace vyznačené na obalu sady či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT Gel nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 96 - SEBIA NÁVOD - Czech
2. PUFROVANÉ PROUŽKY HYDRAGEL 7 & 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) - 2009/12 Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny pro použití. Každý obsahuje : kyselý pufr o ph 6.0 ± 0.2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované proužky fungují jako zásobník pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt gelu a elektrod. Pufrované proužky skladujte ve svislé poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě nebo v chladničce (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku balení pufrovaného proužku. NEMRAZIT Pokud je balení otevřeno a pufrovací proužky vyschlé, zneškodněte je. 3. ŘEDICÍ ROZTOK PRO BARVICÍ ROZTOK Zásobní ředicí roztok pro obarvovací roztok musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok. Pro přípravu barvicího roztoku amidočerni. Zásobní ředicí roztok pro barvicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvicího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správné rekonstituce barvicího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku velmi důkladně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. V případě potřeby opakujte tento krok dvakrát až třikrát. 6. Nalijte zbylý ředící roztok do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvicí roztok je připraven k použití. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň, 0.4 g/dl ; ethylenglykol, 6.7 % a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZOR : Při požití škodlivé. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. 5. HEMOLYZAČNÍ ROZTOK Hemolyzační roztok je připraven k použití. Jedná se o pufr s přídavnými látkami nezbytně nutnými pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Hemolýza červených krvinek. Hemolyzační Roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky hemolyzačního roztoku. Hemolyzační Roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. 6. APLIKÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků. Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. - 97 -
7. FILTRAČNÍ PAPÍRY HYDRAGEL 7 & 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) - 2009/12 Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne pracovní odbarvovací roztok obsahující 0.05 g/dl kyseliny citrónové. Roztok je určen pro odstranění přebytečného barviva a odbarvení pozadí gelů. K opláchnutí barvicího oddílu po provedení mycí procedury. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % roztoku NaOH. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiálního růstu ve zředěném odbarvovacím roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl roztoku ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 2. HYDRASYS - PROMÝVACÍ ROZTOK Každá lahvička Promývacího Roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Po zředění obsahuje pracovní promývací roztok zásaditý alkalin pufr o ph 8.8 ± 0.3 a azid sodný. POZOR : Zásobní promývací roztok obsahuje 0.625 % azidu sodného. Nepožívejte! Při požití ihned vyhledejte pomoc lékaře! Azid sodný může reagovat s kyselinami, olovem nebo s mědí za vzniku toxických a výbušných sloučenin. Před znehodnocením vždy propláchněte velkým množstvím vody. Slouží pro čištění barvicího prostoru systému HYDRASYS. Používejte jej pravidelně - například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. 3. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte roztok NaCl, 0.15 M (0.9 g/dl), v destilované nebo deionizované vodě. K proprání erytrocytů a k naředění hemolyzátu. Fyziologický roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zneškodněte po třech měsících nebo pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro delší skladování přidejte azid sodný, 0.1 g/dl. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č. 1201, kat. č. 1202, kat. č. 1203, kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor například HYDRAPLUS SEBIA, kat. č. 1216 nebo HYDRAPLUS 2 SEBIA, kat. č. 1217 pro alternativní plnění vzorkových aplikátorů. 3. Vlhká Zásobní Komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 4. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS. 5. Pipety : 10 µl a 200 µl. 6. Držák gelu pro poloviční gely SEBIA, kat. č. 1278. - 98 -
VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky nesráživé krve. Lze použít běžné antikoagulanty s obsahem EDTA, citrátu nebo heparinu - nepoužívejte přípravky s obsahem jodoacetátu. Odběr krve musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. V případě potřeby skladovat vzorky při teplotě 2 až 8 C po dobu až 5 dní. vzorků Před odebráním krve pro přípravu promíchejte zkumavku. Centrifugujte krev s antikoagulačním činidlem 5 minut při 5 000 ot. Odstraňte plazmu. Propláchněte 2 krát červené krvinky 10 násobkem fyziologického roztoku ; při zpracování červených krvinek o objemu menším než 10 µl je zapotřebí dbát zvýšené opatrnosti. Odlijte nadměrné množství fyziologického roztoku z povrchu červených krevních destiček a promíchejte (ve vortexu) před odebráním 10 µl k hemolýze. Hemolyzujte 10 µl oddělených červených krvinek pomocí 130 µl hemolyzačního roztoku. Promíchejte (na vortexu) nejméně po dobu 10 sekund a inkubujte 5 minut při pokojové teplotě. Zřeďte 2x hemolyzát destilovanou nebo deionizovanou vodou (např. 50 µl hemolyzátu + 50 µl destilované nebo deionizované vody). POZNÁMKY : - U přípravy hemolyzátu z krve pacientů s mírnou anémií (přibližně 10 g/dl Hb) nebo s těžkou anémií (< 7 g/dl Hb) je třeba objem erytrocytů zvýšit z 15 µl na 20 µl. Zbarvení jednotlivých zón bude v tomto důsledku zvýšeno, nikoliv však relativní koncentrace jednotlivých frakcí. - Hemolyzát se nemusí filtrovat ani centrifugovat. - Hemolyzační roztok SEBIA nemá vliv na nestabilní hemoglobin Bart. - Hemolyzát připravený pro elektroforézu na gelu HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) lze znovu použít pro elektroforézu na gelu HYDRAGEL 7/ 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), přičemž musí být použit do jednoho dne a dvakrát zředěn destilovanou nebo deionizovanou vodou. POSTUP Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, elektroforetická migrace, vysušení, barvení, odbarvení a závěrečné vysušení. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte přístroj HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře (viz Obr. 1). - Naneste 10 µl hemolyzovaného vzorku do každé jamky. Aplikátor naplňte do 2 minut. - Vložte aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček). - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut od nanesení posledního vzorku. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POZOR : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy! 4. V menu přístroje (na levé straně klávesnice) vyberte migrační program "7 ACID(E) Hb" pro HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) nebo "15 ACID(E) Hb" pro HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E). 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované proužky uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastikové vyztužení proužků směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte desku HYDRAGEL. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody pro HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) nebo 200 µl pro HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) do dolní třetiny rámu vyraženého na termoregulační destičce migračního modulu. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). - Gel ohněte a zavěšte dolů na hladinu vody (Obr. 3). Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 7. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 8. Vyjměte aplikátor z vlhké komory. Uchopte jej při tom za ochranný rámeček. - Odlomte ochranný rámeček chránicí zuby aplikátoru. - Umístěte aplikátor do polohy č. 9 na rámečku. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte proces stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace se provádí při konstantních 5 W pro HYDRAGEL 7 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) nebo konstantních 10 W pro HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), při 30 C řízených Peltieriho článkem až do akumulovaných 26 Vh (přibližně 12.5 minuty). - 99 -
Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Teplota kontrolní desky stoupne na 10 minut na teplotu 65 C, čímž dojde k vysušení gelu a fixaci bílkovin. Deska se poté začne chladit. Po ochlazení na 50 C zazní pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Teplota plotny zůstává až do otevření víka na 50 C. Teplota dále klesá, přičemž po dosažení 30 C (za méně než 5 minut) je možné začít další dělení. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zavřené. II. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátor. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. 4. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 5. Po každém použití otřete elektrody i termoregulační plochu vlhkým tamponem. 6. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a vysušený gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 5). 7. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na barvicí roztok obsahuje nejméně 300 ml barvicího roztoku ; - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 L odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. Při připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody. 8. Z menu přístroje vyberte barvicí program "ACID(E) Hb" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). III. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete jej a vyjměte vysušený gel. 2. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. Je vhodné výsledek odečítat bez jakéhokoliv prodlení. Pro pozdější porovnání max. 3 měsíce - lze skladovat v ochranném obalu na suchém, tmavém místě, v bezpečné vzdálenosti od zdrojů tepla. KONTROLA KVALITY Na každou sérii vzorků se doporučuje zařadit kontrolní vzorek krve, obsahující hemoglobiny A, F, S a C (například Hb AFSC Control, SEBIA, kat. č. 4792). VÝSLEDKY Interpretace Většina hemoglobinopatií vzniká v důsledku mutační substituce jedné aminokyseliny v jednom ze čtyř typů polypetidových řetězců. Klinický význam takových změn závisí na ovlivněném typu a pořadí aminokyselin. U klinicky významných onemocnění jsou postiženy řetězce nebo řetězce ß. U dospělých jedinců je známo více než 200 variant hemoglobinů. První studované a nejčastěji se vyskytující abnormální hemoglobiny mají změněný celkový elektrický náboj, což umožňuje snadnou detekci pomocí elektroforézy. Existují čtyři hlavní abnormální hemoglobiny, které si zasluhují zvláštního klinického zájmu S, C, E a D. Elektroforéza pomocí sad HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) slouží k identifikaci variant hemoglobinu dříve zjišťovaných na zásaditých gelech HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) SEBIA, kat. č. 4106 / 4126, zejména k rozlišení hemoglobinu S od D a E od C. Pořadí frakcí od anody ke katodě je následující : hemoglobin C migruje za bod nanesení ; hemoglobin S zůstává na začátku (v bodě nanesení) ; hemoglobiny D, E a A 0 jsou překryty ; hemoglobiny F a A 1 jsou překryty ; na anodické straně frakce A1/F může být pozorován slabý proužek, což způsobuje denaturace nebo degradace v průběhu skladování vzorků. Migrační typy Normální migrace hemoglobinů C Bod nanesení S Bod nanesení A A (A 0 + A 2 ) + D + E A 1 A 1 +F Migrace hlavních abnormálních hemoglobinů A 0 : Neglykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. A 1 : Glykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. Ve výše uvedených typech je katoda dole a anoda nahoře. - 100 -
Interference a Omezení Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Pokud je zjištěn abnormální hemoglobin, je nutné použít jiný způsob identifikace (např. elektroforéza globinových řetězců) nebo odeslat vzorky krve do specializované laboratoře. Odstraňování problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní listy pro reagenty a informace o zneškodňování odpadu jsou k dispozici prostřednictvím technické podpory dodavatele. ÚDAJE O VÝKONU Všechny výsledky jsou založeny na studiích mnoha laboratoří za použití HYDRAGELů a zařízení fy SEBIA a srovnatelných, komerčně dostupných agarózových gelových systémů. Pro porovnávací studie byla navíc analyzovány typy jednotlivých hemoglobinů a jejich hodnoty byly stanoveny HPLC nebo jinou validní metodou. Dále jsou uvedeny příklady výsledků reprezentativních vzorků z hlediska jednotlivých hodnot. Všechny elektroforegramy byly interpretovány vizuálně. Reprodukovatelnost na gelu Dva krevní vzorky byly elektroforézovány na gelech HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) z jedné šarže. Jeden vzorek obsahoval Hb S a jeden Hb S a Hb C. Každý vzorek byla analyzován na 15 stopách jednoho gelu. U každého vzorku vykázalo všech 15 stop u každého gelu naprosto shodné výsledky. Při žádném z opakovaných testů nebyla zjištěna žádná odchylka mobility nebo dodatečné neobvyklé pruhy. Reprodukovatelnost mezi gely Patnáct krevních vzorků bylo analyzováno pomocí gelů HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) z jedné šarže v období 9 dní (jeden gel denně, 15 vzorků na gel). 4. den byly zahrnuty další dvě šarže gelu. Analyzované vzorky zahrnovaly tři vzorky s abnormálním hemoglobinem (Hb S nebo Hb C), jeden vzorek se zvýšeným hemoglobinem Hb A2 a zbylé byly vzorky normální krve. Pro každý vzorek byly každý den a u všech analýz zjištěny přesně stejné výsledky. Při žádném z opakovaných testů nebyla zjištěna žádná odchylka mobility nebo dodatečné neobvyklé pruhy. Přesnost - Potvrzení hemoglobinových abnormalit Třicet různých krevních vzorků bylo analyzováno pomocí sad HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) a jiného komerčně dostupného agarózového gelového systému. Krevní vzorky a příslušné diagnózy byly poskytnuty nemocnicemi. Diagnóza byla založena na běžné elektroforéze na zásaditém a kyselém gelu nebo na HPLC. Všechny abnormální hemoglobiny detekované pomocí HYDRAGEL 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) byly srovnatelné s porovnávacím gelovým systémem, nemocničními výsledky a klinickou diagnózou. Nebyly pozorovány případy falešně pozitivní, jako např. detekce abnormální frakce nenalézající se ve vzorku. Nebyly pozorovány ani případy falešně negativní, například nezjištění abnormální frakce. - 101 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY (1) V.F. Fairbanks, ed. (1980) Hemoglobinopathies and thalassemia: Laboratory methods and case studies. Brian C. Decker, New York. (2) F. Galacteros (1986) Thalassémie, drépanocytose et autres hémoglobinopathies. Techniques et Biologie, 3, 174-178. (3) T.H.J. Huisman and J.H.P. Jonxis (1977) The hemoglobinopathies: techniques of identification. Marcel Dekker, New York. (4) J.S. Krauss, P.A. Drew, M.H. Jonah, M. Trinh, S. Shell, L. Black and C.R. Baisden (1986) Densitometry and microchromatography compared for determination of the hemoglobin C and A 2 proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, 860-863. (5) C. Livingstone (1986) The hemoglobinopathies. Edit. London. (6) M. Maier-Redelsberger, R. Girot (1989) Diagnostic biologique des maladies de l hémoglobine. Feuillets de biologie 170. (7) R.G. Schneider (1978) Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory. CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 9, 243-271. (8) L. Vovan, D. Lara-Russo, A. Orsini (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789. - 132 -
sebia sebia sebia sebia HYDRAGEL 7 & 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E) - 2009/12 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 sebia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Figure 5 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 1 2 3 4 5 6 7 HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 1 2 3 4 5 6 7-133 -