MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA BUNĚK K MALIGNÍCH MOZKOVÝCH TUMORŮ Zemanová Z. 1, Babická L. 1, Kramář F. 3, Ransdorfová Š. 2, Pavlištov tová L. 1, BřezinovB ezinová J. 2, Hrabal P. 4, Kozler P. 3, Michalová K. 1,2 1 Centrum nádorovn dorové cytogenetiky ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha 2 Ústav hematologie a krevní transfuze Praha 3 Neurochirurgická klinika, ÚVN a 1.LF UK Praha 4 Bioptická laboratoř, ÚVN a 1.LF UK, Praha
Nestabilita genomu nádorových n buněk mutace a genové či i chromosomové aberace jedna z nejdůle ležitějších událost lostí při i vzniku maligního procesu Hematologické malignity: stanoveny prognostické hodnoty specifických strukturních či i početn etních chromosomových změn. Solidní nádory: také existují specifické genové či i chromosomové aberace - o molekulárn rně genetické podstatě jejich vzniku dosud mnohem méněm poznatků Metodické obtíže e při p i zpracování nádorové tkáně Zavedení moderních molekulárn rně genetických a molekulárn rně cytogenetických technik rozší šíření spektra vyšet etřovaných maligních nádorů
Mozkové gliomy nejčast astější nádory CNS heterogenní skupina tumorů různé histologické subtypy (astrocytomy, oligodendrogliomy, ependymomy) liší se odezvou na léčbu l a prognózou
Astrocytomy: Mozkové gliomy difúzn zní astrocytom (WHO grade II) anaplastický astrocytom (WHO grade ) glioblastoma multiforme (WHO grade IV) primárn rní x sekundárn rní Oligodendrogliomy: oligodendrogliom (WHO grade II) anaplastický oligodendrogliom (WHO grade )
Mozkové gliomy klasická léčba je problematická nemůž ůže e být nikdy radikáln lní i u tumorů nižší ších stupňů dochází často k relapsu a progresi onemocnění tumory vyšší šších stupňů - 80% mortalita během b prvního roku od stanovení dg
rozlišen ení subtypů založen ené na jaderné a buněč ěčné morfologii je subjektivní jednotlivé subtypy nelze odlišit it pomocí specifických imunohistochemických markerů je nezbytné hledat nové diagnostické a prognostické ukazatele mortality nemocných metoda volby: Mozkové gliomy stratifikace léčby, l snížen ení morbidity a subklasifikace nemocných do diagnostických skupin podle nálezu specifických chromosomových aberací a následnn sledná individualizace léčbyl
Specifické chromosomové aberace u jednotlivých subtypů difúzn zních gliomů astrocytom oligodendrogliom typ difúzn zního gliomu nízkostupňovýový astrocytom anaplastický astrocytom glioblastoma multiforme - primárn rní glioblastoma multiforme - sekundárn rní nízkostupňovýový oligodendrogliom anaplastický oligodendrogliom WHO grade II IV IV II chromosomové aberace trisomie 7, aneuploidie delece genu p53,, delece genu p16,, delece genu RB1,, aneuploidie amplifikace genu EGFR,, delece genu p16, delece genu RB1,, delece genu p53 (vzácn cně), monosomie 10,, aneuploidie delece genu p53,, delece genu p16,, delece genu RB1, monosomie 10,, aneuploidie delece oblasti 19q13.3, aneuploidie delece 19q13.3 / delece 1p36,, aneuploidie (nález kombinované delece jej ukazatelem dobré prognózy)
Cíl l studie Provést detailní molekulárně cytogenetickou analýzu souboru nemocných s difúzními gliomy Zaměřit se zejména na detekci nejčastějších dosud popsaných chromosomových aberací, tj. na: delece tumor-supresorových genů p53, p16 a RB1 delece chromosomových oblastí 1p36 a 19q13.3 amplifikace genu EGFR / trisomie chromosomu 7 monosomie chromosomu 10 U všech nemocných porovnat výsledky molekulárně cytogenetické analýzy s morfologickými a klinickými nálezy.
METODY: Neurochirurgické operace vzorky nádorovn dorové tkáně Molekulárn rně cytogenetická morfologické klasifikaci nádorun analýza vždy v aža po Vzorky: resuspendace v médium hypotonie, fixace příprava prava mikroskopických preparátů I-FISH izolace DNA CGH archivace materiálu
DNA sondy pro I-FISHI chromosomová aberace DNA sonda značen ení výrobce delece p53 LSI p53 (17p13.1) / CEP 17 delece p16 LSI p16 (9p21) / CEP 9 delece RB1 LSI RB1 (13q14) / LSI 13qter delece 1p36 delece 19q13.3 LSI 1p36 / LSI 1q25 LSI 19q13/ LSI 19p13 SO / SG Abbott - Vysis amplifikace EGFR LSI EGFR / CEP 7 monosomie 10 CEP 10 / control CEP probe hodnotíme nejméně 200 interfázních jader; hodnota cut-off 2,5%; směrodatná odchylka 0.5%
VYŠET ETŘENÝ ENÝ SOUBOR NEMOCNÝCH Od února 2004 celkem vyšet etřenoeno 30 nemocných s maligními mi mozkovými tumory 12 žen, 18 mužů věk k 45 let (rozmezí 16-80 let) 21x astrocytom 8x low grade astrocyom 5x anaplastický astrocytom 8x glioblastoma multiforme 9x oligodendrogliom 2x low grade oligodendrogliom 7x anaplastický oligodendrogliom
VÝSLEDKY č. morfologie I-FISH subtyp grade chromosomová aberace závěr 1 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 2 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 3 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 4 gemistocytárn rní astrocytom II delece p16 / tetraploidie gemistocytárn rní astrocytom zhoršen ená prognóza 5 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 6 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 7 difúzn zní astrocytom II polyploidie low-grade astrocytom 8 difúzn zní astrocytom II delece RB1 anaplastický astrocytom zhoršen ená prognóza
delece p16
delece RB1 13
VÝSLEDKY č. morfologie I-FISH subtyp grade chromosomová aberace závěr 9 anaplastický astrocytom polyploidie anaplastický astrocytom lepší prognóza 10 anaplastický astrocytom del RB1, del p16, polyploidie anaplastický astrocytom 11 anaplastický astrocytom normáln lní nález špatně odebraný vzorek 12 anaplastický astrocytom bialelická delece p16, polyploidie anaplastický astrocytom 13 high grade astrocytom -IV IV del RB1, del p16, amplifikace EGFR primárn rní glioblastom 14 glioblastoma multiforme IV -10, del p16,, amplifikace EGFR primárn rní glioblastom 15 glioblastoma multiforme IV normáln lní nález špatně odebraný vzorek 16 glioblastoma multiforme IV amplifikace EGFR, polyploidie primárn rní glioblastom 17 glioblastoma multiforme IV -10, +7, del RB1, bialelická del p16 primárn rní glioblastom 18 glioblastoma multiforme IV -10, polyploidie sekundárn rní glioblastom 19 glioblastoma multiforme IV -10, polyploidie sekundárn rní glioblastom 20 glioblastoma multiforme IV -10, +7 glioblastom 21 glioblastoma multiforme IV -10, +7 glioblastom
glioblastom (G IV)
bialelická delece p16
amplifikace EGFR
monosomie 10 10
VÝSLEDKY č. morfologie I-FISH subtyp grade chromosomová aberace závěr 22 low grade oligodendrogliom II del(19)(p13) / del(1)(p36), polyploidie dobrá prognóza 23 low grade oligodendrogliom II- del(19)(p13) / del(1)(p36) dobrá prognóza 24 anaplastický oligodendrogliom del(19)(p13) / del(1)(p36) dobrá prognóza 25 anaplastický oligodendrogliom del(19)(p13) / del(1)(p36) dobrá prognóza 26 anaplastický oligodendrogliom del(19)(p13) / del(1)(p36) dobrá prognóza 27 anaplastický oligodendrogliom del(19)(p13) / del(1)(p36), polyploidie dobrá prognóza 28 anaplastický oligodendrogliom normáln lní nález špatně odebraný vzorek 29 anaplastický oligodendrogliom normáln lní nález špatná prognóza 30 anaplastický oligodendrogliom del(19)(p13) / del(1)(p36 (1)(p36) dobrá prognóza
delece 19q13 del 19q13 / del 1p36
anaplastický oligodendrogliom
ZÁVĚRY I-FISH poskytla informativní výsledek v 27 případech padech (90%) u 3 nemocných bylo vyšet etření neinformativní z důvodu špatného odběru vzorku I-FISH je vhodná diagnostická metoda pro detekci chromosomových aberací v buňkách mozkových nádorn dorů.
ZÁVĚRY Systematická molekulárn rně cytogenetická analýza upřes esňuje diagnostiku mozkových gliomů a zárovez roveň napomáhá určit prognózu pacienta. V budoucnu by tak mohla přispp ispět t k individualizaci léčby nemocných s mozkovými tumory podle stanoveného rizika, což by v konečném m důsledku d mělo vést v k prodloužen ení a zlepšen ení kvality života těchto pacientů.
SPOLUPRACOVNÍCI CI Centrum nádorovn dorové cytogenetiky ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Lucie Houškov ková,, Ivana Vlčkov ková,, Libuše Matuchová,, Kateřina Vítovská, Libuše Folberová,, Jitka NěmcovN mcová,, Hana Grmelová Cytogenetická laboratoř ÚHKT Jela Melicherčíkov ková,, Dana Konvalinková,, Lucie Voráčkov ková, Jana Limberská Neurochirurgická klinika 1.LF UK a ÚVN Patologickoanatomické oddělen lení ÚVN Práce byla podpořena granty IGA MZ ČR 1A/8237-3 a MZO 00064165.