MIKROBIOLOGICKÝ ÚSTAV Akademie věd České republiky Vídeňská 1083, 420 20 Praha 4 Krč Imunologie a gnotobiologie ZÁVĚREČNÝ PROTOKOL O TESTOVÁNÍ BIOAKTIVNÍCH VLASTNOSTÍ LÁTKY CYTOPROTECT Zadání: Na základě zadání smlouvy o vědecko-technické spolupráci uzavřené podle Obchodního zákoníku č. 513/1991 Sb. ze dne 27. 7. 2014 byla provedena testování bioaktivních vlastností účinné látky CYTOPROTECT dodané firmou FOLIO PHARM s.r.o.: 1. Test proliferace lymfocytů 2. Test cytotoxicity efektorových lymfocytů 3. Test multiplikace buněk tvořících protilátky IgM a IgG Testovaný vzorek: Vodný roztok rozpustné práškové formy účinné látky CytoProtect Testovací systém: Pro testování bioaktivních vlastností vzorků byly použity inbrední samice myší kmene Balb/c (chov MBÚ AV ČR, Praha) ve stáří 3 měsíců a hmotnosti 20g chované za standardních podmínek (teplota, osvit, unifikovaná dieta ad libitum), testované kontrolní skupiny byly po 6 myších Aplikace: Vzorky byly podávány formou pitného programu ad libitum po deset dní paralelně dvěma skupinám myší v koncentracích: 1. Skupina označena: kontrola (pitná voda) 2. Skupina označena: CytoProtect 1 (20 mg/kg/den) Metodika: izolace buněk: lymfoidní buňky sleziny byly separovány na denzitním gradientu (směsi Ficoll Pharmacia AB a Telebrix Léčiva a.s., Praha)* 24 hodin po posledním pitném (10.) dnu; separované lymfocyty byly převedeny do media RPMI 1640 (ÚMG AV ČR, Praha) upraveného přidáním 2mMol L-glutaminu (Sigma-Aldrich s.r.o., Praha), 5% fetálním telecím sérem, (Sigma-Aldrich s.r.o., Praha) a 50 mg/l gentamycinu (Sigma-Aldrich s.r.o., Praha); kultivace: kultivace lymfocytů probíhala v kontrolovaných podmínkách 37 C v termostatu s 5% CO 2 a 100% vlhkostí ; imunizace: myši byly imunizovány T-závislým antigenem a buňky tvořící protilátky třídy IgM a třídy IgG byly izolovány ze sleziny pátý den primární imunitní odpovědi *) příprava směsi Ficoll-Telebrix: 2,13 (Telebrix): 1 (neionizovaná TK voda) 1 (ředěný Telebrix: 2,4 (8% Ficoll; neionizovaná TK voda)
Koeficienty cytotoxické aktivity (Ø% C x ± stdev) po 3,5 hodinách vzorek Ø% C x stdev kontrola 2,4 0,72 CytoProtect 1 1,9 0,23 po 18 hodinách vzorek Ø% C x stdev kontrola 28,6 4.23 CytoProtect 1 27,6 5.86 Hodnocení vlivu účinné látky CytoProtect 1 na cytotoxickou aktivitu lymfocytů: CytoProtect 1 statisticky neprůkazně snižuje cytotoxickou aktivitu NK buněk Závěr: Vzorek CytoProtect 1 vykazuje: Mírnou tendenci specificky snižovat cytotoxickou aktivitu NK buněčné subpopulace; mezi jednotlivými poměry koncentrací efektorových ku cílovým buňkám (E : T) nebyly zjištěny významné rozdíly Multiplikace buněk tvořících protilátky třídy IgG a IgM: absolutní počty slezinných lymfoidních buněk tvořících protilátky třídy IgG a IgM v primární imunitní odpovědi byly zjišťovány modifikovanou plakovou metodou, kdy jsou buňky secernující protilátky identifikovány vazbou morčecího komplementu a tvorbou hemolytických zón (plaků); myši ovlivněné preventivní aplikací vzorků ve stejných dávkách a intervalech jako v předchozích testech byly imunizovány dávkou 0,5 ml 4% ovčích erytrocytů 5 dní před ukončením testování; myši neovlivněné aplikací vzorků (kontrolní skupina) byly imunizovány stejnou dávkou (0,5 ml 4%) ovčího erytrocytů 5 dní před ukončením testování; absolutní počty buněk jsou stanoveny odečtením počtu hemolytických zón; hodnoty jsou uvedeny jako průměr absolutních počtů buněk tvořících hemolytické protilátky stanovených u jednotlivých pokusných zvířat a přepočteny na 10 8 lymfoidních buněk
Výsledky testování Proliferační test: buněčná proliferace je kvantifikována měřením množství 3 H-thymidinu, který se v S fázi buněčného cyklu inkorporuje do jaderné DNA; slezinné lymfocyty v koncentraci 10 6 /ml z každé jednotlivé myši ovlivněné desetidenním podáváním testovaného vzorku CytoProtect 1 formou pitného režimu ad libitum byly smíšeny s mitogeny aktivujícími proliferaci T a B buněk, konkanavalinem A (Con A) v koncentraci 2,5μg/ml a lipopolysacharidem (LPS) v koncentraci 10μg/ml, a kultivovány 48 h; kontrolní (nestimulované) buňky byly kultivovány v mediu RPMI 1640; značení 3 H-Tdr: 4 hodiny před ukončením inkubace byl ke všem buňkám přidán 3 H-thymidin s výchozí aktivitou 40 MBq v konečném ředění 1 : 100 v množství 50μl/10 6 buněk; Odběr byl proveden po 4 hodinách inkubace s 3 H-thymidinem; každý vzorek byl měřen ve čtyřech paralelních řadách na přístroji MicroBeta TM 1450, Wallac, Finland; hodnoty proliferační aktivity jsou uvedeny jako celkový průměr proliferačních indexů jednotlivých pokusných zvířat Proliferační indexy ( ± stdev) spontánní a kostimulované proliferace lymfocytů vzorek spontánní ConA LPS stdev stdev stdev kontrola 24,8 5,47 2094,9 517,73 24004,0 410,12 CytoProtect 1 25,8 8,18 2964,2 919,63 16090,8 5420,52 Porovnání Pi mezi testovaným vzorkem CytoProtect a kontrolami vzorek spont. ConA LPS kontrola 1,0 1,0 1,0 CytoProtect 1 1,0 0,7 1,4 Hodnocení vlivu účinné látky CytoProtect 1 na proliferační aktivitu lymfocytů: celková spontánní proliferace lymfocytů: CytoProtect 1 neovlivňuje celkovou proliferaci stimulovaná proliferace T lymfocytů (kostimulace ConA): CytoProtect 1 neovlivňuje proliferaci T lymfocytů stimulovaná proliferace B lymfocytů (kostimulace LPS): CytoProtect 1 statisticky nevýznamně zvyšuje proliferaci B buněk 1,4 krát
Závěr: Vzorek CytoProtect 1vykazuje: mírnou tendenci specificky stimulovat proliferaci pouze aktivované B buněčné subpopulace; aktivovaná proliferační T buněčná subpopulace není ovlivněna (hodnoty jsou totožné s kontrolními zvířaty); spontánní proliferační aktivita celkové lymfocytární populace není ovlivněna (hodnoty jsou totožné s kontrolními zvířaty) Cytotoxický test: buněčná cytotoxicita je kvantifikována měřením množství 51 Cr, který je uvoňován ze značených cílových (nádorových) buněk, které jsou zabíjeny efektorovými buňkami (lymfocyty testovaného zvířete); značení 51 Cr: cílové buňky myší nádorové linie YAC-1 (American Type Culture Collection) byly 1,5 hodiny inkubovány se 4 MBq Na 51 Cr; efektorové slezinné lymfocyty z každé jednotlivé myši ovlivněné desetidenním podáváním testovaných vzorků ve výchozí koncentraci 10 6 byly smíchány se značenými cílovými buňkami myší nádorové linie YAC-1 (T) v poměrech: E : T 64 : 1; 32: 1; 16 : 1 odběr byl proveden po 3,5 hodinové a po 18 hodinové inkubaci efektorových buněk s cílovými buňkami značenými 51 Cr; hodnoty uvolněného 51 Cr byly měřeny ve čtyřech paralelních řadách; hodnoty cytotoxické aktivity byly spočítány pro ředění E : T, při kterém došlo nejvyššímu výtěžku cytotoxicity; jsou vyjádřeny jako průměrné koeficienty cytotoxických aktivit stanovených u jednotlivých pokusných zvířat: % cytotoxicity = (cpm exp - cpm spont : cpm max - cpm spont ). 100 Absolutní počty buněk tvořících hemolytické protilátky třídy IgG a IgM vzorek IgG IgM stdev stdev kontrola 60556 16074 46778 2912 CytoProtect 1 57333 2325 36417 3236 Hodnocení vlivu účinné látky CytoProtect 1 na tvorbu hemolytických protilátek třídy IgC a IgM v průběhu primární imunitní reakce: CytoProtect 1 statisticky neprůkazně snižuje tvorbu protilátek třídy IgG
Závěr: Vzorek CytoProtect 1 vykazuje: mírnou tendenci specificky snižovat diferenciaci a maturaci B buněčné subpopulace produkující hemolytické protilátky třídy IgG; neovlivňuje diferenciaci a maturaci B buněčné subpopulace produkující hemolytické protilátky IgM Celkové hodnocení bioaktivních vlastností vzorku CytoProtect 1 Vzorek CytoProtect 1 (20 mg/kg/den) podávané ve formě desetidenního pitného programu (ad libitum)nevykazovali žádné známky toxického působení na experimentální zvířata. Hmotnost zvířat se v průběhu pokusu neměnila. Nedošlo k výrazným změnám v počtu červených krvinek v průběhu pokusu Účinná látka CytoProtect má tendenci stimulovat aktivovanou B buněčnou subpopulaci (podpora antiinfekční imunity), neovlivňuje však spontánní proliferační aktivitu lymfocytů, ani aktivitu T buněčné subpopulace) Účinná látka CytoProtect má mírnou tendenci specificky snižovat cytotoxickou aktivitu NK buněčné subpopulace. Účinná látka CytoProtect má mírnou tendenci specificky snižovat absolutní počty buněk produkujících protilátky třídy IgG, neovlivňují však počty buněk produkujících protilátky třídy IgM. Celkově lze usuzovat, že aplikace účinné látky CytoProtect ve formě krátkodobého pitného programu neovlivňuje základní parametry imunitního systému. Ze získaných výsledků o účinné látce CytoProtect lze uzavřít, že některé parametry např. týkající se proliferace jednotlivých subpopulací lymfocytů, cytotoxické aktivity nebo tvorby protilátek, by mohly být při časově delším podávání (1-2 měsíce), případně při aplikaci rozdílnějších dávek přípravku ovlivněny významněji. V Praze 10. 8. 2014 RNDr. Petr Šíma, CSc. Sektor imunologie a gnotobiologie MBÚ AV ČR