BD BBL Enterotube II

POKYNY K POUŽITÍ BBL Enterotube II BD BBL Enterotube II IA-273176.01 Rev.: Jan 2007 ÚČEL POUŽITÍ Systém BBL Enterotube II je identifikační systém k okamžitému použití určený k identifikaci Enterobacteriaceae a různých dalších Gram negativních bakterií a oxidáza negativních bakterií. ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Bakterie Enterobacteriaceae hrají důležitou roli jako infekční činitelé. Tato skupina bakterií využívá uhlovodíků získaných zejména prostřednictvím fermentace a oxidace. Jsou pozitivní na katalázu a téměř všechny jsou negativní na oxidázu [nedávno bylo navrženo, aby Plesiomonas shigelloides byly zahrnuty do Enterobacteriaceae na základě sekvencování 16S rrna a také proto, že obsahují enterobakteriální společný antigen. 1,2 Dříve byl tento organismus, který je pozitivní na oxidázu, zařazován do rodiny Vibrionaceae]. Identifikace Enterobacteriaceae je založena na biochemických reakcích, jak je popisují Ewing a Farmer. Podrobnosti naleznete v odkazech. 1-11 Přestože během let bylo popsáno obrovské množství rodů a druhů, organismy, které jsou izolované z klinických vzorků, patří k 20 až 25 druhům, které jsou již roky dobře známy. Systém BBL Enterotube II je samostatná, do oddílů rozdělená plastová zkumavka obsahující dvanáct různých médií, která umožňují určení 15 biochemických reakcí (glukóza, produkce plynů z glukózy, dekarboxylace lyzinu, dekarboxylace ornitinu, Sirovodík (H 2 S), indol, adonitol, laktóza, arabinóza, sorbitol, Voges-Proskauer (VP), dulcitol, fenylalaninová deamináza (PA), močovina a citrát). Přiložený očkovací drátek umožňuje naočkování všech oddílů v jednom kroku z jedné nebo několika jednotlivých kolonií izolátu. Výsledná kombinace reakcí spolu s interpretačním příručkou (kniha kódů) umožňuje identifikaci klinicky významných bakterií Enterobacteriaceae. Interpretační příručka (kniha kódů) pro systém BBL Enterotube II byla sestavena pomocí údajů o procentech obsažených v odkazech na biochemické testy prováděné systémem BBL Enterotube II. 3-11 Výsledkový blok a barevné reakční schéma umožňují rychlou kontrolu pozitivních reakcí získaných pomocí systému BBL Enterotube II. Zkontrolovaná kladná čísla se sečtou a složené číslo je potom vyhledáno v interpretační příručce, aby organismus mohl být identifikován. Tam, kde jsou uvedeny dva organismy nebo více, jsou stanoveny také ověřovací testy požadované pro jejich další identifikaci. Následující blokové schéma ukazuje, jak lze testy na oxidázu použít k rozlišení členů Enterobacteriaceae od nefermentativních oxidáza pozitivních nebo negativních bakterií a od fermentativních, oxidáza pozitivních Gram negativních bakterií, a kdy se používá system BBL Enterotube II nebo BBL Oxi/Ferm Tube II: Čistá kultura na základním médiu Oxidázový test pozitivní negativní Naočkovat systém BBL Oxi/Ferm Tube II Naočkovat systém BBL Enterotube II Anaerobní glukóza Glukóza Pozitivní Negativní Pozitivní Negativní* Aeromonas spp., Achromobacter spp., Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Plesiomonas Alcaligenes spp., Bordetella Stenotrophomonas shigelloides, bronchiseptica, Moraxella maltophilia, atd. Vibrio spp. spp., Pasteurella spp., atd. * Tyto druhy lze identifikovat pomocí systému BBL Enterotube II, ale k jejich prokázání možná bude nutno použít systém BBL Oxi/Ferm Tube II. IA-273176.01-1 -

REAGENTY Systém BBL Enterotube II Substráty, další aktivní ingredience a zabarvení nenaočkovaného média, Médium 1 (glukóza): Glukóza (20,0 g/l) obsažená ve vhodném základním médiu s kresolovou červení jako indikátorem ph. Médium je zakryto voskem, aby byly zajištěny anaerobní podmínky a umožněno zjištění produkce plynu. Neočkováno: červená Médium 2 (lysin): Lysin (10,0 g/l) obsažený ve vhodném základním médiu s bromkresolovou červení jako indikátorem ph. Médium je zakryto voskem, aby byly zajištěny anaerobní podmínky. Neočkováno: žlutá. Médium 3 (ornitin): Ornitin (10,0 g/l) obsažený ve vhodném základním médiu s bromkresolovou červení jako indikátorem ph. Médium je zakryto voskem, aby byly zajištěny anaerobní podmínky. Neočkováno: žlutá. Médium 4 (H 2 S/indol): Thiosulfan sodný (4,7 g/l), citran železito-amonný (0,6 g/l) a tryptofan (1,2 g/l) ve vhodném základním médiu. Neočkováno: Běžová až světle oranžová. Médium 5 (adonitol): Adonitol (20,0 g/l) obsažený ve vhodném základním médiu s kresolovou červení jako indikátorem ph. Neočkováno: červená. Médium 6 (laktóza): Laktóza (20,0 g/l) obsažená ve vhodném základním médiu s kresolovou červení jako indikátorem ph. Neočkováno: červená. Médium 7 (arabinóza): Arabinóza (20,0 g/l) obsažená ve vhodném základním médiu s kresolovou červení jako indikátorem ph. Neočkováno: červená. Médium 8 (sorbitol): Sorbitol (20 g/l) obsažený ve vhodném základním médiu s kresolovou červení jako indikátorem ph. Neočkováno: červená. Médium 9 (Voges-Proskauer): Glukóza (20,0 g/l) obsažená ve vhodném základním médiu. Neočkováno: bezbarvá až světle oranžová. Médium 10 (dulcitol/pa): Dulcitol (20,0 g/l), fenylalanin (7,0 g/l) a citran železito-amonný obsažené ve vhodném základním médiu s bromthymolovou modří jako indikátorem ph. Neočkováno: zelená Médium 11 (urea): Močovina (20,0 g/l) obsažená ve vhodném základním médiu s fenolovou červení jako indikátorem ph. Neočkováno: béžová až světle oranžová. Médium 12 (citrát): Citran sodný (2,0 g/l) obsažený ve vhodném základním médiu s bromthymolovou modří jako indikátorem ph. Neočkováno: zelená. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ. Pouze pro odborné použití. Zkumavky nepoužívejte, pokud vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, oddělení vosku od příslušného média, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození. Přesnost systému BBL Enterotube II může narušit kterýkoli z následujících stavů: dehydratace nebo zkapalnění, nadzvednutí vosku nad povrch média, všechny změny barvy média na jinou barvu než tu, která je uvedena pod nadpisem "Neočkováno" v části REAGENTY, a všechny známky růstu na povrchu média. S jednotlivými uvedenými oddíly souvisí tato bezpečnostní opatření: Glukóza: Vrstva vosku nanesená v tomto oddílu vytváří určitý stupeň anaerobiózy potřebné k tomu, aby mohlo dojít k opravdové fermentační reakci charakteristické pro Enterobacteriaceae. Zůstane-li toto médium po očkování a inkubaci červené, kmen nepatří k Enterobacteriaceae. Příkladem bakterií, které nejsou-čeledi Enterobac-teriaceae, jsou oxidáza negativní a při anaerobních podmínkách nefermentují glukózu v systému BBL Enterotube II, je druh Acinetobacter, který je negativní na glukózu. I když lze tyto organismy pomocí systému BBL Enterotube II odlišit od Enterobacteriaceae (v interpretačním bloku použijte databázi pro nefermentující oxidáza negativní bakterie), pro jejich další identifikační možná bude potřeba použít systém BBL Oxi/Ferm Tube II. Fenylalanin (PA): Médium může po inkubaci získat tmavší odstín zelené. To je nutno považovat za negativní. Varování: Při přípravě indolových testů a činidel VP a manipulaci s nimi se řiďte odpovídajícími pokyny pro manipulaci a příručkou Rizika a bezpečnost.

Pokyny pro aseptickou manipulaci, biologické nebezpečí a likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ. SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí skladujte systém BBL Enterotube II až do doby těsně před použitím v originální krabici, v temnu a při teplotě 2 až 8 C. Systém nesmí zmrznout nebo se přehřát. Zkumavky lze očkovat až do data expirace a inkubovat je lze po doporučenou dobu inkubace. Zkumavky z otevřených obalů lze používat do data expirace. Otevřené trubičky je nutno ihned použít. KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM Naočkujte systém BBL Enterotube II níže uvedenými kmeny. Při očkování, inkubaci a odečítání postupujte dle popisu v části Provedení testu: ORGANISMY Glukóza plyn Lyzin Ornitin H2S Indol Adonitol Laktóza Arabinóza Sorbitol VP Dulcit Fenylalani n Močovina Citrát Přijatelné biokódy Proteus mirabilis ATCC 12453 + +/- - + + - - - - - - - + + +/- 66007 / 66006 / 46007 Proteus vulgaris +/(+) +/- - - + + - - - - - - + + + 63007 / 43007 ATCC 6380 Providencia alcalifaciens ATCC 9886 + +/- - - - + + - - - - - + - -/+ 61404 / 41405 / 41404 / 61405 Serratia marcescens ATCC 13880 + +/- + + - - +/- - - + + - - - + 74461 / 54461 / 74061 / 54061 Escherichia coli + +/- + + - + - + + + - - - - - 75340 / 55340 ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae + +/- + - - - + + + + + + - -/+ + 50771 / 70771 / 70773 / 50773 ATCC 27736 Pseudomonas - - - - - - - - -/+ - - - - -/(+) + aeruginosa ATCC 27853 * P:aeruginosa jsou pozitivní na oxidázu a proto nejsou zahrnuty do databází BBL Enterotube II. Tento kmen je však užitečný jako kontrolní organismus při určování negativních reakcí v oblastech glukózy a plynů. += pozitivní; = negativní; (+) slabě pozitivní; +/- = pozitivní nebo (ojediněle) negativní; +/(+) = pozitivní nebo (ojediněle) slabě pozitivní; -/+= negativní nebo (ojediněle) pozitivní. POSTUP Dodané materiály Systém BBL Enterotube II. Mikrobiologicky kontrolováno. Výsledkový blok a barevné reakční schéma pro systém BBL Enterotube II. Materiál, který není součástí dodávky Interpretační blok k systému BBL Enterotube II (kniha kódů), dokument č. CM-273176.CE, který je rozdělen do tří databází: (1) Nefermentující bakterie negativní na oxidázu, (2) Enterobacteriaceae metoda bez VP a (3) Enterobacteriaceae metoda s VP. Kováčovo činidlo pro indol (činidlo Indole Dropper Reagent, 50 ampulí, kat. čís. 261185) a činidla Voges-Proskauer (činidlo Voges-Proskauer A Dropper Reagent, 50 ampulí, kat. č. 261192; činidlo Voges-Proskauer B Dropper Reagent, kat. č. 261193); tato činidla jsou k dostání u společnosti BD. Materiály a činidla pro provedení dodatečných testů, jak je uvedeno v interpretačním bloku k systému BBL Enterotube II. Identifikační systém BBL Oxi/Ferm II (kat. č. 212116) pro určování bakterií, které nepatří mezi Enterobacteriaceae. Pomocné živné půdy, činidla a laboratorní vybavení dle popisu.

Činidlo Kovacs lze v laboratoři připravit takto: Amylalkohol nebo izoamylalkohol 75 ml p-dimethylaminobenzaldehyd 5 g Koncentrovaná kyselina 25 ml chlorovodíková Rozpusťte p-dimetylaminobezaldehyd (činidlo by mělo být světle žluté) v alkoholu a poté pomalu přidávejte kyselinu. Připravené činidlo by mělo mít slámově žlutou barvu a mělo by být uloženo v hnědé lahvi a v chladu, aby bylo dosaženo jeho maximální stability. Činidlo, které má tmavě hnědou barvu, nepoužívejte. Činidla Voges-Proskauer lze připravit takto: 5% roztok alfa naftolu alfa naftol 5 g Etanol (etylalkohol), čistý 100 ml 20% roztok hydroxidu draselného Voda Hydroxid draselný (granule) Kreatin 100 ml 20 g 300 mg Po přípravě jsou činidla Voges-Proskauer stabilní v těsně uzavřených lahvích a na tmavém místě po dobu 2 až 8 C. Druhy vzorků BBL Enterotube II je biochemický identifikační systém a nesmí se používat přímo s klinickými vzorky. Použijte izoláty z příslušných médií (viz Provedení testu). Systém BBL Enterotube II lze použít k určování aerobních, případně anaerobních Gram negativních tyček (Enterobacteriaceae) izolovaných z libovolného vzorku. Provedení testu Při očkování BBL Enterotube II lze použít flóru z agarů MacConkey (MAC), eosin-metylenová modř (EMB), Salmonella Shigella (SS) nebo Hektoen Enteric (HE) nebo z základních červených agarových médií. Kultura používaná k nátěru musí být nejméně 18 hodin stará, ale obecně nesmí být starší než 48 hodin. Zkontrolujte, zda izolát, který bude identifikován systémem BBL Enterotube II, je čistá kultura Gram negativních tyček. BBL Enterotube II se smí používat pouze na oxidáza negativních izolátech, protože identifikace oxidáza pozitivních organismů (jiné než Enterobacteriaceae) vyžaduje použití systému BBL Oxi/Ferm Tube II. 1. Připravte jeden list z kódového bloku pro izolaci - zapište jméno pacienta, číslo vzorku a datum. Poznámka: Uživatel se může rozhodnout, zda bude používat databáze s činidlem VP nebo bez něj. V závislosti na tomto rozhodnutí použijte přední nebo zadní stranu kódového bloku. Zvolíte-li databázi bez činidla VP, bude možná u vybraných organismů potřeba provést reakci s činidlem VP jako dodatečný test. 2. Vezměte jednu zkumavku BBL Enterotube II a na štítek napište jméno pacienta, číslo vzorku a datum. 3. Odstraňte oba uzávěry. Špička očkovací jehly je zakryta bílou čepičkou. Jehlu neopalujte. 4. Špičkou očkovací jehly BBL Enterotube II seberte dobře izolovanou kolonii (obr. 1). Na špičce a po stranách jehly by mělo být viditelné množství nátěru. Nedotýkejte se jehlou agaru. K sebrání dalších kolonií použijte jednu nebo více jehel BBL Enterotube II podle vlastních zkušeností. 5. Otočením jehly a poté jejím protažením všemi dvanácti oddíly za současného otáčení jehly proveďte nátěr BBL Enterotube II (obr. 2). 6. Potom jehlu (bez sterilizace) zasuňte otáčivým pohybem zpět do BBL Enterotube II a protáhněte všemi 12 oddíly, dokud nebude zářez na jehle zarovnán s otevřeným koncem zkumavky (obr. 3). Konec jehly by měl být viděn v části obsahující citrát. Ohnutím zlomte jehlu v zářezu. Část jehly, která zůstane ve zkumavce, zajišťuje anaerobní podmínky potřebné pro správnou fermentaci glukózy, produkci plynu a dekarboxylaci lysinu a ornitinu.

7. Pomocí ulomené části jehly propíchejte otvory do fólie, která uzavírá přístup vzduchu do posledních osmi oddílů (adonitol, laktóza, arabinóza, sorbitol, Voges-Proskauer, dulcitol/pa, urea a citrát). Nasaďte zpět obě čepičky. 8. Inkubujte BBL Enterotube II při teplotě 35 nebo 37 C po dobu 18 až 24 hodin tak, aby zkumavka ležela na ploché straně nebo byla ve svislé poloze. Umožněte cirkulaci vzduchu mezi inkubovanými zkumavkami. 9. Interpretujte a zapište všechny reakce s výjimkou indolu a Voges-Proskauer. (Úplné pokyny pro čtení výsledků testu BBL Enterotube II naleznete v části Výsledky.) Všechny ostatní testy musí být odečteny před testem s indolem a činidlem Voges-Proskauer, protože činidla přidávaná kvůli těmto testům mohou změnit zbývající reakce testu BBL Enterotube II. Přidání indolu a činidla Voges-Proskauer: 1. Umístěte systém BBL Enterotube II vodorovně na stůl nebo svisle do držáku tak, aby oddíl s glukózou směřoval dolů. Pomocí jehly, ulomeného konce očkovací kličky systému BBL Enterotube II, nebo roztavením pomocí horké očkovací kličky vytvořte v plastikové fólii nad oddíly Indol/H2S a VP otvor o průměru 3-4 mm. 2. Provedení indolového testu: Přidejte 3-4 Kováčova činidla (kat. č. 261185 nebo připravený v laboratoři; viz část Materiál, který není součástí dodávky) do oddílu H 2 S/indol. Nechejte činidlo v kontaktu s povrchem média. Pozitivní test je indikován do 10 sekund objevením červené barvy v přidaném činidle. 3. Provedení testu Voges-Proskauer: Zvolíte-li databázi s VP, je tento test povinný. Možná bude nutné tento test provést také v případě, že je potřebný jako ověřovací test při použití databáze bez VP. Používáte-li činidla připravená v laboratoři (viz část Materiál, který není součástí dodávky), přidejte dvě kapky 20% roztoku hydroxidu draselného, který obsahuje 0,3 % kreatinu a tři kapky 5% alfanaftolu v čistém etanolu. Pozitivní test je indikován do 20 minut objevením červené barvy. Na výsledky nečekejte více než 20 minut! Používáte-li činidla Dropper Reagents, přidejte 3 až 5 kapek činidla Voges-Proskauer A (kat. č. 261192) a 1 až 2 kapky činidla Voges-Proskauer B (kat. č. 261193). Pozitivní reakce je indikována během 5 až 15 minut objevením třešňové barvy. Měděná nebo hnědá barva je považována za negativní výsledek. Na výsledky nečekejte déle než 15 minut! Výsledky Při určování izolátu postupujte podle níže uvedených pokynů. Tabulka 1 obsahuje informace o vzhledu pozitivních a negativních reakcí. Poznámka: Není-li v oddílu glukózy pozorována žádná změna barvy ani oranžová barva a v ostatních oddílech je podle barevných změn zřejmý růst, organismus nepatří do skupiny Enterobacteriaceae. (Viz část BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ). 1. Všechny reakce interpretujte v rozmezí od 18 do 24 hodin. Kromě indolu a VP odečtěte postupně reakce tak, že porovnáte barvy médií ve zkumavce po inkubaci s barvami, které jsou uvedeny v barevném schématu na krytu kódovacího bloku, a (nakonec) s nenaočkovanou zkumavkou BBL Enterotube II, která musí být nejprve uložena v prostředí s pokojovou teplotou (obrázek 5). Všechny reakce, které by měly být pozitivní, mohou mít stejnou, větší nebo menší intenzity než barvy uvedené v barevném reakčním schématu. 2. Každý pozitivní výsledek testu označte zakroužkováním čísla, které je uvedeno pod příslušným oddílem ve výsledkovém bloku (obrázek 6). 3. Nakonec proveďte indolový test a test VP. Jsou-li pozitivní, zakroužkujte příslušná čísla na připravených listech. Test VP je povinný pouze v případě, že použijete databázi s VP. 4. Sečtěte zakroužkovaná čísla v části v závorce a součet zapište na příslušné místo pod šipkou (obrázek 6). 5. Najděte pětimístné číslo v interpretačním příručce (kniha kódů) a najděte hodnotu, která mu nejlépe odpovídá v sloupci označeném ID value (identifikační hodnota). Zkontrolujte, zda byla použita správná databáze [(1) nefermentující oxidáza negativní bakterie, (2) Enterobacteriaceae metoda bez VP a (3) Entero-bacteriaceae metoda s VP]. V příkladu uvedeném na obr. 6 bylo dosaženo určení Klebsiella pneumoniae.

Obrázek 1 Obrázek 2 Obrázek 3 Obrázek 4 Obrázek 5 (A) (B) Obrázek 6: Výsledkový blok BBL Enterotube II (A= databáze s VP; B= databáze bez VP)

Tabulka 1: Vzhled negativních a pozitivních reakcí u testu BBL Enterotube II REAKCE POZNÁMKY Činidla Negativní Pozitivní Glukóza Produkce plynu červená (až oranžová) vosk není zvednutý žlutá (až zlatá) vosk je zvednutý ODDÍL 1 Glukóza (GLU): Konečnými produkty bakteriální fermentace glukózy jsou buď kyselina, nebo kyselina a plyn. Posun ph v důsledku produkce kyseliny je indikován změnou barvy indikátoru v médiu z červené (zásaditý) na žlutou (kyselý). Jakýkoli odstín žluté je možno interpretovat jako pozitivní reakci, oranžová je považována za negativní. Produkce plynu (GAS): Vyznačuje se úplným a zřetelným oddělením krycí vrstvy vosku od povrchu glukózového média, avšak nikoli bublinkami v médiu. Protože množství plynu produkovaného různými bakteriemi se liší, míra oddělení krycí vrstvy od média se také liší v závislosti na testovaném kmeni. ODDÍL 2 Lysin žlutá fialová Dekarboxyláza lysinu (LYS): Bakteriální dekarboxylace lysinu, jejímž důsledkem je vznik alkalického konečného produktu kadaverinu, je indikována změnou barvy indikátoru v médiu ze světle žluté (kyselý) na fialovou (zásaditý). Nedošlo-li k dekarboxylaci lysinu, médium zůstává žluté. ODDÍL 3 Ornitin žlutá fialová Dekarboxyláza ornitinu (ORN): Dekarboxylace ornitinu, jejímž důsledkem je vznik alkalického konečného produktu putrescinu, je indikována změnou barvy indikátoru v médiu ze světle žluté (kyselý) na fialovou (zásaditý). Nedošlo-li k dekarboxylaci ornitinu, médium zůstává žluté. ODDÍL 4 H 2S béžová až světle jantarová černá Adonitol, laktóza arabinóza, sorbitol Vznik indolu bezbarvá růžovočervená Voges- Proskauer červená (až oranžová) bezbarvý až nahnědlý žlutá (až zlatá) červená Dulcitol zelená žlutá (až zlatá) PA všechny odstíny zelené černákouřově šedá Produkce sirovodíku (H 2S): Bakterie schopné redukovat sloučeniny obsahující síru, například peptony a thiosíran sodný přítomný v médiu, produkují sirovodík. Sirovodík reaguje se solemi železa, které jsou v médiu také přítomny, a vytváří černou sraženinu sulfidu železitého, a to obvykle podél očkovací čáry. Některé kmeny Providencia mohou způsobit difúzní hnědé zabarvení tohoto média, to však nelze zaměňovat se skutečnou produkcí H 2S, tj. přítomností černé barvy. Poznámka: Černá sraženina může vyblednout nebo se opět změnit na negativní, pokud je odečet testu BBL Enterotube II prováděn po 24 hodinové inkubaci. Tvorba indolu (IND): Produkce indolu z metabolismu tryptofanu pomocí bakteriálního enzymu tryptofanázy je detekována vznikem růžovočerveného zabarvení po přidání Kováčova činidla pro indol, které se do oddílu přidává po 18 až 24 hodinách od inkubace zkumavky (viz část Provedení testu). ODDÍL 5,6,7,8 Adonitol (ADON), laktóza (LAC), arabinóza (ARAB), sorbitol (SORB): Bakteriální fermentace adonitolu, laktózy, arabinózy a sorbitolu, jejímž důsledkem je vznik kyselých konečných produktů, je indikována změnou barvy indikátoru v médiu z červené (zásaditý) na žlutou (kyselý). Jakoukoli známku žluté je nutno vykládat jako pozitivní reakci, oranžová je považována za negativní. ODDÍL 9 Voges-Proskauer (VP): Acetylmetylkarbinol (acetoin) je meziprodukt produkce butylenglykolu při fermentaci glukózy. Produkce acetoinu je detekována přidáním činidla VP po inkubaci (viz část Provedení testu). Přítomnost acetoinu je indikována během 5 až 20 minut objevením červené barvy. ODDÍL 10 Dulcitol DUL): Bakteriální fermentace dulcitolu, jejímž důsledkem je vznik kyselých konečných produktů, je indikována změnou barvy indikátoru v médiu ze zelené (zásaditý) na světle žlutou (kyselý). Fenylalaninová deamináza (PA): Tento test detekuje vznik kyseliny pyruvátové z deaminace fenylalaninu. Vzniklá kyselina pyruvátová reaguje s železitou solí přítomnou v médiu a výsledkem je charakteristická černá až kouřově šedá barva. Chlorid železitý není nutno přidávat, protože médium již obsahuje sůl železa.

REAKCE POZNÁMKY Činidla Negativní Pozitivní ODDÍL 11 Urea béžová až světle jantarová světle růžová až růžová Močovina (UREA): Ureáza, enzym obsažený v různých mikroorganismech, hydrolyzuje močovinu na amoniak, což způsobuje, že barva indikátoru v médiu se mění ze žluté (kyselý) na červenofialovou (zásaditý). U druhů Proteus je test na ureázu silně pozitivní a může být zřejmý již za 4 až 6 hodin po inkubaci, u druhů Klebsiella a Enterobacter je slabě pozitivní (světle růžová barva) za 18 až 25 hodin po inkubaci. ODDÍL 12 Citrát zelená modrá Citrát CIT): Tento test detekuje organismy, které jsou schopné jako jediný zdroj uhlíku využívat citrát ve formě chloridu sodného. Organismy schopné využívat citrát produkují alkalické metabolity, které mění barvu indikátoru ze zelené (kyselé) na tmavě modrou (zásadité). Všechny odstíny modré je nutno považovat za pozitivní. POZNÁMKA: Určité mikroorganismy nevytvářejí vždy ideální silnou pozitivní změnu barvy. Světlejší odstíny stejné základní barvy jsou také považovány za pozitivní. CHARAKTERISTIKY PROVEDENÍ A OMEZENÍ POSTUPU Systém BBL Enterotube II je určen speciálně k určování Gram negativních tyček, které jsou negativní na oxidázu, a lze jej používat pouze k odlišení členů rodiny Enterobacteriaceae. Pomocí tohoto systému lze určit také omezený počet nefermentujících bakterií negativních na oxidázu, ale pro tyto organismy se doporučuje použít systém BBL Oxi/Ferm Tube II. Provozní vlastnosti Systém BBL Enterotube II byl hodnocen v rámci několika externích studií. Publikované údaje naznačují přesnost určení 87 až 99%. 12-14 Opakovatelnost: Během tří dnů testovaly tři nezávislé laboratoře dvakrát celkem deset organismů pomocí systému BBL Enterotube II. Tři (30%) organismy vykazovaly při každém opakování jednotlivých laboratorních testů identické biokódy. Pět (50%) organismů vykazovalo při každém opakování mírné změny biokódů, ale výsledkem bylo identické určení organismů. Dva (20%) organismy vykazovaly mírné změny biokódů s identickým určením u dvou z 18 opakování pro tyto organismy, což vedlo k neidentifikovatelným biokódům. U všech opakování byla shoda určení 98,9%. Pomocí identifikačního systému BBL Enterotube II byla analyzována studie 247 již dříve určených kmenů (včetně známých kultur ATCC). Při počátečním očkování se u devíti organismů projevily biochemické neshody. Při opakované naočkování bylo vyřešeno osm těchto neshod. V pěti případech odpovídal vyřešený výsledek počáteční výsledek referenční metody. Ve třech případech odpovídal vyřešený test počátečnímu výsledku systému BBL Enterotube II. V jednom případě byl vyřešený výsledek odlišný od počátečního výsledku. Neshodné biochemické testy byly vyřešeny pomocí třetí metody, která vedla ke stejným výsledkům jako u systému BBL Enterotube II. Studované vzorky jsou shrnut v tabulce 2. Je zde uveden seznam rodů, druhů, počtu testovaných kmenů a procento organismů, u kterých byla zjištěna pozitivní biochemická reakce. Omezení postupu Systém BBL Enterotube II je určen pro uvedený taxon. Jiné druhy než ty, které jsou uvedeny v tabulce 3, nejsou určeny k použití v tomto systému. Biokódy BBL Enterotube II nelze použít ke stanovení fenotypové identity mezi izoláty ze stejných nebo odlišných vzorků. Biochemické výsledky získané pomocí systému BBL Enterotube II se mohou lišit od ostatních metod a publikovaného materiálu. Pro potvrzení Salmonella a Shigella spp. je nutné serologické testování. Izoláty těchto organismů je nutno odeslat do příslušné referenční laboratoře k provedení serotypické a epidemiologické kontroly.

Určování Gram negativních bakterií je nutno provádět s ohledem na další charakteristiky, například zdroj vzorku, anamnézu pacienta, mikroskopickou morfologii a morfologii kolonií, serologii a vzorce antibakteriální citlivosti. Určení vzácných izolátů je nutno opakovat nebo se u nich provádí další testování na ověření určení těchto organismů. Některé kmeny organismů mohou vykazovat kvůli neobvyklým nutričním požadavkům nebo mutacím atypické biochemické reakce a může být obtížné je určit. Některé organismy mohou pro správné určení vyžadovat inkubaci delší než 24 hodin. Přestože bylo nedávno navrženo zahrnout Plesiomonas shigelloides do čeledi Enterobacteriaceae, není tento druh do databází systému BBL Enterotube II zahrnut. 1,2 Místo toho je nutno tento organismus testovat pomocí systému BBL Oxi/Ferm Tube II a jeho databází. Tabulka 2: Výsledky hodnocení výkonu Organismy Testované číslo GLU GAS LYS ORN H2S IND ADO LAC ARA SOR DUL PA UREA CIT ACINETOBACTER A. anitratus 1 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 A. Iwoffii* 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Burkholderia B. cepacia 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 CEDECEA C, davisae 1 100 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 C. lapagei* 1 100 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 100 CITROBACTER C: amalonaticus 1 100 100 0 100 0 100 0 0 100 100 0 0 100 100 C: freundii 4 100 100 0 0 100 0 0 50 100 100 0 0 50 50 ESCHERICHIA E: coli 83 100 92 100 78 0 99 0 88 99 100 1 0 0 0 ENTERICKÉ SKUPINY Enterická skupina 60* 2 100 100 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 ENTEROBACTER E. aerogenes 5 100 100 100 100 0 0 100 80 100 100 0 0 0 100 E. amnigenus bio 1 2 100 0 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 100 E. cloacae 10 100 100 10 90 0 0 10 100 100 100 20 0 10 80 EWINGELLA E: americana 1 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 HAFNIA H. alvei* 3 100 100 100 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 KLEBSIELLA K. oxytoca* 8 100 0 100 0 0 100 100 100 100 100 38 0 100 100 K. ozaenae 4 100 100 100 0 0 100 100 100 100 100 50 0 50 100 K. pneumoniae 20 100 100 100 0 0 0 65 100 100 100 30 0 100 100 KLUYVERA K: ascorbata* 1 100 100 100 100 0 100 0 100 100 0 0 0 0 100 MORGANELLA M: morganii 2 100 100 0 100 0 100 0 0 0 0 0 100 100 50 PROTEUS P. mirabilis* 4 100 75 0 100 100 0 0 0 0 0 0 100 100 100

Tabulka 2: Výsledky hodnocení výkonu (pokračování) Organismy Testované číslo GLU GAS LYS ORN H2S IND ADO LAC ARA SOR DUL PA UREA CIT PROVIDENCIA P. rettgeri* 2 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 100 100 100 P: stuartii* 1 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 100 0 100 SALMONELLA Salmonella species 41 100 100 100 98 100 0 0 0 100 100 100 0 0 100 Salmonella (ariz) IIIa 5 100 100 100 100 100 0 0 0 100 100 0 0 0 80 SERRATIA S. liquefaciens 3 100 100 100 100 0 0 0 67 100 100 0 100 100 67 S. marcescens* 5 100 20 100 100 80 0 0 0 0 80 0 0 0 100 S. plymuthica 1 100 0 0 0 0 0 0 100 100 100 0 0 0 0 SHIGELLA Shigella srgps A,B,C 10 100 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 0 S. sonnei 17 100 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 YERSINIA Y. enterocolitica 1 100 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0 100 0 Y. frederiksenii 2 100 100 0 100 0 100 0 100 100 100 0 0 0 0 Y. ruckeri 2 100 0 50 100 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 * Jediný organismus z této skupiny pocházející z odběru kultury amerického typu. Tabulka 3: Taxon Enterobacteriaceae obsažený v databázích testu BBL Enterotube II Buttiauxella agrestis Hafnia alvei Salmonella serotype Pullorum Cedecea davisae Hafnia alvei biogroup 1 Salmonella (arizonae) IIIa Cedecea lapagei Klebsiella pneumoniae Salmonella (diarizonae) IIIb Cedecea neteri Klebsiella oxytoca Serratia marcescens Cedecea species 3 Raoultella (Klebsiella) ornithinolytica Serratia marcescens biogroup 1 (group 47) Cedecea species 5 Klebsiella ozaenae Serratia liquefaciens Citrobacter freundii Klebsiella rhinoscleromatis Serratia rubidaea Citrobacter koseri (diversus) Kluyvera ascorbata Serratia odorifera biogroup 1 Citrobacter amalonaticus Kluyvera cryocrescens Serratia odorifera biogroup 2 Citrobacter farmeri Leclercia adecarboxylata Serratia plymuthica Edwardsiella tarda Leminorella sp. Serratia ficaria Edwardsiella tarda biogroup 1 Moellerella wisconsensis Serratia fonticola Edwardsiella hoshinae Morganella morganii Shigella serogroups A, B, C Edwardsiella ictaluri Morganella morganii biogroup 1 Shigella sonnei Enterobacter aerogenes Obesumbacterium proteus biogroup 2 Tatumella ptyseos Enterobacter asburiae Pantoea agglomerans (Enterobacter Yersinia enterocolitica agglomerans complex) Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Yersinia frederiksenii Enterobacter gergoviae Proteus vulgaris Yersinia intermedia Enterobacter sakazakii Proteus penneri Yersinia kristensenii Enterobacter cancerogenus (taylorae) Proteus myxofaciens Yersinia pestis Enterobacter amnigenus biogroup 1 Providencia rettgeri Yersinia pseudotuberculosis Enterobacter amnigenus biogroup 2 Providencia stuartii Yersinia ruckeri Escherichia coli Providencia alcalifaciens Yokenella regensburgeri Escherichia coli (AD), inactive Providencia rustiganii Enteric group 58 Escherichia fergusonii Salmonella species Enteric group 59 Escherichia hermanii Salmonella serotype Typhi Enteric group 60 Escherichia vulneris Escherichia blattae Ewingella americana Salmonella serotype Choleraesuis Salmonella serotype Paratyphi A Salmonella serotype Gallinarum BIBLIOGRAFIE 1. Farmer, J.J. III. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Abbott, S.L. 2003. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Farmer, J.J, III., et al. 1985. Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21:46-76. 4. Ewing, W.H. 1973. Differentation of Enterobacteriaceae by biochemical reactions, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control.

5. Ewing, W.H. 1972. Biochemical characterization of Citrobacter freundii and Citrobacter diversus. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 6. Ewing, W.H., and M.A. Fife. 1971. Enterobacter agglomerans and the Herbicola-Lathyri bacteria. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 7. Darland, G., and B.R. Davis. 1973. Biochemical and serological characterization of hydrogen sulfide producing variants of Escherichia coli. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 8. Ewing, W.H. 1974. Isolation and identification of Salmonella and Shigella. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 9. Ewing, W.H., B.R. Davis, and M.A. Five. 1972. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens and Serratia rubidaea. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 10. Brenner, D.J., et al. 1977. Taxonomic and nomenclature changes in Enterobacteriaceae. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control.:, Oct. 1977. 11. Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing s identification of Enterobacteriaceae. Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y. 12. Holmes, B. 1989. Comparative evaluation of the Roche Cobas IDA and Enterotube II systems for identifying members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 27: 1027-1030. 13. Mastroeni, P. et al. 1983. Comparison of six systems for the identification of Enterobacteriaceae. G. Batteriol. Virol. Immunol. 76: 3-19. 14. Chiaradia, V. et al. 1983. Comparative evaluation of 3 miniaturized systems (API 20E, Enterotube II, Sensititre AP60) commonly used in clinical microbiology laboratories. Quad. Sclavo Diagn. 19: 159-175 [in Italian]. BALENÍ/DOSTUPNOST: BBL Enterotube II Kat. č. 273176 25 zkumavek DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD. Becton Dickinson GmbH BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50, Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès 38800 Le Pont de Claix/France Tel: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292 http://www.bd.com BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Enterotube and Oxi/Ferm are trademarks of Becton Dickinson GmbH. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. 2007 Becton, Dickinson and Company