Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC Karel Lemr Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého tř. Svobody 8, 771 46 Olomouc lemr@prfnw.upol.cz Zentiva, Praha, 2007
Chiralita
Chiralita interakce chirálních látek s chirálním prostředím (léčiva, pesticidy, potraviny) případ Thalidomidu S-thalidomide teratogenní, ale s protizánětlivými a imunomodulačními účinky rychlá in-vivo interkonverze separace enantiomerů (HPLC, CE, GC) ale i jinak např. MS O H N O N O O H R(+)-thalidomide O H N O O N H S(-)-thalidomide O
Odlišení enantiomerů interakce s chirálním prostředím L + D + 2D LD + DD tří(dvou)bodová interakce (v okolí chirálního centra, relativní síla interakcí, konfigurace a konformace) L D D D * * * * * *
Rozpoznání enantiomerů v HPLC detektory optické aktivity derivatizace chirálními činidly chirální aditiva v mobilní fázi chirální stacionární fáze
Detektory optické aktivity polarimetrie cirkulární dichroismus magnetooptická rotace (Faradayův efekt)
Detektory optické aktivity IBZ Messtechnik
Detektory optické aktivity IBZ Messtechnik
Derivatizace chirálními činidly L + D + 2D LD + DD Požadavky na derivatizační činidlo stabilní a snadno dostupné v opticky čisté formě při derivatizační reakci nesmí docházet k racemizaci (analytu ani činidla) jednoznačný a kvantitativní průběh derivatizace vhodná je přítomnost chromoforu či fluoroforu v deriv. činidle
Derivatizace chirálními činidly funkční skupina -OH -COOH -SH -NH 2 -NHR činidlo 1-(9-fluorenyl)ethylchloroformiát (FLEC) 1-(p-nitrofenyl)ethylamin FLEC o-ftalaldehyd (OPA)+chirální amin FLEC OPA+N-acetyl-L-cystein OPA+N-isobutyryl-L-cystein (i jiný N-acyl-L-cystein)
Derivatizace chirálními činidly H CH O C O FLEC CH 3 Cl R2 CHCOOH + NH R1 R2 H CH CH 3 CHCOOH O C N O R1 CHO CHO + H 2 N R* + R1 * SH R1* S N R* OPA chirální amin
Derivatizace chirálními činidly Hewlett Packard
Chirální aditiva v mobilní fázi tvorba ternárních komplexů (Cu 2+, Ni 2+, L-prolin, L- a D- fenylalanin, N-oktylamid L-prolinu) vznik iontových párů ((+)-10-kafrsulfonová kyselina, (+)-3- brom-10-kafrsulfonová kyselina, chinin) uplatnění vodíkových vazeb (N-acetyl-L-valin terc.butylamaid) použití cyklodextrinu, makrocyklických antibiotik.. Porovnání se stacionárními fázemi
Chirální stacionární fáze π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) ternární komplexy cyklodextriny makrocyklická antibiotika cyklické chirální polyethery proteiny a peptidy polysacharidy syntetické polymery
Ch.J.Welch:Journal of Chromatography A, 666 (1994) 3-26 π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) dinitrobenzoyl deriváty aminokyselin hydantoinové deriváty
π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) využití π-π elektronových interakcí vodíkových vazeb a interakcí dipólů sterických interakcí někdy derivatizace analytu (zavedení π-akceptorové resp. π-donorové skupiny, pokrytí vysoce polárních funkčních skupin) Ch.J.Welch:Journal of Chromatography A, 666 (1994) 3-26 stacionární fáze se širším záběrem i specifické racionální přístup k přípravě stacionární fáze dolaďování její struktury pro daný analyt
π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) (3R, 4R)-Whelk-O 1 (3S, 4S)-Whelk-O 1 4-(3,5-dinitrobenzamido)-1,2,3,4-tetrahydrofenanthren
π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy)
Ternární komplexy chromatografie ligandové výměny Tvorba ternárních komplexů [MLX] + A [MLA] + X stacionární fáze - dynamicky pokryté chemicky vázané možnost popsat interakce chirální selektor separované enantiomery (podobně jako u Pirklových stac. fází) pomalá ligandová výměna nízká účinnost separace (vliv teploty a průtoku) V.A. Davankov: Journal of Chromatography A, 666 (1994) 55-76
Ternární komplexy chromatografie ligandové výměny V.A. Davankov: Journal of Chromatography A, 666 (1994) 55-76
Cyklodextrinové stacionární fáze Astec
Cyklodextrinové stacionární fáze Astec
Cyklodextrinové stacionární fáze Astec
Cyklodextrinové stacionární fáze jedny z nejrozšířenějších - velký počet úspěšně separovaných enantiomerů inkluze interakce dipólů vodíkové vazby π-π elektronové interakce sterické interakce vliv derivatizace cyklodextrinu reverzní fáze normální fáze polární organické fáze
Cyklodextrinové stacionární fáze Astec
Cyklodextrinové stacionární fáze Astec
Makrocyklická antibiotika Vancomycin 18 chirálních center, M.h. 1449 chirální selektivita pro řadu látek (aminy, estery, amidy, neutrální molekuly) Teicoplanin 23 chirálních center, M.h. 1885 chirální selektivita pro řadu látek (aminokyseliny, hydroxykarboxylové a karboxylové kyseliny, fenoly, neutrální aromatické látky) Astec
Vancomycin - Teicoplanin vzájemně komplementární π-π interakce vodíkové vazby interakce dipólů inkluze sterické interakce elektrostatické interakce reverzní fáze normální fáze polární organické fáze
analyt s více než jednou fční skupinou analyt s jednou fční skupinou polární organické fáze CH 3 OH/HAc/TEA 100/1,0/1,0 eluce < 5 min. CH 3 OH/HAc/TEA 100/0,1/0,1 látky se neeluují separace optimalizace HAc/TEA reverzní fáze CH 3 OH/H 2 O 20/80 1% TEAAc, ph 4 normální fáze Hex/EtOH 80/20 eluce < 5 min. CH 3 OH/HAc/TEA 100/0,01/0,01 separace optimalizace HAc/TEA eluce < 5 min. Teicoplanin Astec
Teicoplanin Astec
Teicoplanin vliv teploty separace diastereoizomerů captoprilu P. K. Owens, L. A. Svensson, J. Vessman: J. Pharm. and Biomed. Anal. 25 (2001) 453 464
Teicoplanin vliv teploty separace diastereoizomerů captoprilu (0,05% TEAA (ph 3,8), 1,0 ml/min) P. K. Owens, L. A. Svensson, J. Vessman: J. Pharm. and Biomed. Anal. 25 (2001) 453 464
Ristocetin A K. H. Ekborg-Ott, Y. Liu, D. W. Armstrong:CHIRALITY 10:434 483 (1998)
Cyklické chirální polyethery tvorba komplexů s vhodným kationtem interakce ion dipól vodíkové vazby rozměry cyklu, analytu vliv substituentů cyklu, analytu separace látek s primární aminoskupinou (m.f. vodná HClO 4 )
Proteiny hydrofobní a elektrostatické interakce vodné a vodně organické mobilní fáze široký záběr omezená kapacita kolon hovězí sérový albumin lidský sérový albumin kyselý α 1 -glykoprotein ovomukoid
Peptidy vyšší kapacita kolon užší záběr reverzní fáze (hydrofobní a elektrostatické interakce) (analýza peptidů, aminokyselin) normální fáze (vodíkové vazby) (derivatizované aminokyseliny)
Polysacharidy Daicel derivatizovaná celulosa a amylosa vliv funkčních skupin příspěvek helikální struktury separace aromatických látek, látek s karbonylovou skupinou, nitrilovou, nitro, hydroxylovou skupinou normální fáze (hexan/alkohol) reverzní fáze
Polysacharidy Daicel, Chiral Technologies
Syntetické polymery Helikální polymery separace např. aromatických nepolárních látek m.f. methanol, hexan/isopropylalkohol poly(trifenylmethylmetakrylát) poly(difenyl-2- pyridylmethylmetakrylát) Předtištěné polymery polymerace za přítomnosti čistého enantiomeru vhodné látky polymerace enantiomeru monomerní jednotky za přítomnosti racemátu vhodné látky selektivita pro určitý typ látek, chvostování píků
Jiné stacionární fáze např. chininové a chinidinové (W. Lindner) M. Lämmerhofer, W. Lindner: J. Chromatogr. A 741 (1996) 33-48.
Daicel, Chiral Technologies Jiné stacionární fáze např. chininové a chinidinové (W. Lindner)
Volba chirálního selektoru?!