Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Využití HPLC pro stanovení barviv ilegálně používaných v potravinách (diplomová práce) Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, PhD. Hradec Králové 2013 Tereza Šmidrkalová
Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucímu diplomové práce panu Doc. RNDr. Daliboru Šatínskému, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady, připomínky při konzultacích v průběhu psaní této práce a v neposlední řadě za jeho vstřícnost a trpělivost. 2
Prohlašuji, že tato práce je mým autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu literatury a v práci citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu. Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. V Hradci Králové dne. 3
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Tereza Šmidrkalová Konzultant: Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D. Název diplomové práce: Využití HPLC pro stanovení barviv ilegálně používaných v potravinách Tato diplomová práce se zabývá hledáním optimálních podmínek pro stanovení sudanových barviv. Pro stanovení byla využita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). V průběhu experimentů bylo testováno několik kolon, různé mobilní fáze a různé typy gradientových elucí. Pro validaci separačních podmínek byla použita kolona na Ascentis Express F5 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm). Detekce byla provedena při vlnové délce 500 nm a 426 nm. Separace probíhala za gradientové eluce s mobilní fází acetonitril voda průtokovou rychlostí 1 ml/min. Nástřik byl 5 μl. Při měření validačních parametrů bylo využito před vlastní separací látek on-line SPE extrakce v HPLC systému na předkolonce Ascentis Express C18 (5 x 4,6 mm, 2,7 μm) s promývací mobilní fází 5% roztok acetonitrilu s vodou. Optimalizace a validace metody proběhla pouze na standardech a metoda byla navržena pro další testování a použití na reálných vzorcích. Klíčová slova: HPLC, sudanová barviva 4
Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Tereza Šmidrkalová Supervisor: Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D. Title of Diploma Thesis: Using of HPLC for illegal colorants determination in foods. This thesis deal with looking for optimal conditions for determination of Sudan dyes. High performance liquid chromatography (HPLC) was used for determination. During searching several various columns and mobile phases were tested. For validation of separation conditions Ascentis Express F5 column (100 x 4,6 mm, 2,7 μm) was used. Detection was measured at a wavelength of 500 nm and 426 nm. Separation used gradient elution with mobile phase of acetonitrile water at a flow rate 1 ml/min. Injection volume was set to 5 μl. During measuring validation parametres was used on-line SPE extraction in HPLC system on precolumn Ascentis Express C18 (5 x 4,6 mm, 2,7 μm) with washing mobile phase 5% solution of acetonitril - water before separation. Optimalization and validation used only standards and method was suggested for other testing and using real samples. Keywords: high performance liquid chromatography (HPLC), Sudan dyes 5
Obsah 1 Seznam použitých zkratek... 8 2 Úvod... 9 3 Cíl a zadání práce... 10 4 Teoretická část... 11 4.1 Barviva typu Sudan... 11 4.1.1 Sudan I... 11 4.1.2 Sudan II... 11 4.1.3 Sudan III... 12 4.1.4 Sudan IV... 12 4.1.5 Vlastnosti a toxikologie Sudanu I - IV... 13 4.1.6 Sudan Red G (Sudanová Červeň G)... 14 4.1.7 Sudan Red 7B (Sudan 7B)... 14 4.1.8 Sudan Orange G (Sudanová Oranž G)... 15 4.1.9 Para Red... 15 4.1.10 Toluidine Red (Toluidinová Červeň)... 15 4.2 Ostatní barviva... 16 4.2.1 Congo Red (Kongo Červeň)... 16 4.2.2 Methyl Red (Methylová Červeň)... 16 4.2.3 Phenol Red (Fenolová červeň)... 17 4.3 Metody stanovení Sudanů... 18 4.4 Chromatografie... 20 4.4.1 Základní principy a rozdělení chromatografických metod... 20 4.4.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie... 20 4.4.2.1 Schéma kapalinového chromatografu... 21 4.4.2.2 Kolony v HPLC... 22 4.4.2.3 Detektory v HPLC... 23 4.5 Možnosti on-line úpravy vzorků v HPLC systému... 25 4.6 Validace analytických metod... 27 4.6.1 Správnost... 27 4.6.2 Přesnost... 27 4.6.3 Selektivita, specifika... 28 4.6.4 Detekční limit... 28 6
4.6.5 Kvantitativní limit... 28 4.6.6 Linearita... 28 4.6.7 Rozsah... 28 4.6.8 Robustnost... 29 4.6.9 Test způsobilosti systému... 29 5 Experimentální část... 31 5.1 Materiál a Pomůcky... 31 5.2 Příprava roztoků standardů... 32 5.2.1 Příprava zásobních roztoků... 32 5.2.2 Příprava roztoků pro optimalizaci... 33 5.2.3 Příprava roztoků pro kalibraci... 33 5.3 Optimalizace chromatografických podmínek... 34 5.3.1 Volba vlnové délky detektoru... 34 5.3.1.1 Absorpční spektrum: Sudan I... 35 5.3.1.2 Absorpční spektrum: Sudan II... 36 5.3.1.3 Absorpční spektrum: Sudan III... 37 5.3.1.4 Absorpční spektrum: Sudan IV... 38 5.3.1.5 Absorpční spektrum: Para Red... 39 5.3.1.6 Absorpční spektrum: Sudan Red 7B... 40 5.3.1.7 Absorpční spektrum: Sudan Orange G... 41 5.3.1.8 Absorpční spektrum: Toluidine Red... 42 5.3.2 Volba kolony a mobilní fáze... 42 5.4 Souhrn optimálních podmínek... 51 5.5 Základní validace metody... 52 5.5.1 Test vhodnosti chromatografického systému (System suitability test SST)... 52 5.5.1.1 Účinnost chromatografického systému (Počet teoretických pater - N)...... 52 5.5.1.2 Asymetrie chromatografických píků (T)... 53 5.5.1.3 Rozlišení chromatografických píků (R)... 53 5.5.1.4 Linearita... 54 5.5.1.5 Opakovatelnost... 62 6 Závěr... 64 7 Seznam literatury... 65 7
1 Seznam použitých zkratek ACN - acetonitril DAD - Diode array detector DMSO - dimethylsulfoxid HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie k - směrnice MeOH - methanol MS - hmotnostní spektrometrie N -počet teoretických pater n - počet bodů q - absolutní člen r - korelační koeficient R - rozlišení chromatografických píků RP - reversed - phase chromatography s - reziduální odchylka S I - Sudan I S II - Sudan II S III - Sudan III S IV - Sudan IV S Org G - Sudan Orange G S Red 7B - Sudan Red 7B SD - směrodatná odchylka SST - system suitability test (test vhodnosti systému) T - asymetrie chromatografických píků THF - tetrahydrofuran Tol Red - Toluidine Red tr - retenční čas UHPLC - ultra vysoce účinná kapalinová chromatografie UV-VIS - ultrafialová/viditelná oblast spektra světla UV - ultrafialová oblast spektra záření w0,05 - šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky 8
2 Úvod Mezi barviva, která se často ilegálně používají v potravinách, patří Sudany. Sudanová barviva jsou lipofilní a mají výborné barvící schopnosti. Ve většině zemích jsou zakázána kvůli jejich potencionální kancerogenitě. Pro stanovení sudanových barviv je v současnosti preferovaná kapalinová chromatografie. V teoretické části jsou uvedeny základní charakteristiky barviv a parametry jejich stanovení pomocí HPLC. V této práci byla vyvinuta HPLC metoda pro současné stanovení sudanových barviv. Postup, optimalizace metody, výsledné optimální podmínky separace jsou uvedeny v experimentální části práce. 9
3 Cíl a zadání práce Tato diplomová práce se zabývá stanovením barviv ilegálně používaných v potravinách za pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Cílem této práce bylo optimalizovat, vyvinout a validovat novou metodu HPLC separace několika vybraných barviv. 10
4 Teoretická část 4.1 Barviva typu Sudan 1 Sudany jsou díky své nízké ceně, snadné dostupnosti a výborným barvícím účinkům využívány hlavně v oblasti průmyslu a vědy. Nejčastěji se používají k barvení mikroskopických preparátů, paliva, vazelíny, olejů, plastů, vosků, přidávají se do leštěnek nebo prostředků na podlahu. 4.1.1 Sudan I 2 Struktura: Obr. 1: Strukturní vzorec - Sudan I Sumární vzorec: C16H12N2O Mr: 248, 28 CAS: 842-07-9 4.1.2 Sudan II 3 Struktura: Obr. 2: Strukturní vzorec - Sudan II Sumární vzorec: C18H16N2O Mr: 276, 33 1 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 17, 24 2 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 5 3 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 6 11
CAS: 3118-97-6 4.1.3 Sudan III 4 Struktura: Obr. 3: Strukturní vzorec - Sudan III Sumární vzorec: C22H16N4O Mr: 352, 39 CAS: 85-86-9 4.1.4 Sudan IV 5 Struktura: Obr. 4: Strukturní vzorec - Sudan IV Sumární vzorec: C24H20N4O Mr: 380, 44 CAS: 85-83-6 4 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 7 5 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 8 12
4.1.5 Vlastnosti a toxikologie Sudanu I - IV 6 Sudany patří do skupiny azobarviv. Jsou rozpustné v tucích a v různých organických rozpouštědlech, např. acetonitril, methanol, tetrahydrofuran. LogP těchto Sudanů se pohybuje mezi 5 6, tudíž jsou vysoce lipofilní. UV/ViS spektra Sudanů jsou rozdílná. Vykazují absorpční maxima v těchto vlnových délkách: Sudan I: 475 nm, Sudan II: 489 nm, Sudan III: 503 nm a Sudan IV: 513-515 nm. Sigma Aldrich udává i další hodnoty pro Sudan II (604 nm), pro Sudan IV (375 nm) a pro Sudan I (418 nm a 476 nm). Sudany jsou analoga azobenzenu a jsou také azo-hydrazon prototropní tautomery (Obr. 5). Při působení UV záření E-forma azobenzenu přechází na Z- formu (Obr. 6 Bez působení UV světla se Z-forma vrátí zpět do E-formy. Sudany jsou slabé kyseliny. Avšak azo skupina v poloze 1 vytváří s fenolovou skupinou intramolekulární vodíkovou vazbu. Tato stabilizace neutrální molekuly Sudanu vede spíše k vyšším hodnotám pka. Sudany I a II mají hodnotu pka 11,65. Hodnoty dalších dvou Sudanů nejsou výrazně odlišné. Sudany tedy mohou být považovány za neutrální molekuly. Sudany vytváří metabolity, které se mění na několik aktivních mutagenů a karcinogenů v lidském těle, např. na aminy. Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (International Agency for Research on Cancer, zkráceně IARC) zařadila tyto Sudany do kategorie 3 neklasifikovaný karcinogen, a proto je zakázáno je používat pro barvení potravin v EU. Přesto se tato barviva mohou objevit ve výrobcích, které se dováží na evropský trh z jiných zemí, např. z Turecka, z Indie. Sudany se mohou objevit ve výrobcích obsahující koření chilli, například ve výrobcích, které obsahují okořeněný palmový olej, ve zmrazených masných výrobcích a v kořenících směsích. Obr. 5: Azo-hydrazon tautomerie 6 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 17 13
Obr. 6: Azobenzen a jeho E Z izomerie 4.1.6 Sudan Red G (Sudanová Červeň G) 7 Struktura: Obr. 7: Strukturní vzorec - Sudan Red G Sumární vzorec: C17H14N2O2 Mr: 278, 31 CAS: 1229-55-6 4.1.7 Sudan Red 7B (Sudan 7B) 8 Struktura: Obr. 8: Strukturní vzorec - Sudan Red 7B 7 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 16 8 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 11 14
Sumární vzorec: C24H21N5 Mr: 379, 46 CAS: 6368-72-5 4.1.8 Sudan Orange G (Sudanová Oranž G) 9 Struktura: Obr. 9: Strukturní vzorec - Sudan Orange G Sumární vzorec: C12H10N2O2 Mr: 214, 22 CAS: 2051-85-6 4.1.9 Para Red 10 Struktura: Obr. 10: Strukturní vzorec - Para Red Sumární vzorec: C16H11N3O3 Mr: 293, 28 CAS: 6410-10-2 4.1.10 Toluidine Red (Toluidinová Červeň) 11 Struktura: 9 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 12 10 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 9 11 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 10 15
Obr. 11: Strukturní vzorec - Toluidine Red Sumární vzorec: C17H13N3O3 Mr: 307, 30 CAS: 2425-85-6 4.2 Ostatní barviva 4.2.1 Congo Red (Kongo Červeň) 12 Struktura: Obr. 12: Strukturní vzorec - Congo Red Sumární vzorec: C32H22N6Na2O6S2 Mr: 696, 66 CAS: 573-58-0 4.2.2 Methyl Red (Methylová Červeň) 13 Struktura: 12 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 15 13 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 14 16
Obr. 13: Strukturní vzorec - Methyl Red Sumární vzorec: C15H15N3O2 Mr: 269, 30 CAS: 493-52-7 4.2.3 Phenol Red (Fenolová červeň) 14 Struktura: Obr. 14: Strukturní vzorec - Phenol Red Sumární vzorec: C19H14O5S Mr: 354, 38 CAS: 143-74-8 14 Kapitola byla vypracována ze zdroje: 13 17
4.3 Metody stanovení Sudanů 15 Ke stanovení Sudanů se nejčastěji využívají metody kapalinové chromatografie, hlavně HPLC a UHPLC. V následující tabulce jsou uvedeny příklady stanovení Sudanů. Vycházelo se z metod publikovaných v odborné literatuře. 15 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 18, 19, 20, 21, 22, 23 18
Stanovované Technika Kolona Mobilní fáze Typ eluce Průtok Nástřik Literatura látky S I S IV, Para HPLC UV-VIS ACE C18 (250 ACN:MeOH Isokratická 1 ml/min 25 μl 19 Red mm x 4,6 mm; 5 μm) (80:20, v/v) S I S IV, S Red UHPLC Agilent Elipse A: 0,1% vodný Gradientová: 0,4 ml/min neuveden 18 7B, S Orange G, Para Red, Toluidine Red MS/MS XDB C18 (2,1 mm, 50 mm; 1,8 μm) roztok kys. mrav. s 20mM octanem amonným B: ACN Počátek: 30% B; 0. 2. min: 30 50% B, 2. 6. min: 50 60% B; 6. 10. min: 60 90% B; 10. 16. min: 90% B; 16. 25. min: 30% B S I S IV HPLC UV RP-Phenomenex A: 0,1% vodný 0. 5. min: 75% B; 6. 13. min: 0,6 ml/min 20 μl 20 Gemini C18 (150 mm 3.0 mm; 5 μm) roztok kys. mrav. B: 0,1% roztok kys. mravenčí v ACN 100% B; 14. 19. min: 75% B S I S IV HPLC UV RP-C18, MeOH: Isokratická 1 ml/min neuveden 21 Lichrospher ODS (200 mm 4,6 mm; 5 μm) THF:voda (40:30:10, v/v/v) S I S IV, Para Red HPLC - UV Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm 150 mm, 5 μm) A: MeOH B: voda Gradientová: 0. 10. min: 85% A; 11. 25. min: 100% A 0,8 ml/min neuveden 22 Tabulka 1: Metody stanovení Sudanů 19
4.4 Chromatografie 16 Chromatografické metody patří k široce využívaným analytickým separačním metodám, které umožňují kvantitativní i kvalitativní hodnocení jednotlivých složek směsi. 4.4.1 Základní principy a rozdělení chromatografických metod Chromatografie využívá dělení analyzovaných látek mezi dvěma nemísitelnými fázemi. Jedna je nepohyblivá stacionární, která je v koloně nebo v plošné vrstvě, a druhá pohyblivá mobilní, která unáší separované látky. V průběhu chromatografického procesu dochází k postupnému vytváření rovnováhy dělených látek mezi těmito fázemi. K separaci dochází tedy na základě afinity jednotlivých dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. Chromatografické metody lze rozdělit podle: Charakteru mobilní fáze - plynová mobilní fáze je inertní plyn - kapalinová mobilní fáze je kapalina Podstaty separačního procesu - adsorpční - afinitní - gelová - iontově výměnná - rozdělovací V této práci byla využívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie High Performance Liquid Chromatography (HPLC). 4.4.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC je jedna z nejvyužívanějších analytických metod, která nachází využití v různých oblastech, např. v analýze léčiv, v analýze potravin, v monitorování lékových hladin, v kontrole léčiv, atd. 16 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 1, 2, 3
Je vhodná ke kvalitativnímu i kvantitativnímu hodnocení separovaných látek. Mezi její výhody patří hlavně rychlost a citlivost stanovení (podle typu detektoru), minimální spotřeba vzorku a možnost automatizace. HPLC lze rozdělit podle polarity mobilní a stacionární fáze na: Chromatografii na normálních fázích jako stacionární fáze se využívá polární silikagel a jako mobilní fáze se používají nepolární rozpouštědla (heptan, hexan, atd.). Chromatografii na reverzních fázích využívají se stacionární fáze, které jsou chemicky modifikované. Na inertní nosič (silikagel, oxid zirkoničitý, atd.) se chemickou vazbou nanesou radikály. Podle typu radikálu jde buď o nepolární fáze (radikál obsahuje uhlíkaté řetězce C8 až C18) nebo o středně polární fáze (radikál obsahuje tříuhlíkaté řetězce zakončené různými skupinami, které ovlivňují polaritu, např. -NH2, -CN, atd.). HPLC je možno realizovat za konstantního složení mobilní fáze v průběhu celé analýzy, tzv. isokratická eluce. Pokud se během analýzy programově mění složení mobilní fáze, jedná se o gradientovou eluci. 4.4.2.1 Schéma kapalinového chromatografu Obr. 15: Schéma kapalinového chromatografu Zásobníky mobilní fáze jsou nádoby vyrobené ze skla, kovu nebo plastu. Může být jeden nebo jich může být více. Mobilní fáze musí být odplyněna, buď použitím vakua, nebo probuláním inertním plynem (např. heliem). Nové sestavy mají zabudované degassery. 21
Vysokotlaké čerpadlo tlačí konstantní průtokovou rychlostí mobilní fázi nastaveného složení přes kolonu do detektoru. V HPLC se používají dva typy čerpadel. Jedná se buď o vysokotlaká čerpadla, u kterých se složky mobilní fáze mísí až za čerpadlem, nebo o nízkotlaká čerpadla, která pumpují už smísenou mobilní fázi. Oba typy čerpadel ale pracují za vysokého tlaku, až 40 MPa. Programovací jednotka nastavuje požadované složení mobilní fáze. Dávkovací zařízení umožňuje nadávkovat roztok vzorku na kolonu. Nové HPLC sestavy mají zabudované automatické dávkovače, tzv. autosamplery, které automaticky a přesně dávkují i malá množství vzorku. Na koloně dochází k rozdělení směsi na jednotlivé složky, které jsou unášeny mobilní fází do detektoru. U nových přístrojů je kolona umístěna v termostatovaném prostoru, což zajišťuje stálou a regulovatelnou teplotu analýzy. Detektor registruje průtok mobilní fáze a složek směsi, a tento průtok převádí na vhodný signál do počítače, kde je vhodným softwarem dále zpracováván. Na typu detektoru závisí citlivost a také selektivita analýzy. 4.4.2.2 Kolony v HPLC Kolona je 2 30 cm dlouhá trubice, která je vyráběná většinou z kovu. Je vyplněná sorbentem a tvoří stacionární fázi systému. Na délce kolony, jejím vnitřním průměru a velikosti částic sorbentu závisí rozlišení, šířka píku, doba analýzy a tlakový spád. Nejčastěji používané kolony jsou dlouhé 75 300 mm s průměrem 2 5 mm a velikostí částic 1,7 5 µm. V současné době převládá tendence zmenšování částic a používání kratších kolon, na kterých je analýza kratší a nižší je i spotřeba rozpouštědel. S kratší kolonou se ale sníží rozlišení a její účinnost. Pro ochranu kolony před mechanickými nečistotami jsou používány předkolony. Ty jsou nejčastěji umístěny před kolonou a využívají se zejména při analýze biologického materiálu. 22
4.4.2.2.1 Fused-Core technologie 17 Pro vylepšení stacionární fáze v kolonách se využívá technologie pevného jádra (Fused-Core), která poskytuje minimálně dvakrát větší rychlost a účinnost než u klasických kolon při polovičním zpětném tlaku. Okamžitě se může zlepšit rozlišení, kapacita a citlivost při současném snížení spotřeby rozpouštědel. Toto zvýšení výkonu lze aplikovat téměř na všechny běžné HPLC systémy. Částice Fused-Core se od tradičních porézních částic liší třemi charakteristickými znaky, které vylepšují výkonnost kolon. Jde o užší rozdělení částic, větší hustotu rozložených vrstev a kratší cestu difúze. Neporézní silikonové jádro (core) má velikost 1,7 µm a je obaleno 0,5 µm vrstvou slinutých silikonových nanočástic. Konečná velikost částic je tedy 2,7 µm. Obr. 16: Fused-Core částice a klasická porézní částice 4.4.2.3 Detektory v HPLC Na použitém detektoru závisí citlivost celého chromatografického systému. U všech detektorů jsou požadovány stejné vlastnosti. To jsou: vysoká citlivost, stabilita a reprodukovatelnost odezvy, linearita odezvy a minimální objem detekční cely. Detektory můžeme rozdělit na selektivní a univerzální. Selektivní detektor je schopný zaregistrovat jen látku, jejíž odezva nás zajímá a ostatní látky ze směsi se na chromatogramu neprojeví. Univerzální detektory jsou naopak schopny zaregistrovat všechny typy látek. Jednotlivé typy detektorů lze mezi sebou vzájemně kombinovat. 17 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 4, 25 23
Mezi nejčastější typy detektorů patří: Spektrofotometrické detektory jsou nejčastější detektory využívané k analýze léčiv. Jsou univerzální a velice citlivé. Měří absorbanci záření určité vlnové délky, které prochází jednotlivými složkami směsi. K detekci léčiv se nejvíce používá UV oblast spektra, méně viditelná oblast a minimálně infračervené oblast spektra. V praxi se uplatňují především UV detektory, event. UV-VIS detektory. Nejpoužívanější UV detektory: UV detektor s fixní vlnovou délkou, která je nejčastěji 254 280 nm, při níž absorbuje většina léčiv. UV-VIS detektor s proměnnou vlnovou délkou, která je libovolně měnitelná dle potřeb. Scanning UV detektor, který snímá během několika sekund absorpční spektrum v maximu hodnoceného píku. Diode array detektor (DAD detektor), který snímá celé absorpční spektrum, hodnotí látky současně při několika vlnových délkách a porovnává poměry absorbancí. Fluorimetrické detektory se využívají u látek, které vykazují fluorescenci. Látky, které nefluoreskují lze často derivatizací převést vhodnými činidly na fluoreskující deriváty. Jsou méně univerzální, než UV detektory, ale citlivější a selektivnější. Elektrochemické detektory se uplatňují při hodnocení látek, u kterých lze využít dějů, které souvisejí s elektrochemickou reakcí probíhající na rozhraní elektroda eluent. Proměřují elektrochemickou veličinu, jejíž hodnota je závislá na koncentraci analyzované látky. Mezi elektrochemické detektory patří amperometrický, polarografický a voltmetrický detektor. Jsou značně citlivé, ale nevýhodou je, že je nelze univerzálně použít u všech látek. Refraktometrické detektory měří rozdílný index lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem vytékajícím z kolony, obsahujícím analyzovanou látku. Jsou univerzální. Ale nevýhodou je nutnost termostatování a malá citlivost. Hmotnostní detektor se čím dál tím více častěji využívá ke spojení s HPLC. Nevýhodou je ale jeho finanční náročnost. 24
4.5 Možnosti on-line úpravy vzorků v HPLC systému Úprava vzorků před vlastní analýzou je jednou z nejdůležitějších součástí celého analytického procesu a může významně ovlivnit kvalitu dosažených analytických výsledků. V současné analytické praxi existuje velké množství různých extrakčních postupů, které jsou založeny na extrakci analytu do kapalné fáze (LLE), nebo na extrakci analytu na tuhou fázi (SPE). Moderní modifikace těchto extrakčních metod umožňují minimalizovat spotřebu vzorků a rozpouštědel a některé postupy i částečně automatizovat. Reálné provedení online úpravy vzorků přímo v analytických systémech je však pro většinu těchto extrakčních technik omezené a vyžaduje větší či menší množství kroků úpravy vzorků provedených před vlastní analýzou. Jednou z možností jak maximálně zjednodušit úpravu vzorku před vlastní analýzou je provedení tzv. on-line SPE extrakce přímo v chromatografickém systému s využitím techniky přepínání kolon. V této modifikaci HPLC systému jedna kolona (kolonka) funguje jako extrakční kolona pro adsorbci analytů, kde probíhá přečištění vzorku od balastní matrice, zatímco druhá (delší) analytická chromatografická kolona slouží k vlastní separaci analytů. Systém dvou kolon je propojen přes šesticestný selekční ventil, který pomocí dvou poloh reguluje tok dvou mobilních fází na analytickou nebo na extrakční kolonu a umožní po přepnutí do jedné z poloh spojit obě kolony do toku jedné mobilní fáze. Analýza tedy probíhá ve dvou krocích: v prvním kroku je vzorek pomocí autosampleru a jedné pumpy s promývací mobilní fází dávkován na extrakční kolonu, kde po určitou dobu probíhá extrakce analytů a zároveň vymývání balastní matrice, která teče přímo do odpadu. V této době je druhá, analytická kolona kondicionována mobilní fází. Po určité době (většinou se jedná o interval 1-5 minut), je pomocí šesticestného selekčního ventilu tok promývací mobilní fáze přepnut přímo do odpadu a extrakční kolona je otočením poloh ventilu přepojena do toku elučně silnější analytické mobilní fáze, která směřuje přímo na analytickou kolonu. Dochází tak k eluci zadržených analytů z extrakční kolonky přímo na analytickou kolonu, kde je provedena separace látek pomocí analytické mobilní fáze (viz. schema č. 1). Jednotlivé kroky čas přepnutí ventilu (doba promývání), rychlost toku na extrakční a analytické koloně, eluční síla obou mobilních fází aj. je třeba nutné pečlivě optimalizovat, aby 25
nedocházelo ke ztrátě analytů během extrakce či k přenosu balastních látek na analytickou kolonu, popř. k průtokové či tlakové inkompatibilitě na obou kolonách, která by způsobila nestabilitu nulové linie detektoru. V této diplomové práci byly testovány pouze základní podmínky pro on-line SPE extrakci pomocí krátké předkolonky s reverzní fází C-18, kde jako promývací mobilní fáze byla použita jednoduchá směs 5% acetonitrilu s vodou. Vzhledem k lipofilní povaze analyzovaných látek zajišťovaly tyto podmínky dostatečnou retenci na extrakční koloně. Schéma č. 1: Znázornění HPLC systému s technikou přepínání kolon pro on-line SPE extrakci. (schéma převzato z přednášek předmětu Vybrané separační metody) 26
4.6 Validace analytických metod 18 Validace analytické metody nám potvrzuje, že daná metoda je vhodná pro dané stanovení. Cílem validace je určit podmínky, za kterých je zkušební postup použitelný a zjistit stejnou spolehlivost při opakovaném použití v jedné nebo v různých laboratořích. Validace se provádí při vývoji nové metody, při její změně nebo při přenosu dat do jiné laboratoře. Sledují se tyto parametry: Správnost (accuracy) Přesnost (precision) Selektivita, specifita (specifiky) Detekční limit (limit of detection, LOD) Kvantitativní limit (limit of quantitation, LOQ) Linearita (linearity) Rozsah (range) Robustnost (robustness) Test způsobilosti (system suitability test) 4.6.1 Správnost Vyjadřuje shodu mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou. Zjišťuje se analýzou nejméně šesti vzorků a vyjadřuje se jako rozdíl správné a naměřené hodnoty nebo jako výtěžnost: Výtěžnost (recovery) = 100 x nalezená hodnota / správná hodnota 4.6.2 Přesnost Vyjadřuje shodu mezi výsledky získanými opakovaným proměřováním jednoho vzorku. Jeden vzorek se obvykle šestkrát analyzuje stejným postupem, včetně přípravy vzorku. Přesnost se vyjadřuje jako relativní směrodatná odchylka těchto šesti stanovení. Podle podmínek analýzy se rozlišují tři úrovně přesnosti: Opakovatelnost (repeability) je opakování jedním pracovníkem na stejném přístroji. 18 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 1, 2 27
Mezilehlá přesnost (intermediate precision), při níž se analýza provádí různými pracovníky na různých přístrojích, v různé dny, ale se stejným vzorkem a ve stejné laboratoři. Reprodukovatelnost (reproducibility), u které je provedení stejné jako u mezilehlé přesnosti, ale probíhá v různých laboratořích. 4.6.3 Selektivita, specifika Je schopnost metody změřit danou látku správně a specificky i v přítomnosti jiných možných látek, jako jsou nečistoty, rozkladné produkty, další účinné látky, atd. 4.6.4 Detekční limit Vyjadřuje citlivost metody. Je to nejnižší koncentrace látky, kterou můžeme detekovat, ale nestanovuje se kvantitativně. U instrumentálních metod se může detekční limit určit jako koncentrace látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 3. 4.6.5 Kvantitativní limit Je také parametr citlivosti metody. Je to nejnižší koncentrace látky, která je stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Bývá to obvykle trojnásobek detekčního limitu. Vyjadřuje se jako koncentrace s poměrem signálu k šumu s hodnotou 10. 4.6.6 Linearita Je schopnost metody poskytovat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky. Obvykle se stanovuje minimálně pět různých koncentrací v rozmezí 50 150% deklarovaného obsahu. Ověření linearity se provádí na pěti různých koncentracích látky. Vhodné je pracovat s roztoky standardů. Po proměření se sestaví kalibrační křivka a určí se její směrnice. 4.6.7 Rozsah Odvozuje se z linearity metody a myslí se jím koncentrační hranice, ve kterých může být metoda používána. Dolní hranicí může být např. detekční limit a horní může být určen maximální odezvou. 28
4.6.8 Robustnost Vyjadřuje míru vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy. Sbírají se poznatky z vývoje metody a cílem je upozornit na podmínky, které mohou ovlivnit výsledky. U HPLC se zjišťuje vliv složení mobilní fáze, teplota na koloně, rychlost průtoku, rozdíly mezi kolonami od různých výrobců apod. 4.6.9 Test způsobilosti systému Tímto testem se prokazuje, že daná metoda je vhodná k použití a není potřebná nová validace (např. při novém použití metody). Test způsobilosti zahrnuje zjištění parametrů, které jsou uvedeny v následující tabulce: SST parametr Doporučený limit Počet teoretických pater N > 2000 Asymetrie píků / faktor symetrie T = 0,8-1,5 Rozlišení píků Rij > 1,5 Kapacitní faktor k > 2 Opakovatelnost - retenční čas RSD < 1% (min. 5 nástřiků) Opakovatelnost - ploch píku RSD < 1% (min. 5 nástřiků) Tabulka 2: Parametry zjišťované při SST Počet teoretických pater tento parametr vyjadřuje účinnost kolony. Vzorec pro jeho výpočet je: t R N 5,54 wh Asymetrie píků Tento parametr vyjadřuje tendenci látky zadržovat se na koloně a je důležitý pro výpočet plochy píků. Vzorec pro výpočet je: w A S 2d Rozlišení píků je vzdálenost mezi píky dvou složek analyzované směsi. Doporučený limit rozlišení ( > 1,5 odpovídá rozdělení píků až na základní linii). Vzorec pro výpočet je: 0,05 2 29
t R2 tr 1 Rs 2 w w Kapacitní faktor vyjadřuje kapacitu kolony a je mírou sorpce analytu na koloně. Vzorec pro výpočet je: D m t 1 R t t M 2 M Vysvětlivky: tr - retenční čas W - šířka píku v polovině jeho výšky W0,05 - šířka píku ve dvacetině jeho výšky tm - mrtvý čas d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky 30
5 Experimentální část 5.1 Materiál a Pomůcky Standardy barviv: Sudan I 97%, Sigma Aldrich Sudan II 90%, Sigma Aldrich Sudan III 90%, Sigma Aldrich Sudan IV 80%, Sigma Aldrich Sudan Red G, Sigma Aldrich Sudan Red 7B 95%, Sigma Aldrich Sudan Orange G 85%, Sigma Aldrich Para Red 95%, Sigma Aldrich Toluidine Red 70%, Sigma Aldrich Phenol Red, Sigma Aldrich Methyl Red, Sigma Aldrich Congo Red 40%, Sigma Aldrich Chemikálie: Acetonitril, (HPLC Gradient grade) Dimethylsulfoxid, p.a. Chloroform, p.a. Kyselina mravenčí, p.a. Methanol (HPLC Gradient grade) Tetrahydrofuran (HPLC Gradient grade) Destilovaná voda (Millipore systém) Přístroje a pomůcky: Chromatografická sestava: Pumpy: Degasser: Autosampler: Termostat kolony: Shimadzu LC-10 LC-10 AD VP DGU-14 A SIL-HTA CTO-10 AV VP 31
Chromatografická sestava: Detektor: Vyhodnocení: Ultrazvuková lázeň: Analytické váhy: Prominence LC 20-AD s DAD detektorem a systémem přepínání ventilů DAD detektor SPD-M10A VP Chromatografický software LC Solution Bandelin SONOREX RK52, Berlín, SRN Sartorius 2004 MP, SRN Předkolona: Ascentis Express C18 (5 x 4,6 mm; 2,7 μm) Kolony: Ascentis Express F5 (10 cm x 4,6 mm; 2,7 μm) Ascentis Express F5 (10 cm x 3 mm; 2,7 μm) Ascentis Express C18 (10 cm x 3 mm; 2,7 μm) Ascentis Express RD Amide (10 x 3 mm; 2,7 μm) 5.2 Příprava roztoků standardů 5.2.1 Příprava zásobních roztoků Byly připraveny zásobní roztoky standardů barviv. Navážky standardů byly rozpuštěny a doplněny po rysku rozpouštědlem do 50 ml odměrných baněk. Navážka (g) Rozpouštědlo Koncentrace (g/l) Červeň fenolová 0,0528 Methanol 1,056 Červeň kongo 0,0508 Dimethysulfoxid 1,016 Červeň methylová 0,0495 Methanol 0,990 Para red 0,0506 Tetrahydrofuran 1,012 Sudan I 0,0497 Methanol 0,994 Sudan II 0,0546 Methanol 1,092 Sudan III 0,0515 Tetrahydrofuran 1,030 Sudan IV 0,0504 Tetrahydrofuran 1,008 Sudan orange G 0,0507 Tetrahydrofuran 1,014 32
Sudan red 7B 0,0525 Tetrahydrofuran 1,050 Sudanová červeň 0,0522 Tetrahydrofuran 1,044 Toluidine red 0,0509 Chloroform 1,018 Tabulka 3: Koncentrace zásobních roztoků barviv 5.2.2 Příprava roztoků pro optimalizaci Z každého zásobního roztoku standardu bylo odměřeno 100 μl do vialky a doplněno 900 μl rozpouštědla, ve kterém bylo barvivo rozpuštěno. Byl také připraven směsný roztok, kdy se do jedné vialky odměřilo z každého zásobního roztoku 100 μl. 5.2.3 Příprava roztoků pro kalibraci Roztoky pro kalibraci byly připraveny jako směsné roztoky z osmi zásobních roztoků. Z každého zásobního roztoku bylo odměřeno 5 ml (8x5 = 40ml) a doplněno THF do 50 ml odměrných baněk. Z každé této odměrné baňky bylo odměřeno postupně od 1,5 ml do 0,05 ml a doplněno methanolem do 20 ml odměrných baněk. Koncentrace (mg/l) Odměřené Sudan I Sudan II Sudan III Sudan IV množství (ml) Roztok č. 1 1,50 7,455 8,190 7,725 7,560 Roztok č. 2 1,25 6,212 6,825 6,437 6,300 Roztok č. 3 1,00 4,970 5,460 5,150 5,040 Roztok č. 4 0,75 3,727 4,095 3,862 3,780 Roztok č. 5 0,50 2,485 2,730 2,575 2,520 Roztok č. 6 0,25 1,242 1,365 1,287 1,260 Roztok č. 7 0,10 0,497 0,546 0,515 0,504 Roztok č. 8 0,05 0,248 0,273 0,257 0,252 Tabulka 4: Příprava pracovních roztoků pro kalibraci Koncentrace (mg/l) Odměřené Para red Sudan Sudan Toluidine množství (ml) orange G red 7B red 33
Roztok č. 1 1,5 7,590 7,605 7,875 7,635 Roztok č. 2 1,25 6,325 6,337 6,562 6,362 Roztok č. 3 1,0 5,060 5,070 5,250 5,090 Roztok č. 4 0,75 3,795 3,802 3,937 3,817 Roztok č. 5 0,5 2,530 2,535 2,625 2,545 Roztok č. 6 0,25 1,265 1,267 1,312 1,272 Roztok č. 7 0,1 0,506 0,507 0,525 0,509 Roztok č. 8 0,05 0,253 0,253 0,262 0,254 Tabulka 5: Příprava pracovních roztoků pro kalibraci 5.3 Optimalizace chromatografických podmínek Optimalizace chromatografických podmínek je výběr takových podmínek chromatografické analýzy, při kterých dojde k co nejlepší separaci složek směsi. Cílem optimalizace metody bylo najít vhodné podmínky pro současné stanovení sudanových barviv. Bylo nutné najít vhodnou kolonu, mobilní fázi a vlnovou délku pro detekci. Analýza látek probíhala při průtoku 1 ml/min a byl zvolen nástřik 5 μl. 5.3.1 Volba vlnové délky detektoru Pro analýzu byl jako detektor zvolen DAD detektor. Pomocí DAD detektoru byla změřena a stanovena vlnová délka, která by umožnovala detekci všech stanovovaných analytů. Pro detekci byly zvoleny dvě vlnové délky podle absorpčních maxim jednotlivých analytů, tzn. 426 nm pro Sudan Orange G a 500 nm pro ostatní barviva. 34
5.3.1.1 Absorpční spektrum: Sudan I Obr. 17: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan I 35
5.3.1.2 Absorpční spektrum: Sudan II Obr. 18: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan II 36
5.3.1.3 Absorpční spektrum: Sudan III Obr. 19: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan III 37
5.3.1.4 Absorpční spektrum: Sudan IV Obr. 20: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan IV 38
5.3.1.5 Absorpční spektrum: Para Red Obr. 21: Absorpční spektrum v mobilní fázi Para Red 39
5.3.1.6 Absorpční spektrum: Sudan Red 7B Obr. 22: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan Red 7B 40
5.3.1.7 Absorpční spektrum: Sudan Orange G Obr. 23: Absorpční spektrum v mobilní fázi Sudan Orange G 41
5.3.1.8 Absorpční spektrum: Toluidine Red Obr. 24: Absorpční spektrum v mobilní fázi Toluidine Red 5.3.2 Volba kolony a mobilní fáze Celkem byly testovány čtyři kolony, které jsou uvedeny v Kapitole 5.1 a čtyři typy gradientů mobilní fáze, které jsou uvedeny v Tabulkách 6-9. Z chromatogramů uvedených níže je patrné, že některé podmínky jsou pro separaci vhodné více, některé méně. Z výsledků jednotlivých analýz bylo možno vybrat větší počet analýz, které poskytují optimální podmínky pro separaci. Nakonec byly vybrány separační podmínky, které jsou zobrazeny na Obrázku 34. Na následujících tabulkách jsou dokumentovány jednotlivé typy gradientů. Gradient 01 Složení mobilní fáze (%) Čas (min) Vodná fáze Organická fáze 42
2. 50 50 12. 10 90 17. 5 95 19. 22. 50 50 Tabulka 6: Složení a změny mobilní fáze při použití gradientu č. 1 Gradient 02 Složení mobilní fáze (%) Čas (min) Vodná fáze Organická fáze 2. 50 50 11. 5 95 18. 100 0 19. 22. 50 50 Tabulka 7: Složení a změny mobilní fáze při použití gradientu č. 2 Gradient 03 Složení mobilní fáze (%) Čas (min) Vodná fáze Organická fáze 2. 50 50 17. 10 90 18. 5 95 19. 22. 50 50 Tabulka 8: Složení a změny mobilní fáze při použití gradientu č. 3 Gradient 04 Složení mobilní fáze (%) Čas (min) Vodná fáze Organická fáze 2. 60 40 17. 10 90 18. 5 95 19. 22. 60 40 Tabulka 9: Složení a změny mobilní fáze při použití gradientu č. 4 43
Na následujících obrázcích jsou dokumentovány separace na jednotlivých kolonách za různých testovaných podmínek mobilních fází. mau 400 350 300 250 Č. Methyl Toluidine Red 200 150 100 50 S Orange G Č. Sudan S I + Para Red S II S III S IV S Red 7B 0-50 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 25: Podmínky separace: Ascentis Express F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 03 - organická fáze: ACN:THF (1:2), vodná fáze: kyselina mravenčí (ph 3) mau 225 200 175 150 S Orange G 125 100 75 50 25 Č. Sudan S I Toluidine Red S II S III S IV S Red 7B 0-25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 26: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 03 - organická fáze: ACN:THF (1:5), vodná fáze: voda 44
600 mau 550 500 450 400 350 Č. Methyl Toluidine Red 300 250 200 150 100 50 S Orange G Č. Fenol Para Red S I + Č. Sudan S II S III S IV S Red 7B 0-50 -100 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 27: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 03 - organická fáze: ACN, vodná fáze: kyselina mravenčí (ph 3) 650 mau 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 S Orange G Č. Methyl S I + Prara Red + Č. Sudan Toluidine Red S II S III S IV + S Red 7B 0-50 -100 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 28: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 03 - organická fáze: ACN:MeOH (1:1), vodná fáze: kyselina mravenčí (ph 3) 45
mau 500 450 400 350 Č. Methyl 300 250 200 150 100 50 S Orange G Č. Sudan + S I + Para Red Toluidine Red S II S III S IV S Red 7B 0-50 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 29: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 04 - organická fáze: ACN:THF (1:5), vodná fáze: kyselina mravenčí (ph 3) 70 mau 60 50 Toluidine Red 40 30 20 S Orange G Para Red S I + Č. Sudan S II S III S IV S Red 7B 10 0-10 -20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 30: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 01 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 46
100 90 80 70 60 Č. Methyl Toluidine Red 50 40 30 20 10 S Orange G Para Red S I Č. Sudan S II S III S Red 7B S IV 0-10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Obr. 31: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 4,6 mm, 2,7 µm; gradient 04 - organická fáze: ACN, vodná fáze: kyselina mravenčí 0,1 % 55 mau 50 45 40 35 30 Č. Methyl Para Red Toluidine Red 25 20 15 10 5 S. Orange G Č. Sudan S I S II S III S IV S Red 7B 0-5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 32: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 4,6 mm, 2,7 µm; gradient 02 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 47
50 mau 45 40 35 30 Toluidine Red 25 20 Č. Methyl 15 10 5 S. Orange G Ć. Sudan S I S II S III S IV S Red 7B 0-5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 33: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 4,6 mm, 2,7 µm; gradient 03 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 120 mau 110 100 90 80 70 Toluidine Red 60 50 40 30 20 10 S. Orange G Para Red S I Č. Sudan S II S III S IV S Red 7B 0-10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 34: Podmínky separace: Ascentis F5 100 x 4,6 mm, 2,7 µm; gradient 04 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 48
80 mau 70 60 50 40 30 20 10 S. Orange G Č. Methyl Para Red Č. Sudan Toluidine Red S I S II S III S Red 7B S IV 0-10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min Obr. 35: Podmínky separace: Ascentis Express C18 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 01 - organická fáze: ACN, vodná fáze: kyselina mravenčí 150 mau 125 100 75 50 S Orange G + Č. Methyl S I S II S III S IV S Red 7B 25 0-25 0. 1. 2. 3. 4.0 5. 6. 7. 8. 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min 0 0 0 0 0 0 0 0 Obr. 36: Podmínky separace: Ascentis Express C18 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 01 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 49
45 mau 40 35 30 25 20 S Orange G Para Red S Červeň S I Toluidine Red S II S III S IV S Red 7B 15 10 5 0-5 -10 0. 1. 2. 3. 4.0 5. 6. 7. 8. 9. 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17. min 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Obr. 37: Podmínky separace: Ascentis RP Amide 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 01 - organická fáze: ACN, vodná fáze: voda 200 mau 175 150 125 S Orange G S I + Toluidine Red 100 75 50 S Orange G Para Red Č. Sudan S II S III S Red 7B S IV 25 0-25 0.0 1.0 2. 3.0 4.0 5. 0 0 Obr. 38: Podmínky separace: Ascentis RP Amide 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 01 - organická fáze: ACN, vodná fáze: kyselina mravenčí 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min 50
mau 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 S Orange G Para Red S II S III S Red 7B S IV 0-10 -20 0. 1. 2. 3. 4.0 5. 6. 7. 8. 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min 0 0 0 0 0 0 0 0 Obr 39 :Podmínky separace: Ascentis RP Amide 100 x 3,0 mm, 2,7 µm; gradient 02 - organická fáze: MeOH, vodná fáze: voda 5.4 Souhrn optimálních podmínek Kolona: Ascentis Express F5 100 x 4,6 mm, velikost částic 2,7 µm. Detekce: 500 nm a 426 nm Dávkovaný objem vzorku: 5 μl Rychlost průtoku mobilní fáze: 1 ml/min Mobilní fáze: organická fáze: ACN, vodná fáze: voda Gradientová eluce: Gradient 04 Složení mobilní fáze (%) Čas (min) Vodná fáze Organická fáze 2. 60 40 17. 10 90 18. 5 95 19. 22. 60 40 Tabulka 10: Složení a změny mobilní fáze při použití gradientu č. 4 Kolonka pro on-line SPE extrakci: Ascentis Express C18 (5 x 4,6 mm, 2,7 μm) Promývací mobilní fáze: 5% roztok acetonitrilu s vodou, průtok 1 ml/min Čas přepnutí ventilu na analytickou kolonu: 2 minuty 51
5.5 Základní validace metody Pro základní validaci metody nebyly použity všechny standardy barviv, ale jen osm standardů, které se podařilo nejlépe separovat. Jsou to: Para Red, Sudan I, Sudan II, Sudan III, Sudan IV, Sudan Orange G, Sudan Red 7B, Toluidine Red. 5.5.1 Test vhodnosti chromatografického systému (System suitability test SST) Obr. 40: Chromatogram získaný při SST 5.5.1.1 Účinnost chromatografického systému (Počet teoretických pater - N) Analyzované látky tr (min) N Sudan Orange G 6,107 17392 Para Red 9,241 46226 Sudan I 9,500 39004 Toluidine Red 10,065 74259 Sudan II 11,220 75303 Sudan III 12,314 110641 Sudan IV 13,875 158068 52
Sudan red 7B 14,313 183952 Tabulka 11: Hodnoty parametrů získaných při SST Hodnoty byly automaticky počítány chromatografickým softwarem. 5.5.1.2 Asymetrie chromatografických píků (T) Analyzované látky w0,05 T Sudan Orange G 0,246 2,106 Para Red 0,191 1,231 Sudan I 0,204 1,284 Toluidine Red 0,165 1,199 Sudan II 0,188 1,138 Sudan III 0,181 1,248 Sudan IV 0,168 1,204 Sudan red 7B 0,155 1,219 Tabulka 12: Hodnoty parametrů získaných při SST 5.5.1.3 Rozlišení chromatografických píků (R) Analyzované látky R S Org G - Para Red 26,831 Para Red - S I 1,426 S I - Tol Red 3,318 Tol Red - S II 7,424 SII - S III 7,021 S III - S IV 10,854 S IV - S red 7B 3,202 Tabulka 13: Hodnoty parametrů získaných při SST Požadavek pro R > 1,5 byl splněn pro všechny píky, kromě píků Para Red a S I. 53
5.5.1.4 Linearita Pro stanovení linearity bylo použito 8 kalibračních roztoků o různé koncentraci, jejichž příprava je popsána v kapitole 5.2.3. U každého kalibračního roztoku byly provedeny 3 nástřiky na kolonu. Z těchto 3 měření byla stanovena průměrná hodnota plochy píku pro každou koncentraci. Závislost průměrných ploch píků kalibračních roztoků na jejich koncentraci byla vyhodnocena metodou lineární regrese. 5.5.1.4.1 Para Red Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,253 49769 0,506 103246 1,265 265757 2,530 548447 3,795 839464 5,060 1060765 6,325 1384110 7,590 1635758 Tabulka 14: Výsledky testu linearity - Para Red průměrná plocha píku 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 c (mg/l) Obr. 41: Graf lineární regrese - Para Red Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 216734,9 ± 2404,757 Abs. Člen q = -4343,663 ± 10271,03 54
Korelační koef. r = 0,999631 Reziduální odch. s = 17443,26 Tabulka 15: Parametry lineární regrese - Para Red 5.5.1.4.2 Sudan I Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,248 37792 0,497 73159 1,242 206095 2,485 421619 3,727 640436 4,970 810079 6,212 1052842 7,455 1248897 Tabulka 16: Výsledky testu linearity - Sudan I průměrná plocha píku 1500000 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 c (mg/l) Obr. 42: Graf lineární regrese - Sudan I Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 168404,3 ± 1826,189 Abs. člen q = -3589,268 ± 7661,161 Korelační koef. r = 0,999647 Reziduální odch. s = 13010,92 Tabulka 17: Parametry lineární regrese Sudan I 55
5.5.1.4.3 Sudan II Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,273 40321 0,546 78578 1,365 194410 2,730 403030 4,095 611987 5,460 775100 6,825 1010436 8,190 1190727 Tabulka 18: Výsledky testu linearity - Sudan II průměrná plocha píku 1500000 1000000 500000 0 0 5 10 c (mg/l) Obr. 43: Graf lineární regrese Sudan II Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 145951,4 ± 1609,021 Abs. člen q = 169,6545 ± 7415,61 Korelační koef. r = 0,999636 Reziduální odch. s = 12593,9 Tabulka 19: Parametry lineární regrese - Sudan II 56
5.5.1.4.4 Sudan III Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,257 58574 0,515 112242 1,287 277866 2,575 578500 3,862 885505 5,150 1140633 6,437 1491874 7,725 1761442 Tabulka 20: Výsledky testu linearity - Sudan III průměrná plocha píku 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 5 10 c (mg/ml) Obr. 44: Graf lineární regrese - Sudan III Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 229386,7 ± 2365,171 Abs. člen q = -9075,936 ± 10281,64 Korelační koef. r = 0,999681 Reziduální odch. s = 17461,26 Tabulka 21: Parametry lineární regrese - Sudan III 57
5.5.1.4.5 Sudan IV Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,252 51092 0,504 103388 1,260 250813 2,520 514716 3,780 790047 5,040 1018372 6,300 1333316 7,560 1574075 Tabulka 22: Výsledky testu linearity - Sudan IV průměrná plocha píku 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 c (mg/l) Obr. 45: Graf lineární regrese - Sudan IV Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 209269 ± 2185,644 Abs. člen q = -7455,748 ± 9298,277 Korelační koef. r = 0,999673 Reziduální odch. s = 15791,23 Tabulka 23: Parametry lineární regrese - Sudan IV 58
5.5.1.4.6 Sudan Orange G Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,253 31135 0,507 74139 1,267 186830 2,535 376090 3,802 619350 5,070 705060 6,337 899419 7,605 1037336 Tabulka 24: Výsledky testu linearity - Sudan Orange G průměrná plocha píku 1500000 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 c (mg/l) Obr. 46: Graf lineární regrese - Sudan Orange G Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 138331,6 ± 4943,243 Abs. člen q = 17764,67 ± 21154,97 Korelační koef. r = 0,996191 Reziduální odch. s = 35927,4 Tabulka 25: Parametry lineární regrese - Sudan Orange G 59
5.5.1.4.7 Sudan Red 7B Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,262 31409 0,525 59836 1,312 157368 2,625 340595 3,937 548976 5,250 733990 6,562 988925 7,875 1174040 Tabulka 26: Výsledky testu linearity - Sudan Red 7B průměrná plocha píku 1500000 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 c (mg/l) Obr. 47: Graf lineární regrese - Sudan Red 7B Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 151677,7 ± 3168,98 Abs. člen q = -33115,3 ± 14043,37 Korelační koef. r = 0,998693 Reziduální odch. s = 23849,8 Tabulka 27: Parametry lineární regrese - Sudan Red 7B 60
5.5.1.4.8 Toluidine Red Koncentrace Plocha píku (mg/l) 0,254 28901 0,509 61218 1,272 147985 2,545 308413 3,817 471055 5,090 593524 6,362 772903 7,635 939145 Tabulka 28: Výsledky testu linearity - Toluidine Red průměrná plocha píku 1000000 500000 0 0 5 10 c (mg/l) Obr. 48: Graf lineární regrese - Toluidine Red Statistické parametry pro regresi : y = k x + q Počet bodů n = 8 Odhad chyby Směrnice k = 122114,2 ± 1582,67 Abs. člen q = -4160,958 ± 6799,871 Korelační koef. r = 0,999496 Reziduální odch. s = 11548,2 Tabulka 29: Parametry lineární regrese - Toluidine Red 61
5.5.1.5 Opakovatelnost V testu na opakovatelnost bylo provedeno 6 nástřiků pro vybrané 3 koncentrace látek. Z ploch píků analytů byly vypočítány směrodatné odchylky. 0,1 ml směsného Průměr SD RSD (%) roztoku v 20 ml - Roztok A Sudan Orange G 74189 900 1,21% Para red 104211 1582 1,52% Sudan I 73072 209 0,29% Toluidine Red 61261 212 0,35% Sudan II 78829 721 0,91% Sudan III 111756 1092 0,98% Sudan IV 103061 875 0,85% Sudan Red 7B 60081 517 0,86% Tabulka 30: Výsledky testu na opakovatelnost Požadavek na relativní směrodatnou odchylku < 1% nebyl splněn pro dvě látky. 0,5 ml směsného Průměr SD RSD (%) roztoku v 20 ml - Roztok B Sudan Orange G 376785 3688 0,98% Para red 554976 1554 0,28% Sudan I 425379 1193 0,28% Toluidine Red 312953 1163 0,37% Sudan II 409512 1291 0,32% Sudan III 599462 5169 0,86% Sudan IV 537353 5991 1,11% Sudan Red 7B 363790 4913 1,35% Tabulka 31: Výsledky testu na opakovatelnost Požadavek na relativní směrodatnou odchylku < 1% nebyl splněn pro dvě látky. 62
1,5 ml směsného Průměr SD RSD (%) roztoku v 20 ml - Roztok C Sudan Orange G 1086506 16810 1,55% Para red 1641029 1214 0,07% Sudan I 1257584 4640 0,37% Toluidine Red 912438 3899 0,43% Sudan II 1207026 7762 0,64% Sudan III 1805486 20267 1,12% Sudan IV 1609218 14040 0,87% Sudan Red 7B 1253376 7520 0,60% Tabulka 32: Výsledky testu na opakovatelnost Požadavek na relativní směrodatnou odchylku < 1% nebyl splněn pro dvě látky. 63
6 Závěr Byly navrženy podmínky pro HPLC stanovení sudanových barviv. Byla vyvinuta metoda pro separaci barviv se současnou on-line SPE extrakcí v systému přepínání kolon a byla provedena částečná validace (SST, linearita a opakovatelnost) této metody. Vyvinutá metoda pro stanovení barviv zahrnuje tyto optimální podmínky: Kolona: Ascentis Express F5 100 x 4,6, velikost částic 2,7 µm. Detekce: 500 nm a 426 nm Dávkovaný objem vzorku: 5 μl Rychlost průtoku mobilní fáze: 1 ml/min Mobilní fáze: organická fáze: ACN, vodná fáze: voda Gradientová eluce: Gradient 04 (Tabulka 10) Kolonka pro on-line SPE extrakci: Ascentis Express C18 (5 x 4,6 mm, 2,7 μm) Promývací mobilní fáze: 5% roztok acetonitrilu s vodou, průtok 1 ml/min Čas přepnutí ventilu na analytickou kolonu: 2 minuty Při testování vhodnosti chromatografického systému byla vyjádřena opakovatelnost jako relativní směrodatná odchylka ve třech různých koncentracích směsného roztoku. Pro Roztok A se relativní směrodatná odchylka pohybovala v rozmezí 0,29% - 1,52%. Pro Roztok B se relativní směrodatná odchylka pohybovala v rozmezí 0,28% - 1,35%. Pro Roztok C se relativní směrodatná odchylka pohybovala v rozmezí 0,07% - 1,55%. U testování parametru linearity ve sledovaném koncentračním rozmezí byl změřen korelační koeficient. Pro Para Red je jeho hodnota 0,99963, pro Sudan I 0,99965, pro Sudan II 0,99964, pro Sudan III 0,99968, pro Sudan IV 0,99967, pro Sudan Orange G: 0,99619, pro Sudan Red 7B 0,99950 a pro Toluidine Red 0,99950. 17 000. Účinnost kolony vyjádřená jako počet teoretických pater N byla větší než Asymetrie chromatografických píků T se pohybovala v rozmezí 0,8-2,0 kromě látky Sudan Orange G. Rozlišení R bylo větší než 1,5 kromě píků Para Red a S I. Vyvinutá metoda bude dále testována pro on-line úpravu a separaci potravinových vzorků potenciálně obsahujících tyto zakázaná barviva. 64