MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ LÉKAŘSKÁ FAKULTA Interní hematoonkologická klinika Oddělení klinické hematologie FN Brno SYSTÉM KOMPLEXNÍ PÉČE O NEMOCNÉ S ANTIFOSFOLIPIDOVYMI PROTILÁTKAMI Disertační práce MUDr. Alena Buliková Brno, 2005 Tel. 549 491 328 k h vna med. muniiö
Poděkování Je mi milou povinností poděkovat všem, kteří mi při vzniku a zpracování kandidátské disertační práce pomáhali. V prvé řadě toto mé poděkování patří mému školiteli a současně přednostovi Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice Brno profesoru MUDr. Miroslavu Penkovi, CSc. Umožnil mi nejen vlastní provádění práce, ale i účast na celé řadě odborných sympozií a kongresů, což mi bylo průběžně zdrojem aktuálních informací a současně možností prezentace našich výsledků. Cennými radami se podílel na zaměření výzkumu a připomínkami přispěl ke konečné podobě práce. Dále bych si dovolila poděkovat přednostovi Interní hematoonkologické kliniky profesoru MUDr. Jiřímu Vorlíčkovi, CSc, který mi umožnil na svém pracovišti absolvovat postgraduální doktorské studium. Nemalý přínos pro tvorbu závěrů práce měla RNDr. Daniela Némethová z Centra biostatistiky a analýz Masarykovy univerzity v Brně pod vedením docenta RNDr. Ladislava Duška, CSc. Podílela se na statistickém zpracování dat a taktéž mi pomohla s obrazovým vyjádřením výsledků. Konečně si dovoluji taktéž poděkovat svým spolupracovníkům z Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice Brno, kteří se podíleli jednak na výběru vhodných pacientů, jejich vyšetřování, případně na provádění laboratorních vyšetření. Spolupracujícím hematologům z jihomoravského regionu děkuji za důvěru, s níž mi předávali do péče nemocné ze svých spádových oblastí. Práce byla částečně podpořena grantem č. IZ/4263-3 IGA MZ ČR.
OBSAH ANTIFOSFOLIPIDOVÉ PROTILÁTKY - OBECNÝ ÚVOD I. DEFINICE A ROZDĚLENÍ 4 II. MECHANISMY PŮSOBENÍ ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK NA PROCESY KREVNÍHO SRÁŽENÍ 5 Patofyziologie trombotických projevů v přítomnosti antifosfolipidových protilátek 5 Patofyziologie krvácivých projevů u antifosfolipidových protilátek 8 Patofyziologický mechanizmus fenoménu lupus antikoagulans 9 III. VÝSKYT ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK A JEHO PŘÍČINY 10 Genetická determinace antifosfolipidových protilátek 11 Autoimunitní onemocnění a antifosfolipidové protilátky 13 Nádorová onemocnění a antifosfolipidové protilátky 14 Infekční onemocnění a antifosfolipidové protilátky 15 Léky indukované antifosfolipidové protilátky 16 IV. KLINICKÁ MANIFESTACE PŘÍTOMNOSTI ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK, ANTIFOSFOLIPIDOVÝ SYNDROM 18 Primární antifosfolipidový syndrom 19 Venózní žilní trombóza a plieni embolizace 20 Arteriální trombóza a/nebo okluze 21 Ovlivnění gravidity v případě pozitivních APA 21 Kožní projevy 23 Neurologické aspekty přítomnosti antifosfolipidových protilátek 24 Kardiální postižení u antifosfolipidových protilátek 26 Ledviny 27 Plieni manifestace 28 Oční komplikace u antifosfolipidového syndromu 29-1 -
Gastrointestinální postižení u antifosfolipidových protilátek 30 Postižení endokrinních žláz 30 Osteoartikulámí postižení 31 Hematologické změny u antifosfolipidových protilátek 31 Katastrofický antifosfolipidový syndrom 32 V. LÉČEBNÉ OVLIVNĚNÍ ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK 33 Primární prevence 33 Léčba 34 Nové léčebné přístupy 35 VLASTNÍ PRÁCE 36 I. VYHODOCENI PŘÍNOSU ZPŘESNĚN! DIAGNOSTIKY LUPUS ANTIKOAGULANS POUŽITÍM NECLITIVÉ APT! REAGENCIE 37 Úvod 37 Materiál a metodika 37 Statistické zpracování 38 Výsledky 38 II.VYUŽIT!TESTUPROCGLOBAL KPREDIKCIPROTROMBOTICKÉHORIZIKA UNEMOCNÝCH Diskuse 40 S ANTIFOSFOLIPIDOVYMI PROTILÁTKAMI 42 Úvod 42 Soubor pacientů 42 Materiál a metodika 43 Statistické zpracování 44 Výsledky 45 Diskuse 47 III. DLOUHODOBÉ SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ S ANTIFOSFOLIPIDOVYMI PROTILÁTKAMI K URČENI PARAMETRŮ POTŘEBNÝCH K PÉČI O TYTO NEMOCNÉ 49 Úvod 49 Soubor pacientů 49-2-
Metodika 50 Statistické zpracování 52 Výsledky 53 Diskuse 63 IV. VYHODNOCEN! RIZIK NASTAVEN! A SLEDOVÁN! NTIKOAGULAČNI LÉČBY U PACIENTŮ S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI 65 Úvod 65 Soubor pacientů 65 Materiál a metodika 66 Statistické zpracování 66 Výsledky 66 Diskuse 67 V. ZÁVĚRY, DOPORUČENI DO LABORATORNÍ A KLINICKÉ PRAXE, PERSPEKTIVY DALŠÍHO VÝVOJE 69 Diagnostika lupus antikoagulans 69 Predikce protrombotického rizika u nemocných s antifosfolipodovymi protilátkami 69 Určení parametrů potřebných k péči o pacienty s antifosfolipidovými protilátkami 69 Antikoagulační léčba u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami 70 VI. PŘÍLOHY Příloha č. 1: použitá literatura 71 Příloha č. 2: přehled použitých zkratek 83 Příloha č. 3: obrazová dokumentace 85-3-
ANTIFOSFOLIPIDOVÉ PROTILÁTKY - OBECNÝ ÚVOD I. DEFINICE A ROZDĚLENÍ Antifosfolipidové protilátky jsou velmi heterogenní skupinou protilátek (synonyma: protilátky antifosfo-proteinové, protilátky fosfolipid-dependentní nebo z pohledu jejich působení protilátky proti plazmatickým proteinům vázajícím fosfolipidy). Obecně je tato skupina spojena se získaným trombofilním stavem (1). Tyto protilátky můžeme dále dělit různým způsobem - např. na auto- a alloprotilátky či protilátky indukované léky, případně na primárně resp. sekundárně se vyskytující. Nejúčelnější se zdá být dělení podle metody detekce (2). Jako lupus anťikoaqulans (LA) nazýváme heterogenní skupinu protilátek, které ovlivňují fosfolipid-dependentní koagulační reakce in vitro. Mezi LA můžeme rozlišovat dvě velké skupiny inhibitorů, a to podle antigenního cíle, proti němuž je daná protilátka namířena: protilátky proti ß-qlvkoproteinu I - podle použité diagnostické metody lze tento typ protilátek prokázat u 60-90% LA; epitopem může být doména I nebo doména IV molekuly ß 2 -glykoproteinu I; vyskytují se jak u lidí, tak u jiných druhů (krysy.ovce) protilátky proti protrombinu - opět v závislosti na použité metodě jsou prokazatelné u 50-90% LA; epitopem v tomto případě může být buď fragment 1 nebo pretrombin 1 a průkaz těchto protilátek je u lidí. Toto rozdělení má i klinický dopad, neboť LA namířené proti ßp-qlvkoproteinu I, mají významnější asociaci s trombotickými stavy nežli protilátky antiprotrombinové (3). Jinou možností detekce protilátek závislých na fosfolipidu je ELISA, podle použitého antigénu pak zjištěné protilátky nazýváme jako antikardiolipinové (v detekční soustavě je použit kardiolipin), antifosfolipidové (v detekční soustavě je použita směs fosfolipidu) nebo anti ß r qlvkoprotein l-ové (jako antigen použit ß 2 -glykoprotein I), dalšími podskupinami mohou být protilátky proti protrombinu, proti anexinu V atd. Cílovými antigény těchto protilátek jsou makromolekulami struktury vázané na negativně nabité, většinou fosfolipidové povrchy. Je však nutno říci, že tato místa zásahu antifosfolipidových protilátek jsou velmi heterogenní a jejich stručný přehled je shrnut rámcově v tabulce č. 1. Za pomocí ELISA je možné u části nemocných, ale i u zdravých osob, detekovat protilátky proti vlastním fosfolipidům - proti fosfatidylserinu, fosfatidyletanolaminu, fosfatidylglycerolu, proti fosfatidylinositolu či fosfatidylcholinu. Význam těchto specifických antifosfolipidových protilátek pro klinickou manifestaci je dle literárních dat nepřehledný a data se významným způsobem liší (1, 4). Podobně není dosud možno definovat vztah k trombóze u celé řady autoprotilátek, namířených proti nejrůznějším antigenním cílům vázaným na negativně nabité povrchy a zasahující do mechanismu krevního srážení či do procesů obranyschopnosti, jako jsou protilátky namířené proti proteinu C, proteinu S, vysokomolekulámímu kininogenu, faktoru XI, inhibitoru zevní cesty koagulace (TFPI), faktoru H komplementu, komplexu faktoru VIIA/llaadalším(4, 5). -4-
II.MECHANISMYPŮSOBEN!ANTIFOSFOLIPIDOVYCHPROTILÁTEKNAPROCESYKREVNÍHO SRAŽEN! Vzhledem k heterogenite antifosfolipidovych protilátek nepřekvapí, že byla dosud pospána nebo uvažována řada možných mechanizmů, jimiž tyto protilátky mohou ovlivňovat procesy krevního srážení. Patofyziologie trombotických projevů v přítomnosti antifosfolipidovych protilátek Z obecně patofyziologického mechanizmu je možné rozlišit dva hlavní procesy - (i) reakce protilátky s antigény navázanými na membránu může ovlivňovat kinetiku reakcí závislých na fosfolipidech, nebo (ii) reakce protilátky s antigény vázanými na buněčné povrchové receptory může měnit přenos signálu a aktivaci buňky (6). Ovlivnění koagulačních reakcí závislých na fosfolipidech Protrombogenní působení antifosfolipidovych protilátek je možné pozorovat na řadě úrovní. Zahrnují zejména ovlivnění systému přirozených inhibitorů krevního srážení, fibrinolýzy, rovnováhu mezi prostacyklinem a tromboxanem a řadu dalších vlivů (4,5, 7,8,9,10). Rámcový přehled je uveden v tab. č. 1. Tab. č. 1: Možné mechanismy působení fosfolipid-dependentních protilátek Cíl - substrát ß 2 -glykoprotein protrombin /trombin protein C protein S fosfolipáza A 2 trombomodulin heparan-sulfát cévní stěny TFPI Možný důsledek působení Inhibice aktivace PC, inhibice inaktivace FVa a FVIIIa cestou APC/PS, inhibice aktivace fibrinolýzy komplexem FXII/PK, inhibice aktivace AT mediované heparan sulfátem, potenciace aktivace trombocytů, potenciace tvorby FXa na trombocytech, snížení volného PS cestou inhibice interakce ß 2 -glykoprotein I a C4-vázající protein. Interference s funkcí odstraňování cizích částic a apoptotických buněk z cirkulace. Vazba na trombinem aktivované destičky, inhibice uvolnění prostacyklinu pod vlivem trombinu, inhibice aktivace PC, potenciace vazby protrombinu na membrány Inhibice aktivace proteinu C, inhibice inaktivace FVa a FVIIIa cestou APC/PS Inhibice inaktivace FVa a FVIIIa cestou APC/PS Inhibice produkce prostacyklinu z endoteliálních buněk Inhibice aktivace PC Inhibice aktivace AT mediované heparan sulfátem Inhibice vazby TFPI a FXa na negativně nabité fosfolipidové povrchy a tím zábrana vzniku komplexu, který brání další generaci trombinu anexin V Ovlivnění funkce placentárního antikoagulačního proteinu 1 (= anexinu V) tvorbou komplexů, blokádou nebo odstraněním anexinu V z jeho přirozených míst v placentě PC - protein C, PS - protein S, F - faktor, APC - aktivovaný protein C, AT - antitrombin, PK - prekalikrein, TFPI - tissue factor pathway inhibitor (inhibitor zevní cesty tvorby trombinu) -5-
V posledních 10-ti letech je zdůrazňována role buněčných elementů v procesech krevního srážení a tím se také stále častěji potvrzuje jejich úloha v patofyziologii působení antifosfolipidových protilátek. Klíčovou roli zde hrají endoteliální buňky, trombocyty a monocyty. Jedním z důležitých předpokladů možného zapojení trombocytu a endotelií do patofyziologie trombózy je jejich primární aktivace, při níž dochází k expozici negativně nabitých fosfolipidů na povrch buňky. Na tyto se pak váže ß 2 -glykoprotein I případně protrombin. Ten je pak cílovým antigenem pro vazbu antifosfolipidových protilátek. Depozice imunních komplexů vede k další aktivaci buňky nevyjasněným transdukčním mechanizmem, v němž se předpokládá úloha receptoru Fcy Rlla. U destiček vede k uvolnění obsahu granulí a tvorbě mnohočetných mikrovesikul, které zprostředkují mnohem větší negativně nabitý fosfolipidový povrch a tím spíše potencují nežli inhibují generaci trombinu (4, 5) - viz obr. č.1 (požito z publikace 5). Úloha antifosfolipidových protilátek je tedy z tohoto pohledu považována v potenciaci trombogenního rizika za druhotnou - teorie second hit". Obr. č. 1: Mechanizmus zapojení buněk do patofyziologie trombózy M******'* 9 * 0 Mi*wr vascular injury rrikf p4ale4ot activator? tfsc*?* 0 * mrmunfl 1 Goraptanea Enpo^re of trnguóveŕy chorpod phcspfküptd Trombocyty Aktivace trombocytu v přítomností antifosfolipidových protilátek byla opakovaně prokázána (11,12). Významnou úlohu zřejmě hraje tvorba destičkových membránových mikropartikulí (13). Některé práce dokladují, že ß 2 -glykoprotein I může v těchto mikropartikulích ovlivňovat receptor GPIIb/llla. Na něj se váže protrombin a tato interakce urychluje tvorbu trombinu. Přitom ß 2 -glykoprotein I v tomto případě neovlivňuje vazbu fibrinogenu na tento receptor (14). Přítomnost antifosfolipidových protilátek taktéž zřejmě ovlivňuje metabolismus kyseliny arachidonové a vede ke zvýšené produkci tromboxanu (15). -6-
Endoteliální buňky Přirozená antitrombotická funkce nepoškozeného endoteliálního povrchu může být přítomností antifosfolipidových protilátek alterována na řadě úrovní (16,17,18,19). Může jít o ovlivnění metabolizmu prostacyklinu a nerovnováhu proti tvorbě tromboxanu, indukci apoptózy endotelií, zvýšení exprese adhezívních molekul na povrchu endotelií cestou ß 2 - glykoproteinu I (E-selektin, VCAM-1, ICAM-1), zvýšení prozánětlivého interleukinu (IL)1ß, IL 6, a tím i zvýšení adheze mononukleárů. V arteriální části řečiště pak svou roli hraje taktéž zvýšení plazmatické koncentrace endotelinu 1 jako nejmohutnějšího vasokonstrikčního faktoru produkovaného endoteliemi pod vlivem antifosfolipidových protilátek. In vitro studie prokázaly zvýšení prepro-endotelin 1 mrna na endoteliálních tkáňových kulturách po přidání protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I. Antifosfolipidové protilátky mohou indukovat zvýšenou expresi tkáňového faktoru na povrchu endoteliálních buněk. Podobně jako v případě trombocytů i u endotelií je prokázána významná role endoteliálních mikropartikulí v patogenezi trombózy u antifosfolipidových protilátek (20, 21). Jednak představují katalytická místa pro tvorbu prokoagulačních komplexů, mohou indukovat apoptózu - což představuje pozitivní zpětnou vazbu a zvýšení prokoagulačního efektu další tvorbou mikropartikulí. Mikropartikule mohou mít i prozánětlivý efekt na endoteliální buněčný povrch se zvýšením exprese cytoadhezivních molekul. Monocyty, dendritické buňky Také monocyty hrají nezanedbatelnou roli v protrombotické náchylnosti osob s přítomnými antifosfolipidovými protilátkami. Byla popsána zvýšená exprese tkáňového faktoru na těchto buňkách (22), i když některé práce dokladovaly roli zvýšených hladin tumorózního nekrotizujícího faktoru (TNF-a) či IL 1 ß na tomto procesu, jiné tento vliv popíraly (23). Svou roli zde může hrát i druhotná sekrece prozánětlivých cytokinů (TNF-a, IL 1ß a IL 10) z dendritických buněk po té, co fagocytují trombocyty opsonizované ß 2 -glykoproteinem I a proti němu namířenou protilátkou. Sám tento proces však potřebuje nastartování imunitní resp. autoimunitní reakce, které zabezpečí funkční vyzrání a antigen prezentující funkce dendritických buněk (24). Zvýšená exprese tkáňového faktoru na monocytech může být u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami zapříčiněna zvýšenou lipidovou peroxidací - oxidačním stresem, která je u nemocných s antifosfolipidovým syndromem jasně prokázána (viz níže, 25). APA a procesy fibrinolýzy a proteolýzy Snížení funkce fibrinolytického systému je u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami dlouho známa - nejpravděpodobněji jde o výraz endoteliální dysfunkce. Jsou zvýšeny hladiny PAI -1 a t-pa, ale vzhledem k tomu, že tyto cirkulují v komplexech, je t-pa neaktivní. U nemocných s antifosfolipidovými protilátkami je taktéž popisována zvýšená hladina lipoproteinu (a), i když jeho hladina je geneticky determinována a není v jasné korelaci s hladinou samotných autoprotilátek - svou roli může zřejmě hrát i vlastní autoimunitní proces (26). Ne zcela vyjasněnou roli v ovlivnění fibrinolýzy můžepředstavuje strukturální homologie apo (a) - tedy glykoproteinová součást lipoproteinu (a) s plazminogenem; při vyšších hladinách lipoproteinu (a) může být inhibována vazba plazminogenu na fibrin nebo buňky a tímto procesem může být inhibována fibrinolýza a pericelulární proteolýza. Díky možné vazbě na apo(a) může být na těchto površích akumulován i ß 2 -glykoprotein I a může zde být štěpen plazminem (26, 27). APA a ateroskleróza Při časném vzniku aterosklerózy je prokázána akumulace cholesterolem naplněných pěnových buněk, které jsou odvozeny od monocyto-makrofágového systému. Makrofágy -7-
pohlcují chemicky modifikovaný lipoprotein nízké denzity (LDL) jako jsou acetylovaný LDL, oxidizovaný LDL a lipidové vesikuly obsahující negativně nabité fosfolipidy. ß 2 -glykoprotein I může přímo vázat oxidizované plazmatické lipoproteiny jako jsou oxidizovaný lipoprotein velmi nízké denzity, oxidizovaný LDL, oxidizovaný lipoprotein vysoké denzity. Takto může inhíbovat absorpci oxidizovaného LDL makrofágy a toto se zdá být i jeho původní funkce. V přítomnosti antifosfolipidových protilátek však ß 2 -glykoprotein I naopak pohlcování LDL zvyšuje a tím je zprostředkován aterogenní efekt těchto protilátek (28, 29). Náchylnost s progresivnímu průběhu aterosklerózy lze přenést autoantigenem (ß 2 -glykoproteinem I) senzibilizovanými lymfocyty na myších modelech (30). Patofyziologie krvácivých projevů u antifosfolipidových protilátek významná trombocytopenie Trombocytopenie je v přítomnosti APA ve většině případů lehká a nevede ke krvácivým komplikacím (31). Jen ojediněle je trombocytopenie významná a tehdy může být vzácně provázena běžnou klinickou manifestací spontánních krvácení do kůže a sliznic ve formě petechií, hematomů, eventuálně i hematurií (32). Při dostatečném počtu nebo jen nevýznamném poklesu trombocytů dochází při poranění cévní stěny k aktivaci trombocytů, k expresi fosfolipidů flip-flop mechanismem na jejich povrchu. Na tyto fosfolipidy se pak může vázat inhibitor a tím je blokován jeho možný vliv na prokoagulační cestu krevního srážení v místě potřebného vzniku koagula. Při významné trombocytopenii však tento mechanismus selhává a sekundární krvácivé projevy (např. při operačních výkonech) pak mohou být výraznější, nežli by odpovídalo prosté trombocytopenii (2). trombocytopatie Funkční poruchy destiček jsou popisovány až u 40% pacientku s APA (32). Část antifosfolipidových protilátek svou vazbou na trombocyty zřejmě mohou pokrývat vazebná receptorová místa a vést k membránovému typu funkční poruchy destiček. Naopak částečnou aktivací a degranulací může vznikat porucha uvolňovací reakce. Samovolné krvácivé projevy jsou vzácné, ale porucha funkce trombocytů musí být uvážena v rámci diferenciální diagnostiky krvácivých projevů u nemocných s APA, není-li jiný důvod. Navíc jde o nemocné, u nichž uvažujeme zavedení antitrombotické profylaxe nebo léčby. Část z těchto nemocných má normální počet trombocytů. antikoagulační léčba Zavedení antikoagulační léčby, která je dlouhotrvající až doživotní, si vynutí prodělaná trombotická příhoda za přítomnosti antifosfolipidových protilátek u většiny pacientů. Tato léčba je komplikována významnějšími krvácivymi projevy v případech pacientů vyššího věku, při současné trombocytopenii, při intenzivnějším antikoagulačním režimu (INR více než 3,0). Průměrné riziko závažného krvácení při vyšší intenzitě antikoagulační léčby (INR mezi 3,1-4,0) je udáváno 3,6% ročně (33). Pacienti na antikoagulační léčbě mohou mít relativní rezistenci na warfarin s potřebou vysokých dávek (denní dávka vyšší než 25 mg není vzácností). Na této resistenci se mimo jiné může podílet i současná léčba revmatického procesu zejména azathioprin, který významně ovlivňuje metabolismus warfarinu indukcí hepatálních enzymů. Náhlé vysazení azathioprinu bez kontrol nastavení antikoagulace může vést k rychlému predávkovaní a fatálním krvácivým komplikacím (34). -8-
sekundární hypoprotrombinémie Vznik hypoprotrombinémie za přítomnosti antifosfolipidových protilátek namířených proti protrombinu (ať jíž charakteru lupus antikoagulans nebo prokazovaných metodou ELISA, kdy je na negativně nabitý povrch vázán protrombin jako cílový antigen) je typickým příkladem ne-neutralizujícího cirkulujícího antikoagulantu. Imunoglobulin s lupus antikoagulans aktivitou reaguje s molekulou protrombinu mimo jeho funkční místo a nevede přímo k ovlivnění - neutralizaci aktivity faktoru. Vznikají však komplexy antigen-protilátka, které jsou odstraňovány z cirkulace, a tímto způsobem může vznikat získaný deficit protrombinu, výjimečně i závažný, spojený s krvácivými projevy (35). Vazebným místem pro antifosfolipidovou protilátku je obvykle fragment 1 protrombinu a nebo a-trombin, ale ne fragment 2, který obsahuje vazebné místo pro faktor Va (36). Na rozdíl od ostatních lupus antikoagulantu, které běžně neovlivňují hodnotu protrombinového času (37) dle Quicka (fosfolipid je u tohoto testu při běžném provedení dodáván v nadbytku a neutralizuje přítomnou antifosfolipidovou protilátku), jsou lupus antikoagulanty se sekundární hypoprotrombinémií provázeny při klinicky významném snížení faktoru II prodloužením tohoto testu. Proto je patologie v protrombinovém času u lupus antikoagulans významným signálem rizika jinak vzácného krvácení a je nutné stanovit aktivitu protrombinu. Lehké snížení hladiny faktoru II beze změn v protrombinovém čase má dle některých nálezů řada pacientů s lupus antikoagulans a komplexy protrombin - protilátka byly dokonce popsány u většiny nemocných s LA (36). Nález závažné imunitně podmíněné hypoprotrombinémie v přítomnosti antifosfolipidových protilátek je častější u dětí po virových infekcí, ale byl výjimečně popsán i u dospělých. V těchto případech může být závažné krvácení první známkou přítomnosti autoimunitního procesu a přítomnosti antifosfolipidových protilátek (38). jiné příčiny krvácení Antifosfolipidové protilátky zejména ty, které se manifestují přítomností inhibitoru typu lupus antikoagulans, mohou provázet a/nebo být provázeny přítomností specifického inhibitoru proti některému z koagulačních faktorů. Tento nález je známý u nemocných s hemofílií a s inhibitorem proti FVIII (39), ale byl popsán i u získaných typů hemofílie (40). Taktéž byly popsány skutečné specifické protilátky proti FXII - tedy ne zvýšená clearence imunních komplexů známá u faktoru II; tento nález byl v souvislosti s LA a v FXII také dokumentován (41). Ojedinělé nálezy popisují přítomnost přechodného specifického inhibitoru FX a současně lupus antikoagulans po respirační infekci (42). Podle povahy a závažnosti deficitu příslušného faktoru navozeného specifickým inhibitorem pak tyto stavy mohou být provázeny závažnými krvácivými komplikacemi (40, 42). Patofyziologický mechanizmus fenoménu lupus antikoagulans Vzhledem k tomu, že náchylnost k trombóze je významně vyšší (43) u těch antifosfolipidových protilátek, které se chovají jako lupus antikoagulans - tedy prodlužují koagulační testy závislé na fosfolipidech, je z patofyziologického hlediska důležité pochopit, proč se některé z APA chovají jako lupus antikoagulans a jiné ne. Tento mechanismus byl vysvětlen a opakovaně publikován (44, 4, 5). ß 2 -glykoprotein I byl popsán jako klinicky významný kofaktor protilátek vázajících fosfolipidy v roce 1990 třemi nezávislými skupinami (45-47). Přestože se váže s vysokou afinitou na negativně nabité fosfolipidy (kardiolipin, fosfatidylserin), jeho afinita k fyziologických prokoagulačním fosfolipidům je slabá a proto je sám o sobě špatným antikoagulantem. Za některých okolností, které jsou dány cílovým epitopem, mobilitou pantové" oblasti protilátky a/nebo denzitou lipidové vazby ß 2 -glykoproteinu I, mohou být vytvořeny bivalentní imunní komplexy antigen - protilátka, které mají mnohem vyšší afinitu k fosfolipidům, nežli vlastní -9-
antigen. Tento fakt byl prokázán jak za použití monoklonálních protilátek, taki za pomocí vysoce čištěných IgG od pacientů s antifosfolipidovým syndromem. Důležitost bivalentních komplexů byla rovněž potvrzena cestou rekombinantní DNA technologie - rekombinantní ß 2 - glykoprotein I dimer měl 35-ti násobnou afinitu nežli z plazmy získaný ß 2 -glykoprotein I a byl schopný napodobit antikoagulační efekt. Cestou bivalentních komplexů se mohou uplatňovat i antifosfolipidové protilátky závislé na protrombinu vykazující aktivitu lupus antikoagulans(5). Tento mechanizmus je zobrazen na obr. 2 (použito z publikace 5). Obr. č. 2: Fenomén lupus antikoagulans ouoöösössuööooööosooöuöoööoööösösosö ß 2 GPI - ß 2 -glykoprotein I; FN -faktor II neboli protrombin III. VÝSKYT ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK A JEHO PŘÍČINY Antifosfolipidové protilátky (APA) se mohou prokazovat i u jinak zdravých jedinců jako náhodný nález - viz tabulka č. 2 (48,49). Nicméně takto náhodně detekované protilátky bývají častěji přechodné, většinou po infekcích - Kratz v skupině 88 dětí s infekty horních cest dýchacích zjistil pozitivitu APA až ve 30% (50). -10-
Tab. č. 2: Frekvence výskytu antifosfolipidových protilátek v běžné populaci Studie, rok počet, skupina LA (%) ACLA(%) Lockwood, 1989 737 těhotných 2,7 2,2 Shi, 1990 499 dárců krve 3,6 5,6 Infante-Rivard, 1991 993 těhotných 3,8 1,5 Patkinson, 1993 933 těhotných 1,2 1,0 Buliková, 1997 335 dárců krve 0,6 1,19 Dle některých prací je nález těchto protilátek mnohem častější u geriatrických pacientů - Manousskis prokázal nález antikardiolipinových protilátek u jinak zdravých osob s průměrným věkem 80 let v 50% (51). Recentnější práce spíše prokazují vyšší incidenci antifosfolipidových protilátek ve vyšším věku spíše u chronicky nemocných jedinců (52). Trvalá přítomnost antifosfolipidových protilátek je však mnohem častější jako doprovodný nález u celé řady stavů, a to buď jako klinicky němý laboratorní průkaz, nebo je provázen klinickými projevy pod obrazem antifosfolipidoveho syndromu (viz dále). Tato tzv. sekundární pozitivita (tj. u jiného zjistitelného onemocnění či stavu) může být dočasná, s odstraněním vyvolávající příčiny či navození klinické remise doprovodné choroby dochází v některých případech k vymizení přítomných protilátek. Jindy však může přetrvávat i po navození remise základního onemocnění, resp. i o řadu let předcházet vznik např. systémového onemocnění - řada autorů doporučuje z tohoto pohledu dlouholeté cílené sledování pozitivních nemocných (53). U více než poloviny nemocných však zůstává důvod tvorby patologického imunoglobulinu neobjasněn. Hovoříme o tzv. primárním výskytu. Tento bývá mnohem častěji trvalý, nebo alespoň dlouhodobý (je popsáno vymizení primárního inhibitoru po více než 9 letech). Genetická determinace antifosfolipidových protilátek Od roku 1980, kdy Exner a kol. poprvé popsali familiární výskyt antifosfolipidoveho syndromu (APS) resp. nakupení antifosfolipidových protilátek u rodinných příslušníků nemocných s APS, se problematice vrozené náchylnosti k primárnímu či sekundárnímu APS (vznikající u jiných onemocnění, nejčastěji revmatických - systémový lupus erythematodes) věnovala řada prací a sdělení (54, 55). Nicméně vzhledem k relativně vzácnému výskytu familiárního APS nebyla dosud tato problematika definitivně dořešena a byla konstatována potřeba velké mezinárodní multicentrické studie, která se bude věnovat tomuto tématu. (9 th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies, September 12-16, 2000, Tours, France). Koordinátory této studie jsou E. Toumier-Lasserve a Jean-Charles Piette, Department of Internal Medicine, Groupe Hospitalier Pitié-Salpetrierie, University Paris VI, France. Mezi rodinnými příslušníky pacientů s primárním APS je opakovaně prokazováno nakupení různých autoimunitních stavů včetně také APS, systémového lupus erythematodes (SLE), revmatické artritídy, autoimunitní tyreoiditidy u starších členů rodin. Mezi mladšími jedinci je obvyklá vysoká prevalence autoprotilátek, jako jsou APA, ANA nebo pozitivita revmatického faktoru bez přítomnosti klinicky manifestního autoimunitního onemocnění. Předpokládá se, že plná exprese autoimunitního onemocnění je odložena. Podobná situace je mezi členy rodin nemocných SLE, kteří mají rovněž vysokou frekvenci různých autoimunitních chorob či autoprotilátek. U primárního APS 11% nemocných má nejméně jednoho příbuzného s výskytem autoprotilátek. Náchylnost ke vzniku autoimunitního onemocnění se zdála vykazovat autozomálně dominantní mendelovskou dědičnost. V současné době byla a je -11 -
zkoumána řada specifických genetických faktorů, které mohou být v souvislosti s touto náchylností. U primárního APS závisí tvorba autoprotilátek, vznik autoimunitního onemocnění naplňujícího klinická kriteria antifosfolipidového syndromu a velmi heterogenní způsob klinické manifestace, zřejmě na velkém množství geneticky podmíněných vlivů. Na rozvoji onemocnění mohou hrát roli některé genetické rizikové faktory - alely hlavního histokompatibilního systému II. třídy, deficitní alely C4 složky komplementu, polymorfismus ß 2 -glykoproteinu I, případně výskyt jiných trombofilních faktorů. Hlavní histokompatibilní systém II. třídy Od konce 80-tých let byla opakovaně věnována pozornost zvýšené frekvenci určitých alel hlavního histokompatibilního systému (MHC) II. třídy pří výskytu antifosfolipidových protilátek. V několika těchto studiích (přehled v 56) byla prokázána asociace s alelami HLA DR 4 a HLA DR 7, resp. i DRw53, případně DQB1*0301 (DQ7). Arnett a kol. (1991) předpokládá, že skutečné rizikový faktor pro výskyt APA může být DQB1 oligonukleotidová alela kódující sedm následných zbytků ve třetí hypervariabilní oblasti na zevní doméně DQB1-71-77, tzv. TRAELDT. V této oblasti epitopu je možné ovlivnění imunitní odpovědi zásahem do prezentace antigénu na T lymfocytovém receptoru. Byla prokázána asociace nálezu lupus antikoagulans (LA) s alelou DQB1*0301 (DQ7), a ti pacienti, kteří tuto alelu neměli, ale měli pozitivní nález LA, byli nosiči alel *0302, *0303 nebo *0602, které všechny nesou výše popsanou sekvenci 71-77 TRAELDT. Tato sekvence byla nalezena i mezi členy rodin pacientů s primárním APS, kteří měli APA v séru. Další studie však ukázaly, že relativní riziko výskytu APA spojené s touto alelou je malé (50% HLA-DQB1 genů u populace bez známek výskytu onemocnění má TRAELDT sekvenci). Z tohoto důvodu je předpokládána existence dalšího neznámého rizikového faktoru. Deficitní alely pro C4 složku komplementu Wilson a kol. (57) prokázali u familiárního výskytu APA, že je nezávisle na TRADELT sekvenci nález autoprotilátek asociován s MHC haplotypy obsahujícími C4A a C4B deficitní alely. Některé deficitní alely byly delece genu C4A nebo C4B, zatímco jiné byly genové konverze C4B (strukturální geny C4B obsahující C4A specifické nukleotidové sekvence), které neměly žádný protein jako produkt C4B genu v séru. Snížená produkce C4 složky komplementu zapříčiňuje imunologický deficit - snížená opsonizace a clearence antigénu vede k přetrvávání antigénu v cirkulaci a výsledkem může být autoimunizace. ß 2 -glykoprotein I ß 2 -glykoprotein I je protein sestávající z 326 aminokyselinových zbytků a patří do skupiny proteinů charakterizovaných přítomností opakujících se jednotek SCR - short concensus repeat nebo sushi domény. Struktura ß 2 -glykoproteinu I obsahuje čtyři uniformní klasické sushi domény I - IV (s centrální antiparalení ß-vrstvou a s dvěma disulfidovými můstky) a doménu V, která se od předchozích odlišuje. Má ve své zevní kličce velkou pozitivně nabitou oblast o velikosti asi 2000A, která obsahuje 12 lysinových, jeden argininový a jeden histidinový zbytek uložené v zevní linii "fish - hook". Ve středu této pozitivně nabité oblasti je flexibilní hydrofobní klička (Ser 311 - Lys 317), která se pravděpodobně zasouvá do fosfolipidové membrány a má určenou specifitu pro lipidové vrstvy. Tato hypotéza je podpořena zjištěním, že mutací Try 316 dochází ke ztrátě schopnosti vázat lipidové vrstvy, ale není dotčena schopnost vázat heparin. Try 316 v této pozici představuje spojení mezi acylovym řetězcem a fosfátovými skupinami, kterým ukotvuje molekulu do membrány, což je mechanismus obvyklý pro proteiny vázající membrány (58). ß 2 -glykoprotein I je rovněž nazýván jako apoh vzhledem ke spojení s velkými lipoproteinovými částicemi. V literatuře "genetické" je obvyklé popisovat jako apoh k popisu -12-
genového produktu a APOH pro gen, který je lokalizovaný na 17 chromozomu v segmentu 17q23-24. Isoelektrickou fokusací-imunoblottingem byly popsány tři běžné alely APOH strukturálního lokusu a to APOH*1, APOH*2 a APOH*3. Původní "rodičovská" alela je APOH*2 (Kavkazská populace 86%, původní Američané 100%). Frekvence výskytu alely APOH*1 (mutace v kodonu 88 Ser -> Asp) kolísá od 1% (u afrických černochů) do 13% (původní obyvatelstvo Austrálie a Samoané). Alela APOH*3 se nachází s frekvencí asi 6% u Kavkazské populace, Číňanů a černochů. Vzácná je u původních obyvatelů Ameriky a pacifické oblasti. V této alele lze vyčlenit navíc APOH*3 w - reaktivní a APOH*3 B nonreaktivní (podle reaktivity s monoklonální protilátkou 3D11 v imunoblottingu). Zatímco alela APOH*3 w je obvyklá u Kavkazské populace a Číňanů (90 resp. 100% ze všech případů APOH*3) v černošské populaci je dominující alelou APOH*3 B (100% u APOH*3 afrických černochů a 90% u amerických černochů). APOH*3 w je dána mutací v kodonu 316 záměnou Try-> Ser. Homozygotní stav alely APOH*3 w je charakterizován zrušením vazby ß 2 -glykoproteinu I na fosfatidylserin. Nicméně rušení této vazby bylo zjištěno i u nemocných, kteří měli heterozygotni nález dané alely. Přímou sekvenční analýzou a reštrikční analýzou PCR amplifikovaných produktů bylo zjištěno, že u těchto jedinců byla navíc prokázána bodová mutace v kodonu 306 a tím záměna v pozici 306 Cys -> Gly v heterozygotni formě. K vazbě ß 2 -glykoproteinu I na kardiolipin nedochází ani v případě, je-li mutace Cys -> Gly přítomna v homozygotní formě bez současné změny v kodonu 316 (59). V asijské populaci (60) bylo prokázána u pacientů s antifosfolipidovým syndromem významně vyšší exprese valinu (záměna za leucin) v pozici 247; zejména homozygotní nosičství je spojeno s významně vyšším rizikem tvorby protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I. Tyto nálezy mutací v genu pro ß 2 -glykoprotein I mohou napomoci v úvahám o patogenese působení APA u APS. Navíc se lze o ně opřít ve zdůvodňování výrazných etnických rozdílů frekvence výskytu antifosfolipidových protilátek (48). Protilátky proti ß 2 -glykoproteinu I se váží predominantně na doménu I. Jen část těchto autoprotilátek se váží i na strukturu, v níž byla doména I arteficiálně mutovaná. Zde se předpokládá možnost na vazbu v oblasti domény II. Tyto nálezy dávají tušit další možnosti, kdy se mutace struktury molekuly ß 2 -glykoproteinu I budou významnou částí podílet v indukci APA, ale i v patogeneze APS (61, 62). Jiné trombofilní faktory S ohledem na multifaktoriální genezi trombózy, kdy při klinické manifestaci hraje podstatnou roli vliv jak vrozených tak i získaných faktorů zvyšujících rizika trombózy, lze i u APS předpokládat, že vrozené trombofilní stavy budou zvyšovat frekvenci klinické manifestace trombembolické nemoci u pacienta se současnou přítomností geneticky podmíněných rizikových faktorů (Leidenská mutace faktoru V, mutace protrombinu 20210A, vrozené deficity přirozených inhibitorů krevního srážení - antitrombinu, proteinu S, proteinu C, zvýšené hladiny faktoru Vlil a dalších) a APA. Nicméně tento aditivní efekt vrozených trombofilií a stavu považovaného za získanou trombofílii - tedy přítomnost APA - byl prokázán jen v některých případech - u Leidenské mutace FV, resp. při zvýšené frekvenci alely 4G (u 4G/5G polymorfizmu pro gen plazminogen aktivátoru inhibitoru 1) při trombózach v arteriálním řečišti. Na druhé straně mutace protrombinu 20210A, která je obecně považována za hereditární trombofílii ani termolabilní varianta v genu pro methyléntetrahydrofolát reduktázu nezvyšovala riziko klinické manifestace trombózy u pacientů s APA (63). Autoimunitní onemocnění a antifosfolipidové protilátky Vzhledem k tomu, že již vlastní tvorbu antifosfolipidových protilátek můžeme zařadit mezi poruchy či odchylky imunitního systému, není překvapivé, že mezi onemocněními, které jsou nejčastěji provázena jejich přítomností, jsou právě stavy, které zařazujeme do široké skupiny autoimunitních chorob. -13-
systémová onemocnění pojiva K onemocněním, které jsou provázena nálezem antifosfolipidových protilátek ze zcela nejvyšší frekvencí, patří systémový lupus erythematodes (SLE). Údaje, s jakou frekvencí jsou ty - které z antifosfolipidových protilátek u této choroby nalézány se značně liší podle studie a zejména podle metody detekce. Lupus antikoagulans je udáván mezi 11-30%, zatímco protilátky proti kardiolipinu ve velmi širokém rozmezí 17-86%. Důležitá je taktéž doba, po níž jsou pacienti se SLE v tomto pohledu monitorováni - při pětiletém prospektivním longitudinálním sledování byly kardiolipiny zjištěny u 26% nemocných a lupus antikoagulans ve 22%. Mezi těmito pacienty dojde podle Hopkins Lupus Cohort v průběhu 20-ti let ke klinické manifestaci antifosfolipidového syndromu v 50% (48). Z ostatních systémových onemocnění je nález antifosfolipidových protilátek citován u revmatické arthritidy v 16% (64), dále u stavů označovaných lupus-lide disease", překryvné choroby pojiva, Sjögrenova syndromu, systémové sklerózy, difúzni fasciitidy, polymyozitidydermatomyozitidy a u vaskulitid - polyarteritis nodosa, gigantocelulámí arteritida, Takayasu arteritida i Behcetova choroba (53, 65, 66). Frekvence nálezu u těchto dalších systémových onemocnění není jednoznačně dána a některé studie u nich neprokázaly vyšší incidenci nežli u dárců krve (64). jiná autoimunitní onemocnění Z dalších autoimunitních stavů, která jsou provázena výskytem antifosfolipidových protilátek a u nichž je frekvence tohoto nálezu častěji referována, je to především idiopatická autoimunitní purpura, která je dle některých sledování provázena až ve třetině případů tímto nálezem (67,68). Mnohem vzácnější je nález u autoimunitní hemolytické anémie - 4% při primárním výskytu protilátek. Referovány jsou dále insulin-dependentní diabetes mellitus, autoimunitní thyreoiditis, myastenia gravis a Crohnova choroba (53, 65, 66). Nádorová onemocnění a antifosfolipidové protilátky Nádorová onemocnění jsou tradičně asociována s trombotickými projevy - klinicky zjevnou trombózu prodělá 15% nemocných s tumorem a dle sekčních nálezů je trombóza nebo její zjevné následky detekována ve u 30-50% (2). Patogeneze trombotických projevů u nádorů je velmi komplexní a podílí se na ní lokální a reaktivní změny, vlastní prokoagulační vliv tumoru, faktory související s léčbou. Již od počátku 80-tých let se uvažuje o tom, že mezi trombofilními vlivy mohou i u nádorových onemocnění hrát svou roli antifosfolipidové protilátky. Frekvence záchytu antifosfolipidových protilátek u tumorů je velmi variabilní podle jednotlivých studií a pohybuje se mezi 3% (tedy zhruba na úrovni normální zdravé populace) až do 22% (69). Sami jsme mezi 85 pacienty se solidními nádory prokázali středně významné titry antikardiolipinů u 2 nemocných, zatímco fenomén lupus antikoagulans u 17 nemocných tj. ve 20% (70). Oba nemocní s antikardiolipinovými protilátkami a 29,5% nemocných s lupus antikoagulans prodělalo trombózu. Nález antifosfolipidových protilátek může být u tumorů dočasný a může mizet s navozením remise onemocnění. Tam, kde pozitivita přetrvává, je větší tendence k trombotickým komplikacím (69). solidní nádory Mezi solidními nádory jsou v souvislosti s antifosfolipidovými protilátkami popisovány jednak karcinomy nejrůznějšího origa - plíce, prostata, děložní čípek, jícen, střevo, močový měchýř, vaječník, hepatocelulámí karcinom, karcinom kůže, trachey, karcinomy ORL oblasti. Výskyt - 14-
protilátek je dokumentován i u metastatického postižení kostí či jater neznámého origa. Z ostatních solidních nádorů je v literatuře pakované zmiňována souvislost s thymomem (53, 65, 66, 69). hematologické malignity Přítomnost antifosfolipidových protilátek je opakovaně dokumentována u nejrůznějších typů hematologických malignit. Je spíše obtížné komentovat frekvenci výskytu, protože jde o velmi heterogenní onemocnění svou patofyziologickou povahou a pokud u některých typů byla přítomnost antifosfolipidových protilátek sledována systematicky, pak byly hodnoceny jen velmi malé série - např. Lossos dokumentoval na 27 nemocných s akutní myeloidní leukémií přítomnost antikardiolipinů v 68%, jejich titr se zdál korelovat s aktivitou choroby a autoři předpokládali, že by mohly být predikátorem relapsu choroby (71). Jiní však u téže diagnózy zjistili prevalenci jen 26%. Většina literárně dokumentovaných případů se však odvíjí spíše od jednotlivých popisů. Kromě již zmiňované akutní myeloidní leukémie - včetně případů s monocytární složkou nádorové populace, je přítomnost antifosfolipidových protilátek publikována i u akutních lymfoblastických leukémií, vlasatobuněčné leukémie, pravé polycytémie a jiných myeloproliferativních stavů. Zvláště často jsou zmiňovány v souvislosti s přítomností APA maligní lymfomy - z nich častěji lymfocytární lymfom, Waldenströmova makroglobulinémie, kožní T buněčné lymfomy (mycosis fungoides a Sézaryho syndrom), dále splenický vilózní lymfom, periferní T buněčné lymfomy. Frekvence nálezů u těchto stavů je udávána dle malých sérií mezi 35-40% a opět je dokladováno vymizení po úspěšné léčbě (69). Zvláštní postavení mají ty hematologické malignity, které jsou provázeny nálezem monoklonální gamapatie - ať už jsou to výše zmiňované lymfoproliferace z periferních buněk, nebo mnohotný myelom. Nález antifosfolipidových protilátek byl opakovaně asociován i s monoklonální gamapatií nejasného významu. Nález antifosfolipidových protilátek byl rovněž popsán u chronické graft-versus-host disease" po allogenní transplantaci kostní dřeně (65,69). Infekční onemocnění a antifosfolipidové protilátky Doklady o spojení infekčních chorob a antifosfolipidových protilátek jsou dnes již téměř stoleté od doby, kdy v roce 1906 Wassermann použil extrakt z fetálních jater a sleziny u kongenitální formy syfilis k detekci protilátek u jedinců s touto chorobou. Až v roce 1941 se prokázalo, že cílovým antigenem této reakce je kardiolipin. Týž pak byl použit Harrisem pro detekci antifosfolipidových protilátek a popis antifosfolipidového syndromu. Celá řada infekčních chorob může být provázena výskytem antifosfolipidových protilátek - přehled udává tabulka č. 3 (72, 73, 74). Většina autorů se domnívá, že antifosfolipidové protilátky nejsou spojeny se zvýšeným rizikem trombózy, jsou-li indukovány infekčními procesy (75). Dokonce je používáno rozdělení na autoimunní" a infekční". Nicméně některé novější zprávy prokazují, že je možné za pomoci virových či bakteriálních produktů vázaných na fosfolipidy vyvolat tvorbu protilátek, které váží ß 2 -glykoprotein I (73, 74, 76) a navíc jsou u některých infekčních onemocnění dokumentovány nejen trombotické komplikace, ale i jiné projevy antifosfolipidového syndromu - kožní nekróza vyvolaná mikrotrombotizací, transverzální myelopatie, netrombotická plieni hypertenze (73, 74). -15-
Tab. č. 3: Infekční choroby u nichž byly detekovány antifosfolipidové protilátky Virové hepatitis C, virus Ebstein Barr, HIV, cytomegalovirus, parvovirus 19, adenovirus, varicella zoster, vaccinia, virus lidských příušnic, zarděnek, HTLV-1, hepatitis A, hepatitis B, spalničky Bakteriální a spirochetové Parazitární virové choroby lepra, tuberkulosa, mycobacterium pneumoniae, mycobacterium penetrans, salmonela, stafylokoky, streptokoky, Coxiella burnetii (Q horečka), bakteriální endokarditida, lepra, lymeská boreliosa, syfilis, středozemní skvrnitá horečka, legionářská nemoc, tyfus, E. coli, ornitóza malárie, kala azar, toxoplazmóza Z virových infekcí je nejčastěji dávána do souvislosti indukce antifosfolipidových protilátek virem lidského získaného imunodeficitu a s chorobou AIDS. Incidence těchto protilátek je u těchto stavů vysoká, udávaná obvykle mezi 36-72% (75). Některé případy jsou provázeny vznikem nejrůznějších trombotických komplikací - kausální souvislost však nemusí být jednoznačná vzhledem k možnosti a lépe řečeno pravděpodobnosti jiných příčin, jako jsou poruchy lipidového metabolizmu i krevního srážení navozeného retrovirovou léčbou. Nicméně i u těchto pacientů byly prokázány jednak antikardiolipiny závislé na ß 2 - glykoproteinu I, ale i přímo protilátky proti ß 2 -glykoproteinu I (asi u 5% nemocných), takže možný vliv nelze s jistotou vyloučit. Navíc byly popsány nejen klasické trombotické komplikace, ale i případy kožní nekrózy či netrombotická plieni hypertenze, které patří do obrazu antifosfolipídového syndromu. Trombotické komplikace byly popsány i u jedinců s APA a infekcí virem hepatitídy C, virem Ebstein - Barrové, cytomegalovirem, při infekci adenovirem a virem varicelly (74, 77). Průkaz protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I - tedy potencionálně protrombogenních - byl dokumentován dále u infekcí parvovirem B19, ale bez trombembolických komplikací (78). Vysoká hladina antifosfolipidových protilátek byla asociována s cytomegalovirovou infekci u jedinců, který podstoupili nepříbuzeneckou transplantaci kostní dřeně a allogení transplantaci pupečníkové krve, taktéž bez trombotické manifestace (79). bakteriální a spirochetové choroby Bakteriální infekce nejsou obvykle spojeny s přítomností protrombogenních" antifosfolipidových protilátek. Výjimku tvoří onemocnění leprou, kdy byly prokázány opakované nejen mikrovaskulární trombózy, ale i antifosfolipidové protilátky závislé na ß 2 - glykoproteinu I (73,74). Infekce a katastrofický antifosfolipidový syndrom Katastrofický průběh antifosfolipidového syndromu může být indukován infekčními procesy až ve 35% případů (74). Ve většině případů jde spíš o virový původ, nelži bakteriální. Opakovaně však byly dokumentovány případy katastrofického průběhu při tyfové nákaze. Léky indukované antifosfolipidové protilátky Existuje řada léků, která je dávána do souvislosti s indukcí tvorby antifosfolipidových protilátek. U některých je s jejich podáním frekvence tohoto laboratorního nálezu vysoká (napři, i více než 50% nemocných), u jiných jsou popsány zcela ojedinělé případy. Přehled je uveden v tabulce č. 4 (66, 80,81). Po vysazení léku pozitivita mizí po době měsíců až let. Ojedinělý pokus o odstranění protilátek plazmaferézou byl neúspěšný. -16-
Tab. č. 4: Léky indut cující přítomnost antifosfolipidových protilátek Antiarytmika prokainamid, chinin/chinidin, fenytoin Antipsychotika Antihypertenziva Antikonulziva Tricyklická antidepresiva Antibiotika Jiné chlorpromazin, haloperidol, flufenazin, perfenazin, fenothiazin, Clozaril hydralazin, propranolol, acebutol fenytoin, kyselina valproová Doxepin penicilin a deriváty (amoxycilin), streptomycin interleukin/interferon, silika, estrogenní kontraceptiva, intoxikace alkoholem, drogy - heroin antifosfolipidové protilátky indukované chlorpromazinem Frekvence nálezu antifosfolipidové protilátky-tj. lupus antikoagulans a/nebo protilátky proti kardiolipinům při medikaci chlorpromazinu je udávána mezi 38-89% (81). Indukce protilátek je dána dávkou léku a trváním léčby. Více než 50% těchto nemocných má IgM typ protilátky a taktéž splenomegalii. Navíc byla dokumentována závislost vazby na ß 2 -glykoproteinu I u těchto autoprotilátek, tedy spíše skutečně autoimunitní původ. IgG antikardiolipiny má méně než 10% nemocných. Trombotická manifestace je však vzácná. Na tomto se může podílet skutečnost, že chlorpromazin má jakýsi vlastní kompenzatomí antitrombotický efekt - fenothiaziny inhibují kalmodulin a stabilizují membrány, takže můžou vyrovnávat změny vznikající na endoteliálních buňkách vlivem APA. Zda mohou i jiné fenothiaziny indukovat antifosfolipidové protilátky, není zcela vyjasněno. Recentnější studie udávají jejich incidenci v 13-17% (81). Výjimečné zprávy hovoří o trombóze v souvislosti s APA a flufenazinem, perfenazinem, fenothizinem a haloperidolem. antifosfolipidové protilátky a prokainamid Prokainamid je lék významně spojen s léky-indukovaným SLE a také na rozdíl od fenothizinových derivátů je indukce antifosfolipidových protilátek často spojena s tímto syndromem. Většina nemocných má klinickou manifestaci hluboké žilní trombózy nebo cévní mozkové příhody. Jsou popsány případy plieni embólie, těžkého vaso-okluzívního postižení retiny. Přítomnost antifosfolipidových protilátek se však může zjistit i u pacientů, kteří nemají projevy léky-indukovaného SLE. Více než 21% kardiaků užívajících prokainamid má pozitivitu antikardiolipinů. I zde jsou popsány případy trombotických komplikací - zejména cévních mozkových příhod a trombóz hlubokého žilního systému dolních končetin (81). antifosfolipidové protilátky a kombinace interleukin 2 - interferon Tato imunoterapeutická léčba je používána v léčbě některých nádorových onemocnění (maligní melanom, tumory ledvin). Opakovaně bylo dokumentováno, že může vést k rychlé indukci antifosfolipidových protilátek včetně trombembolických komplikací (69). genetická podmíněnost léky indukované tvorby antifosfolipidových protilátek Riziko tvorby antifosfolipidových protilátek je v případě chlorpromazinu zřetelně vyšší u nosičů alely Bw44 či DR7 hlavního histokompatibilního systému. U antifosfolipidových protilátek indukovaných prokainamidem hraje roli geneticky podmíněná pomalá acetylace jaterního enzymu N-acetyl transferázy. Tento nález byl zjištěn u většiny, jestli ne u všech, nemocných s tímto nálezem (81). -17-
IV.KLINICKÁMANIFESTACEPŘÍTOMNOSTIANTIFOSFOLIPIDOVÝCHPROTILÁTEK, ANTIFOSFOLIPIDOVÝ SYNDROM Tam, kde je nález antifosfolipidových protilátek provázen klinickými projevy trombózy a/nebo opakovanými předčasnými ztrátami plodu, hovoříme o antifosfolipidovém syndromu (APS) Definice antifosfolipidového syndromu doznala v průběhu let několik revizí. Poslední ucelené diagnostické schéma vzešlo z workshopu, který navazoval na 8. mezinárodní sympózium o antifosfolipidových protilátkách v Sapporu v roce 1998. Kriteria definitivní diagnózy podle mezinárodního konsensu shrnuje tabulka č. 5 (82). Tab. č. 5 Klinická klasifikace APS podle "International Consensus Statement" KLINICKÁ KRITERIA trombózy poruchy těhotenství LABORATORNÍ KRITERIA PŘÍZNAKY jedna a více arteriální a/nebo venózní trombóza trombóza malých cév v jakékoli tkáni či orgánu prokázaná jasně klinicky, Dopplerem nebo histopatologicky (v tomto případě bez známek zánětu cévy) tři a více nevysvětlitelných následných samovolných potratů před 10. týdnem gestace s vyloučením anatomických, genetických nebo hormonálních příčin jedno nebo více nevysvětlitelných odúmrtí morfologicky normálního plodu v 10. a více týdnu gravidity s tím, že morfologie plodu byla dokumentována ultrasonograficky nebo přímým vyšetřením plodu jeden nebo více předčasných narození morfologicky zdravého novorozence ve 34. týdnu či dříve spojeném s těžkou preeklampsií nebo těžkou insuficiencí placenty NÁLEZY ACLA IgG a/nebo IgM isotypu jsou přítomny ve středním nebo vysokém titru, prokázány 2 a vícekrát v odstupu 6 a více týdnů, jsou vyšetřeny standardizovaným typem ELISA pro průkaz na ß 2 -glykoproteinu I závislých ACLA protilátek lupus antikoagulans prokázán dva a vícekrát v odstupu 6 a více týdnů detekce je provedena dle doporučení SSC Subcommittee pro lupus antikoagulants/fofolipidově závislé protiláteky v následujících krocích: průkaz prodloužení fosfolipidově -závislého screeningového testu nedochází ke korekci normální plazmou chudou na destičky zkrácení nebo korekce testu po přidání nadbytku fosfolipidů vyloučení jiných poruch krevního srážení (především inhibitor FVIII a heparin) Jistá diagnóza APS je v případě naplnění 1 klinického a 1 laboratorního kriteria. Kategorie "možného" nebo "pravděpodobného" APS nebyly na tomto sympóziu definitivně ustanoveny. Je však řada nemocných, u nichž je diagnóza antifosfolipidového syndromu možná, ale sapporská" kriteria nejsou naplněna. V roce 2000 formuloval Harris kriteria nejisté" diagnózy antifosfolipidového syndromu (83). Kriteria, za nichž je možné tuto diagnózu ustanovit shrnuje tabulka č. 6. -18-
Tab. č. 6: Kriteria nejisté" diagnózy antifosfolipidového syndromu KLINICKÁ KRITERIA 1) venózní nebo arteriální trombóza nebo opakovaná ztráta plodu 2) malé" známky onemocnění jako jsou chlopňové leze, transverzální myelopatie, trombocytopenie LABORATORNÍ KRITERIA + nízký titr antikardiolipinových protilátek ve třídě IgG nebo IgM (< 20 U/ml) a negativní lupus antikoagulans + pozitivní antikardiolipiny v jakékoli hladině a v jakékoli třídě nebo pozitivní lupus antikoagulans 3) kterákoli známka popsaná výše 1 a/nebo 2 + negativní antikardiolipiny a lupus antikoagulans ale pozitivní protilátky proti ß 2 -glykoproteinu 4) kterákoli známka popsaná výše 1 a/nebo 2 + negativní antikardiolipiny a lupus antikoagulans, negativní protilátky proti ß 2 -glykoproteinu, ale pozitivní protilátky proti protrombinu, proteinu C či anexinu V Na základě poznatků, že přítomnost inhibitoru lupus antikoagulans a protilátek proti ß 2 - glykoproteinu I je více asociována s trombózou nežli přítomnost antikardiolipinu, byla v roce 2002 na jednání standardizačního výboru ISTH (Mezinárodní společnostní pro trombózu a hemostázu) doporučena nová klasifikace laboratorních kriterií pro diagnózu antifosfolipidového syndromu (84). Doporučuje rozlišovat: Typ I: pozitivita lupus antikoagulans a současně pozitivita protilátek proti ß 2 - glykoproteinu I Typ II: izolovaný průkaz lupus antikoagulans Typ III: izolovaná pozitivita protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I Typ IV: průkaz jiných antifosfolipidových protilátek (proti fosfatidyletanolaminu, proti protrombinu atd.) Nález antikardiolipinových protilátek v tomto doporučení na novou klasifikaci nebyl výslovně zmiňován s tím, že průkaz protilátek proti kardiolipinu bude nahrazen více specifickým vyšetřením protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I. Toto doporučení však bylo v následných zprávách podrobeno kritice (85), protože značná část pacientů (až 26%) naplňujících sapporská" kritéria APS, by dle této klasifikace vůbec nebyla diagnostikována. Přes jisté rozpory, které t.č. v názorech na diagnostiku antifosfolipidových protilátek panují, lze v současné době akceptovat přítomnost protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I jako nezávislé laboratorní kriterium antifosfolipidového syndromu. Primární antifosfolipidový syndrom Stav, u nějž můžeme stanovit diagnózu antifosfolipidového syndromu, může vyplývat z nejrůznějších klinických situací. Obvykle rozlišujeme čtyři kategorie (86): a) antifosfolipidový syndrom spojený se systémovým onemocněním pojiva obvykle se SLE b) pacienty s antifosfolipidovým syndromem, u nichž nebylo zjištěno žádné doprovodné onemocnění systémového onemocnění pojiva - primární antifosfolipidový syndrom c) pacienty s antifosfolipidovým syndromem u nichž je podezření na systémové onemocnění pojiva, ale klinická kriteria tohoto onemocnění nebyla s jistotou naplněna - lupus-like" choroba -19-
d) antifosfolipidový syndrom z jiných príčin jako jsou léky, nádorová onemocnění, infekce. Řada těchto pacientů má jen antifosfolipidove protilátky bez klinické manifestace onemocnění, jsou-li přítomny, jsou obvykle lehké a přechodné Je dobře doloženým faktem, že systémové onemocnění pojiva se může vyvinout až po letech sledování, kdy byl pacient zařazen do kategorie primární antifosfolipidový syndrom (53,83). Diagnóza primárního antifosfolipidového syndromu může tedy být stanovena po té, co jsou naplněna kriteria antifosfolipidového syndromu a vyloučena jiná příčina, zejména systémové onemocnění pojiva. Vylučovací kriteria primárního antifosfolipidového syndromu byla stanovena již v roce 1993 Piettem (87) a jsou shrnuta v tabulce č. 7. Tab. č. 7: Vylučovací kriteria primárního antifosfolipidového syndromu KLINICKÁ KRITERIA tvářový exantém, diskoidní exantém ulcerace v ústech a hltanu (ulcerace nosního septa či perforace jsou připuštěny) klinicky zjevná artritída pleuritida bez přítomnosti plieni embólie či levostranného srdečního selhávání perikarditida bez přítomnosti infarktu myokardu či urémie léčba medikamenty, o nichž je známo, že indukují tvorbu antifosfolipidových protilátek LABORATORNÍ KRITERIA trvalá Proteinurie > 0,5g/den z důvodů biopticky ověřené imunokomplexové glomerulonefritidy lymfopenie méně než 1,0 x 10 9 /l protilátky proti nativní DNA prokázané RIA nebo imunofluorescenčně protilátky proti extrahovatelnému jadernému antigénu antinukleolární protilátky v titru více než 1:320 nález LE buněk v serózním výpotku Je doporučováno nejméně 5-ti lete sledování pacientů od doby vzniku klinických příznaků. Klinické projevy APS jsou však velmi pestré. Většina z nich je zapříčiněna trombotizací venózní nebo arteriální části cévního řečiště nejrůznějších systémů od velkých cév po mikrocirkulaci. Na změnách se podílí trombotická mikroangiopatie, druhotná ischémie zapříčiněná poruchou přítoku na základě okluze arteriálního řečiště, periferní embolizace z venózních, arteriální či intrakardiálních zdrojů. Teoreticky může být postižen jakýkoli orgán. Na klinickém průběhu se podílí jednak velikost postižené cévy, jednak rychlost a míra její okluze (88). Venózní žilní trombóza a plieni embolizace Venózní žilní trombóza, zejména manifestující se na dolních končetinách, je nejčastější klinickou manifestací antifosfolipidového syndromu. Objevuje s frekvencí 29-55 % nemocných s přítomnými antifosfolipidovými protilátkami v průměrné době sledování méně nežli 6-ti let (88). Ve velkém prospektivním sledování italského registru pro antifosfolipidove protilátky se trombotická manifestace objevovala s celkovou incidencí 2,5%/pacienta ročně, s tím, že u nemocných s anamnézou předchozí trombózy to bylo 5,4%/pacienta ročně, bez této předchozí manifestace 0,95%/ pacienta ročně. Zřetelná většina nemocných mělo idíopatický typ trombotické manifestace (89). -20-
Arteriální trombóza a/nebo okluze Je u antifosfolipidového syndromu o něco méně častým klinickým příznakem. Tíže příznaků je v korelaci s rozsahem postižení a rychlostí vzniku arteriální okluze. Nejčastějším postižením je ischemická cévní mozková příhoda, která tvoří 50% arteriálních postižení. Okluze koronárni tepny pak tvoří 23% případů, zatímco zbývajících 27% znamená arteriální postižení v nejrůznějších oblastech (88) jak budou ještě dále specifikovány. Kromě vzniku trombózy či okluze cévy ať již v arteriálním, venózním typu řečiště nebo v mikrocirkulaci, mohou se na některých klinických projevech antifosfolipidového syndromu podílet i jiné patofyziologické mechanizmy - ty budou zmíněny u jednotlivých klinických syndromů. Ovlivnění gravidity v případě pozitivních APA Branch nazývá graviditu "speciální šancí" na klinickou manifestaci nemocných s APA. Přepokládá, že nejdůležitější anatomické změny vznikají v děložních spirálních artériích lůžka placenty (90). Novější práce (91) zdůrazňují časnou poruchu placentace v průběhu sekundární invaze trofoblastu a negativní ovlivnění intertrofoblastické fúze. Mechanizmů, jimiž antifosfolipidové protilátky mohou vést k nepříznivému ovlivnění probíhající gravidity, však byla popsána celá řada (92). Patří sem např. zásah do mechanizmu apoptózy - vazbou na fosfatidylserin na aktivovaných nebo apoptotických buňkách (destičkách, endoteliích, buňkách trofoblastu nebo jiných), ß 2 -glykoprotein I (a tím i APA) slouží jako součást normálního mechanizmu, jímž je indukována apoptóza, nebo jímž jsou apoptotické buňky odstraňovány. Alternativně může vazba antifosfolipidových protilátek cestou ß 2 -glykoproteinu I vést k aktivaci endoteliálních buněk nebo destiček a tím indukovat vznik trombózy. Předčasná cévní okluze v placentě, vzniklá primárním postižením endotelia (tj. proliferací endoteliálních buněk) a/nebo trombózou, vede k narušení normálního průtoku placentou a může být příčinou předčasného ukončení gravidity. Protilátky proti fosfatidylserinu mohou negativně působit na diferenciaci trofoblastu včetně formace syncytia. APA mohou reverzibilně blokovat sekreci gonadotropinu či mohou zasahovat do aktivity anexinu V (placentárního antikoagulačního proteinu I) tvorbou komplexů, blokádou a nebo odstraněním anexinu V z jeho přirozených míst v placentě. Na experimentálních modelech bylo dokumentováno, že APA indukují resorpci myšího fétu. Zkřížená reaktivita APA s fosfolipidy vilózního trofoblastu může být příčinou destrukce trofoblastu cytologický mateřskými imunitními efektorovými buňkami. APA třídy G zvyšují produkci tromboxanu v tkáňových kulturách vytvořených z lidských placentárních explantátů. Tímto mechanizmem mohou zřejmě APA také redukovat průtok placentou, lnterleukin-3 (IL- 3) je důležitý pro udržení normálního průběhu těhotenství, zřejmě proto, že působí jako růstový faktor pro trofoblast. Snížená sérová hladina IL-3 byla opakovaně prokázána u nemocných s APA, ale i v jiných případech opakovaných ztrát plodu. Navíc je třeba brát v úvahu, že mnoho autoimunitních procesů může být spojeno se ztrátou plodu - autoimunitní postižení štítnice, diabetes mellitus, SLE a jiné, a jak orgánově specifické tak i neorgánové protilátky mohou samy o sobě, nebo jen preexistující porucha imunitního systému, být přímo zodpovědné za ztrátu plodu. Navíc sám proběhlý samovolný potrat má za následek rozsáhlé poškození tkání a u imunologicky senzitivních jedinců dochází k senzibilizaci imunitního systému matky fetoplacentámími antigény. Tak sporadický potrat bez vztahu k APS může potencovat tvorbu APA a výsledkem může být budoucí ztráta plodu již v rámci APS. -21 -
Matemální komplikace U žen s APA častěji vzniká" těhotenská toxémie" resp. preeklampsie (až 18%), zejména v případech primárního antifosfolipidového syndromu. Popisována je i chorea gravidarum. Část klinických příznaků, které byly dříve asociovány s APA, se dnes přisuzují dříve často používané léčbě kortikoidy - zvláště těhotenská hypertenze a předčasné porušení membrán plodu (PROM). V souvislosti s APA je popisována je vyšší incidence HELLP syndromu (hemolysis, elevated liver enzyme, low platelets). Poměrně vzácnou komplikací je postpartum cardiopulmonary syndrome" (93). Vzniká u žen s APA typicky 2-10 den po porodu. Je charakterizován febrilními špičkami, pleuritickou bolestí na hrudi, dyspnoí a pleurálními výpotky, skvrnitými plicními infiltráty, kardiomyopatií a komorovou arytmií. Většinou však tato pestrá Symptomatologie odeznívá spontánně bez potřeby terapeutického zásahu. Vyšší incidence arteriálních a venózních trombóz v průběhu gravidity a puerperia byla také opakovaně dokumentována, i když ne ve všech sledováních jednoznačně potvrzena (94). Běžným nálezem je trombocytopenie, obvykle ne příliš závažná, s počtem destiček mezi 50-100 x 10 9 /l. K vzácnějším komplikacím gravidity patří další projevy antifosfolipidového syndromu, jako jsou livedo reticularis, autoimunitní hemolytická anémie, postižení srdečních chlopní (Liman- Sacks-like), klinický obraz napodobující sclerosis multiplex, plieni hypertenze, postižení ledvin, event, katastrofický antifosfolipidový syndrom s vaskulámím oklusivním postižením v četných orgánových systémech. Otázkou, která ve vztahu komplikace těhotenství ze strany matky a pozitivních APA není dosud definitivně vyřešena, je problematika primární infertility a event, selhání in vitro fertilizace (IVF). Některé studie dokládají vyšší incidenci APA v těchto situacích, jiné naopak nepotvrdily žádné rozdíly mezí APA pozitivními a APA negativními ženami na konečný výhled event, gravidity (95). Stejně tak jen ojedinělé zprávy spekulují o možnosti vyšší incidence trombózy v průběhu IVF či ovariálního hyperstimulačního syndromu. Každopádně rutinní testování žen podstupujících IVF na přítomnost APA není jednoznačně doporučeno (96). Neonatální komplikace S ohledem na APA a jejich možný vliv na ukončení těhotenství se jeví jako výhodné rozlišení na fázi pre-embryonální (5 týdnů od 1. dne poslední menstruace), embryonální (od 5. do 9. týdne) a fázi fetální (ta je definována jako doba od 10. týdne gravidity resp. po 70. dnu od koncepce). Porucha těhotenství v pre-embryonální a embryonální fázi může mít celou řadu příčin jiných, nežli APA. Opakované ztráty plodu v této době jsou spojeny s výskytem APA asi v 6%. Na druhé straně, jsou-li mezi opakovanými předčasně ukončenými graviditami i ztráty ve fetálním období (nejméně jednou), jsou dle větších studií s nálezem těchto protilátek spojeny až v 80% (97). Proto lze uzavřít, že typickým nálezem antifosfolipidového syndromu jsou ztráty v pokročilejších fázích gravidity, tj. po 10. týdnu. K častým komplikacím těhotenství v případě APA jsou porucha růstu plodu v děloze (IUGR), popisovaná až ve 31% případů a dále narození nezralého plodu (43%). Jsou-li APA třídy IgG, nelze vyloučit transplacentární přenos prokoagulační tendence - byl popsán u plodu vznik ischemické ataky mozku nebo diseminované trombózy plodu. Po porodu obvykle nebývá IgG v cirkulaci plodu detekováno - předpokládá se, že protilátka je kompletně vázána na cílové struktury. -22-
Kožní projevy Přítomnost antifosfolipidových protilátek může být spojena s výskytem celé řady kožních projevů až u 41% pacientů s antifosfolipidovým syndromem (98). Při kožní manifestaci jsou častěji nalézány antikardiolipiny třídy IgA (99). Livedo reticularis Patří k nejčastějším projevům antifosfolipidového syndromu. Je charakterizováno síťovitým vzorkem modrofialového zabarvení kůže spojeným z poruchou normálního zabarvení uvnitř této sítě. Charakteristická je lokalizace na horních a dolních končetinách, ale v rozvinutých případech nezůstává lokalizace omezena a šíří se centripetálně. Neobvyklé je postižení obličeje, zejména nosu. Síťovitý charakter postižení je dán normální strukturou mikrovaskulatury kožního zásobení, kdy kónusy o průměru 1-4 centimetry jsou zásobovány jednou arteriolou. Porucha prokrvení je dána obstrukcí přítoku i odtoku krve, resp. i hyperviskozitou krve (100). Na rozdíl od "cutis marmorata", která je spíše variantou normy u mladých žen a dětí, má livedo reticularis nepravidelnou strukturu s porušenými segmenty (101). Je možná variace intenzity či rozsahu zabarvení v závislosti na teplotě prostředí či poloze těla, nicméně nález na rozdíl od "cutis marmorata" nemizí zcela. V kombinaci s ischemickým vaskulárním postižením mozku hovoříme o Sneddonově syndromu. V histologickém nálezu z centra kožní leze můžeme nalézt normální tkáň, případně obliterujíci endarteritidu v hlubokých arteriolách dermis či hypodermis. V postižené tkáni (z retikulinové sítě) je zjišťována hyperplázie kožních cév. Kožní ulcerace Jsou pozorovány u 20-30% pacientů s antifosfolipidovým syndromem (98). Jde většinou u malé (0,5-3,0 cm v průměru), bolestivé afekce na kůži, často hvězdicovitého tvaru či nepravidelných okrajů, provázené purpurově-hnědavým lemem a rekurentní purpurou. Jsou nejčastěji lokalizovány na kotnících a chodidlech. Obtížně se hojí, často s následnou atrofickou jizvou a tmavě pigmentovaným lemem. V histologickém obraze je možné zjistit vaskulární trombotizací, kapilární proliferaci, kožní hemorrhagii, depozita hemosiderinu resp. obliterujíci endarteritis. Nekrotizující vaskulitida a livedoidní vaskulitida Podkladem těchto změn je hyalinizující segmentální vaskulitida kožních cév spojená s trombotickou okluzí a lymfatickou infiltrací. Klinicky se manifestují livedoidními lezemi, purpurou s tendencí ke vzniku ulcerací, které se pokrývají tmavou krustou se zánětlivými liniemi. Po týdnech až měsících se hojí porcelánovitými hvězdicovitými jizvami s atrofií, přítomnými teleangiektasiemi a hyperpigmentovanym ohraničením. Charakteristický je výskyt u mladých žen, má sezónní charakter exacerbací a lokalizaci na dolních končetinách. Kožní gangréna a nekróza Kožní gangréna s postižením prstů je dobře popisovaný příznak antifosfolipidového syndromu s frekvencí výskytu okolo 3% pacientů (100). Proces začíná erythematoidními makulózními změnami, cyanosou nebo pseudocelulitidou, které vyústí do nekrózy. Angiografie potvrzuje okluzi či těžkou stenózu středně velkých či větších cév. Nálezy jsou častější u kuřáků, hypertoniků, žen na hormonální kontracepci, resp. u nemocných s predispozicí vrozené trombofilie. V histologickém nálezu kožní excise je přítomna cévní trombotizace, obliterujíci endarteritida, epidermání nekróza a kožní hemorrhagie. Náhlý vznik kožní nekrózy je popisován rovněž u 3% nemocných (98). Je charakterizován rozsáhlou bolestivou leží charakteru purpury, následován černým nekrotickým plakem s -23-
prokrvácenými hranicemi a vnikem buly. Lokalizace je nejčastější na končetinách, obličeji (líce, nos, uši) nebo v hýžďové oblasti. V histologickém nálezu je charakteristická trombotizující mikroangiitida. Povrchová tromboflebitis Ke vzniku nálezu vede obdobný mechanizmus jako při rozvoji hluboké žilní trombózy. Pseudo-vaskulitické leze Do tohoto pojmu je obvykle zahrnováno poměrně široké spektrum kožních nálezů, které se mohou u antifosfolipidového syndromu vyskytnout. Zahrnují erytematózní makuly, bolestivé noduly, purpurózní projevy, palmární-plantární erytém. Nejčastějším histologickým nálezem je mikrotrombotizace kožních cév. Subunguální hemorrhagic Originálně popisované u subakutní bakteriální endokarditidy, u antifosfolipidového syndromu jsou zapříčiněny nejčastěji trombembolickým procesem. Charakteristické jsou "třískovité", podélně orientované, červenohnědé až černé afekce, které nemizí po tlaku na vlastní nehet. Jejich nález na více než jednom nehtovém lůžku signalizuje nutnost pátrat po vyvolávajícím doprovodném onemocnění. Neurologické aspekty přítomnosti antifosfolipidových protilátek Neurologické symptomy jsou přítomny u řady pacientů s prokázanými antifosfolipidovými protilátkami, avšak ne všechny studie dobře prokazují signifikantní korelaci mezi těmito nálezy a hladinou antifosfolipidových protilátek (102). U některých projevů je jasný vztah k trombembolicke manifestaci těchto protilátek, u jiných se předpokládá jiný mechanizmus na protilátkách závislý. Cerebrovaskulární ischémie Je nejčastější arteriální trombotickou manifestací u nemocných s antifosfolipidovým syndromem (103). Může jít o dokonanou cévní mozkovou příhodu i tranzitomí ischemickou ataku. Zdá se, že svou roli zde hrají i další rizikové faktory, i když recentní práce dokumentují rozhodující roli protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I bez ohledu na přítomnost či nepřítomnost hypertenze (104). Průměrný věk postižených pacientů je o několik desetiletí nižší nežli je běžná klinická manifestace těchto příhod bez přítomnosti APA (102). Výskyt příhod je také častější v případech, kdy jde o primární antifosfolipidový syndrom (1). Některé práce dokumentují význam koexistence různých typů antifosfolipidových protilátek - např. proti ß 2 - glykoproteinu I a fosfatidylsehnu/protrombinu - zde se předpokládá aktivace trombocytů jako součást patogenetického mechanizmu vzniku arteriální trombózy (105). Postižena může být kterákoli část cévního řečiště. Nejčastěji angiografie prokazuje okluzi intrakraniálního větvení nebo trunku. Nebývá však typická ateromatózní leze při bifurkaci karotid. U nemocných s primární formou antifosfolipidového syndromu je popisováno ztluštění intimy-medie karotické tepny (106). U třetiny pacientů s antifosfolipidovými protilátkami je navíc abnormální echokardiografický nález nejčastěji prokazující nespecifické ztluštění levostranné chlopně, většinou mitrální. Klinický obraz i histopatologické nálezy u nemocných s katastrofickým průběhem antifosfolipidového syndromu prokazují vícečetné okluze malých cév (trombotickou mikroangiopatii). -24-
Trombóza cerebrálního venózního sinu Vznik této komplikace je u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami vázán na mladší věk, větší rozsah postižení superficiálního řečiště a postižení hlubokého řečiště ve srovnání s případy, kdy antifosfolipidové protilátky prokázány nebyly (103). Demence a jiné kognitivní dysfunkce V lehkém případě jsou pacienti postiženi zapomnětlivostí, poruchou pozornosti, obtížemi soustředit se na otázky - tyto potíže mohou být jedinou klinickou manifestací antifosfolipidového syndromu (102). Bylo popsáno zhoršení výkonnosti, verbálního učení a paměti a schopnosti prostorového vidění - tyto nálezy mohou indikovat preklinickou fázi neurologického postižení (103). Klinické projevy nemusí být spojeny s žádným nálezem na MRI mozku a proto se předpokládá nejen snížený průtok krve CNS, ale i přímý efekt antifosfolipidových protilátek na funkci neuronu. Také část případů Sneddonova syndromu je spojeno s přítomností antifosfolipidových protilátek - v tomto případě řada případů vyústí do demence na bází mnohočetných mozkových infarktů. Rozsah postižení koreluje s nálezem na nukleární magnetické rezonanci (NMR) (101). Do demence mohou vyústit i jiné případy antifosfolipidového syndromu bez kožního postižení - i zde je mnohočetné ischemické postižení mozku obvyklým nálezem. Případy katastrofického antifosfolipidového syndromu jsou až v 50% provázeny akutním vznikem fulminantní encefalopatie (102). Je nutno zde také zmínit možnost ovlivnění kognitivních funkcí medikací - steroidy, která je podávána z indikace základního onemocnění u sekundárních antifosfolipidových syndromů např. při SLE a revmatické arthritidy. Diferenciální diagnóza je v těchto případech obtížná. Psychóza a jiné afektivní poruchy I když poruchy chování, psychiatrické potíže až jasné případy psychózy byly popsány u pacientů s APS, nelze na základě současných zkušeností jednoznačně potvrdit kausální roli těchto protilátek, i když v některé malé studie u pacientů s první atakou psychózy prokazovaly častější nález APA nežli v běžné populaci i u nemocných bez jiného autoimunitního onemocnění (103). Svou roli na rozvoj onemocnění zde může sehrát i vlastní chronické onemocnění či léčba steroidy. Navíc některá neuroleptika sama mohou tvorbu antifosfolipidových protilátek indukovat. Migréna Nebyla prokázána asociace antifosfolipidových protilátek s migrénou. Nicméně NMR u nemocných s pozitivním nálezem protilátek prokazuje častěji permanentní fokální postižení bez ohledu na přechodný průběh klinické manifestace a také dochází častěji k jinak vzácnému migrenóznímu cerebrálnímu infarktu. Křeče Literární data dávají různé výsledky při studiu vztahu epilepsie a antifosfolipidových protilátek. Nicméně pokusy na zvířatech prokazují přímou vazbu APA v mozku a jejich schopnost snižovat obsah chloridů v neuronech cestou ovlivnění receptoru kyseliny gamaaminobutyrové (GÁBA); tento inhibiční mechanizmus vede k přímému reverzibilnímu snížení prahové pohotovosti ke křečovým stavům. -25-
Chorea Chorea se může vyskytnou u primárního i sekundárního antifosfolipidového syndromu. Vzhledem k časté manifestaci v graviditě, puerpehu či při hormonální kontracepci se předpokládá role estrogenu při rozvoji klinických příznaků. Za použití pozitronové emisní tomografie (PET) byl u těchto nemocných prokázán přechodný hypermetabolizmus v kontralaterálním basálním gangliu a proto se zde předpokládá spíše excitační vliv protilátek nežli dříve předpokládaná porucha prokrvení (102). Transverzální myelopatie a multiple sclerosis - like" syndrom První popis transverzální myelopatie v přítomnosti antifosfolipidových protilátek pochází od Harrise a spolupracovníků z roku 1985. Od té doby bylo dokumentováno více případů; u části z nich se předpokládá cévní postižení, u jiných negativní NMR nález a úspěšnost imunosupresivní a nikoli antitrombotické léčby předpokládá spíše přímý vliv autoprotilátek či zánětlivé vlivy. Přítomnost APA může být spojena s projevy, které napodobují obraz roztroušené sklerózy. Klinický neurologický nález ani laboratorní vyšetření nemusí s jistotou oba stavy rozlišit. Podle některých prací je možné rozlišení na základě NMR - případy roztroušené sklerózy jsou spojeny s více rozšířeným postižením bílé hmoty, zatímco případy s pozitivitou APA mají abnormity zejména v oblasti putamen. Jiní však tuto NMR asociaci nepotvrdili. Obvykle je doporučováno přihlížet k jiným klinickým projevům antifosfolipidového syndromu (103). Další neurologické manifestace spojené s přítomností antifosfolipidových protilátek Přítomnost antifosfolipidových protilátek byla prokázána u některých případů Guillainova- Barrého syndromu, u sensoneruální ztráty sluchu - zejména při jeho náhlém vzniku; zde se předpokládá cévní geneze potíží. Také některé stavy přechodné globální amnézie - náhlé nevysvětlitelné ztráty paměti jsou dávány do souvislosti s APA. K projevům APS patří i postižení optického nervu. Při neurologických symptomech v přítomnosti antifosfolipidových protilátek je indikováno vyšetření mozku resp. i míchy nukleární magnetickou resonancí (NMR). Nejčastějším nálezem jsou malé fokusy vysokého signálu v subkortikální bílé hmotě rozeseté difúzne po mozku. Tento nález však není specifický. I když je užitečné prokázat strukturální leze jako jsou infarkty a hemorágie, NMR špatně koreluje s difúzni či globální dysfunkcí. Tyto potíže nezřídka neodhalí ani PET (102). Kardiální postižení u antifosfolipidových protilátek Postižení chlopní Jak primární tak i sekundární výskyt antifosfolipidových protilátek je spojen s nálezem postižení chlopenního aparátu srdce, což je u těchto nemocných nejčastější kardiální manifestací (107). V patofyziologii se předpokládá APA vyvolaná aktivace endoteliálních buněk na chlopních a následná lokální zánětlivá reakce, která vyústí v chlopenní postižení. Celá situace je navíc podpořena obecnou protrombotickou tendencí. V echokardiografických nálezech je patologie nalézána u třetiny nemocných s primárním antifosfolipidovým syndromem (108,109). Nejčastějším nálezem je ztluštění chlopně, obvykle 2-3 násobné ve srovnání s normální chlopní. Postižena je chlopeň mitrální, méně často aortální, zatímco postižení pulmonální či trikuspidální chlopně je popisováno zřídka. Asi -26-
čtvrtina nemocných (109) má mitrální regurgitaci, jako nejčastější hemodynamickou abnormitu. Aortální regurgitace se nachází zřídka a stenóza ať již mitrálního či aortálního ústí jsou vzácným nálezem. Funkční změny na pravostranných chlopních jsou obvykle sekundární (plieni hypertenze, mitrální či aortální regurgitace). Echokardiografické vyšetření obvykle umožní i odlišení změn vztažených k působení antifosfolipidových protilátek od změn při revmatické horečce či infekční endokarditidě (ztluštění chlopně je difusní, v případech, kdy je lokalizované je postižen střed či báze chlopenního cípu). U pacientů s přítomností antifosfolipidových protilátek je vyšší prevalence nebakteriálních vegetací zejména na mitrální chlopni. Koronárni arteriální choroba Přítomnost antifosfolipidových protilátek nebyla s jistotou prokázána jako nezávislý rizikový faktor pro nestabilní angínu pectoris. Zdá se však být nezávislým rizikovým faktorem pro rozvoj infarktu myokardu a náhlou kardiální smrt (109). Svou roli zde zřejmě hraje proaterogenetický efekt protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I a tím nový model imunitně podmíněné aterosklerózy. Kausální role antifosfolipidových protilátek při rozvoji koronárni příhody bez postižení koronámích artérií se však spíše nepředpokládá (110). Přítomnost antifosfolipidových protilátek hraje svou roli pří terapii koronárni srdeční nemoci -je vyšší incidence okluze štěpu po provedeném by-passu i restenózy po perkutánní koronárni angioplastice. Další možné kardiální manifestace přítomnosti antifosfolipidových protilátek U pacientů s přítomností antifosfolipidových protilátek je popisováno vyšší riziko vzniku intrakardiální trombu, ojediněle je popisována i souvislost s akutní kardiomyopatií (na patofyziologickém základě kardiální mikrovaskulopatie), resp. i chronické kardiomyopatie (109,110). Ledviny Podobně jako v ostatních parenchymatózních orgánech je přítomnost antifosfolipidových protilátek provázena zvýšenou tendencí k trombotickému procesů v ledvinných cévách a to na všech úrovních cévního zásobení, počínaje od hlavní ledvinné tepny a jejich větví, přes arterioly, glomerulámí kapiláry až po ledvinné žíly (111). Proces v ledvinách je jak z patofyziologického, tak i klinického pohledu komplikován tím, že ledviny jsou orgánem, jež může být postižen jak přítomností vlastních antifosfolipidových protilátek, tak i základním onemocněním - procesem, který je příčinou indukce těchto protilátek. Tím je nejčastěji systémové onemocnění pojiva (ať už SLE, vaskulitidy), ale i jiné stavy, které jednak indukují tyto protilátky a jednak samy o sobě poškozují ledviny (například nádorová onemocnění vyvolávající trombotickou mikroangiopatii samy nebo díky své léčbě, nebo vyvolávají DIC). Jinou možností je nepřímé poškození ledvin vlastními APA - např. APA indukovaná preeklampsie nebo HELLP syndrom. Z tohoto pohledu je nutno vyspecifikovat postižení ledvin taková, která jsou s vysokou pravděpodobností zapříčiněna vlastními APA bez ohledu na jiné vztahy, byť patogenetický mechanismus ledvinného poškození v tom kterém konkrétním případě může být nejednoznačný a komplexní. Situace je navíc ovlivněna i faktem, že i sama chronická renální insuficience v dialyzačním programu je sekundární indukcí antifosfolipidových protilátek nezřídka provázena. -27-
Postižení renální tepny U nemocných s antifosfolipidovými protilátkami mohou vznikat okluze či stenózy ledvinných tepen a to jak velkých tak i středně velkých. Klinickou manifestací je především těžká renovaskulámí hypertenze, bolesti v bederní oblasti, hematurie a zejména v případech primárního antifosfolipidového syndromu i renální selhání (112). Trombóza glomerulars kapiláry Vznik hyalinních trombů je popisován u nemocných s akutní obvykle proliferativní lupus nefritidou. Některé práce však dokumentují výrazně častější nález u nemocných s přítomností lupus antikoagulans - tedy při sekundárním antifosfolipidovém syndromu. Intrarenální cévní postižení Tyto nálezy jsou někdy shrnovány do pojmu nefropatie antifosfolipidového syndromu" (APSN). V klinickém obrazu dominuje obvykle těžká systémová hypertenze, akutní nebo chronické ledvinne selhání, Proteinurie - lehká až obraz nefrotického syndromu, je přítomna téměř u všech nemocných. Hematurie je nekonstantním nálezem. V histologickom obraze nacházíme postižení intrarenálních cév s fibrotickou vaskulární okluzí (artérioskleróza, fibrózní intimální hyperplazie, arteriální okluze, fokální kortikální atrofie) a akutními mikrotromby, u třetiny nemocných je zjišťována trombotická mikroangiopatie. U části nemocných je popisována také intersticiální fibróza a tubulámí atrofie (111). Sapporská kriteria antifosfolipidového syndromu vyžadují vyloučení zánětlivých změn, proto je obvykle uvažováno, že do obrazu postižení při přítomnosti antifosfolipidových protilátek nepatří vaskulitida a zánětlivé cévní leze - Levy však v roce 1998 popsal tři nemocné s primárním antifosfolipidovým syndromem s nálezem fokálně segmentální glomerulonefritidou, resp. elektronmikroskopicky prokázaným ukládáním imunitních komplexů (113). Trombóza ledvinných žil Jak trombóza hlavní žíly, tak i trombózy menších ledvinných žil jsou popisovány jak u primárního tak i sekundárního antifosfolipidového syndromu. Bilaterální postižení může být příčinou renálního selhání. Terminálni renální choroba ( End-stage renal disease") V případech, kdy není příčina renálního postižení jasně určena je vyšší prevalence nálezu antifosfolipidových protilátek, zejména lupus antikoagulans (112). Transplantace ledviny Nález antifosfolipidových protilátek se zdá být prognosticky nepříznivou známkou pro výsledek transplantace ledviny a přežití štěpu (114). Plieni manifestace Plieni embólie a infarkt Patří k nejčastějším manifestacím antifosfolipidového syndromu (115) - až třetina pacientů s trombózou má tuto komplikaci, u 9% nemocných jde o první projev choroby (116). -28-
Plieni hypertenze Je definována jako střední tlak v plieni artérii vyšší nežli 25 mmhg. Primární plieni hypertenze pak předpokládá vyloučení celé řady příčin (zejména chronickou hypoxii, levostranné komorové selhávání a opakovanou plieni embolizaci). V patofyziologii se předpokládá účast více faktorů, zejména pak nerovnováha mezi vasoaktiviními látkami - tj. kysličník dusný a prostacyklin na straně jedné a zvýšená exprese endotelinu 1 a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) na straně druhé, dále pak poruchy kanálu pro K+, event, i klonální expanze endoteliálních buněk (117). U antifosfolipidového syndromu se plieni hypertenze popisuje s frekvencí okolo 2-5%. Příčinou je nejčastěji plieni embolizace, levokomorové plieni selhání (dysfunkce chlopní, infarkt myokardu, kardiomyopatie), vzácně také portální hypertenze či plieni venookluzivní choroba. Primární plieni hypertenze je v souvislosti s přítomností antifosfolipidových protilátek popisována spíše raritně. Trombotická mikroangiopatie Také plieni parenchym může být v případě antifosfolipidových protilátek postižen mikrotrombotizací - v klinickém obrazu může při chronickém průběhu dojít ke vzniku plieni hypertenze, v při akutním či subakutním průběhu dochází ke vzniku syndromu akutního respiračního selhání (ARDS) nebo ke vniku intraalveolámí plieni hemorágie (88). Popôrodní syndrom Plieni manifestace jsou dominující u vzácného postpartum cardiopulmonary syndrome". Vzniká u žen s APA typicky 2-10 den po porodu. Je provázen vznikem horeček, pleuritickou bolestí na hrudi, dyspnoí a pleurálními výpotky, skvrnitými plicními infiltráty, kardiomyopatií a komorovou arytmií. Většina příznaků odeznívá během několika dnů i bez kausální léčby (118). Oční komplikace u antifosfolipidového syndromu Trombotické postižení očních struktur je jedním z rysů antifosfolipidového syndromu. Amaurosis fugax Epizodická monookulární ztráta vizu je popisována v souvislosti s přítomností antifosfolipidových protilátek od konce 80-tých let (119). Je charakterizována vznikem v mladém věku a vysokou frekvencí epizod - až 20 denně (120). Obvykle není prokázána embolizace retiny a nález na echokardiogramu může být normální. Vasookluzivní retinopatie a chordopatie Primární postižení v přítomnosti antifosfolipidových protilátek je spíše vzácné (120), častěji při sekundárním antifosfolipidovém syndromu. Relativně časté je současné postižení CNS. Část nemocných může mít patologický oční nález (či fluorescenční angiografii) bez klinických symptomů (121). Ojediněle byla popsána současná klinická manifestace trombotické trombocytopenické purpury (122). Optická neuropatie Jak primární tak i sekundární přítomnost antifosfolipidových protilátek je dávána do souvislosti s optickou neuropatií. Kromě ischemického postižení - snížení krevního zásobení -29-
ze zadních ciliárních artérií zde může svou roli hrát přímé axonální postižení. V klinickém obrazu je popisována akutní retrobulbární optická neuritida, ischemická optická neuropatie a progresivní optická atrofie. Gastrointestinální postižení u antifosfolipidových protilátek Postižení jater Jaterní postižení je relativně vzácné u antifosfolipidového syndromu (123). Alterace jaterních testů, která je relativně častěji popisována, může mít jiné příčiny, nežli vlastní vliv antifosfolipidových protilátek - vyvolávající onemocnění nebo podávaná léčba. APA jsou však udávána jako častá příčina Budd Chiariho syndromu (123,124). Dalším postižením může být venookluzivní nemoc jater, nodulární regenerativní hyperplazie (124,125), vzácně je taktéž popisována jinak nevysvětlitelná portální hypertenze (124). Postižení střeva Trombotizace mezenterických cév či jejich okluze může vést ke klinické manifestaci infarktu střeva či abdominální angíny (124). Také ischemická kolitida patří do spektra možné, byť poměrně vzácné intestinální manifestace antifosfolipidového syndromu. Popisovány jsou i esofageální ulcerace (88). Je nutno ovšem připomenout, že chronické zánětlivé střevní procesy mohou být samy přítomností antifosfolipidových protilátek provázeny, na což je potřeba myslet v diferenciální diagnostice. Další gastrointestinální a intraabdominální postižení u antifosfolipidového syndromu. Trombóza či trombotická mikroangiopatie může postihnout kterýkoli s parenchymatózních orgánů - proto do klinických projevů antifosfolipidového syndromu vzácně patří i splenický infarkt, postižení pankreatu i s rozvojem akutní pankreatitidy (88,124). Tato postižení jsou častější u katastrofických forem. Vzácně je popisována i akalkulózní cholecystitida. Postižení endokrinních žláz Hypoadrenalismus a Addisonova choroba Úloha antifosfolipidových protilátek se zdá být kausální při vzniku řady případů Addisonovy choroby (123). Postižení je častější u primárního výskytu a nezřídka k němu dochází i při katastrofickém průběhu onemocnění (124). Na snadném" postižení nadledvinek se mohou podílet speciální patofyziologické mechanizmy - vysoký podíl buněk fascikulární zóny kůry nadledvin na metabolismu cholesterolu, význam pozdních endozomů a kyseliny lysobisfosfatidové (LBPA) na transportu a uchovávání cholesterolu a dále fakt, že LBPA může být cílovým antigenem antifosfolipidových protilátek (126). Tím může docházet k akumulaci antifosfolipidových protilátek v této oblasti, druhotné aktivaci endoteliálních buněk, k lokálním mikrotrombotizacím a k následnému krvácení do ischemických ložisek. Jiná endokrinní postižení Infarkty či mikrotrombotizace mohou postihnout i jiné endokrinní orgány - jsou popisovány pituitární insuficience (zřejmě některé případy Sheehanova syndromu jsou této geneze), infarkty testikulární, epidydimální a infarkty prostaty (123). -30-
Osteoartikulární postižení Avaskulární kostní nekróza je dle některých studií dávána do souvislosti s antifosfolipidovými protilátkami (127). Nicméně trombóza arteriální ani venózní nebyla prokázána jako možný patofyziologický podnět k jejímu vzniku. Ve skupině nemocných s histologický dokumentovanou alveolárni osteonekrózou čelisti byly antifosfolipidové protilátky prokázány asi u třetiny případů (128) Ke klinickým projevům antifosfolipidového syndromu patří poměrně často i artralgie, nicméně klinicky zjevná artritída je pro primární antifosfolipidový syndrom vylučujícím kriteriem (87). Hematologické změny u antifosfolipidových protilátek Trombocytopenie u antifosfolipiodových protiolátek Trombocytopenie je poměrně častým nálezem u antifosfolipidového syndromu, je popisována u 20-30% nemocných (116,129). Ve skupině pacientů se sekundárním výskytem antifosfolipidových protilátek je trombocytopenie udávána ve 49% při nálezu lupus antikoagulans a ve 33% u pozitivity antikardiolipinových protilátek (130). Počet trombocytu bývá obvykle jen lehce snížen, trombocytopenie má chronický charakter a nebývá provázena krvácivými komplikacemi. Počet destiček nižší nežli 50 x 10 9 /l je vzácný a i v tomto případě jsou spontánní krvácivé projevy spíše neobvyklé. I u závažných poklesů počtu trombocytu však nejsou vyloučeny trombotické komplikace (67). V patofyziologii se předpokládá spíše second hit" teorie - na již dříve aktivované trombocyty se váží protilátky cestou ß 2 -glykoproteinu I, další aktivace trombocytu je pak zprostředkována reakcí mezi Fc fragmentem imunoglobulinu a Fcy RH receptorem (131). Jiné příčiny trombocytopenie v případě antifosfolipidových protilátek Nález antifosfolipidových protilátek může provázet idiopatickou trombocytopenickou purpuru až ve třetině případů (67, 68). Počet trombocytu je zde obvykle nižší než u pouhé přítomnosti antifosfolipidových protilátek (méně než 50 x 10 9 /l), je možný průkaz také specifických antitrombocytárních protilátek. V ojedinělých publikacích byla pospána vyšší frekvence antifosfolipidových protilátek při průkazu EDTA-indukované pseudotrombocytopenie. V rámci diferenciální diagnostiky trombocytopenie u pacientů s průkazem antifosfolipidových protilátek je nutno brát v úvahu možnost indukce diseminované intravaskulámí koagulace nebo trombotické trombocytopenické purpury buď identickým základním onemocněním nebo jeho terapií. Výjimečně byla popsána manifestace TTP u primárního antifosfolipidového syndromu (67). Trombotická mikroangiopatie někdy provázená i mikroangiopatickou hemolytickou anémií je však relativně častým nálezem u nemocných s antifosfolipidovým syndromem a proto trombocytopenie zde zjišťovaná může být částečně i této geneze. Pozitivní protilátky proti erytrocytům a autoimunní hemolytická anémie u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami Pozitivní přímý antiglobulinový test (PAT) je popisován u jedinců s přítomnými antifosfolipidovými protilátkami jak u sekundárního výskytu v rámci SLE - zde je výskyt udáván až mezi 30-50%, tak i u primárního antifosfolipidového syndromu - okolo 14% (67). Pozitivita jak PAT tak i APA byla prokázána vzácně i u zdravých dárců krve (132). Projevy autoimunitní hemolytické anémie (AIHA) jsou méně časté - u nemocných s primárním výskytem antifosfolipidových protilátek okolo 4% (67). -31 -
Přímá vazba antifosfolipidových protilátek na membránu erytrocytu je pravděpodobná, což podporuje řada nálezů - průkaz antikardiolipinových protilátek v eluátech z erytrocytu u nemocných s AI HA a APA, korelace mezi titrem antifosfolipidových protilátek a intenzitou hemolýzy, antierytrocytární aktivita z eluátů může být inhibována absorpcí na fosfolipidové struktury a antikadiolipinová aktivita přítomná v eluátech může být inhibována absorpcí na fixované erytrocytární membrány. Antigen, který by však mohl být antifosfolipidovými protilátkami vázán na povrhu erytrocytu, však nebyl objeven. Negativně nabité fosfolipidové struktury se za normálních okolností nacházejí jen na vnitřní straně erytrocytární membrány. Roli zde může hrát široká zkřížená reaktivita některých antikardiolipinů třídy IgM, které mohou alternativně reagovat s neutrálně nabitým fosfatidylcholinem, jenž je exprimován na povrchu erytrocytu při bromelinovém testu. Jiné teorie připouští roli imunitních komplexů fixovaných na povrch erytrocytu (67). Opakovaně byly prezentovány případy Evansova syndromu při nálezu antifosfolipidových protilátek (133). Kromě autoimunitního mechanizmu se na anémii u těchto stavů může podílet mikroangiopatická hemolýza a anémie chronických onemocnění tam, kde jde o sekundární výskyt autoprotilatek. Jiné cytopenie u antifosfolipidových protilátek Některé práce dokumentují klinickou korelaci mezi neutropenií a sekundárním výskytem antifosfolipidových protilátek u SLE. Závažnou byť vzácnou komplikací může být nekróza kostní dřeně, provázané těžkou pancytopenií a špatnou prognózou (67). Katastrofický antifosfolipidový syndrom Jde o vzácně se vyskytující onemocnění charakterizované akutně vznikajícími mnohočetnými nezánětlivými cévními okluzemi postihujícími více orgánů a tkání vznikající v přítomnosti antifosfolipidových protilátek (2). Vzhledem k tomu, že k tomu katastrofický antifosfolipidový syndrom (CAPS) postihuje jen malou část nemocných, kteří mají antifosfolipidové protilátky, předpokládá se úloha i dalšího resp. dalších mechanismů, než jen obecný protrombogenní potenciál antifosfolipidových protilátek, který zahájí difusní, multiorgánovou mikrovaskulopatii. K těmto přídatným stimulům zřejmě patří cytokiny, komplement a jeho části a další autoprotilátky (134,135). Důležitými mediatory aktivace endoteliálních buněk u CAPS se zdají být TNF-alfa, interferon- Y a interleukin 1. K aktivaci endotelu může docházet pod vlivem některých částí komplementu, zejména C3b, ic3b a C5a. Také komplex C5b-C9 (MAC - membrane attack complex) vede ke zvýšení adhezívních molekul endotelu, zejména pak zvýšení exprese TF. C1a je zase kofaktor potřebný ke stimulaci endotelia cirkulujícími imunokomplexy. Reakce s buňkami endotelu byla potvrzena v in vitro studiích u různých autoprotilatek, nejen APA, ale i přímé antiendoteliální protilátky a anti-dsdna. Tyto imunoglobuliny všechny vedou ke zvýšení exprese TF na těchto buňkách. Aktivace endoteliálních buněk provázená zvýšením adhezívních molekul a zvýšenou expresí tkáňového faktoru je zřejmě klíčovým momentem pro vznik CAPS. Stejné mediatory mohou působit i na leukocyty, trombocyty, zvyšovat jejich adhezi na cévní endotel a podporovat mikrotrombotizaci, uvolnění toxických mediátorů včetně volných kyslíkových radikálů. Tyto interakce pak v konečném důsledku vedou k difusní mikroangiopatii charakterizující CAPS. Z tohoto důvodu se zdá být mnoho patogenetických i klinických paralel se SIRS, který může vznikat jak u sepsí, tak ale i z neinfekčních příčin, jako imunitně způsobené multiorgánové postižení. Syndrom postihuje častěji ženy (2:1). Většina dosud popsaných případů vznikala u PAPS, méně často u SLE (cca 30%), vzácné jsou popisy u SLE-like syndromů či jiných systémových onemocnění pojiva (Sjogrenův syndrom, revmatická artritída a další). Asi třetina nemocných měli v anamnéze již prodělanou příhodu venózního trombembolizmu, -32-
arteriální trombózy se vyskytly u méně než čtvrtiny nemocných, stejně tak jako anamnéza samovolných potratů. Vzácný je v předchorobí nález trombocytopenie - méně než 10%, ojedinělý je případ prodělaného HELLP syndromu (135). Jako možný spouštěcí moment se uvažují nejčastěji infekce (horní respirační trakt, střevní infekce), dále užívání léků (thiazid, Captopril, orální kontraceptiva) nebo většinou drobné chirurgické zákroky, resp. i ukončení těhotenství. U některých pacientů bylo v časném předchorobí provedeno vysazení antikoagulační léčby (134,135). Pro stanovení diagnózy je zapotřebí průkazu postižení tři a více orgánových systémů, histopatologického průkazu okluze velkých nebo malých cév a laboratorního průkazu přítomnosti antifosfolipidových protilátek (36). Častým jevem je taktéž trombocytopenie. U 27 (134) až 28% (135) nemocných se rozvíjí syndrom diseminované intravaskulámí koagulace. Na rozdíl od běžného průběhu APS je u CAPS hluboká žilní trombóza neobvyklá. Klinické nálezy a postižení jednotlivých orgánových soustav shrnuje tabulka č. 8. Tab. č. 8: Klinické nálezy u CAPS POSTIŽENÝ ORGÁN INCIDENCE (%) KLINICKÁ MANIFESTACE Ledviny 80 zvýšená urea, kreatinin, sekundární hypertenze Plíce 67 těžká dyspnoe, ARDS, mnohačetná plieni embolizace, intersticiální infiltráty, intraalveolámí hemorrhagie nervový systém 57 intrakraniální infarkty spíše vzácné, poruchy chování, emoční labilita, zmatenost, stupor, epileptiformní křeče, grand mail, status epilepticus, mnohočetné mononeuritidy, postižení cév retiny kard.-vaskulární systém 48 difusní kardiální postižení, méně často typický AIM gastrointestinální systém 38 postižení v. mesenterica, portae i v. cava inferior, arteriální okluze provázené gangrénou střeva kůže 49 livedo reticularis, uleerace, gangréna, purpura, akrocyanosa, ischémie prstů, třískovité hemorrhagie jiné < jrgány játra slezina pankreas nadledvinky» testes» prostata 33 19» 10» 26» 8. 1,75 V. LÉČEBNÉ OVLIVNĚNÍ ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK Primární prevence Léčebný přístup k nemocným, u nichž je průkaz APA doposud klinicky asymptomatický, není s definitivní platností vyřešen. Řada z těchto pacientů nikdy trombembolickou příhodu neprodělá, i když je přítomnost APA dlouhodobá či trvalá. V úvahu přichází následující postupy (136): -33-
Žádná trvalá léčba. Pacientům je doporučeno vystříhat se dalších rizikových faktorů - orální kontracepce, kouření, obezita, ale také např. léčby COX-2 inhibitory. Je naopak zavedena náležitá léčba hypertenze a hypercholesterolémie. Krátkodobá antitrombotická profylaxe obvykle nízkomolekulárním heparinem je zavedena při dalším navýšení trombofilního rizika - operace, úrazy, imobilizace. Nemocní by měli být pečlivě monitorováni. Kyselina acetylosalicylová (ASA). Nízké dávky aspirinu (75-1 OOmg denně) je nejčastěji používanou léčbou v těchto indikacích (110). Jen ojedinělé práce však dokládají, že ASA chrání proti trombóze, a to navíc jen v úzce vymezených situacích - po porodu u žen s APS manifestujícím se pouze ztrátami plodu, nikoli však trombembolickou příhodou (137). Většina sdělení neprokazuje žádný přesvědčivý benefit (37, 38). V současné době probíhá prospektivní studie k zhodnocení efektu tohoto léčebného přístupu - APLASA study (138). Antimalarika. Protidestičkové působení hydrochlorochinu či chlorochinu je známo od 70-tých let, kdy byly využívány pro profylaxi žilního trombembolizmu po ortopedických operacích. Opakovaně byl v retrospektivních studiích i na zvířecích modelech prokázán jejích efekt jak u primárního tak i sekundárního výskytu APA. Nízkodávkovaná antikoaqulační léčba warfarinem. Efekt tohoto typu léčby s cílovým INR 1,5 v kombinaci s nízkodávkovanou ASA je v současné době porovnáván v prospektivní multicentrické studii ve Velké Británii s účinností samotného aspirinu (136). Léčba Iniciální léčba akutní trombotické epizody se u pacienta a APS v ničem neodlišuje od terapie trombózy vzniklé z jiných důvodů (139). Dle místa lokalizace, rozsahu a klinického nálezu lze využít léčbu nízkomolekulárním heparinem, trombolýzou, trombektomií či angioplastikou v případě koronárni trombózy. Použití nefrakcionovaného heparinu naráží na problém sledování - aktivovaný parciální tromboplastinový čas je ovlivněn přítomnosti lupus antikoagulans již před zavedením terapie a jeho další prodloužení vlivem heparinu není proporcionální. Hlavním terapeutickým zásahem pro sekundární profylaxi je antikoagulační léčba. Na základě retrospektivních studií (140,141) bylo stanoveno doporučení dosažení cílového INR 3,0-4,0 a dlouhodobé resp. i doživotní podávání dikumarolových preparátů. V současné době prospektivní studie prokazují, že řada nemocných je úspěšně léčena konvenčním dávkováním kumarinů s cílovým INR 2,0-3,0 (142,143). Vysokodávkovaná a dlouhodobá resp. doživotní léčba bude zřejmě vyhrazena nemocným s rekurentní idiopatickou trombembolickou manifestací. Jasný přínos léčby antikoagulační ve srovnání s antiagregační terapií nebyl prokázán u nemocných s cévní ischemickou mozkovou příhodou (144). Pacienti na antikoagulační léčbě mohou mít relativní rezistenci na warfarin s potřebou vysokých dávek. Při selhání antikoagulační léčby warfarinem je zvažováno přidání ASA k vysokodávkované léčbě dikumarolovymi preparáty, podání imunomodulační terapie (34) nebo nízkomolekulární heparin (110), a to zejména v případech arteriální manifestace. Imunosupresivní léčba není účinná pro prevenci rekurence trombózy (139). Má své přesně vymezené indikace, ať už je to léčba základního onemocnění u sekundární indukce APA systémovým procesem, je jí možno ovlivnit sekundární hypoprotrombinémii s krvácivými projevy (3), klinicky významnou trombocytopenii (110). Její podání je taktéž zvažováno tam, kde se předpokládá jiný nežli protrombotický mechanizmus klinické manifestace. Do této indikace patří zejména některé z neurologických symptomů. Postupy ovlivňující imunitní systém jsou taktéž používány u katastrofického průběhu APS (145). -34-
Nové léčebné přístupy V současné době jsou diskutovány různé další léčebné možnosti u APS. Jednak je to využití léků, které se používají rutinně v jiných indikacích, druhým směrem je pak specifické ovlivnění imunitního systému. Mezi perspektivní přístupy je jeví využití statinů. Tyto léky, primárně užívané k ovlivnění nepříznivého lipidového spektra, mají znám i vícečetny efekt na krevní elementy (trombocyty, monocyty). V současné době byl in vitro prokázán inhibující vliv fluvastatinu na protrombotické a prozánětlivé vlastnosti endoteliálních buněk navozené přítomností APA (146). Na zhodnocení v této indikaci čekají jak novější typy protidestičkových léků - z nichž širší využití u APS doznal pouze klopidogrel (1), stejně tak i řada dalších nových antitrombotik - např. přímé inhibitory trombinu melagatran/ximelagatran, rekombinantní inhibitor cesty tkáňového faktoru a jiné (110). Vakcinace či imunizace je další otázkou, která by měla být v budoucnu zodpovězena jako možnost ovlivnění u některých, jasně definovaných jedinců s APS (147). Příkladem léčebného přístupu s imunomodulačním zaměřením je syntéza toleragenu (LJP 993) určeného k inaktivaci B lymfocytů specifických k epitopu ß 2 -glykoproteinu I (110,139). Teoretické taktéž zůstává využití transplantace hemopoetických buněk v této indikaci, neboť efekt této léčby byl prokázán u APS na myších modelech (148) a v jiných indikacích závažných autoimunitních stavů byl tento postup použit i klinicky v humánní medicíně (149). -35-
VLASTNÍ PRÁCE Vzhledem k tomu, že již vlastní zadání práce směřující ke stanovení systému komplexní péče o nemocné s antifosfolipidovými protilátkami je relativně široké, bylo nutno i do jejího souhrnu provést rozdělní do několika dílčích úkolů. Z tohoto pohledu zde vymezujeme řešené problémy: vyhodnocení přínosu zpřesnění diagnostiky lupus antikoagulans použitím necitlivé aptt reagencie; využití testu ProCglobal k predikci protrombotického rizika u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami; dlouhodobé sledování pacientů s antifosfolipidovými protilátkami k určení parametrů potřebných k péči o tyto nemocné; vyhodnocení rizik nastavení a sledování antikoagulační léčby u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami. Každá problematika byla řešena na vymezeném souboru pacientů či jejich výsledků, s použitím nezbytné metodiky a s použitím potřebné statistické analýzy, které budou dále v jednotlivých kapitolách upřesněny. -36-
I. VYHODNOCEN! PŘÍNOSU ZPŘESNĚN! DIAGNOSTIKY LUPUS ANTIKOAGULANS POUŽITÍM NECLTLIVÉ APT! REAGENICE Úvod Přestože doporučení k vyšetření lupus antikoagulans vzešla z mezinárodního konsenzu již v roce 1994 (150), do současné doby patří tato diagnostika k nejvíce problematickým metodám koagulační laboratoře (4,151,152). Zvýšení diagnostických možností přineslo zavedení kontrolních materiálů, ať již připravených z plazmy, či monoklonální technologií (153,154). Situace je ještě komplikovanější při vyšetřování přítomnosti lupus antikoagulans u pacientů na antikoagulační léčbě, která ovlivňuje řadu screeningových testů, které jsou k této diagnostice používány - zejména nejvíce specifický test s ředěným jedem Russelovy zmije (drwt), ale v jisté míře i aktivovaný parciální tromboplastinový test (aptt) a jeho modifikace (1,155). Většinou je k umožnění diagnózy LA u nemocných na antikoagulační léčbě doporučováno ředění bezdestičkovou normální plazmou před vyšetřením. Zde nelze vyloučit poddiagnostikování některých slabých, časově závislých inhibitorů (1). Také aptt reagencie se vyznačují různou citlivostí vůči přítomnosti lupus antikoagulans (156,157). Tato citlivost je jednak okolnostmi, které mohou obecně aptt u nemocného ovlivnit - gravidita, reakce akutní fáze, zvýšená hladina fibrinogenu a/nebo faktoru Vlil, ale je dána i obsahem a strukturou fosfolipidů v daném použitém laboratorním přípravku. Tak lze mezi dnes komerčně dostupnou poměrně širokou škálou aptt reagencií určit ty, které jsou v přítomnosti inhibitoru LA relativně málo prodlouženy, nebo naopak ty, které byly k detekci LA přímo sestrojeny a vyznačují se zvlášť zřetelným prodloužením doby tvorby koagula v přítomnosti tohoto inhibitoru (158,159). Po přidání fosfolipidů (ať již v lamelami nebo hexagonální fázi) dochází obvykle k jejich významnému zkrácení a tím jsou využívány jako testy konfirmační (158,159,160). Materiál a metodika Na našem pracovišti používáme pro stanovení inhibitoru LA jako screeningove testy ředěný aktivovaný parciální tromboplastinový test - PTT-LA (Diagnostica Stago), ředěný test s jedem Russelovy zmije - reagencie Rüssel viper venom (Diagnostica Stago) a kaolinový čas za použití 2% kaolinové suspenze (Kaolin Diagnostica Stago). U vzorků, u nichž poměr k normální směsné plazmě (R) přesáhne hodnotu 1,2 je proveden korekční test normální směsnou plazmou. Ve vzorcích, v nichž nedochází ke korekci, je přítomnost inhibitoru ověřena nebo vyloučena konfirmačním testem - neutralizací inhibitoru fosfolipidy trombocytů. U nejednoznačných výsledků je doplněn další konfirmační test s neutralizací fosfolipidy v hexagonální fázi II - Hexagonal Neutralization Procedure (HNP) - Staclot LA (Diagnostica Stago). Toto diagnostické schéma je od ledna 2002 na našem pracovišti doplněno o použití aptt s diagnostickým reagens necitlivým k přítomnosti LA (Actin FS, Dade Behring). Veškeré testy jsou prováděny ze speciálně preanalyticky připravené bezdestičkové plazmy; stejná příprava, směřující k odstranění fosfolipidů z destiček, je použita pro přípravu normální plazmy používané ke směsným studiím. Pro rutinní screeningove vyšetření testu aptt využíváme PTT Automate (Diagnostica Stago). Všechny výsledky aptt jsou bez ohledu na použitou reagencii vyjadřovány poměrem R, který vyjadřuje čas pacienta/čas normální plazmy. Vyhodnotili jsme retrospektivně 100 výsledků vyšetření hodnocených jako pozitivní na přítomnost inhibitoru lupus antikoagulans a 100 výsledků hodnocených jako negativní při použití běžné výše uvedené procedury k porovnání rutinně používaného aptt (dále označeno aptt), dále aptt s vysokou (dále označeno PTT-LA) a nízkou citlivostí k přítomnosti inhibitoru (dále označeno Actin FS). V dalším jsme porovnávali citlivé" a necitlivé" aptt u nemocných na antikoagulační léčbě, u nichž byla známa přítomnost -37-
inhibitoru a u nichž byla přítomnost inhibitoru vyloučena předchozím testováním. Mezi vzorky se známou přítomností LA bylo 18 vyšetřeno bez diluce (skupina 1) a u 33 vzorků byla před testováním provedena diluce 1:1 normální bezdestičkovou plazmou ke zrušení účinku antikoagulacní léčby (skupina 2). Vzorky bez přítomnosti inhibitoru (24 testování) byly vyšetřovány bez předchozí diluce (skupina 3). Základní charakteristiku souboru shrnuje obr. č. 1.1. Pro potřeby srovnání byl vytvořen index RLA, který je dán vztahem: RLA = (PTT-LA - Actin FS)/Actin FS Statistické zpracování Pro porovnání hodnot aptt, PT, PTT-LA, Actin FS a indexu RLA U pozitivních a negativních pacientů bez antikoagulacní léčby byl použit Mannův-Whitneyův U test. Pro srovnání hodnot PT, PTT-LA, Actin FS a indexu RLA mezi skupinami pacientů s antikoagulacní léčbou (pozitivní pacienti bez diluce, pozitivní pacienti s dilucí, negativní pacienti) byl také použit Mannův-Whitneyův U test, a to vždy pro všechny možné dvojice skupin pacientů. Pomocí logistické regrese byl vytvořen model závislosti přítomnosti lupus antikoagulans na hodnotě indexu RLA a to jak pro pacienty bez antikoagulacní léčby, tak i pro pacienty s antikoagulacní léčbou. Výsledky Porovnání hodnot aptt, PTT-LA a Actin FS u pozitivních a negativních vzorků ukazuje tabulka č. 1.1 a 1.2 a obrázky č. 1.2 a 1.3. Hodnoty se statisticky významně lišily ve všech případech - aptt bylo více prodlouženo u LA pozitivních nemocných jak při použití aptt, tak i PTT-LA, zatímco významně kratší hodnoty u LA pozitivních pacientů byly nalezeny při použití Actin FS. Poměr R se však při použití všech tří typů reagencií překrývá a nedovoluje tedy rozlišení pozitivní - negativní. Proto bylo použito srovnání za pomocí indexu RLA= (PTT- LA - Actin FS)/Actin FS. Tento index je nejen statisticky významně odlišný u LA pozitivních a LA negativních nemocných, ale navíc nedochází k překrývání hodnot LA pozitivních a LA negativních nemocných (viz tabulka č. 1.1 a. 2, obr. č.l. 4). Pomocí logistické regrese byl vytvořen predikční model, který na základě hodnoty RLA umožňuje pacienta zařadit do skupiny LA pozitivních nebo LA negativních pacientů, p = 1/[1+exp(5.986-22.356x R LA )] Nastavíme-li hodnotu dělícího bodu RLA = 0,268 (což odpovídá hladině dělícího bodu p = 0,5), má tento model korektní predikci u 95,5% pacientů. Pacienti s hodnotou indexu RLA vyšší než 0,268 budou vytvořeným modelem klasifikováni jako pozitivní na lupus antikoagulans, pacienti s nižší hodnotou indexu R L AJako negativní. Použitý index RLA je významným prediktorem, zda pacient má lupus antikoagulans (test podílem věrohodností x 2 = 229,76, d.f. = 1, p < 0,001). Následně jsme provedli testování hodnot PTT-LA a Actin FS u pacientů na antikoagulacní léčbě. Nastavení antikoagulacní léčby bylo ve všech skupinách testovaných vzorků stejné - hodnoty INR se statisticky významně v jednotlivých skupinách nelišily (viz tab. 1.1 a 1.2, obr. č. I. 6). Hodnota PTT-LA byla statisticky významně prodloužena více u pacientů s nálezem lupus antikoagulans (skupiny 1 a 2), nežli u LA negativních nemocných (skupina 3), zatímco nedošlo k významnému rozdílu mezi vzorky vyšetřovanými v diluci normální bezdestičkovou plazmou a bez ní (tab. č. I. 1 a 2, obr. č. I. 6). Naopak hodnoty Actin FS se lišily pouze u vzorků preanalyticky ošetřených diluci - zde dochází ke zkrácení hodnot vlivem korekce deficitu faktorů navozených antikoagulacní léčbou (skupina 2), nebyl rozdíl mezi vzorky s přítomností inhibitoru lupus antikoagulans a bez ní (tab. č. 1.1 a I. 2, obr. č. 1.6). Použití námi vytvořeného indexu R L A U LA pozitivních a LA negativních vzorků ovlivněných antikoagulacní léčbou ukazuje tab.č. I. 1 a I. 2, obr. č.l. 7. Index rozlišuje LA pozitivní a LA -38-
negativní nálezy bez ohledu na použití či nepoužití preanalytické diluce. Proto byly do logistické regrese zařazeny skupiny 1 a 2 společně. Byl vytvořen model p = 1/[1 +exp(0,980-11,895 x R^)] Model má statisticky významnou schopnost predikce pacientů s lupus antikoagulans a antikoagulační léčbou. Při nastavení hodnoty dělícího bodu RLA = 0,082 (což odpovídá hladině dělícího bodu p = 0,5), má tento model korektní predikci u 90,7% pacientů. Pacienti s hodnotou indexu RLA vyšší než 0,082 budou vytvořeným modelem klasifikováni jako pozitivní na lupus antikoagulans, pacienti s nižší hodnotou indexu RLA jako negativní. Použitý index RLA je významným prediktorem, zda pacient s antikoagulační léčbou má lupus antikoagulans (test podílem věrohodností x 2 = 60,04, d.f. = 1, p < 0,001). Porovnání nálezů pozitivních pacientů bez antikoagulační léčby a touto léčbou v jednotlivých provedených testech vyšetřených bez diluce a s dilucí, přináší obr. č. I. 8., resp. I.9. Ze všech provedených srovnání byl jištěn statisticky významný rozdíl pouze při vyšetření aptt s LA necitlivou reagencií mezi pacienty léčenými a neléčenými warfarinem, je-li vyšetření provedeno bez předchozí diluce plazmy. Zde antikoagulační léčba ovlivňuje test významněji, nežli přítomnost inhibitoru lupus antikoagulans. U negativních pacientů, ať již na antikoagulační léčbě nebo bez ní, nedosáhly rozdíly statistické významnosti v žádném z použitých testů (viz obr. 1.10). Tabulka 1.1. Popisné statistiky parametrů aptt, PT, PTT-LA, Actin FS a indexu RLA U pozitivních a negativních vzorků pacientů bez antikoagulační léčby, resp. pacientů léčených warfarinem (skupina 1: pozitivní pacienti bez diluce; skupina 2: pozitivní pacienti s dilucí; skupina 3: negativní pacienti; PT - protrombinový čas). aptt (R) PTT-LA (R) Actin FS (R) Index R LA PT (INR) 1 2 3 PTT-LA (R) 1 2 3 Actin FS (R) 1 2 3 Index RLA 1 2 3 pac./skup. N průměr sm. odch. medián min max pozitivní 100 1,64 0,57 1,47 0,98 3,35 negativní 100 1,26 0,20 1,25 0,88 1,87 pozitivní 100 2,63 1,19 2,35 1,38 6,50 negativní 100 1,50 0,18 1,47 1,26 2,11 pozitivní 100 1,25 0,20 1,20 0,90 1,88 negativní 100 1,40 0,21 1,36 1,06 2,08 pozitivní 100 1,12 0,92 0,88 0,14 4,19 negativní 100 0,08 0,10 0,09-0,25 0,31 18 2,33 0,49 2,30 1,44 3,30 33 2,32 0,58 2,40 1,35 3,69 24 2,39 0,54 2,29 1,44 3,76 18 33 24 18 33 24 18 33 24 2,89 2,49 1,42 1,65 1,28 1,51 0,76 0,93-0,06 1,08 0,99 0,27 0,28 0,13 0,21 0,64 0,69 0,12 2,80 2,37 1,40 1,74 1,27 1,50 0,55 0,85-0,05 1,32 1,22 1,08 1,24 1,09 1,28-0,13-0,09-0,27 4,62 5,54 2,17 2,04 1,76 2,04 2,30 2,90 0,24-39-
Tabulka I. 2. Porovnání hodnot aptt, PT, PTT-LA, Actin FS a indexu R _A U pozitivních a negativních vzorků pacientů bez antikoagulační léčby, resp. pacientů léčených warfarinem (skupina 1: pozitivní pacienti bez diluce; skupina 2: pozitivní pacienti s dilucí; skupina 3: negativní pacienti; PT - protrombinový čas). srovnávané skupiny Mannův-Whitneyův r U test aptt pozitivní vs. negativní pac. U = 2515 N = 200 p < 0,001 PTT-LA pozitivní vs. negativní pac. U = 805,5 N = 200 p < 0,001 Actin FS pozitivní vs. negativní pac. U = 2804 N = 200 p < 0,001 Index pozitivní vs. negativní pac. U = 106 N = 200 p < 0,001 PT skupina 1 vs. skupina 2 skupina 1 vs. skupina 3 skupina 2 vs. skupina 3 U = 289 U = 209 U = 368 N = 51 N =42 N = 57 p = 0,875 p = 0,859 p = 0,651 PTT-LA skupina 1 vs. skupina 2 skupina 1 vs. skupina 3 skupina 2 vs. skupina 3 Actin FS skupina 1 vs. skupina 2 skupina 1 vs. skupina 3 skupina 2 vs. skupina 3 Index RLA skupina 1 vs. skupina 2 skupina 1 vs. skupina 3 skupina 2 vs. skupina 3 U = 227 U = 29 U = 102 U = 64,5 U = 149,5 U = 125,5 U = 253 U = 21 U = 22 N = 51 N = 42 N = 57 N = 51 N =42 N = 57 N = 51 N =42 N = 57 p = 0,168 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,091 p < 0,001 p = 0,386 p < 0,001 p < 0,001 Diskuse Průkaz inhibitoru lupus antikoagulans je obvykle založen na principu detekce ovlivnění dostatečně citlivého screeningového testu a následně konfirmací danou průkazem zkrácení téhož testu po zvýšení koncentrace fosfolipidu (150). Na tomto principu je založena řada komerčně dostupných laboratorních diagnostik určených pro průkaz lupus antikoagulans. Jak screeningové testy tak i koagulační testy obvykle odrážejí vliv na jinou část koagulační kaskády, která je inhibitorem ovlivněna. Tak rozlišujeme testování na bázi aptt, ředěného času s jedem Russelovy zmije (drwt), kaolinového času (KCT), či ředěného tromboplastinového času (dpt). Neexistuje žádný test se 100% sensitivitou a specificitou. Z tohoto důvodu se doporučuje použití nejméně dvou, lépe tří screeningových testů, které mapují jinou část koagulační kaskády (35). Zatímco sensitivita tohoto testování je obvykle vysoká a pohybuje se mezi 96-100%, specificita je obvykle mnohem nižší a je udávána mezi 60-73% (35). Nejvíce senzitivním i specifickým testem nejen pro přítomnost lupus antikoagulans ale i ve vztahu k riziku trombózy je udáván drwt (35, 161,162,163). Sami jsme taktéž prokázali významnou pozitivní korelaci mezi pozitivitou screeningového testu drwt a výskytem trombotických komplikací u našich nemocných (164). Sakakura (165) však v roce 2000 prokázal, že rozdíl mezi aptt reagencií citlivou a necitlivou k lupus antikoagulans je u pozitivních pacientů stejně velký, jako rozdíl mezi screeningovým a konfirmačním drwt - tedy po přidání fosfolipidu. Vzhledem k tomu, že citlivé aptt však nevykazovalo vysokou specificitu ve vztahu k přítomnosti LA a pro koagulační vyšetření na přítomnost LA proto doporučuje drwt a KCT. Lindhoff-Last se svými spolupracovníky (166) využili dvě odlišné aptt reagens s různou koncentrací fosfolipidu k vytvoření metodiky MIXCON-LA essay, využívající použití analyzátoru, ředění normální plazmou a rozdílu citlivosti obou reagencií. Přítomnost heparinu ve vzorku byla neutralizována. Prokazovali 100% specificitu vůči deficitům koagulačních faktorů a ovlivnění antikoagulační léčbou, metodika však nebyla schopna odlišit získaný inhibitor FVIII u hemofilika. Při interpretaci nálezů z jiných pracovišť je nutno brát ohled nejen na typ použité reagencie, ale do jisté míry i na typ použitého koagulačního přístroje a metody detekce, kterou používá (167,168). Proto nelze výsledky testování v jiné laboratoři většinou použít beze zbytku a je nutné vlastní nastavení. -40-
V naší studii jsme využili různé citlivosti reagencií aptt k přítomnosti lupus antikoagulans s retrospektivnímu zhodnocení pozitivních a negativních vzorků. Při zavedení indexu RLA a metody logistické regrese je tento model schopen predikovat pozitivní nález u pacientů v podmínkách našeho nastavení s vysokou citlivostí a to u pacientů na antikoagulační léčbě. V roce 2002 bylo použití jiné aptt reagencie necitlivé k lupus antikoagulans včetně vytvoření různých indexů (rozdíl citlivé a necitlivé reagencie k necitlivé resp. i rozdíl citlivé a necitlivé ku citlivé) využito k odlišení LA pozitivních a negativních nemocných argentinskými autory (169). I oni zjistili možnost využití těchto kalkulovaných indexů při antikoagulační léčbě nemocných jako jediného kriteria. Metoda spočívala v kalkulaci akceptovatelné sensitivity a specificity vyšetření v podmínkách jejich nastavení. Rutinně používané screeningové aptt do celkového vyhodnocení nálezu použito nebylo. I když bylo provedeno u každého vyšetření z téhož odběru, preanalytické zpracování vzorku bylo použito pro přípravu plazmy chudé na destičky, nikoli však pro přípravu bezdestičkové plazmy (< 5 x 10 9 /l), jak je tomu u vzorků zpracovávaných na vyšetření lupus antikoagulans. Tento fakt může hrát v hodnotě času i poměru R významnou roli, bez ohledu na citlivost vlastní reagencie díky možnému neutralizačnímu efektu trombocytů (170). Přesto však hodnoty R vyšetřené touto reagencií byly u pozitivních vzorků zřetelně delší, nežli při vyšetření aptt reagencií necitlivou k přítomnosti lupus antikoagulans (tab.č.l. 1 a I. 2, obr. č. 2 a 3). To dokládá dostatečnou sensitivitu námi používané rutinní aptt reagens k přítomnosti tohoto inhibitoru pro běžná screeningová vyšetření. Použití aptt necitlivé k přítomnosti lupus antikoagulans považujeme za přínosné ve spektru diagnostických metod k průkazu antifosfolipidových protilátek ovlivňujících koagulační reakce a v diferenciální diagnostice stavů provázených prodlouženým aptt. Vzhledem k přítomnosti celé řady vlivů, které se mohou na výsledcích testování podílet, považujeme za nutné nastavení diskriminačního rozhraní podle použitých reagencií a přístrojového vybavení individuálně pro každou laboratoř. -41 -
II.VYUŽIT!TESTUPROCGLOBAL KPREDIKCIPROTROMBOTICKÉHORIZIKA UNEMOCNÝCH S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI Úvod Trombofilní tendence je u antifosfolipidových protilátek (APA) důsledkem mnohočetného vlivu na koagulační kaskádu. Významnou roli hraje ovlivnění náležité funkce systému proteinu C, a to buď přímo, nebo častěji ovlivněním jeho kofaktorů (7, 8,171,172, 173,174). V roce 1995 byl vyvinut jednoduchý test k zjištění funkčních odchylek systému proteinu C - test ProCglobal (175,176). Zachycuje jednak funkční ovlivnění krevního srážení v přítomnosti Leidenské mutace faktoru V, získané resistence k aktivovanému proteinu C, deficitu proteinu C, deficitu proteinu S, ale také odráží vychýleni hemokoagulační rovnováhy u stavů provázených zvýšenou aktivitou faktoru Vlil. Dokonce po vyloučení všech těchto jednotlivých možností je snížená hodnota testu ProCglobal stále spojena s vyšším rizikem trombózy (177, 178). Leidenská trombofilní skupina udává u tohoto testu při použití hodnoty cut-off < 0,68 přídatné riziko trombózy 4,3-násobné po vyloučení deficitů proteinu C, proteinu S a Leidenské mutace FV. Při použití u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami jsou výsledky tohoto testu různorodé. Někteří autoři neprokázali statisticky významné rozdíly v hodnotě testu ProCglobal u pacientů s lupus antikoagulans mezi skupinou s klinickou manifestací trombózy a nemocnými bez klinických příznaků (178). Jiné nálezy dokladují, že skupina nemocných s inhibitory typu lupus antikoagulans, které více ovlivňují test s jedem Russelovy zmije (drwt), nežli test s kaolinovou suspenzí (KCT), a tím jsou považovány za více asociované s trombózou (161,162, 163,164,179), mají významněji ovlivněn ProCglobal test (180). Ani v této studii však jasná korelace poklesu ProCglobal s klinickou manifestací trombózy nebyla prokázána se statistickou významností. Naše vlastní předchozí práce však prokazovaly statisticky významný pokles testu ProCglobal u klinické manifestace trombózy při primárním výskytu lupus antikoagulans, tedy u nemocných bez průkazu přítomnosti revmatického či nádorového procesu (181,182). Soubor pacientů Do hodnocení bylo zařazeno 126 nemocných s přítomností antifosfolipidových protilátek tj. s lupus antikoagulans a/nebo s průkazem antikardiolipinů ve třídě IgM a/nebo IgG, případě s průkazem protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I. Současně bylo vyšetřeno 64 zdravých dobrovolníků, u nichž byla přítomnost antifosfolipidových protilátek testováním vyloučena. U těchto probandů nikdy nedošlo ke klinické manifestaci trombózy či ke spontánním ztrátám plodu. Pacienti byli podle klinické manifestace rozděleni do skupin; MV+ při anamnéze prodělané žilní trombózy, případně MV-, pokud ke klinické manifestaci v žilním řečišti nedošlo. Analogicky byla vytvořena skupina MA+ z nemocných, u nichž došlo k manifestaci trombózy v arteriálním řečišti, pacienti, kteří tento typ trombotických příhod neprodělali, byli zařazeni do skupiny MA-. Ženy, které prodělaly minimálně jednou ztrátu plodu, byly zařazeny do skupiny SPA+, zatímco ženy bez těchto pôrodníckych komplikací, tvoří skupinu označenou SPA-. Popisnou charakteristiku souboru udává tab. č. II. 1. Zastoupení pohlaví se ve skupině pacientů a ve skupině kontrolní neliší (test dobré shody: X 2-0,982; p=0,322). Průměrný věk nemocných byl 51,7 let (medián 53 let, minimum 18, maximum 88 roků), ve skupině kontrolní 41,08 let (medián 39 let, minimum 19, maximum 78 let). Ve skupině kontrolní byl tedy věk významně nižší (Mannův-Whitneyův U test; U=2732,5 p<0,001, obr. č. II. 1). Na základě statisticky nevýznamné korelace mezi věkem a hodnotou ProCglobal ovšem můžeme tvrdit, že věk neovlivňuje hodnotu testu (ve skupině pacientů: r s =0,013; p=0,884; v kontrolní skupině: r s =0,043; p=0,734) a tak jsou použité soubory srovnatelné. -42-
Tabulka č. II. 1: Charakteristika souboru jen LA LA + ACLA jen ACLA* jen anti/ff 2 -GPI žádné APA Celkem pacienti ženy 29 40 13 2 0 84 pacienti muži 19 21 2 0 0 42 kontroly ženy 0 0 0 0 38 38 kontroly muži 0 0 0 0 26 26 Celkem 48 61 15 2 64 190 'slabá pozitivita ACLA zařazena mezi negativní nálezy Materiál a metodika Stanovení antifosfolipidových protilátek Ke stanovení inhibitoru lupus antikoagulans byla požita dříve popsaná metodika. K zařazení pacienta do soboru bylo nutné ověření nálezu v časovém odstupu 6-ti a více týdnů. Stanovení protilátek proti kardiolipinům a proti /? 2 -glykoproteinu I bylo provedeno mimo naše pracoviště užitím ELISA techniky a pro vyhodnocení výsledků jsme použili škálu doporučenou laboratoří, která výsledky provádí. Ta poskytuje hodnocení pro antikardiolipinove protilátky < 10 U/ml jako negativní, hraniční nález zahrnuje rozmezí 10-19 U/ml, nálezy 20-39 U/ml jako nález slabě pozitivní. Pozitivní nálezy pak zahrnují titry protilátek 40-79U/ml, hodnoty nad 80U/ml jsou hodnoceny jako silná pozitivita. Pokud byl průkaz antikardiolipinů izolovaný tj. bez přítomnosti lupus antikoagulans resp. protilátek proti /?2-glykoproteinu I, pak bylo pro zařazení do studie nutno prokázat opakovaný nález pozitivity ACLA IgM nebo ACLA IgG v titru nejméně 40U/ml. Výsledky protilátek proti /? 2 -glykoproteinu jsou spolupracující laboratoří vyjadřovány pouze v semikvantitativní škále hodnocení jako negativní, slabě pozitivní, pozitivní a silně pozitivní. Pokud byl průkaz těchto protilátek izolovaný, pak pro zařazení pacienta byl nutný opakovaný průkaz nejméně pozitivního nálezu. Stanovení ProCglobal Ke stanovení hodnoty testu ProCglobal byla u nemocných bez zavedené antikoagulační léčby warfarinem odebírána venózní krev do plastikových odběrových zkumavek s obsahem 3,8% citrátu sodného v poměru 1:10, centrifugována při 2500g po 20 minut při pokojové teplotě, šokově zmražena a následně uchovávána v plastikových zásobnících při - 70 C do doby provedení vyšetření. K laboratorní diagnostice byl použit původní kit ProCglobal (Dade Behring), stanovení bylo provedeno na koagulačním analyzátoru STA-Complact. Princip testu: test odráží globální aktivitu systému proteinu C, ke které dochází po aktivaci endogenního proteinu C ve vzorku plazmy po přidání hadího jedu Protacu (jed Agkistrodon contortrix). Takto aktivovaný protein C vede k prodloužení aktivovaného parciálního tromboplastinového času (aptt); z poměru aptt před a po aktivaci je vypočítán poměr R. Normalizovaný poměr R (NR) je stanoven vynásobením poměru R kalibračním faktorem, který je určen pro každou šarži reagencie. Vyjadřování výsledků v NR snižuje ovlivnění konečných výsledků použitým koagulačním analyzátorem, šarží testu a podobně. Normální hodnoty poměru NR dané firemním nastavením testu jsou > 0,8. U nemocných, u nichž byla stanovena hodnota, která je považována za patologickou resp. pozitivní tj. méně než 0,8, bylo v dalším průběhu doplněno vyšetření, které blíže tuto pozitivitu analyzují - stavení případné přítomnosti Leidenské mutace FV, deficitu proteinu C, deficitu proteinu S a zvýšené aktivity FVIII. -43-
Stanovení Leidenské mutace FV. Izolace DNA byla provedena standardní metodou, pomocí izolačního kitu "QIA Blood Mini Kit" firmy Qiagen, umožňující rychlou izolaci DNA z malého množství periferní krve (200^1) odebrané do odběrových zkumavek obsahující K3 EDTA. Vlastní průkaz Leidenské mutace FV byl proveden metodou PCR-RFLP, která je založena na amplifikaci známé sekvence genu pomocí dvou specifických příměrů FVL1 a FVL2 (Metabios International AG). FVL 1: 5 ' TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3 ' FVL 2: 5 ' TCTCTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3 ' Výsledkem amplifikace jsou amplikony (PCR produkty o stejné délce), které jsou detekované elektroforeticky na agarózovém gelu, po předchozím enzymatickém štěpení pomocí restrikčních endonukleáz (Promega Corporation) za specifických podmínek. Stanovení aktivity proteinu C a proteinu S. Venózní krev odebraná do plastikových zkumavek s obsahem citrátu sodného v poměru 1:10 byla centrifugována po 15 minut při 2500g, šokově zmražena a uchována při -70 C do doby vyšetření. Aktivita proteinu C byla stanovena za pomoci reagenčního setu STA Stacloct Protein C (Diagnostica Stago) na koagulačním analyzátoru STA-Complact nebo analyzátoru STA-R. Aktivita proteinu S byla stanovena za stejných podmínek pomocí reagenčního setu STA Staclot Protein S (Diagnostica Stago). Stanovení aktivity FVIII Venózní krev odebraná do plastikových zkumavek s obsahem citrátu sodného v poměru 1:10 byla centrifugována po 15 minut při 2500g, šokově zmražena a uchovávána do doby vyšetření při - 20 C do doby vyšetření (ne déle než 4 týdny). Aktivita faktoru Vlil byla stanovena standardní metodikou zavedenou na pracovišti v ředění plazmy 1:20 resp. dle zjištěné hodnoty i v ředění 1:40 event, i 1:80 k zabezpečení přesného odečtu vysokých hodnot aktivity. Stanovení bylo provedeno na koagulačním analyzátoru STA Compact nebo STA-R za použití diagnostik PTT-Automete 10 (Diagnostica Stago), FVIII deficitní plazmy DG-FVIII (Grifols s.r.o), STA Unicalibrator (Diagnostica Stago) a STA System Control N+P (Diagnostica Stago). Statistické zpracování Ke srovnání hodnot ProCglobal mezi pacienty a kontrolní skupinou byl vzhledem k normalitě rozložení hodnot ProCglobal použit t-test. T-test byl rovněž použit ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s manifestací žilní trombózy a pacientů bez této manifestace, ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s manifestací arteriální trombózy a pacientů bez této manifestace, dále pak ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientek, které měly samovolný potrat a pacientek bez samovolného potratu. Podobně byl t-test použit ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s lupus antikoagulans a bez lupus antikoagulans, také ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s přítomností antikardiolipinových protilátek a bez těchto protilátek. T-test byl použit také ke srovnání hodnot ProCglobal mezi muži a ženami a to jak u souboru pacientů tak i v kontrolní skupině a dále ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s klinickou manifestací trombózy a bez této manifestace. Toto srovnání bylo provedeno zvlášť pro muže a zvlášť pro ženy. U pacientů s hodnotou ProCglobal nižší než 0,8 byl ke srovnání hodnot ProCglobal mezi pacienty s Leidenskou mutací FV a pacienty bez Leidenské mutace použit také t-test. Ke srovnání hodnot ProCglobal u pacientů s přítomností pozitivity, slabé pozitivity a nepřítomnosti protilátek proti /? 2 -glykoproteinu I byla použita analýza rozptylu. Analýza rozptylu byla použita také ke srovnání hodnot ProCglobal mezi pacienty s přítomností/nepřítomnosti Leidenské mutace a jiného koagulačního nálezu. K určení významnosti rozdílů mezi jednotlivými skupinami byl dále použit Fisherův LSD test. -44-
ROC analýza byla použita k určení takové hodnoty ProCglobal, která nejlépe rozliší pacienty s žilní a/nebo arteriální trombózou a pacienty bez manifestace trombózy. Diskriminační hodnota testu ProCglobal byla určena zvlášť pro muže a zvlášť pro ženy. Závislost manifestace trombózy na hodnotě ProCglobal vzhledem ke hraniční hodnotě určené ROC analýzou byla sledována pomocí testu dobré shody. Výsledky Hodnota ProCglobal se statisticky významně lišila mezi skupinou pacientů a skupinou kontrolní (t-test, p< 0,001; obr č. II.2). Při analýze jednotlivých skupin nemocných lze zjistit statisticky významný rozdíl v hodnotě testu při srovnání skupiny nemocných s žilní trombózou a skupiny bez této manifestace (skupiny MV+ a MV-, t-test, p<0,001), rozdíl však nebyl zjištěn při klinické manifestaci arteriální trombózy (skupiny MA+ a MA-, t-test, p=0,413) a samovolné ztráty plodu (t-test, p=0,732). Výsledky hodnoty NR testu ProCglobal shrnuje tabulka č.ll. 2 a obr. II. 3. Hodnota ProCglobal se zdála být více ovlivněna přítomností lupus antikoagulans, ale ani zde nedosáhl rozdíl statistické významnosti (t-test, p=0,083). Také při srovnání pacientů s přítomností antikardiolipinovych protilátek a nemocných bez tohoto nálezu, nebyla hodnota NR ProCglobal testu odlišná (t-test, p=0,363). Stejně tak přítomnost pozitivity, slabé pozitivity, případně nepřítomnost protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I neovlivňovala hodnotu testu se statistickou významnosti (ANOVA; F=0,157; ä^=2; df 2 =80; p=0,855). Hodnoty ProCglobal v přítomnosti či nepřítomnosti jednotlivých typů antifosfolipidových protilátek shrnuje tabulka č. II. 2 a obr.ll. 4. Tabulka č. II. 2: Hodnoty NR testu ProCglobal v jednotlivých skupinách ProCglobal" ProCglobaf t-test skupina N prumer sm.od. skupina N průměr sm.od. t df P kontrola 64 1,10 0,25 pacienti 126 0,82 0,24-7,767 188 <0,001 kontrola k - ženy 38 1,13 0,27 k - muži 26 1,06 0,20 1,149 62 0,255 pacienti p - zeny 84 0,85 0,24 p - muži 42 0,76 0,23 1,994 124 0,048 MV- 73 0,88 0,24 MV+ 53 0,73 0,21 3,691 124 <0,001 MA- 96 0,83 0,23 MA+ 30 0,78 0,26-0,821 124 0,413 SPA- 65 0,85 0,24 SPA+ 19 0,83 0,23 0,344 82 0,732 LA- 17 0,91 0,24 LA+ 109 0,80 0,24-1,747 124 0,083 ACLA- 43 0,85 0,25 ACLA+ 80 0,81 0,24-0,913 121 0,363 Při bližší analýze příčin poklesu ProCglobal na hodnotu 0,8 NR a méně jsme vyšetřili 59 nemocných na přítomnost Leidenské mutace FV (FVL+), deficit proteinu C resp. S a zvýšení aktivity FVIII nad 150% (pro potřeby další analýzy byly tyto tři odchylky zahrnuty do skupiny ostatní). V tomto vyšetřování jsme zjistili u 13ti nemocných nález Leidenské mutace FV, všechny v heterozygotní formě. V 17ti případech pak byly nalezeny další koagulační odchylky - 4x kombinovaná odchylka se zvýšením aktivity FVIII nad 150% a snížením proteinu S, 8x snížení proteinu S, 4x zvýšení aktivity FVIII a jednou kombinace deficitu proteinu S, deficitu proteinu C a zvýšení aktivity FVIII. Změny, které byly nalezeny, byly spíše méně významné - nejvyšší dosažená hodnota FVIII byla 282%, nejnižší zjištěná aktivita proteinu S dosahovala 50%. Jediný deficit proteinu C v kombinaci s jinými faktory byl 69%. U pěti nemocných byla přítomnost Leidenské mutace kombinována s jiným koagulačním nálezem. Hodnoty ProCglobal v jednotlivých skupinách blíže určených nemocných shrnuje tabulka č. II. 3. U tří nemocných s pozitivním nálezem ProCglobal bylo provedeno pouze stanovení Leidenské mutace FV, zatímco koagulační faktory vyšetřeny nebyly. -45-
Tabulka č.ll. 3: Hodnoty NR při pozitivním nálezu ProCglobal testu v jednotlivých skupinách Skupina N ProCglobal průměr ProCglobal srn. Odch. FVL- 46 0,64 0,11 FVL + 13 0,51 0,09 FVL +/ostatní - 5 0,51 0,10 FVL +/ostatní + 5 0,52 0,10 FVL -/ostatní - 32 0,66 0,10 FVL -/ostatní + 12 0,59 0,13 Porovnání hodnot ProCglobal se statisticky významně liší při srovnání nemocných, kteří kromě přítomnosti antifosfolipidových protilátek případně dalších koagulačních odchylek s trombofilní tendencí byli současně nositeli Leidenské mutace FV a těch, kteří tuto vrozenou náchylnost neměli (t-test; t=4,033; df=57; p< 0,001, obr. II. 5). Hodnoty ProCglobal se mezi pacienty s výskytem Leidenské mutace a/nebo jiným koagulačním nálezem lišily (ANOVA, F=4,466; df!=3, df 2 =50; p=0,007; obr. II.5). Pomocí Fisherova LSD testu byl statisticky významný rozdíl zjištěn mezi skupinou pacientů FVL- /ostatní- a skupinou FVL+/ostatní- a také skupinou FVL+/ostatní+. Z toho plyne, že s pozitivitou FVL se hodnota ProCglobal snižuje. Tento nález se odráží i v klinické manifestaci - pouze jeden ze třinácti nositelů Leidenské mutace se současnou přítomností antifosfolipidových protilátek neměl žádnou trombotickou komplikaci tj. 7,69% v porovnání 53 (tj. 41,73%) pacienty s APA bez trombotické manifestace v celém souboru pacientů. Pozitivita dalších koagulačních odchylek nemá na snižování ProCglobal statisticky významný vliv. Hodnota testu se však v námi vyšetřovaných souborech lišila i dle pohlaví (tab.ll. 2) - a to se statistickou významností ve skupině pacientů s antifosfolipidovými protilátkami (t-test, p=0,048). Podobně ve skupině kontrolní lze vysledovat tento trend, ale zřejmě díky menšímu počtu probandů nebylo statistické významnosti dosaženo (t-test, p=0,255). Rozdíly ukazuje obr. II. 6. Při analýze vztahu hodnoty ProCglobal a klinické manifestaci trombózy u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami jsme zjistili statisticky významný rozdíl u žen, které prodělaly žilní či arteriální trombotickou komplikaci (T+) ve srovnání se skupinou žen, které žádnou klinickou manifestaci trombózy neměly (T-) (t-test, p<0,001). Tento rozdíl však nebyl zjištěn u mužů (t-test, P=0,404), zřejmě díky malému počtu mužů bez klinické manifestace arteriální či venózní trombózy v této skupině. Je-li toto porovnání provedeno v celém vyšetřovaném souboru, je statisticky významného rozdílu dosaženo v obou pohlavích (t-test, v obou případech p<0,001). Výsledky shrnuje tabulka č.ll. 4, obr. II.6. Tabulka č.ll. 4: Hodnoty NR ProCglobal ve vztahu ke klinické manifestaci žilní nebo tepenné trombózy ProCglobar skupina N průměr sm.od. skupina N pacienti s antifosfolipidovými protilátkami ženyt- 40 0,94 0,24 ženyt+ 44 mužit- 12 0,80 0,12 muži T+ 38 celý vyšetřený soubor (včetně kontrol) ženyt- 78 1,03 0,27 ženyt+ mužit- 38 0,98 0,22 muži T+ 44 30 ProCglobar průměr sm.od. T 0,76 0,74 0,76 0,74 0,21 0,27 0,21 0,27-3,713-0,843-5,837-4,157 t-test df 82 40 120 66 P <0,001 0,404 <0,001 <0,001-46-
Pomocí ROC analýzy jsme se u obou pohlaví pokusili nastavit diskriminační hodnotu testu ProCglobal tak, aby byla schopna predikce manifestace trombózy. Toto stanovení je smysluplné pouze na celém souboru, protože u mužů není rozdíl v hodnotách statisticky významný mezi T+ a T- pacienty. Pro skupinu žen se jako nejlepší jeví hraniční hodnota 0,80 NR, při které je 76% případů klinické manifestace trombózy správně zařazeno. Ve skupině mužů byla určena hraniční hodnota 0,71 NR, při které je 81% případů klinické manifestace trombózy správně zařazených. Ve skupině žen s ProCglobal do 0,8 byl zaznamenán 1,8-krát vyšší výskyt trombózy ve srovnání se ženami s ProCglobal nad 0,8 (tabulka č. II. 5). Ve skupině mužů s ProCglobal do 0,71 byl zjištěn 1,7-krát vyšší výskyt trombózy ve srovnání s muži s ProCglobal nad 0,71 (tabulka 5). U žen i u mužů byla potvrzena závislost výskytu trombózy na hodnotě ProCglobal vzhledem ke hraniční hodnotě určené ROC analýzou (test dobré shody; ženy: /=8,727; df=1; p=0,003; muži: ;r 2 =7,467; df=1; p=0,006). Tabulka č. II. 5: Počet žen a mužů podle kritické hodnoty ProCglobal počet žen s hodnotou ProCglobal počet mužů s hodnotou ProCglobal doo,8nr nad 0,8 NR do 0,71 NR nad 0,71 NR ženyt- 10 30 muži T- 2 10 ženy T+ 25 19 muži T+ 19 11 Diskuse ProCglobal se jeví jako jednoduchý screeningový test, který je schopen predikovat náchylnost zejména k žilnímu trombembolizmu v různých situacích. Více prací dokladuje, že jeho patologická hodnota může být po vyloučení dalších trombofilních dispozic nezávislým rizikovým faktorem žilní trombózy (183,184). V naší práci jsme u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami nalezli nižší hodnoty testu ProCglobal nežli v kontrolní skupině zdravých jedinců bez těchto autoprotilátek. S poklesem této hodnoty navíc narůstala četnost případů klinické manifestace žilní trombózy. Hodnota testu byla současně významně ovlivněna přítomností Leidenské mutace faktoru včetně klinické manifestace. V souhlase s jinými nálezy (63) je i dle našich výsledků přítomnost Leidenské mutace významným přídatným rizikovým faktorem u osob s pozitivním průkazem antifosfolipidových protilátek. Protože ProCglobal je považován na test s vysokou senzitivitou k odhalení přítomnosti této vrozené trombofilie (183,185), lze předpokládat, že pokles jeho hodnoty upozorní i na riziko možnosti takto kombinované trombofilie. Přítomnost jiných odchylek krevního srážení ovlivňujících hodnotu ProCglobal tj. deficity proteinu C, proteinu S případně zvýšení aktivity FVIII byla prokázáno v 17ti případech. Hodnota testu v těchto případech však již nebyla statisticky významně nižší ve srovnání se 32 případy, kdy kromě přítomnosti antifosfolipidových protilátek nebyla zjištěna jiná koagulační odchylka a také zastoupení trombotických komplikací nebylo významně vyšší. Zjištěné změny zřejmě druhotně odráží jak vliv vlastních APA na systém krevního srážení, ale stejně tak je možný i vliv základního onemocnění, které tvorbu APA indukuje (zánětlivé či nádorové procesy). Těmito faktory navozené sekundární změny koagulace již dle našich výsledků riziko trombózy dále nezvyšují a jednoznačný vrozený deficit přirozených inhibitorů krevního srážení v našem souboru prokázán nebyl. Nález závislosti hodnoty ProCglobal na pohlaví ve skupině nemocných byl spíše překvapivý, i když o trendu nižších hodnot u mužů bylo již referováno v práci Matýskové 2001(185). Zde však na souboru 565 osob s trombofilií nenabyl rozdíl statistické významnosti (p=0,275) při průměrných hodnotách 0,80 zjištěných u mužů a 0,82 zjištěných u žen. Statisticky významný rozdíl mezi ženami a muži ve skupině nemocných nás vedl k rozdílnému nastavení cut off hodnoty, která v jednotlivých skupinách predikuje riziko -47-
trombózy. U žen se tato hodnota rovnala firemně nastavené tj. 0,8 NR, zatímco u mužů námi zjištěná hodnota schopná predikovat riziko trombózy je 0,71 NR. Vzhledem k tomu, že pokles hodnoty ProCglobal je spojen s významně vyšším rizikem žilní trombózy u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami, že test s vysokou citlivostí zachycuje přítomnost Leidenské mutace FV, že odráží vliv sekundárních změn koagulačního systému (deficity C, S a zvýšení FVIII) i blíže neurčený zásah antifosfolipidových protilátek do krevního srážení, jeví se tento test jako výhodné screeningové vyšetření v této skupině nemocných. -48-
III. DLOUHODOBÉ SLEDOVÁNI PACIENTŮ S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI K URČENI PARAMETRŮ POTŘEBNÝCH K PÉČI O TYTO NEMOCNÉ Úvod Mezi trombofilními stavy má přítomnost antifosfolipidovych protilátek resp. antifosfolipidový syndrom specifické postavení. Odlišuje jej zejména pestrá klinická manifestace, která není obvyklá u vrozených trombofilií a také individuálně velmi různý účinek na organizmus svého nositele. Dnes se stále více autorů kloní k názoru, že důvodem je patofyziologie zásahu protilátek nejen do mechanizmů krevního srážení, ale zejména ovlivnění celé řady buněčných struktur a že řada klinických projevů není způsobena procesem vzniku trombu či mikrotrombu v krevním řečišti (186). Z tohoto pohledu se zdá, že schéma vyšetření pacienta s nálezem těchto autoprotilátek bude v mnohém odlišné od postupů používaných u jiných trombofilních či hyperkoagulačních situací, ať již vrozených nebo získaných. Na základě analýzy nálezů získaných z dlouhodobého sledování nemocných s antifosfolipidovými protilátkami a antifosfolipidovým syndromem jsme se pokusili vytipovat ty diagnostické postupy, které jsou pro vstupní vyšetření resp. i následné sledování pacienta přínosné. Soubor pacientů Do dlouhodobého sledování nemocných s nálezem antifosfolipidovych protilátek bylo zařazeno od září 1999 do začátku srpna 2004 124 nemocných, studie byla ukončena v prosinci 2004. Nejkratší doba sledování byla tedy 4 měsíce. U pacientů, kteří byli již v době zahájení studie v dispenzarizaci pro nález antifosfolipidovych protilátek, byla do celkové doby sledování zahrnuta i předchozí ambulantní péče. Průměrná délka sledování nemocných byla tedy 45,31 měsíce (medián 39 měsíců), s minimem 4 a maximem 139 měsíců. Základní charakteristiku souboru udává tabulka č. III. 1. Tabulka č. III. 1: Soubor pacientů podle věku a pohlaví skupina počet (%) průměr medián min. max. ženy 81 (65,32) 47,53 46 19 91 muži 43 (34,68) 56,14 60 18 83 celkem 124(100) 50,52 52 18 91 Zařazení pacienti měli pozitivní nález antifosfolipidovych protilátek tj. přítomnost lupus antikoagulans (LA), přítomnost antikardiolipinových protilátek (ACLA) a/nebo přítomnost protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I. Podle mezinárodní dohody vytvořené v Sapporu 1998 (82) byli jako pozitivní nemocní považováni ti, kteří měli střední a vysoké titry antikardiolipinů ve třídě IgG či IgM, lupus antikoagulans byl proveden dle doporučení ISTH a v obou případech byla pozitivita dokladována kontrolním vyšetřením v časovém odstupu 6 a více týdnů. Za pozitivní nález byla rovněž považována izolovaná pozitivita (nález pozitivní a silně pozitivní) protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I podle doporučení ISTH z Bostnu 2002 (84), toto vyšetření však nebylo považováno za rutinní a nebylo provedeno u všech pacientů - viz dále. Antikardiolipiny ve třídě IgA byly doplněny u části nemocných, jejich izolovaná pozitivita však vylučovala nemocného ze zařazení do sledování. Přehled zastoupení pozitivity jednotlivých typů antifosfolipidovych protilátek ve sledovaném souboru udává tabulka č. III. 2. -49-
Tab. č.lll. 2: Pozitivní nález jednotlivých typů antifosfolipidových protilátek ve sledovaném souboru nemocných ACLA IgM ACLA IgG ACLA IgA anti- ß 2 -GPI LA N % N % N % N % N % Negativní 52 41,94 56 45,16 78 62,90 46 37,10 11 9,79 Hraniční 5 4,03 4 3,23 15 12,10 NA NA NA NA + 36 29,03 16 12,9 7 5,65 10 8,06 NA NA ++ 8 6,45 12 9,68 7 5,65 30 24,19 NA NA +++ 23 18,55 36 29,03 7 5,65 16 12,90 NA NA nevyšetřeno 0 0 0 0 17 13,71 22 17,74 0 0 Pozitivní NA NA NA NA NA NA NA NA 113 91,13 NA - není aplikovatelné, anti-ß 2 -GPI - protilátky proti anti- ß 2 -glykoproteinu I Pozn: pro sjednocení nálezů z různých laboratoří ve výsledcích ELISA metod použito následující škály hodnocení hraniční nález: vyjádření +- nebo 10 až 19U/ml; + 20 až 39U/ml; ++ 40-79U/ml, +++ 80 a více U/ml Pro možnost dalšího zpracování byli nemocní s minimálně jednou klinickou manifestací ve formě žilního trombembolizmu (hluboká žilní trombóza, plieni embólie, zahrnuta taktéž povrchová tromboflebitida) zařazeni do skupiny MV+, osoby bez takového klinického projevu tvořily skupinu MV-. Analogicky pacienti s arteriální trombózou (prodělaný infarkt myokardu, cévní mozková příhoda či periferní arteriální okluze) byli označení MA+, resp. MA-, pokud takovou trombotickou komplikaci neprodělali. Nemocní, u nichž bylo v průběhu vyšetřování a sledování zjištěno orgánové postižení v důsledku předpokládané mikrotrombotizace, byli zařazeni do skupiny MO+ nebo MO-, pokud takovéto postižení prokázáno nebylo. Ženy, které prodělaly nejméně jednu ztrátu plodu, byly zařazeny do skupiny SPA+, ty, u nichž ke ztrátě plodu nikdy nedošlo, tvořily skupinu SPA- (bez ohledu na to, zda byly, či nebyly těhotné). Zastoupení pacientů v jednotlivých takto definovaných skupinách shrnuje tabulka č. III. 3. Tab. č. II. 3: Zastoupení nemocných i/ jednotlivých skupinách pod le klinických projevů skupina MV+ MV- MA+ MA- MO+ MO- SPA+ SPA- SPANÁ N 51 73 34 90 55 69 18 63 43 % 41,13 58,87 27,42 72,58 44,35 55,65 14,52 50,81 34,68 NA - nelze aplikovat Metodika Pacienti zařazení do souboru prošli vstupním a opakovanými kontrolními vyšetřeními jednak klinickými, jednak laboratorními. Tato vyšetření byla provedena v následujícím schématu: Anamnéza: Rodinná: zaměření na frekvence výskytu trombembolických komplikací, samovolných reprodukčních ztrát a systémových/autoimunitních onemocnění Osobní: zaměření na výskyt možných projevů a/nebo přítomnost známého infekčního, nádorového onemocnění, systémového onemocnění pojiva či jiného autoimunitního onemocnění. Výskyt arteriálních či žilních trombóz, jejich frekvence a vyvolávající okolnosti Farmakologická: zaměření na medikaci léků, které indukuji přítomnost APA Gynekologická: event, přítomnost reprodukčních ztrát včetně týdnu gestace a jiných známých okolností, za kterých k nim došlo, event, je-li k dispozici i pitevní nález ; užívání estrogenní hormonální léčby Nynější onemocnění: zaměření na příznaky artralgických resp. artritických projevů, fotosenzibilita, přítomnost nespecifických příznaků systémových či nádorových procesů - teploty, hmotnostní úbytek. Poruchy kognitivních funkcí - zapomnětlivost, poruchy -50-
pozornosti, obtíže se soustředit až projevy demence. Poruchy osobnosti, křečové stavy, migrény. Poruchy visu. Projevy střevní poruchy. Projevy hypofunkce štítnice. Krvácivé projevy. Objektivní nález: zaměření na Kůže, sliznice: tvářový či diskoidní erythém, livedo reticularis, kožní ulcerace, nekrotizující vaskulitida, livedoidní vaskulitida, kožní gangréna a nekróza, ulcerace nosního septa, patra, povrchová trombofilebitis, pseudovaskulitické leze, subungální hemorrhagie Kardiovaskulární systém: projevy srdeční vady (mitrální regurgitace), projevy kardiálního selhání, Perikarditis, hypertenze Plíce: známky pleuritidy Břicho: hepatosplenomegalie, resistence v dutině břišní Končetiny: projevy Raynaudova syndromu, žilní trombózy, postflebitického syndromu Postižení periferních uzlin, prsu. Laboratorní nález: krevní obraz a diferenciální rozpočet leukocytu základní koagulogram - protrombinový čas dle Quicka, aktivovaný parciální tromboplastinový test, fibrinogen, D-dimery U nemocných, z jejich základního vyšetření nevyplynula příčina možné indukce antifosfolipidových protilátek, byl rozsah vyšetření doplněn o: základní revmatologická vyšetření - ANA, antiena, protilátky proti nativní DNA (event, i imunofluorescenčně) bílkovina v moči za 24 hodin echokardiografie sonografie orgánů dutiny břišní vyšetření protilátek proti virovým hepatitídam, viru EB a cytomegaloviru protilátek proti erytrocytům (NAT, PAT, chladové aglutininy) a trombocytům Doplňková vyšetření byla již cíleně zaměřena podle klinických či laboratorních projevů a směřovala k: zjištění orgánového postižení u přítomnosti antifosfolipidových protilátek funkční vyšetření ledvin resp. i renální biopsie, rtg hrudníku, funčkní vyšetření plic, při prodloužení PT aktivita Fll, při krvácivých projevech funkční vyšetření trombocytů či jiné poruchy primární hemostázy. Neurologické vyšetření, psychiatrické vyšetření, NMR, sonografie karotid, oční vyšetření včetně event, fluorescenční angiografie, TSH event. s endokrinologické vyšetření a další zjištění možného vyvolávajícího onemocnění revmatologické vyšetření, screening na onkologické resp. hemato-onkologické onemocnění V průběhu sledování byla opakovaně prováděna klinická a laboratorní vyšetření k vyloučení sekundárního procesu v doporučení dle Piette (87) - klinické a laboratorní vyšetření v intervalu minimálně 6 měsíců, echokardiografie a kvantitativní Proteinurie jednou ročně. Pro vyhodnocení byl od každého pacienta použit klinicky nejzávažnější nález. Stanovení pozitivity antifosfolipidových protilátek K určení přítomnosti lupus antikoagulans byla použita metodika běžně užívaná na našem pracovišti, popsaná dříve. Ke stanovení pozitivity protilátek proti kardiolipinum resp. protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I jsme využili výsledků ze spolupracujících laboratoří, do nichž při běžné ambulantní činnosti -51 -
odběry zasíláme. Jde o imunologickou laboratoř Dermatovenerologické kliniky Fakultní nemocnice v Brně (provádí semikvantitativní stanovení ACLA ve třídách IgM, IgG, IgA), imunologickou laboratoř Imunologického ústavu Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně (provádí kvantitativní stanovení ACLA ve třídách IgM a IgG a semikvantitativní stanovení protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I bez určení tříd) a dále soukromou imunologickou laboratoř Viamedia v Brně (provádí semikvantitativní stanovení ACLA ve třídách IgM, IgG a IgA a semikvantitativní stanovení protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I ve třídách IgM, IgG a IgM). Pro sjednocení nálezů byla použita semikvanitativní škála uvedena v tabulce č. 2, pozitivita protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I nepřihlížela k případnému stanovení třídy imunoglobulinu. Statistické zpracování Mannův-Whitneyův U test byl použit ke srovnání počtu trombocytu u pacientů LA negativních a LA pozitivních. Tento test byl rovněž použit ke zhodnocení rozdílů v počtu trombocytu u pacientů s MV a bez MV, u pacientů s MA a bez MA, u pacientů s MO a bez MO, a také u pacientek s SPA a bez SPA. Mannův-Whitneyův U test byl použit také ke srovnání počtu trombocytu u pacientů s pozitivními ACLA G a negativními ACLA G a věku u pacientů s hypertenzí a bez hypertenze. Ke srovnání počtu trombocytu u pacientů s různými hladinami protilátek ACLA IgM, ACLA IgG, ACLA IgA a také protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I byl vzhledem k nenormálnímu rozložení dat použit Kruskalův-Wallisův test. Vztah mezi pozitivitou/negativitou protilátek ACLA IgM (i ACLA IgG, ACLA IgA, LA, antiß 2 - glykoprotein I) a výskytem žilního trombembolizu, (také manifestaci arteriální trombózy, orgánového postižení, resp. spontánních abortů) byl hodnocen Fisherovým exaktním testem. Podobně byl Fisherův exaktní test použit ke zjištění závislosti pozitivity protilátek ACLA IgM, ACLA IgG, ACLAIgA, LA, protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I a počtu trombocytu, vyjádřených ve dvou kategoriích (do 150x10 9 /l a nad 150x10 9 /l). Pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) byly zjišťovány vztahy mezi hladinou protilátek ACLA IgM, ACLA IgG, ACLA IgA, LA, antiß 2 -glykoprotein I a počtem trombocytu a výskytem MV, MA, MV, SPA. Hladiny protilátek byly kvantifikovány následovně: - = 0; hran = 0.5; + = 1; ++ = 2; +++ = 3. Do PCA byly proměnné hladiny protilátek a počet trombocytu zařazeny jako aktivní proměnné, výskyt MV, MA, MO, SPA byly zařazeny jako pasivní proměnné (supplementary variables). Pomocí metodiky analýzy přežití byla spočítána doba nástupu onemocnění (trombózy), kdy jako kompletní odpověď byl použit výskyt daného typu trombózy. Výsledkem této analýzy bylo také procento pacientů, u kterých došlo k manifestaci DVT/EP, SVT, AtypT nebo CMP po 12 měsících. Ke srovnání počtu trombocytu mezi pacienty, kteří mají nějakou protilátku a pacienty bez protilátky byl vzhledem k normálnímu rozdělení počtu trombocytu ve skupinách použit t-test. Ke srovnání počtu trombocytu mezi skupinami pacientů s různým typem protilátek byla použita analýza rozptylu. -52-
Výsledky Rodinná anamnéza: Rodinná anamnéza zahrnovala data od příbuzných - prarodiče, rodiče, sourozenci a děti. Jen informace o případném výskytu antifosfolipidového syndromu, pokud byla k dispozici, byla zahrnuta v širším příbuzenstvu. Byl analyzován výskyt žilního trombembolizmu (TEN), arteriální trombózy - tj. klinických manifestací ve formě infarktu myokardu a/nebo cévní mozkové příhody (AT), výskyt revmatických onemocnění, výskyt krvácivých komplikací a výskyt případů antifosfolipidového syndromu. Výsledky shrnuje tabulka č. III. 4. Tab. č. III. 4: Výsledky analýzy rodinné anamnézy pacientů s antifosfolipidovými protilátkami negativní AT TEN Revmat.on krvácení APS Jiná Počet 77 19 12 10 2 1 3 % 62,1 15,3 9,7 8,1 1,6 0,8 2,4 Mezi revmatickými onemocnění byl zjištěn jednou výskyt systémového lupus erythematodes u otce, jednou prodělaní revmatické horečky u matky a jednou výskyt erythema nodosum u dcery našich pacientů. Ostatní revmatická onemocnění nebylo možno blíže specifikovat. S nálezem antifosfolipidového syndromu v rodinné anamnéze jsme se setkali jen jednou u synovce naší pacientky (nebyl však u nás vyšetřen). Klinická manifestace trombózy: Přehled klinické manifestace trombózy v arteriálním či žilním řečišti shrnuje tabulka č. III. 5. Jde o nálezy, které byly zjištěny z osobní anamnézy, nebo k této manifestaci došlo v průběhu sledování (viz ještě dále). Tabulka č. II. 5. Výskyt trombotických příhod u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami DVT EP SVT Atyp. T IM CMP počet 38 12 15 13 9 13 % 30,6 9,7 12,1 10,5 7,3 10,5 z toho recidivujíci 15 2 4 0 3 7 % 12,1 1,6 3,2% 0 2,4 5,6 25 10 14 13 NA NA z toho idiopaticky %* 65,8 83,3 93,3 100% NA NA DVT - hluboká žilní trombózy EP - plieni embólie SVT - povrchová tromboflebitida * procento je vyjádřeno vůči počtu trombóz Atyp. T - trombóza v atypické lokalizaci IM - infarkt myokardu CMP - cévní mozková příhoda (zahrnuty i tranzitorní ischemické ataky) NA - nelze aplikovat; analýza rizikových faktorů nebyla detailně provedena Mezi analýzou příčin manifestace hluboké žilní trombózy bylo 4x podání hormonální léčby (včetně kortikoidů, hormonální kontracepce a anabolik), 3x úraz s imobilizací, 3x porod, 2x invazivní zákrok a jednou klinicky zjevná arthritida kyčelního kloubu. V případě plieni embólie šlo jednou o porod a jednou o podání chemoterapie. Ke klinické manifestaci superficiální flebitidy došlo jednou v souvislosti s podáváním hormonální restituční terapie. Při analýze postižení CNS při diferenciální diagnostice trombotického postižení mozku jsme navíc zjistili poměrně frekventní nález epilepsie v našem souboru - u šesti nemocných tj. 4,8%. Z těchto nemocných 4 měli negativní CT i NMR nález při vyšetření mozku, jeden z nemocných měl po vícečetných ischemických příhodách a u jedné pacientky bylo NMR ischemické ložisko v mozečku zjištěno až za 4 roky po začátku klinických projevů. Naopak u tří našich nemocných byly NMR změny zjištěny bez zřejmé ložiskové neurologické Symptomatologie - vyšetření bylo indikováno na základě anamnézy poruchy kognitivních funkcí. V průběhu sledování došlo ke klinické manifestaci trombózy u 17-ti našich nemocných, z toho u dvou nemocných byla přes následně zavedenou léčbu trombotická příhoda -53-
opakovaná (tj. celkem 19 příhod za dobu sledování). Jedna pacienta prodělala dvě plieni embólie přes zavedenou léčbu warfarinem, u druhého pacienta došlo k TEN manifestaci a přes zavedenou léčbu warfarinem prodělal recidívu cévní mozkové příhody. Pomocí metodiky analýzy přežití byla spočítána doba nástupu onemocnění - klinické manifestace trombózy, kdy jako kompletní odpověď byl použit výskyt daného typu trombózy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. III. 6. a na obr. č. III. 1-4. Tabulka č. III. 6: Klinická manifestace trombózy za 12 měsíců sledování typ klinické manifestace pacientů za rok (%) DVT/EP 2,58 SVT 0,86 atypická trombóza 0,86 CMP 0,43 DVT/EP - hluboká žilní trombóza a/nebo plieni embólie SVT - povrchová tromboflebitida CMP - cévní mozková příhoda Do 12 měsíců sledování došlo k žilnímu trombembolizmu u 2,58% sledovaných nemocných, k povrchové tromboflebitidě a atypické trombóze u 0,86%, k příznakům cévní mozkové příhody u 0,43% nemocných. Z 19 příhod bylo 11 tj. 57,9% recidivujících, u 15 tj. 78,9% nebyl zjištěn žádný provokující moment (idiopatická manifestace). Krvácivé projevy Sklon ke zvýšenému krvácení mělo dle anamnézy nebo v klinickém obraze v našem souboru 71 nemocných tj. 57,3%. V naprosté většině šlo o nezávazné stavy charakteru zvýšeného sklonu k hematomů, epistaxím, hypermenorrhoea. Závažné krvácení bylo u dvou nemocných krvácení do gastrointestinálního traktu, jedno život ohrožující krvácení měla jedna naše pacientka, avšak bez souvislosti s přítomností antifosfolipidových protilátek - krvácení při placenta previa. Při analýze příčin jsme zjišťovali souvislost s podávanou terapií, dočasný či trvalý sklon k hemorrhagické diatéze. Výsledky shrnuje tabulka č. III. 7. Tabulka č. III. 7: Příčiny krvácivých projevů u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami příčina N %* trombocytopenie 29 40,8 protidestickova léčba 4 5,6 antikoagulační léčba 8 11,2 deficit Fl I 11 15,5 vrozený deficit FVII 1 1,4 vrozený deficit FXI 1 1.4 von Willebrandova choroba 1 1,4 dysfibrinogenémie 1 1,4 hemofílie A těžká 1 1,4 hemofílie B lehká 2 2,8 renální selhání 2 2,8 nezjištěna 13 18,3 *je uvedeno procento z nemocných, kteří měli projevy krvácení Do skupiny, kdy jako příčina byla identifikována antikoagulační či protidestickova léčba, byly zařazeny případy, kdy jiná příčina nalezena nebyla a krvácivé projevy měly jasnou časovou souvislost se zavedeném těchto typů terapie. -54-
U více nemocných bylo možno zjistit kombinovanou příčinu krvácení. Vrozené stavy byly ověřeny rodinnou studií, nebo šlo o nemocné sledované pro toto základní onemocnění v naší ambulanci - u dvou nemocných s hemofílií byl nález antifosfolipidových protilátek druhotný při diferenciální diagnostice aptt prodlouženého přes substituční terapii. Oba taktéž měli přítomnost antikardiolipinových protilátek. Charakter krvácení byl typický pro diagnózu - u pacientka s těžkou hemofílií opakované krvácení do kloubů, u pacienta s lehkou hemofílií krvácení po operačním výkonu před stanovením diagnózy. Situace není jednoznačná u jednoho z nemocných s deficitem FIX, který neměl pozitivní rodinnou anamnézu a celý život měl sklon ke krvácení. Deficit FIX však u něj byl stanoven až ve vysokém věku 70-ti let. Sekundární hypoprotrombinémie byla ve většině případů spíše lehká - průměrná hodnota aktivity byla u prokázaných deficitů Fll (tj. < 70%) 54%, medián 64%, minimum 14%, maximum 67%. Orgánové projevy a) postižení kůže V našem souboru jsme zjišťovali jednak možné poškození kůže vlastní přítomností antifosfolipidových protilátek, jednak projevy, které vedou k podezření na rozvoj systémového procesu. Nálezy shrnuje tabulka č. III. 8. Tabulka č. III. 8: Kožní nálezy u nemocných s antifosfolipidov typ projevu N % livedo reticularis 8 6,5 pseudovaskulitické leze 10 8,1 kožní ulcerace 1 0,8 tvářový erythém, diskoidní 7 5,6 erythém fotosenzitivita 3 2,4 Raynaudův fenomén 3 2,4 V našem souboru bylo orgánové postižení kůže přítomností antifosfolipidových protilátek s předpokládanou mikrotrombotizací zjištěno u 19 tj. 15,3% tj. nemocných. b) postižení kardiovaskulárního aparátu hypertenze Hypertenzi mělo mezi našimi nemocnými 52 tj. 41,9% nemocných. Přestože se nález vysokého krevního tlaku vyskytoval i u mladších nemocných - 9 pacientů (tj. 7,3% z celého souboru a 17,3% z pacientů s hypertenzí) ve věku do 40ti let, byl věk nemocných s hypertenzí vyšší nežli nemocných bez hypertenze (Mannův-Whitneův U test; U=981,5; p<0,001). Srovnání přináší tabulka č.lll. 9 a obr.č.lll.5. Tabulka č. II. 9: Hypertenze u nemocnýc h s antifosl olipidovými protilátkami Věk N průměr medián min. max. 10% kvantil 90% kvantil srn. odchylka hypertenze ano 52 59,77 62 20 91 34 78 16,03 hypertenze ne 72 43,83 40,5 18 83 23 72 18,10 nálezy na echokardiografii -55-
Echokardiografické vyšetření bylo provedeno nejméně jednou u 105 nemocných. Toto vyšetření nebylo indikováno u pacientů, u nichž bylo dominantní základní onemocnění - nádorové, nebo toto vyšetření přes vysvětlení důležitosti nechtěli absolvovat. Nálezy shrnuje tabulka č. III. 10. Tabulka č. III. 10: Echokardiografické nálezy u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami Nález N %* postižení Mi chlopně Mi regurgitace kombinovaná Mi vada ztluštění chlopně** 20 17 3 5 19,0 16,2 2,9 4,8 ztluštění Ao chlopně 2 1,9 Tri regurgitace 2 1.9 pulmonální regurgitace 1 1.0 kombinovaná změna na chlopních*** 23 21,9 stopa perikardiálního výpotku 3 2,9 jiné nálezy 7 6,7 negativní 48 45,7 procento kalkulováno z počtu vyšetřených ** ztluštění chlopně bylo provázeno mitrální regurgitací *** všechny kombinované změny zahrnovaly současně mitrální regurgitací Mi - mitrální Ao-aortální Tri - trikuspidální Postižení mitrální chlopně regurgitací bylo nejčastějším nálezem, které bylo popsáno samostatně nebo v kombinaci u 43 nemocných tj. 40,9%. Mezi jinými nálezy byly opakovaně zjištěny ložisková hypokineze, jednou koncentrická hypertrofie levé komory, jednou izolovaný nález poruchy diastolického plnění levé komory a jednou nález foramen ovale apertum. c) postižení ledvin Vyšetření ledvin bylo provedeno u 112 nemocných. Podobně jako u echokardiografie část nemocných toto vyšetření neabsolvovala. Nálezy shrnuje tabulka č. III. 11. Tabulka č. III. 11: Nálezy při vyšetření ledvin u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami. zjištěný nález N %* poteinurie za 24 hodin > 39 43,68 0,015g snížená GF nebo CHRI 10 8,9 End stage kidney 1 0,9 jiné nálezy dle histologie TMA lupus nefritis IgA nefropatie minimální glomerulární změny mesangiálně proliferativní nefritida 8 2 3 1 1 1 7,1 1,8 2,7 0,9 0,9 0,9 jiné nálezy na ledvinách 5 4,5 normální nález 59 52,7 procento počítáno z vyšetřených nemocných, součet nedává 100% neboť některé nálezy jsou kombinované GF - glomerulární filtrace CHRI - chronická renálni insuficience -56-
d) postižení plic Funkční vyšetření plic a/nebo pneumologické vyšetření bylo provedeno u 80 nemocných našeho souboru. Nálezy shrnuje tab. č. III. 12. Tabulka č. III. 12: Nálezy vyše tření plic u nemocných s antifo; nález N % obštrukční ventilační 5 6,3 porucha reštrikční ventilační porucha 5 6,3 porucha d if use 5 6,3 parciální respirační 2 2,5 insuficience normální nález 65 81,3 'procento počítáno z vyšetřených nemocných, součet nedává 100% neboť některé nálezy jsou kombinované e) postižení endokrinních žláz Osm (tj. 6,5%) z našich nemocných bylo léčeno pro hypothyreózu, tři (tj. 2,4%) pro insuficienci nadledvinek (z toho oba tyto nálezy byly zjištěny u jednoho pacienta). Výsledky analýzy jednotlivých typů antifosfolipidových protilátek a jejich kombinací podle přítomnosti či nepřítomnosti klinických projevů shrnuje tabulka č. III. 13. Jako negativní byly souborně označeni pacienti zařazení do skupin MV-, MA- a MO-. Jako pozitivní byli označeni nemocní ze skupin MV+ a/nebo MA+ a/nebo MO+. K jakékoli klinické manifestaci došlo u 94 tj. 75,8% nemocných. Zcela bez klinických příznaků bylo 30 tj. 24,2% pacientů. Přítomnost či nepřítomnost spontánního potratu zde nebyla uvažována. Tabulka č. III. 13: Jednotlivé typy antifosfolipidových protilátek ve vztahu ke klinickým projevům ACLA IgM ACLA IgG ACLA iga antiß 2 - GPI LA negat požit celkem negat % požit % celkem % + + + + + 7 7 0,0 5,6 5,6 + + + + 1 1 2 0,8 0,8 1,6 + + + + 7 17 24 5,6 13,7 19,4 + + + 1 1 0,0 0,8 0,8 + + + 2 7 9 1,6 5,6 7,3 + + 1 1 2 0,8 0,8 1,6 + + + 1 1 2 0,8 0,8 1,6 + + + 4 4 0,0 3,2 3,2 + + 1 3 4 0,8 2,4 3,2 + + 2 8 10 1,6 6,5 8,1 + 1 1 2 0,8 0,8 1,6 + + + + 1 1 0,0 0,8 0,8 + + + 2 6 8 1,6 4,8 6,5 + + 1 1 0,0 0,8 0,8 + + 1 7 8 0,8 5,6 6,5 + 1 1 0,8 0,0 0,8 + + 2 2 0,0 1,6 1,6 + + 3 3 6 2,4 2,4 4,8 + 7 23 30 5,6 18,5 24,2 celkový součet 30 94 124 24,2 75,8 100,0-57-
Za pomoci analýzy hlavních komponent jsme prokázali silné ovlivnění výskytu žilního trombembolizmu nálezem lupus antikoagulans a počtem trombocytu pod fyziologickými hodnotami, zatímco mnohem méně výrazný byl trend výskytu arteriálních trombóz a orgánových postižení přítomností antikardiolipinů ve třídě IgA, IgM a přítomností protilátky proti ß 2 -glykoproteinu I. Nálezy ukazuje obr. č. 111.6. Vzájemné vztahy mezi jednotlivými klinickými manifestacemi a jednotlivými typy antifosfolipidových protilátek byly následně analyzovány za pomoci Fischerova exaktního testu. Nálezy vztahů u hlavních skupinách shrnuje tab. č. 111.14. Pomocí Fischerova testu nebyla prokázána jasná souvislost mezi výskytem antikardiolipinů ať již třídy IgG či IgM, resp. přítomností lupus antikoagulans a jednotlivých klinických projevů. Nebyl prokázán rovněž vztah mezi nálezem antikardiolipinů třídy IgA a výskytem venózní trombózy (N=92; p=1,0000), arteriální trombózy (N=92; p=0,34567) a nálezem orgánového postižení (N=92; p=0,77119), resp. ani mezi nálezem protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I a nálezem žilního trombembolizmu (N=102; p= 1,0000) a orgánového postižení (N=102; p= 1,0000). Trend byl naznačen v případe tepenné okluze (N=102; p=0,08182), ale v našem souboru nedosáhl statistické významnosti. Počet trombocytu. trombocvtopenie a antitrombocytámí protilátky Počet trombocytu byl analyzován u všech nemocných. Pacientů s počtem trombocytu pod 150x10 9 /l bylo souboru 53 tj. 42,7%, nemocných s nesníženým počtem trombocytu tedy 150x10 9 /l a více 73 tj. 57,2%. U 72 pacientů byly navíc stanoveny protilátky proti trombocytům. Výsledky shrnuje tabulka č. III. 14. Tabulka č. III. 15: Poč1 y trombocytu u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami Skupina N průměr Medián Min. Max. 10% kvantil 90% kvantil Sm. odchylka Celý soubor 124 171,08 161,5 10 693 84 250 84,17 Zeny 81 170,42 173 10 335 84 243 67,56 Muži 43 172,33 150 19 693 75 250 109,78 Skupina vyšetřených* 72 155,69 150,5 10 335 65 247 74,21 PI negativní 38 180,32 179,5 10 335 75 273 77,46 DIFT+ 20 132,85 126 33 240 53,5 220 61.33 ELISA+ 6 143,5 136,6 125 183 125 183 21.80 TAT+ 2 71,50 71,5 20 123 20 123 72,83 DIFT+ELISA+ 6 116,17 102,5 19 250 19 250 79,99 * skupina vyšetřených na přítomnost protilátek proti trombocytům PI - protilátky Ve skupině nemocných se současnou pozitivitou průkazu některé z antitrombocytámích protilátek (u 34 pacientů) byl zjištěn nižší počet trombocytu nežli u nemocných bez průkazu těchto protilátek (t-test, t=3,159; df=70; p=0,002). Mezi pozitivitou různých testů k jejich průkazu však již nebyl zjištěn v počtu trombocytu žádný rozdíl (ANOVA, F=0,822; dfi=3, df 2 = 30; p=0,492). Nálezy ukazuje obr. č. III.7. -58-
Tab. č. III.14: Vzájemné vztahy mezi hlavními typy antifosfolipidových protilátek a klinickými projevy MV negat MV požit celkem MA negat MA požit Celkem MO negat MO požit Celkem ACLA IgM poz ACLA IgM negat 41 26 67 44 23 67 34 33 67 31 1 52 42 10 52 30 22 52 celkem 72 47 N=119* 86 33 N=119* 64 55 N=119* Fischerův test p= 1,000 p=0,09803 p=0,45670 Ol CO ACLA IgG poz 37 27 64 46 18 64 33 31 64 ACLA IgG negat 34 22 56 41 15 56 32 24 56 celkem 71 49 N=120* 87 33 N=120* 65 56 N=120* Fischerův test p=0,85265 p=1,0000 p=0,71260 LA požit 65 46 112 81 31 112 62 50 112 LA negat 8 4 12 9 3 12 7 5 12 celkem 73 51 N=124 90 34 N=124 68 55 N=124 Fischerův test P=0,75965 p=1,0000 ' součet není roven počtu pacientů souboru, hraniční nálezy antikardiolipinových protilátek nebyly do analýzy uvažovány p=0,70377
Byla provedena analýza počtu trombocytů ve vztahu k pozitivitě antifosfolipidových protilátek. Nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi pacienty s přítomností lupus antikoagulans a bez tohoto nálezu (Mannův Whitneův U test; U=583,0; p=0,452). Podobně nebyl zjištěn rozdíl v počtu trombocytů v jednotlivých skupinách pozitivity antikardiolipinů třídy IgM (Kruskal-Wallis ANOVA, H=5,567; p=0,234), třídy IgA (Kruskal-Wallis ANOVA, H=1,067; p=0,785) a protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I (Kruskal-Wallis ANOVA, H=6,629; p=0,085). Naproti tomu ve skupině nemocných s protilátkami proti kardiolipinům ve třídě IgG - (nálezy + až+++) je statisticky významně nižší (Mannův-Whitneyův test, U=1492; p=0,033) ve srovnání s pacienty s negativními nálezy (- až +-). Výsledky ukazuje tabulka č. III. 16 a obr. č. III. 8. Tabulka č. 111.16: Srovnání počtu trombocytů u ACLA IgG pozitivních a ACLA IgG negativních pacientů ACLA IqG N průměr medián min max 10% kvantil 90% kvantil srn. odchyl. neg 60 191,72 175,5 19 693 101 294,5 99,12 poz 64 151.73 154 10 274 65 225 62,00 celkem 124 171,08 161,5 10 693 84 250 84.17 Autoimunitní hemolvtická anémie a protilátky proti erytrocvtům Klinickou manifestaci autoimunitní hemolytické anémie měla v průběhu sledování jedna nemocná (tj. 0,9%). Mnohem častější byl pozitivní nález při vyšetření protilátek proti červeným krvinkám. U 76 nemocných bylo provedeno systematické vyšetření těchto antierytrocytámích protilátek v rozsahu screening antierytrocytámích protilátek, vyšetření chladových aglutininů, přímý a nepřímý antiglobulinový test, test v prostředí bromelinu. Výsledky shrnuje tabulka č. III. 16. Tabulka č. III. 17: Nálezy vyše tření antierytrocytámích protilátek nález N %* negativní 48 63,2 nespec, reakce bromelin 10 13,2 NAT bez urč. specifity 8 10,5 PAT bez urč. speficity 14 18,4 aloimunitní protilátky 6 7,9 NAT s určenou speficitou 1 1,3 PAT s určenou specifitou 0 0 chladové aglutininy 4 5,3 *je vyjadřováno z vyšetřených nemocných; u některých nemocných více pozitivních nálezu, nelze sumárně shrnovat NAT - nepřímý antigloublinový test PAT - přímý antiglobulinový test U aloimunních protilátek nepředpokládáme souvislost s nálezem antifosfolipidových protilátek. S výjimkou dříve uvedeného případu autoimunitní hemolytické anémie s pozitivitou jak PAT tak i NAT (polyspecifické protilátky), všechny ostatní nálezy neměly klinicky ani laboratorně prokázánu extravaskulární a/nebo intravaskulární hemolyzu. Chladové aglutininy byly ve všech případech v nízkém titru bez klinického významu. Systémová onemocnění Přehled systémových onemocnění, která byla u nemocných známa v době zařazení do našeho sledování, resp. která byla následně diagnostikována, udává tabulka č. 18. -60-
Tabulka č. 18: Systémová a jiná autoimunitní onemocnění u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami onemocnění N % systémový lupus erythematodes 19 15,3 SLE-like syndrom 31 25 Sklerodermie 2 1,6 revmatická artritída 6 4,6 juvenilní revmatická artritída 1 0,8 ankylozující spondartritida 2 1,6 anamnéza prodělané revmatické 2 1.6 horečky polymyalgia revmatica 1 0,8 anamnéza erythema nodosum 1 0,8 IgA nefropatie 1 0,8 psoriáza 1 0,8 Crohnova choroba 1 0,8 celkem 68 54,8 U čtyř nemocných byla diagnóza SLE a u jednoho pacienta diagnóza ankylozující spondartritidy stanovena bezprostředně po převzetí do naší péče na základě naší indikace revmatologického vyšetření (diagnóza zjevného onemocnění byla do 2 měsíců revmatologem potvrzena). U 9 nemocných (z 19 celkem) se v průběhu našeho sledování postupně vyvinuly klinické či laboratorní kriteria, které dovolily stanovit diagnózu SLE. Doba, za kterou došlo k rozvoji těchto diagnostických příznaků byla průměrně 54,4 měsíce, medián 52 měsíců. V nejkratším sledování jsme zjistili systémové onemocnění za 14 měsíců, nejdelší doba, po niž k této manifestaci došlo byla v našem souboru 112 měsíců. V této souvislosti je potřeba upozornit na případ nemocné nar. 1978, která byla vedena jako primární antifosfolipidový syndrom (opakovaná ztráta plodu, opakovaná trombembolická manifestace). Žádné klinické ani laboratorní známky nesvědčily pro systémové onemocnění, jen na echokardiografii byly stopy perikardiálního výpotku bez progrese. Autoprotilátky antiena, protilátky proti nativní DNA byly opakovaně negativní, ANA nejvýše do titru 1:160. Tato pacientka po 46 měsících sledování zemřela na fulminantní průběh SLE nereagující na léčbu ve svých 24 letech. V době náhlé klinické manifestace systémového onemocnění byly náhle výše zmíněné autoprotilátky silně pozitivní (bez ohledu na negativní nález před 4 měsíci). Do skupiny SLE-like syndrom" jsme zařadili nemocné, kteří naplňují vylučující kriteria primárního antifosfolipidového syndromu dle Piette 1996 (s výjimkou polékové indukce antifosfolipidových protilátek), ale za dobu sledování nebyly u nich kriteria SLE naplněna. Průměrná doba sledování těchto nemocných byla v době ukončení studie 40,6 měsíce, medián 35 měsíců, minimální sledování 9 měsíců, maximální 139 měsíců. Nádorová onemocnění Vzhledem k možné indukci antifosfolipidových protilátek nádorovým onemocnění, bylo pátráno po nádorovém onemocnění prodělaném v anamnéze či aktivním onemocnění v léčbě. Také v rámci vstupního či kontrolních vyšetření byla na tuto možnost zaměřena aktivní pozornost. Výsledky tohoto pozorování shrnuje tabulka č. 19. Mezi nádorová onemocnění byly zařazeny i prekancerózy" typu aplastické anémie a myelodysplastického syndromu. U dvou nemocných jsme se setkali s duplicitou - měli anamnézu dříve řešeného nádoru a současně přítomnost aktivního onemocnění. Šest nemocných bylo z našeho sledování vyřazeno právě v důsledku úmrtí na základní nádorovou diagnózu, z toho jeden za projevů masivní plieni embólie. -61 -
Tabulka č. 19: Nádorová onemocnění u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami N % Diagnózy v anamnéze thymom, nádor oka, ca vaječníku, nádor ledviny, 7 5,6 ca submandibulární žlázy, ca dělohy, Seminom aktivní onemocnění ca močového měchýře, 2x aplastická anémie, 1x 15 12,1 MDS, maligní Schwannom, 2x CMMol, PV, 2xHCL*, tumor jícnu, adenoca kardie žaludku*, M. Hodgkin, mnohočetný myelom*, CLL zjištěno při sledování 3 2,4 ET, CLL, hepatocelulární ca jater pozitivní onkomarkery 1 0,8 Ca 72-2 Ca - karcinom;mds - myelodysplastický syndrom;hcl - vlasatobuněčná leukémie CLL - chronická lymfatická leukemie;cmmol - chronická myelomonocytární leukémie PV - pravá polycytémie; ET - esenciální trombocytémie;m - morbus * případy doprovázené monoklonálnl gamapatií K diagnóze nového nádorového onemocnění došlo v jednom případě v rámci vstupního vyšetření a další analýzy laboratorních nálezů - lehká lymfocytóza s následnou analýzou za pomocí flowcytometrie umožnila časnou diagnózu chronické lymfatické leukémie (kriteria jsou jen hraničně naplněna). K rozvoji esenciální trombocytémie došlo u druhého nemocného po 47 měsících sledování, k příznakům hepatocelulámího karcinomu a k jeho diagnóze u třetího pacienta za 41 měsíců sledování. Indukce antifosfolipidových protilátek léky Z léků, které jsou známy možností indukce tvorby antifosfolipidových protilátek, naši pacienti užívali v čase zařazení do sledování jednom případě preparát Kinidin durules, jedna nemocná měla krátce vysazenou hormonální antikoncepci a jedna pacientka hormonální restituční terapii. Ani v jednom případě nedošlo po vysazení léku k vymizení přítomnosti protilátek při sledování 75, 20 resp. 23 měsíců. Z tohoto důvodu považujeme kausální souvislost s uvedenou medikací za málo pravděpodobnou. Virová a jiná infekční onemocnění Sérologická vyšetření na přítomnost virového onemocnění - infekční mononukleosy (EBV), infekční hepatitídy či cytomegalovirové infekce (CMV) bylo provedeno U 80ti nemocných. U ostatních bylo od této diagnostiky upuštěno, neboť v čase vyšetření byla identifikována jiná možná příčina indukce antifosfolipidových protilátek. Nálezy shrnuje tabulka č. 20 Tab. č. 20: Proti átky proti virovým < onemocněním negat EBV EBV EBV CMV CM CMV HAV Jiné IgG IgM IgM+lgG IgG IgM IgM+lgG N 4 61 0 4 26 3 11 18 5(4) % 5 76,3 0 5 32,5 3,8 13,8 22,5 NA V našem souboru nebyla zjištěna žádná akutní EB virová infekce, u tří nemocných nelze vyloučit indukci protilátek v souvislosti s akutní infekcí cytomegalovirem. Reaktivace EBV či CMV infekce byla zjištěna celkem u 15ti pacientů, může jít o výraz odchylné reakce imunitního systému. Mezi jinými nálezy jsou zahrnuty 1x pozitivita proti kôrovému antigénu viru hepatitídy B, 2x pozitivita proti s antigénu hepatitídy B. U jednoho z nemocných byl průkaz hepatitídy B (anti-s) a taktéž sérologický průkaz hepatitídy C ověřený pozitivním PCR nálezem. V tomto případě šlo o nemocného s těžkou hemofílií A na dlouhodobé substituční léčbě a domníváme se, že tyto komplikace u něj mohou být příčinou indukce antifosfolipidových protilátek. -62-
V jednom případě jsme diagnostikovali přítomnost antifosfolipídových protilátek v časové souvislosti s prodělanou meningitidou s průkazem Neiseria meningitidis. Dvě naše nemocné byly opakovaně léčeny pro kloubní formu Lymeské boreliózy. Diskuse Již v roce 1994 se v českém písemnictví objevily první práce, odrážející komplexní pohled na problematiku antifosfolipídových protilátek - tj. identifikaci možných příčin jejich indukce, tak i orgánových postižení (187). S rozvojem poznatků o antifosfolipidovém syndromu se pak objevila i doporučení, zahrnující vyšetřování, sledování a léčení těchto nemocných (188). Nicméně díky extrémní variabilitě možných vztahů, a to jak příčin, tak i následků přítomnosti antifosfolipídových protilátek, je u konkrétního nemocného obtížné určit, jaká vyšetření a v jakém sledu, mají být provedena. Na základě analýzy dat souboru nemocných jsme se zaměřili na zjištění, která vyšetření jsou pro pacienty přínosné. Současně jsme se zaměřili na rozdíly v systému vyšetřování a sledování pacientů s nálezem APA v porovnání s jinými trombofilními stavy. V rodinné anamnéze jsme zaznamenali častý výskyt revmatických chorob, resp. i nález antifosfolipidového syndromu (8,1% v porovnání s < 2% výskytem v běžné populaci). V osobní anamnéze pak byla dominantním nálezem prodělaná žilní trombóza, v naprosté většině případů idiopatická. Event, příčiny rozvoje trombembolické nemoci, pokud byly zjištěny, se v ničem neodlišovaly od klinické manifestace u jiných trombofilií. V průběhu sledování jsme pozorovali frekvenci výskytu žilního trombembolizmu v 2,58% případů ročně, častěji jako recidivující a idiopatický výskyt. Tyto nálezy jsou plně v souladu s nálezy velkého italského registru, který udává, že ke klinické manifestaci dochází u 2,5% nemocných ročně. Spíše překvapivým zjištěním byla vysoká frekvence anamnézy či klinické manifestace krvácivých projevů u více než poloviny našich nemocných (57,3%). Tato skutečnost upozorňuje na fakt, že získaná trombofilie může komplikovat vrozené stavy nedostatečnosti hemostázy, může být příčinou získaných poruch, nebo tuto poruchu krevního srážení může vyvolávat zavedená léčba (v našem případě 16,8% nemocných). Při analýze orgánových projevů klinickým nebo následným laboratorním vyšetřením, dominovalo v našem souboru postižení kůže, kardiovaskulárního aparátu a ledvin. Kožní postižení, které může být ve vztahu i primárnímu působení antifosfolipídových protilátek, mělo 15,3% nemocných. Literární data udávají ještě mnohem vyšší incidenci těchto projevů (88, 98-100). Významným klinickým příznakem se zdá být u pacientů s APA hypertenze. V našem souboru dospělých nemocných byla zjištěna téměř ve 42% případů - běžně udávaná prevalence je v dospělé populaci vyspělých zemích mezi 20 a 30%. Přestože nemocní s hypertenzí byli statisticky významně vyššího věku, je opakovaný nález u pacientů 20-30ti letých hoden zvláštní pozornosti. V patofyziologii se zřejmě podílí jak možný vliv na cévní endotel, progrese aterosklerosy, tak i možné postižení cirkulace v ledvinách. Změny na chlopních jsou u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami udávány asi u třetiny vyšetřených. V našem souboru byly echokardioqrafické změny nalezeny u více než poloviny vyšetřených pacientů, i když vedoucím nálezem byla stopová mitrální regurgitace, pravděpodobně bez klinické významnosti. Při opakovaném vyšetření (1x ročně) jsme ani u jednoho nemocného nezaznamenali progresi změn v těchto nálezech. Téměř polovina vyšetřených měla změny při funkčním či morfoloqickém vyšetření ledvin. Vedoucím příznakem byla Proteinurie, která byla v 8 případech natolik závažná či v čase progredující, že si vynutila renální biopsii. Pro dva nemocné nález trombotické mikroangiopatie znamenal změnu léčebné strategie. Naopak funkční vyšetření plic bylo u většiny nemocných bez zjištěné patologie a event, odchylky od normálního nálezu byly bez kausální souvislosti s nálezem APA. Výskyt hypothyreosy v našem souboru byl porovnatelný s incidencí u starších žen (4-7%), zatímco chronickou insuficienci nadledvin jsme zjišťovali relativně často - v běžné populaci vzácné onemocnění. Při analýze vzájemných vztahů mezi jednotlivými skupinami antifosfolipídových protilátek a jednotlivými typy klinické manifestace, se nám nepodařilo zjistit statisticky významné souvislosti. Důvodem je zřejmě fakt, že díky spektru nemocných sledovaných -63-
v hematologické ambulanci měla většina nemocných přítomnost lupus antikoagulans, který je dle literatury v současné době považován na příčinu většiny projevů antifosfolipidového syndromu (43,186). Proto nemohla izolovaná pozitivita protilátek proti kardiolipinům nabýt statistické významnosti. Zajímavý je trend vyššího výskytu žilní trombózy při sníženém počtu trombocytů v přítomnosti LA. Trombocvtopenie ie u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami častým nálezem, je popisována u 20-30% nemocných (116,129). V našem souboru byl snížený počet trombocytů pozorován ještě častěji, na poklesu se statisticky významně podílela pozitivita v testování antitrombocytámích protilátek. Zde se předpokládá, že průkaz pozitivity protilátek v ELISA či DIFT testu prokazuje vazbu antikardiolipinových protilátek na destičky - protilátky proti negativně nabitým fosfolipidům byly prokázány z trombocytárních eluátů (189). Dle našich nálezů je nutno očekávat významnější pokles počtu trombocytů v případě pozitivity ACLA IgG. V souladu s literaturou (67) je i v našem souboru klinicky manifestní AIHA vzácným nálezem, zatímco naopak často se setkáváme s průkazem imunních protilátek v séru nemocných či se senzibilizací erytrocytu protilátkou bez určené specifity. Za významné považujeme, že u 4% nemocných bylo možné bezprostředně po klinickém a základním laboratorním vyšetření stanovit vysoké podezření diagnózu onemocnění pojiva; u dalších 7,3% nemocných došlo k této manifestaci v průběhu sledování. Doporučení dle Piette z roku 1996 navrhuje nejméně pětileté sledování možného vývoje systémového procesu (66), nicméně ve velké studii mexických autorů z počátku 90-tých let (190) bylo popsáno naplnění kriterií SLE v 10ti letem sledování u 2% nemocných. Také jiné práce potvrzují, že nález antifosfolipidových protilátek předchází klinické manifestaci SLE spíše řadu let - podobně jako protilátky antinukleámí, anti-ro, anti LA, zatímco jiné protilátky jako například anti-sm, resp. protilátky proti jadernému ribonukleoproteinu se objevují mnohem kratší dobu před naplněním diagnostických kritérií (191). V našem souboru jsme měli 1 pacientku (0,8%), u níž se suspektní diagnóza SLE potvrdila po více než devíti letech. U jiné (0,8%) došlo naopak vývoji systémového onemocní s fatálním zakončením, aniž by předchozí testování bylo schopno zachytit nastupující vývoj. Taktéž k průkazu nádorového procesu může dle našich zkušeností při systematickém pátrání dojít vzácně v čase diagnózy (0,8%), nebo v průběhu sledování (1,6%). Při serologickem vyšetřování na přítomnost protilátek proti virovým antigenum isme na rozdíl od některých literárních dat neprokázali (192) v našem souboru akutní infekční mononukleosu, opakovaně však akutní infekci cytomegalovirem a dále i reaktivaci jak cytomegalovirové, tak i EB virové infekce. Cílem naší práce však nebylo rutinní testování u těchto případů. Kausální souvislost s případy reaktivace onemocnění EBV či CMV je problematická. Vyšetření na viry hepatitíd se neukázaly být jako přínosné. V jednom případě bylo sice uvažováno o kausální souvislosti s indukcí protilátek, nicméně u tohoto nemocného - pacientka s těžkou hemofílií na substituční léčbě, by bylo vyšetření provedeno i bez průkazu APA. -64-
IV. VYHODNOCEN! RIZIK NASTAVEN! A SLEDOVÁN! ANTIKOAGULAČNÍ LÉČBY U PACIENTŮ S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI Úvod Řada nemocných s antifosfolipidovými protilátkami vyžaduje antikoagulační léčbu. V současné době není s jistotou vyřešena otázka, jaká má být cílová hodnota mezinárodního normalizovaného poměru (INR), ani délka podávání antikoagulační léčby po proběhlé trombotické epizodě. Novější práce však spíše podporují názory, že se cílové nastavení antikoagulační léčby u pacientů s antifosfolipidovým syndromem (APS) neodlišuje od hodnot dosahovaných v jiných indikacích tj. INR 2,0-3,0 (142,143). Antikoagulační léčba pacientů s APS však má svá specifika. Může to být především krvácivá tendence u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami. Nejčastěji je dána preexistující sekundární hypoprotrombinémií (35), trombocytopenií a/nebo trombocytopatií (31, 32). Dalším problémem může být relativní necitlivost na podávání antikoagulační léčby; ta je však dána spíše lékovou interferencí, zejména současným podáváním azathioprinu. U těchto nemocných jsou popisovány udržovací dávky i 25 mg warfarinu denně (34). Od druhé poloviny 90-tých let některé práce opakovaně dokládaly ovlivnění stanovení hodnoty INR přítomností lupus antikoagulans (193, 194). V této souvislosti vznikla některá doporučení ke specifickému sledování - ať již kalibrací specifického ISI (indexu citlivosti tromboplastinu) (193), tak k použití modulovaných testů, jako například vyšetřování protrombinového-prokonvertinového času (194), nebo vyšetřováním stanovení faktoru X chromogenní metodou, která je necitlivá na přítomnost lupus antikogulans (LA). Následná analýza však ukázala, že ne všechny tromboplastiny používané ke stanovení protrombinového času jsou stejně citlivé k přítomnosti LA (195,196,197). Z těchto prací vyplynulo, že přítomností LA jsou ovlivněny, s jasnou tendencí ukazovat vyšší nežli skutečné hodnoty, zejména rekombinantně připravované tromboplastiny resp.tromboplastiny, u nichž byl dodán rekombinantně připravený tkáňový faktor (195,196,197). Ovlivnění je taktéž dáno heterogenitou lupus antikoagulans, resp. epitopem, proti němuž je protilátka namířena (195,196). Většina komerčně dostupných tromboplastinu však není přítomností lupus antikoagulans ovlivněna s klinickou významností. Opatrnosti je rovněž zapotřebí při použití point of care testing", protože ojedinělé zprávy dokladují vyšší hodnoty INR při použiti CoaguCheck nežli jsou hodnoty laboratorně stanovené u nemocných s lupus antikoagulans (198). K vyhodnocení nastavení antikoagulační léčby u nemocných s lupus antikoagulans v běžné klinické praxi jsme retrospektivně srovnali skupinu nemocných s antifosfolipidovým syndromem se skupinou pacientů dlouhodobě léčených warfarinem, u nichž nebyla přítomnost antifosfolipidových protilátek prokázána. Soubor pacientů K analýze byli vybráni nemocní s přítomností lupus antikoagulans na antikoagulační léčbě. Ke každému takovému nemocnému byl přiřazen z kartotéky naší ambulance pacient stejného pohlaví, přibližně stejného věku, kteří byli rovněž dlouhodobě léčeni warfarinem. Všem pacientům byla poskytnuta formou letáku standardní informace o antikoagulační léče a jejím možném ovlivnění a současně poučení ze strany ošetřujícího lékaře. Doba jejich sledování byla vybrána tak, aby od zahájení antikoagulační léčby warfarinem uběhla doba 3 měsíců a výchozí hodnota INR byla již v terapeutickém dávkování. U žádného nemocného nebylo v průběhu sledování nutno přerušovat antikoagulační léčbu z důvodu závažného krvácení, invazivního výkonu či plánovaného ukončení terapie. Hodnoty INR byly analyzovány v časovém sledu tak, aby doba sledování přesáhla 365 dní - k nejbližší následující kontrole po tomto intervalu bylo sledování přerušeno. Cílová hodnota nastavení antikoagulační léčby byla u všech nemocných stanovena v intervalu INR 2,0 až 3,0. Popisnou charakteristiku sledovaných pacientů uvádí tabulka 1. -65-
Tabulka 1. Soubor sledovaných nemocných s dlouhodobou antikoagulační léčbou LA požit vní LA negativní Pacient věk pohlaví diagnóza pacient věk pohlaví Diagnóza Č.L 27 m APS S.A. 30 m FVL homozygot K.P. 29 m APS K.J. 31 m deficit PC K.L. 23 f sekundárni APS B.A. 21 f masivní EP* K.J. 79 m APS F.A. 78 m Fisi K.l. 43 f sekundárni APS H.A. 44 f deficit AT N.L. 68 m LA+ fisi Ř.J. 70 m recidivuj ící DVT* V.J. 83 m APS+ FVL B.E. 93 m Fisi H.J. 47 f APS T.E. 51 f recidivující EP* Ř.M. 19 f APS + PT20210A S.L 20 f FVL + deficit PC S.Z. 59 f APS L.E. 58 f recidivující E P** H.M. 47 m APS K.L. 44 m FVL D.J. 46 m APS S.J. 42 m PT20210A P.V. 50 m APS M.J. 52 m Fisi APS - antifosfolipidový syndrom FVL - Leidenská mutace faktoru V fisi - fibrilace siní LA - nález lupus antikoagulans EP - embólie plic DVT - hluboká žilni trombóza PC - protein C AT- antitrombin PT 20210A - variantní mutace protrombinu * jiná trombofilie neprokázána ** jako trombofilní faktor následný průkaz nádorového onemocnění Materiál a metodika Krev nemocných byla odebrána uzavřeným způsobem do 3,8% citronanu sodného v poměru 1:9, centrifugována při 2500g po 20 minut při pokojové teplotě. Protrombinový test (PT) dle Quicka byl proveden za použití reagencie Neoplastin Cl plus (Diagnostika Stago) na plně automatizovaném koagulometru STA-R případně na koagulačním analyzátoru STA- Compact. Hodnota mezinárodního normalizovaného poměru (INR) byla kalkulována obvyklým způsobem: INR = (čas PT pacienta v sekundách/čas normální plazmy v sekundách) isi Stanovení inhibitoru lupus antikoagulans popisumeme dříve. Statistické zpracování K porovnání relativního počtu hodnot INR mimo terapeutické rozmezí tj. INR < 2,0 a INR > 3,0 a průměrné odchylky od cílového INR v obou skupinách pacientů byl vzhledem k nenormálnímu rozložení dat použit Mannův-Whitneyův U test. Dále byla porovnána doba, kterou nemocní strávili v terapeutických hodnotách INR, tj. 2,0 až 3,0. Také pro porovnání tohoto parametru mezi dvěma skupinami nemocných byl použit Mannův-Whitneyův U test. Ke srovnání dávky warfarinu u dvou skupin pacientů byl použit také Mannův-Whitneyův U test. Výsledky Celkem bylo provedeno 203 vyšetření PT (INR) u LA pozitivních a 201 vyšetření u LA negativních nemocných. Průměrná doba sledování byla u LA pozitivních nemocných 376,8 dnů, u LA negativních nemocných 385,9 dnů (tab. 1). Tento rozdíl nebyl statisticky významný (Mannův-Whitneyův U test, U = 65, N = 26, p = 0,317; tab. 2). Za tuto dobu nedošlo u žádného z nemocných ke klinicky významnému krvácivému projevu ani k trombembolické komplikaci. V každé skupině byla pouze jednou zjištěna klinicky významná hladina INR > 6,0. Průměrný počet vyšetření za sledované období se u LA pozitivních pacientů (15,62) a LA negativních pacientů (15,46) statisticky významně nelišil (U = 79,5, N = 26, p = 0,798; tab. 2). U LA pozitivních pacientů bylo průměrně 21,79 % hodnot INR nižších než 2 a 17,71% hodnot INR vyšších než 3. Podobně u LA negativních pacientů bylo 24,24% hodnot INR nižších než 2 a 13,56% hodnot vyšších než 3. Při srovnání těchto dvou parametrů mezi skupinou LA pozitivních a LA negativních pacientů, a stejně i celkového relativního počtu hodnot INR -66-
mimo cílový interval nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly (U = 70,5 až 81,5, N = 26, p = 0,473 až 0,878; tab. 2; obr. IV. 1). Průměrná odchylka hodnot INR nižších než 2 od cílové hodnoty INR = 2 byla 0,22 u LA pozitivních pacientů a 0,23 u LA negativních pacientů. Rozdíl mezi skupinami v tomto parametru nebyl statisticky významný (U = 81,5, N = 26, p = 0,878; tab. 2; obr. IV.2). Podobně nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl u průměrné odchylky hodnot INR vyšších než 3 od cílové hodnoty INR = 3, která byla v obou skupinách pacientů 0,60 (U = 66, N = 24, p = 0,729; tab. 2; ob r. IV.2). Celkově odchylka od cílového intervalu INR nabývala průměrné hodnoty 0,40 u LA pozitivních pacientů a LA 0,36 u negativních pacientů. Tento rozdíl také nebyl statisticky významný (U = 79, N = 26, p = 0,778; tab. 2; obr. IV.2). Obr. IV.3 znázorňuje procentuální zastoupení hodnot INR mimo terapeutické hodnoty protrombinového času (menší než 2 nebo větší než 3) zjištěných u LA pozitivních a LA negativních pacientů. Dále byl analyzován čas, v němž byli pacienti nastaveni na účinnou antikoagulační léčbu warfarinem s dosažením cílového terapeutického rozmezí. Doba, za níž došlo k docílení náležité hladiny po jejím vychýlení, byla vypočítána lineární interpolací mezi dvěma hodnotami INR. LA pozitivní pacienti strávili v cílovém INR průměrně 273 dnů (72,45 % z celkového času), LA negativní pacienti 270 dnů (70,00%). Porovnání doby, v níž byli obě skupiny pacientů účinně léčení warfarinem v cílových hodnotách INR se statisticky významně nelišil (U = 73, N = 26, p = 0,555; tab. 2; obr. IV.4). Stejně tak nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi LA pozitivními a LA negativními pacienty v udržovací dávce warfarinu vyjádřené počtem miligramu warfarinu za týden (U = 62, N = 26, p = 0,249; tab. 2; obr. IV.5). Tabulka 2. Porovnání hodnot INR mimo terapeutické rozmezí, doby v cílových hodnotách INR a dávek warfarinu v obou skupinách pacientů. LA pozitivní (n = 13) LA negativní (n = 13) M-W U test Parametr průměr medián průměr medián U P počet dnů sledování 376,8 378 385,9 380 65 0,317 počet vyšetření 15,62 15 15,46 15 79,5 0,798 počet hodnot INR < 2,0 (v %) 21,79 21,43 24,24 25 70,5 0,473 počet hodnot INR > 3,0 (v %) 17,71 11,77 13,56 13,33 81,5 0,878 počet hodnot INR mimo cílový interval (v %) 39,49 35,71 37,80 40 80,5 0,837 Odchylka od cílové hodn. (INR < 2) 0,22 0,23 0,23 0,23 81,5 0,878 Odchylka od cílové hodn. (INR > 3) * 0,60 0,46 0,60 0,53 66 0,729 Odchylka od cílového intervalu INR 0,40 0,30 0,36 0,36 79 0,778 počet dnů v cílovém INR 272,7 290,6 269,7 283,9 77 0,701 počet dnů v cílovém INR (v % z celkového času) 72,45 76,82 70,00 73,07 73 0,555 dávka warfarinu (mg/týden) 34,54 35 42,12 40 62 0,249 * počet pozitivních i negativních pacientů je 12 (u dvou pacientů hodnoty INR nikdy nepřesáhly hodnotu 3) Diskuse Faktorů, které mohou ovlivňovat nastavení účinné antikoagulační léčby a možnosti jejího sledování, je dnes známa celá řada. Patří mezi ně zejména věk nemocných (199), náležitá informovanost nemocného (200), ale také spolupráce pacienta na léčbě (201), případně lékové interakce (202). Současné práce dokládají na dávce závislý vliv přísunu vitamínu K v potravě (203,204). Přítomnost lupus antikoagulans může ovlivňovat antikoagulační léčbu jednak klinicky navozením krvácivé tendence, jednak laboratorně při sekundární hypoprotrombinémii nebo -67-
při použití některých citlivých tromboplastinů. Jaký je optimální způsob monitorování antikoagulační léčby u pacientů s lupus antikoagulans není jasné (205). Mezi našimi pacienty s lupus antikoagulans byly klinicky zřetelné krvácivé projevy přítomny před zahájením antikoagulační léčby u jedné nemocné - příčinou byla sekundární hypoprotrombinemie s aktivitou Fll 23%. Ještě před klinickou manifestací antifosfolipidového syndromu byla však tato nemocná léčena kortikoidy pro základní systémové onemocnění (ŠLE) a hladina Fll se při této terapii normalizovala stejně tak jako hemorrhagická diatéza. Pět pacientů ze sledovaných nemocných s APS mělo lehkou trombocytopenii (průměr 120,4x10 9 /l, minimum 96x10 9 /l, maximum 142x10 9 /l) bez krvácivých projevů. Žádný z těchto nálezů neovlivňoval závažným způsobem průběh antikoagulační léčby. Ke stanovení protrombinového času v hodnotách INR jsme použili tromboplastin z králičí mozkové tkáně, který byl již v publikaci Tripodiho (197) prokázán jako necitlivý vůči přítomnosti lupus antikoagulans. Výsledky námi zjištěných dosažených cílových hodnot INR v obou skupinách pacientů jsou srovnatelné s velkými studiemi (206) - v auditu na Novém Zélandu bylo dosaženo hodnot 2,0-3,0 v 58,3% z 9038 měření (v naší studii 60,5% u LA pozitivních a 62,2% u LA negativních nemocných), hodnoty pod 2,0 INR byly zjištěny v 24,6% (při naší analýze 21,8% u LA pozitivních a 24,2% u LA negativních), hodnoty přes 3,0 INR v 17,1% (námi 17,7 resp. 13,5%). Na rozdíl od této publikace však časové intervaly mezi jednotlivými měřeními v naší studii dosahovaly v průměru 3-4 týdnů, zatímco v této práci byla většina měření kontrolována v odstupu jednoho až dvou týdnů. Práce, které analyzují dobu, po níž jsou v náležitém terapeutickém rozmezí hodnot INR neselektovaní nemocní, většinou udávají hodnoty pohybující se okolo 50% (207). V našem sledování bylo relativní zastoupení času náležité antikoagulační léčby mnohem příznivější (v průměru 72,5 resp. 70%) a nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi LA pozitivními a LA negativními nemocnými. Neprokázali jsme, že by pacienti s LA vyžadovali k udržovací léčbě vyšší dávky warfahnu. Minimální dávka u LA pozitivních nemocných byla 15 mg, u LA negativních 10mg, zatímco maximální dávka 72,5 mg u LA pozitivních a 77,5 mg u LA negativních. Ve shodě s literaturou měli nižší udržovací dávky většinou starší nemocní (199). -68-
V. ZÁVĚRY, DOPORUČENI DO LABORATORNÍ A KLINICKÉ PRAXE, PERSPEKTIVY DALŠÍHO VÝVOJE Diagnostika lupus antikoagulans Použití lupus antikoagulans necitlivé aptt reagencie má v laboratorní diagnostice vícečetné využití. Jednak umožňuje rychlou orientační diferenciální diagnostiku krvácivých a trombofilních situací spojených s prodloužením tohoto testu, ale i zlepšení jinak komplikovaného diagnostického procesu průkazu inhibitoru LA. Zavedení RLA indexu toto využití významným způsobem zpřesňuje. Je však nutné individuální nastavení pro použitou metodiku, typy reagencií a přístrojové vybavení laboratoře (208). V současné době je na našem pracovišti tato diagnostika rutinně využívána. V testovacím procesu je nastavení na automatickou analýzu a testování další aptt LA necitlivé reagencie (firmy Grifols). Náš další výzkum v této oblasti směřuje k zavedení systému mezinárodní externí kontroly kvality pro tuto laboratorní diagnostickou metodu a použití kalibračních materiálů (153, 209), resp. i zavedení metodiky k určení klinicky významných lupus antikoagulans (210, 211). Predikce protrombotického rizika u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami ProCglobal test je jednoduchý a finančně málo náročný screeningový test k určení patologií v systému proteinu C. Prokázali jsme, že v případě jeho snížení je klinická manifestace žilního trombembolizmu u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami 1,7 resp. 1,8 násobně vyšší (212). Proto byl měl být rutinně vyšetřen u všech těchto pacientů. Jeho limitací je však ovlivnění antikoagulační léčbou. Navíc se v naší práci ukázalo, že je jeho hodnota zřejmě ovlivněna pohlavím; toto zjištění bude vyžadovat ověření na větším souboru dat. Sami jsme se dříve zabývali možnostmi laboratorního testování trombofilního rizika u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami (181). Vzhledem k potencionálně velmi různorodému zásahu antifosfolipidovych protilátek do systému krevního srážení, je stanovení jednoho či dvou takovýchto testů, které toto riziko obsáhnou, zřejmě velmi diskutabilní. V současné době se další zaměření v této oblasti na našem pracovišti bude ubírat směrem zavedení metodiky stanovení endoteliálních a trombocytárních mikropartikulí (20, 21). Určení parametrů potřebných k péči o pacienty s antifosfolipidovými protilátkami Při dlouhodobém sledování pacientů s antifosfolipidovými protilátkami jsme se na našem souboru pokusili určit ty parametry, které jsou pro sledování a léčbu přínosné. Více než 75% nemocných mělo postižení, které lze dát do kausální souvilosti s přítomností APA, ať již v čase diagnózy, nebo v průběhu sledování. Zjistili jsme oprávněnost systematického vyšetřování rodinné anamnézy zaměřené na výskyt revmatických onemocnění, podrobného vstupního vyšetření zaměřeného na přítomnost orgánových postižení, systémového či nádorového procesu. Vzhledem k časté frekvenci krvácivých projevů doporučujeme podrobné vyšetření krevního srážení tímto směrem. V následném sledování doporučujeme opakované testování přítomnosti jiných typů autoprotilátek v intervalu 6 měsíců (ANA, anti-ena, anti-ss-dna, anti-ds-dna), kvantitativní Proteinurie v intervalu 12 měsíců a pravidelné kontroly krevního tlaku. Vzhledem k tomu, že jsme neprokázali progresi nálezu na echokardiografii, považujeme toto vyšetření za indikované vstupně a následně až dle klinického průběhu. Jako nepřínosné ve vztahu k nálezu antifosfolipidovych protilátek se ukázalo rutinní funční vyšetření plic. Diskutabilní výsledky dává systematické vyšetřování na přítomnost některých typů protilátek proti virózám. Žádný z těchto nálezů nevedl ke změně terapeutické strategie, i když jsme ve všech případech reaktivace EBV či CMV indikovali imunologické vyšetření. Své zkušenosti s dlouhodobým sledováním nemocných s antifosfolipidovými protilátkami jsme shrnuli do vytvoření standardu léčebného plánu (213). -69-
Problémem, který vzniká u pacientů sledovaných a/nebo léčených pro nález antifosfolipidových protilátek, je jejich dispenzarizace u lékařů nejrůznějších odborností - praktických lékařů, internistů, neurologů, dermatovenerologů, psychiatrů, revmatologů, nefrologů, imunologů a jiných. Tím se tříští individuálně nabyté zkušenosti. Domníváme se, že role hematologů v tomto systému by měla být centralizující, což navíc potvrzují i mezinárodní zkušenosti (214). Proto máme v úmyslu iniciovat vytvoření mezioborového registru těchto nemocných. Jen tak lze zřejmě ověřit navržený systém sledování resp. jej doplnit na základě analýzy dat získaných široce koncipovanou spoluprací. Antikoagulační léčba u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami V námi provedené analýze antikoagulační léčby u nemocných s nálezem lupus antikoagulans jsme nezjistili žádné rozdíly v přítomnosti nežádoucích klinických projevů ve smyslu krvácivých komplikací, selhání antikoagulační léčby či větší nestability udržení náležitého cílového INR ve srovnání se skupinou pacientů dlouhodobě léčených warfarinem z jiného důvodu. Při výběru vhodného tromboplastinu ke kontrole těchto pacientů zřejmě nedochází k interferencím s přítomností LA a běžně používaný protrombinovy čas je dostatečnou metodou pro sledování nastavení terapie kumarinovými deriváty (215). Podle našich zkušeností dochází k největším klinickým komplikacím a nejčastějším vychýlením z terapeutického rozmezí v případech, kdy je u téhož pacienta protrombinovy čas stanovován v různých laboratořích, za použití různého tromboplastinu a léčba je upravována různými ošetřujícími lékaři (vlastní dosud nepublikovaná data). Na výzkum v této oblasti se taktéž zaměří naše další pozornost v budoucím sledování nemocných s antifosfolipidovými protilátkami. -70-
VI. PŘILOHY Příloha č. 1: použitá literatura: 1. Bick R.L.: Antiphospholidpid Thrombosis Syndrome. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis. 2001;7:241-258 2. Buliková A.: Diferenciální diagnostika. In Penka M., Buliková A., Matýskova M., Zavřelová J.: Diseminovaná intravaskulární koagulace, Grada Publishing a.s. 2003, Praha: 119-133 3. Galii M., Luciani D., Bertolini G., Barbui T.: Anti -ß 2 -glykoprotein I, antiprothrombin antibodies, and the risk of thrombosis in the antiphospholipid syndrome. Blood. 2003; 102: 2717-2723 4. Arnout J., Vermylen J.: Current status and implications of autoimmune antiphospholipid antibodies in relation to thrombotic disease. J Thromb Haemost 2003; 1: 931-942 5. Arnout J., Jankowski M.: Antiphospholipid syndrome. Hematology J 2004; 5: S1-S5 6. Roubey R.A.S. Mechanisms of autoantibody-mediated thrombosis. Lupus 1998; 7: 114-119 7. de Groot P.G., Horbach D.A., Derksen R.H.W.M.: Protein C and other cofactor involved in the binding of antiphospholipid antibodies: relation to the pathogenesis of thrombosis. Lupus 1996; 5: 488-493 8. Esmon L.N., Smirnov M.D., Esmon CHT.: Thrombogenic mechanisms of antiphospholipid antibodies. Thromb Haemost 1997; 78: 79-82 9. Adams M.J., Donohoe S., Mackie I.J., Machin S.J.: Anti-tissue factor pathway activity in patients with primary antiphospholipid syndrome. British J Haematol 2001; 114: 375-379 10. Triplett D.A.: Lupus anticoagulants/antiphospholipid-protein antibodies: the great importers. Lupus 1996; 5: 431-435 11. Fanelli A., Bergamini C, Rapi S et al.: Flow cytometic detection of circulation activated platelets in primary antiphospholipid syndrome. Correlation with thrombocytopenia and anticardiolipin antibodies. Lupus 1997; 6: 261-267 12. Joseph J.E., Donohoe S., Harrison P. et al.: Platelet activation and turnover in the primary antiphospholipid syndrome. Lupus 1998; 7: 333-340 13. Joseph E.J., Harrison P., Mackie I.J. et al.: Increased circulation platelet-leukocyte and platelet activation in patients with antiphospholipid syndrome, systemic lupus eryhematosus and rheumatoid arthritis. British J Haematol 2001; 115: 451-459 14. Fallad L, Renault V., Langer-Cannard V., Lecompte T.: ß 2 -glykoprotein I binding to platelet microparticle membrane specifically reduces immunoreactivity of glycoproteins Mb/Ill. Thromb Haemost 2001; 85: 314-319 15. Forastiero R., Martinuzzo M., Carreras L.O., Maclouf J.: Anti-ß 2 -glykoprotein I antibodies and platelet activation in patients with antiphospholipid antibodies: Association with increased excretion of platelet-derived thromboxane urinary metabolites. Thromb Haemost 1998; 79: 42-45 16. Hill M.B., Phipps J.L., Hughes P., Greaves M.: Anti-endothelial cell antibodies in primary antiphospholipid syndrome and SLE: patterns of reactivity with membrane antigens on microvascular and umbilical venous cell membranes. British J Haematol 1998; 103: 416-421 -71 -
17. Del Papa N., Raschi E., Tincani A., Neroní P.L.: Interaction of antiphospholipid antibodies with endothelial cells. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer- Verlag London, 299-306 18. Espinosa R.G., Liu X., Colden-Stranfield M. et al.: E-selectin mediates pathogenetic effects of antiphospholipid antibodies. J Thromb Haemost 2003; 1: 843-848 19. Raschi E., Teutoni C, Bosisio D. et al.: Role of the MyD88 transduction signalling pathway in endothelial activation by antiphospholipid antibodies. Blood 2003; 101: 3495-3500 20. Geer I.A.: Endothelial cell microparticles and antiphospholipid syndrome: pathologic explanations and diagnostic opportunities. Thromb Haemost 2004; 91: 636-638 21. Dignat-George F., Camoin-Jau L., Sabatier F. et al.: Endothelial mircroparticles: a potential contribution to the thrombotic complications of the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost 2004; 91: 667-673 22. Cuadrado M.J., López-Pedrera Ch., Khamashta M.A. et al: Thrombosis in primary antiphospholipid syndrome: a pivotal role for monocyte tissue factor expression. Arthritis Rheum 1997; 40: 834-841 23. Dobado-Berrios P.M., López-Pedrera Ch., Velasco F. et al: Increased levels of tissue factor mrna in mononuclear blood cell of patients with primary antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost 1999: 82: 1578-1582 24. Bondanza A., Manfredi A.A., Zimmermann V.S. et al: Anti-ß 2 -glykoprotein I antibodies cause inflammation and recruit dendritic cells in platelet clearance. Thromb Haemost 2001; 86: 1257-1263 25. Ferro D., Saliola M., Meroni P.L. et al: Enhanced monocyte expression of tissue factor by oxidative stress in patients with antiphospholipid antibodies: effect of antioxidant treatment. J Thromb Haemost 2003; 1: 523-531 26. Anglés-Cano E.: Plasminogen activation and fibrinolysis in the antiphospholipid syndrome. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 325-336 27. Horbach D.A., van Oort E., Lisman T. et al: ß 2 -glykoprotein I is proteolytically cleaved in vivo upon activation of fibrinolysis. 28. Hasunuma Y., Matsuura E., Makita Z. et al.: Involvement of ß 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies in oxidatively modified low-density lipoprotein uptake by macrophages. Clin Exp Immunol 1997; 107: 569-573 29. Matsuura E., Kobayashi K, Yasuda T., Koike T.: Antiphospholipid antibodies and atherosclerosis. Lupus 1998; 7: 135-139 30. Shoenfeld Y., Harats D., George J.: Heat shock protein 60/65, ß 2 -glycoprotein I and oxidized LDL as players in murine atherosclerosis. J Autoimmunity 2000; 15: 199-202 31. Machin S.J.: Platelets and antiphospholipid antibodies. Lupus 1996; 5: 386-387 32. Galli M., Barbui T.: Management of thrombocytopenia in Hughes Syndrome. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 408-418 33. Crowther M.A., Ginsberg J.S., Julian J. et al.: A comparison of two intensities of warfarin for prevention of recurrent thrombosis in patients with antiphospholipid antibody syndrome. N Engl J Med 2003; 349: 1133-1138 34. Khamashta M.A.: Management of thrombosis in the antiphospholipid syndrome. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 391-396 35. Triplett D.A.: Use of the dilute Rüssel viper venom time (drwt): its importance and pitfalls. J Autoimmunity 2000; 15: 173-178 -72-
36. Asherson R.A., Piette J-Ch., Carver R.: Primary", secondary", catastrophic"and other variants of the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 249-258 37. Mackie I.J., Donohue S., Machin S.J.: Lupus anticoagulant measurement. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 214-224 38. de Larranga G., Forastiero R., Carreras L.O. et al: Acquired hypoprothrombinemia a related to high titres of antiprotein-phospholipid antibodies. Thromb Haemost 1999; 81: 317-318 39. Nuss R., Jacobson L., Hathaway W.E. et al.: Evidence for antiphospholipid antibodies in haemophilic children with factor VIII inhibitors. Thromb Haemost 1999; 82: 1559-1560 40. von Depka M.: Rituximab for IT in acquired haemophilia. Novo Nordisk European Symposium Madrid 2004; abstract book: 13 41. Jones D.W., Gallimore M.J., Harris S.L., Winter M.: Antibodies to factor XII associated with lupus anticoagulant. Thromb Haemost 1999; 81: 387-390 42. Ashrani A.A., Aysola A., Al-Khatib H. et al: Lupus anticoagulant associated with transient severe factor X deficiency: a report of two patients presenting with major bleeding complications. British J Haematol 2003; 121: 639-642 43. Galli M., Luciani D., Bertolini G., Barbui T.: Lupus anticoagulants are stronger risk factors for thrombosis than anticardiolipin antibodies in the antiphospholipid syndrome: a systematic review of the literature. Blood 2003; 101: 1827-1832 44. Arnout J., Vermylen J.: Mechanism of action of ß 2 -glykoprotein l-dependent lupus anticoagulants. Lupus 1998; 7: 23-28 45. McNeil H.P., Simpson R.J., Chesterman C.N., Krilis S.A.: Anti-phospholipid antibodies are directed a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation. Proc Natl Acad Sei 1990; 87: 4120-4124 46. Galli M., Comfurius P., Maassen C. et al.: Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet 1990: 335: 1544-1547 47. Matsuura E., Igarashi Y., Fujimoto M. et al.: Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet 1990; 336:177-178 48. Petri M.: Epidemiology of the antiphospholipid syndrome. J Autoimmunity 2000; 15: 145-151 49. Buliková A., Matýskova M., Zavřelová J. et al.: Antiphospholipid antibodies in blood donors. Haemostasis 1998; Suppl. 2: 460 50. Krazt C, Mauz-Korholz C, Kruck H. et al.: Detection of antiphospholipid antibodies in children and adolescent. Pediatr Haematol Oncol 1998; 15: 325-332 51. Manoussakis M.N., Tzioufas A.G., Silis M.P. et al: High prevalence of anti-cardiolipin and other autoantibodies in a healthy elderly population. Clin Exp Immunol 1987; 69: 557-565 52. Juby A.G., Davis P.: Prevalence and disease associations of certain autoantibodies in elderly patients. Clin Invest Med 1998; 21: 4-11 53. Asherson R.A., Cervera R., Gharavi A.E.: Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome. Ann Med Interne 1993; 144: 367-376 54. Sammaritano L.R. Pediatric and familiar antiphospholipid syndromes. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-CH., Shoendeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Inc. Boca Raton 1996; 59-266 -73-
55. Wilson W.A, Gharavi A.E.: Genetic risk factors for apl syndrome. Lupus 1996; 5: 398-403 56. Wilson W.A.: Family studies and the major histocompatibility complex. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 348-375 57. Wilson W.A., Scopelitis E., Michalskí J.P. et al.: Familial antibodies are associated with C4 deficiency genotypes that coexist with MHC DQB risk factors. J Rheumatol 1995; 22: 227-235 58. de Groot P.G., Bouma B., Lutters B.C.H et al.: Structure-function studies on ß 2 - glycoprotein I. J Autoimmunity 2000; 15: 87-89 59. Kamboh M.I., Hehdi H.: Genetics of apoliporotein H (ß 2 -glycoprotein I) and anionic phospholipid binding; Lupus 1998, 7: 10-13 60. Hirose N., Williams R., Alberts A.R. et al.: A role for the polymorphism at position 247 of the ß 2 -glycoprotein I gene in the generation of anti-ß 2 -glycoprotein I antibodies in the antiphospholipid syndrome. Arthritis Rheumat 1999; 42:1655-1661 61. Reddel S.W, Wang Y. X., Sheng Y.H et al. Epitope studies with anti-ß 2 -glycoprotein I antibodies from autoantibody and immunized sources. J Autoimmunity 2000; 15: 91-96 62. Koike T., Ichikawa K, Atsumi T. et al. ß 2 -glycoprotein I - anti-ß 2 -glycoprotein I interaction. J Autoimmunity 2000; 15: 97-100 63. Galli M., FinazziG., Duca F. et al.: The G1691-» A mutation of factor V, but not the G20210-» A mutation of factor II or the C677-» T mutation of methylenetetrahydrofolate reductase genes, is associated with venous thrombosis in patients with lupus anticoagulants. British J Haematol 2000; 108: 865-870 64. Merkel P., Chang Y., Pierangeli S. et al.: The prevalence and clinical associations of anticardiolipin antibodies in a large inception cohort of patients with connective tissue diseases. Am J Med 1996; 101: 576-583 65. Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y.: The antiphospholipid syndrome: History, definition, classification and differential diagnosis. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996:3-12 66. Piette J-Ch.: 1996 diagnostic and classification criteria for the antiphospholipid/cofactors syndrome: a mission impossible"? Lupus 1996; 5: 354-363 67. Montecucco C, Caporali R.: Hemocytopenias in antiphospholipid syndrome. In Khamashta (Ed): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 20-31 68. Diz- Kucukkaya R., Hacihanefioglu A., Generel M. et al: Antiphospholipid antibodies and antiphospholipid syndrome in patients presenting with immune thrombocytopenic purpura: a prospective cohort study. Blood 2001; 98: 1760-1764. 69. Asherson R.A.: Antiphospholipid antibodies, malignances and paraproteinemias. J Autoimmunity 2000; 15: 117-122 70. Buliková A., Matýskova M., Dušek L. et al.: Antiphospholipid antibodies and thromboses in patients with rheumatologic diseases and tumours. Haemostasis 2000; 30: 159-160 71. Lossos I.S., Bogomolski-Yahalom V., Hatzner Y.: Anticardiolipin antibodies in acute myeloid leukaemia: prevalence and clinical significance. Am J Haematol 1998; 57: 139-143 72. Loziou S.A., Walport M.J., Davies K.A. The antiphospholipid syndrome in infectious diseases. In Asherson RA, Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 267-284 -74-
73. Gharavi A.E., Pierangeli S.S.: Infections and antiphospholipid antibodies. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London: 135-143 74. Asherson A., Cervera R.: Antiphospholipid antibodies and infections. Ann Rheumat Diseases 2003; 62: 388-399 75. Hunt J., Krilis S. An antiphospholipid -ß 2 -glycoprotein I complex is an antigen for anticardiolipin antibodies occurring in autoimmune disease but not with infection. Lupus 1992; 1:75-82 76. Gharavi A.E., Pierangeli S.S.: Origin of antiphospholipid antibodies: induction of apl by viral peptides. Lupus 1998; 7: 52-54 77. Viseux V., Darnige L., Carmie E. et al.: Pulmonary embolism and transitory anti-ß 2 -GP I antibodies in an adult with chicken pox. Lupus 2000; 9: 558-560 78. Chou T-NK., Hsu T-C, Chen R-M. et al.: Parvovirus B19 infection associated with the production of antineutrofil cytoplasmic antibody (ANCA) and anticardiolipin antibody (acl). Lupus 2000; 9: 551-554 79. Mengarelli A., Minotti C, Palumbo G. et al.: High levels of antiphospholipid antibodies are associated with cytomegalovirus infection in unrelated bone marrow and cord blood allogenic stem cell transplantation. British J Haematol 2000; 108:126-131 80. Triplett D.A.: Many faces of lupus anticoagulants. Lupus 1998; 7: 18-22 81. Sammaritano L.R.: Drug-induces antiphospholipid antibodies. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London: 144-154 82. Wilson W.A., Gharavi A.E., Koike T. et al.: International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome. Arthritis Rheumat 1999; 42: 1309-1311 83. Harris E.N., Pierangelli S.S.: Equivocal" antiphospholipid syndrome. J Autoimmunity 2000; 15:81-85 84. Arnout J.: ISTH scientific standardisation subcommittee lupus anticoagulants/phospholipid dependent antibodies. International society of thrombosis and haemostasis. Boston, July 2002. 85. Nash M.J., Camillieri R.S., Kunka S. et al.: The anticardiolipin assay is required for sensitive screening for antiphospholipid antibodies. J Thromb Haemost 2004; 2: 1077-1081 86. Vincent T., Mackworht-Young C: The primary antiphospholipid syndrome. In Khamashta (Ed): Hughes Syndrome 2000; Springer-Verlag London: 111-126 87. Piette J-Ch., Wechsler B., Frances C. et al.: Exclusion criteria for primary antiphospholipid syndrome. J Rheumatol 1993; 20: 1802-1804 88. Levine J.S., Branch D.W., Rauch J.: The antiphospholipid syndrome. J Engl J Med. 2002; 346: 752-763 89. Finazzi G., Btrancaccio V., Moia M. et al.: Natural history risk and risk factors in 360 patients with antiphospholipid antibodies. A four year prospect study form the Italian registry. Am J Med 1996; 100: 530-536 90. Branch D.W.: Thoughts on the mechanism of pregnancy loss associated with antiphospholipid syndrome. Lupus 1994; 3: 275-280 91. Sebire N.J., Regan L, Rai R.: Biology and pathology of the placenta in relation to antiphospholipid antibody-associated pregnancy failure. Lupus 2002; 11(10): 641-643 92. Lockshin M.D.: Pathogenesis of the antiphospholipid antibody syndrome. Lupus 1996; 5: 404-408 -75-
93. Kochenour NK, Branch D.W., Rote N.S.: A new postpartum syndrome associated with antiphospholipid antibodies. Obstet Gynecol 1987; 69: 460 94. Lima F., Khamashta M.A., Buchanan N.M et al.: A study in sixty pregnancies in patients with antiphospholipid syndrome. Clin exp Rheumatol 1996; 14:131-136 95. Homstein M.D., Davis O.K., Massey J.B. et al.: Antiphospholipid antibodies and in vitro fertilization success: a meta-analysis. Fertility and Sterility 2000; 73: 330-333 96. Udoff L.C., Branch D.W: Management of patients with antiphospholipid antibodies undergoing In vitro fertilization. J Autoimmunity 2000; 15: 209-211 97. Obshiro B.T. Antiphospholipid antibodies and fetal's death. Obstet Gynecol 1996; 87: 489-493 98. Battagliotti CA. Skin Manifestation of the antiphospholipid antibody syndrome. In Khamashta M.A. (Ed.) Hughes Syndrome. Springer, London 2000: 59-69 99. Tajima C, Suzuki Y., Mizushima Y., Ichikawa Y.: Clinical significance of immunoglobulin A APL. Possible association with skin manifestation and small vessel vasculitis. J Rheumatol 1998;25:1730-1736 100. Frances C, Blétry O., Piette J-Ch.: Dermatologie manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 201-211 101. Frances C, Piette J-Ch.: The mystery of Sneddon syndrome: Relationship with antiphospholipid syndrome and systemic lupus eryhematosus. J Autoimmunity 2000; 15: 139-143 102. Navarrete M.G., Brey R.L., Levine S.R.: Cerebral disease in the antiphospholipid syndrome. In Khamashta M.A. (Ed.): Hughes Syndrome. Springer, London 2000: 43-58 103. Bray R.L.: Differential diagnosis of central nervous system manifestation of the antiphospholipid antibody syndrome: J Autoimmunity 2000; 15: 133-138 104. Chen W.H.: Anti-beta2-glycoprotein I antibody and hypertension in cerebral ischemia. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 2004; 10: 55-60 105. Nojima J., Kuratsune H., Suehisa E. et al.: Strong correlation between the prevalence of cerebral infarction and the presence of anti-cardiolipin/ß 2 -glycoprotein I and antiphosphatidylserine/prothrombin antibodies. Br J Haematol 1997; 96: 447-450 106. Medina G., Casaos D., Jara L.J. et al.: Increased carotid artery intima-media thickness may be associated with stroke in primary antiphospholipid syndrome. Ann Rheumat Diseases 2003; 62: 607-613 107. Cervera R.: Recent advances in antiphospholipid antibody-related valvulopathies. J Autoimmunity 2000; 15: 123-125 108. Levy R.A.: Clinical manifestations of the apl syndrome. Lupus 1996; 5: 393-397 109. Font J., Cervera R.: Cardiac manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Khamashta M.A. (Ed.) Hughes Syndrome. Springer, London 2000: 32-42 110. Ozturk M.A., Hazneradoglu I.C., Turgut M., Goker H.: Current debates in antiphospholipid syndrome: the acquired antibody-mediated thrombophilia. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 2004; 10: 89-126 111. Nochy D., Daugas E., Huong D.L.T. et al: Kidney involvement in the antiphospholipid syndrome. J Autoimmunity 2000; 15, 127-132 112. Amigo M.C., García-Torres R.: Kidney disease in antiphospholipid syndrome. In Khamashta M.A. (Ed.): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 70-81 -76-
113. Levy Y., Georgie J., Záporem L. et al.: Massive proteinuria as a main manifestation of primary antiphospholipid syndrome. Pathobiology 1998; 66: 49-53 114. Vaidya S., Wang C.C., Gugliuzza C, Fish J.C.: Relative risk of post-transplant renal thrombosis in patients with antiphospholipid antibodies. Clin Transplant 1998; 12: 439-444 115. Cervera R., Garcia-Carrasco M., Asherson R.A.: Pulmonary manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 161-167 116. Cervera R., Piette J-Ch., Font J. at al.: Euro-phospholipid project group. Antiphospholipid syndrome: Clinical and immunologic manifestation and patterns of disease expression in a cohort of 1000 patients. Arthritis Rheum 2002; 46: 1019 117. Piette J.-Ch., Hunt B.J.: Pulmonary hypertension and antiphospholipid antibodies. In Khamashta M.A. (Ed.): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 96-101 118. Bick R.L., Arun B., Frenkel E.P.: Antiphospholipid thrombosis syndrome. Lectures 15th international congress on thrombosis 1997; 155-162 119. Levine S.R., Crofts J.W., Lesser G.R. et al: Visual symptoms associated with the presence of a lupus anticoagulant. Ophthalmology 1988; 95: 686-692 120. Labutta R.J.: Ophthalmic manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 213-218 121. Castanon C, Reyes P.A.: The eye in the primary antiphospholipid syndrome (Hughes Syndrome). In Khamashta M.A. (Ed.): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 89-95 122. Murphy P.T., Rao P: Central retinal venous occlusion with co-existent thrombotic thrombocytopenic purpura and antiphospholipid syndrome. Brit J Ophthalm 2003; 87: 658-663 123. Hughes G.R.V.: Of the beaten tracks: A clinician's view. In Khamashta M.A. (Ed.): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 105-110 124. Asherson R.A.: Adrenal, hepatic, and other intraabdominal manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 183-191 125. Klein R., Golier S., Bianchini L.: Nodular regenerative hyperplasia (NRS) of the liver - a manifestation of organ-specific antiphospholipid syndrome"? Immunobiology 2003; 207: 51-58 126. Berneis K., Buitrago-Téllez C, Miller B. et al: Antiphospholipid syndrome and endocrine damage: why bilateral adrenal thrombosis? Eur J Haematol 2003: 71: 299-302 127. Lioté F., Meyer O.: Osteoarticular manifestation in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 195-200 128. Grupo R., Glueck Ch.J., McMahon R.E. et al.: The pathophysiology of alveolar osteonecrosis of the jaw: Anticardiolipin antibodies, thrombophilia, and hypofibrinolysis. J Lab Clin Med 1996: 127: 481-488 129. Cuadrado M.J., Mujic F., Munoz E. et al: Thrombocytopenia in the antiphospholipid syndrome. Ann Rheum Diseases 1997; 56: 194-196 130. Davies K.A., Athanassiou P., Loizou S.A.: Thrombocytopenia and other haematological abnormalities in the antiphospholipid syndrome. In Asherson R.A., Cervera R., Piette J-Ch., Shoenfeld Y. (Eds): The Antiphospholipid Syndrome. CRC Press, Boca Raton 1996: 219-234 -77-
131. Arnout J.: The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome: a hypothesis based on parallelisms with heparin-induced thrombocytopenia. Throm Haemost 1996: 536-541 132. Win N., Islam S.I.A.M., Peterkin M.A., Walker I.D.: Positive direct antiglobulin test due to antiphospholipid antibodies in normal healthy blood donors. Vox Sanguinis 1997; 72:182-184 133. Musial J., Frolow M, Skotnicki A.B. et al.: Evans's syndrome with positive lupus anticoagulant and antiphospho-protein antibodies. Clin AppI Thrombosis/Hemostasis 1997; 3: 96-98 134. Asherson R.A.: The catastrophic antiphospholipid syndrome, 1998. A review of the clinical features, possible pathogenesis, and treatment. Lupus 1998; 7: 55-62 135. Belmont H.M.: Catastrophic antiphospholipid syndrome. In Khamashta M.A. (Ed.): Huges Syndrome 2000; Springer-Verlag London, 127-134 136. Khamashta M.A.: Primary prevention of thrombosis in subjects with positive antiphospholipid antibodies. J Autoimmunity 2000; 15: 249-253 137. Erkan D. Merril J.T., Yazici Y. et al: High thrombosis rate after fetal loss in antiphospholipid syndrome: Effective prophylaxis with aspirin. Arthritis Rheumat 2001; 44: 1466-1467 138. Erkan D., Yazici Y., Harrison M. et al.: APLASA study: primary thrombosis prevention in asymptomatic antiphospholipid antibody (apl) patients with low-dose aspirin. Lupus 2004; 11:573 139. Roubey R.: Treatment of the antiphospholipid syndrome. Curr Opin Rheumatol 2002; 14: 238-242 140. Khamashta M.A., Cuadrado M.J. Mujic F. et al.: The management of thrombosis in the antiphospholipid-antibody syndrome. N Engl J med 1995; 332: 993-997 141. Ruiz-lrastorza G., Khamashta M.A. Hunt B.J et al.: Bleeding and recurrent thrombosis in definite antiphospholipid syndrome: analysis of a series of 66 patients treated with oral anticoagulation to a target international normalized ratio of 3, 5. arch Intern Med 2002; 162: 1164-1169 142. Crowther M.A., Ginsberg J.S., Julian J. et al.: A comparison of two intensities of warfarin for the prevention of recurrent thrombosis in patients with the antiphospholipid antibody syndrome. N Engl J Med 2003; 349: 1133-1138 143. Finazzi G., Marchioli R., Barbui I.: A randomized clinical trial of oral anticoagulant therapy in patients with the antiphospholipid syndrome. The WAPS study. J Thromb Haemost 2003; Suppl 1: Abstract OC 365 144. APASS Investigators: Antiphospholipid antibodies and subsequent thrombo-occlusive events in patients with ischemic stroke. JAMA 2004; 291: 576-584 145. Asherson R.A., Cervera R., de Groot P.G. et al.: Catastrophic antiphospholipid syndrome Registry Project Group: Catastrophic antiphospholipid syndrome: International consensus statement on classification criteria and treatment guidelines. Lupus 2003; 12: 530 146. Ferrari D.E., Swerlic R., Casper K. et al.: Fluvastatin inhibits up-regulation of tissue factor expression by antiphospholipid antibodies on endothelial cells. J Thromb Haemost 2004; 2: 1558-1563 147. Lockshin M.D. Future trends for treatment of APS. J Autoimmunity 2000; 15: 261-264 148. Adachi Y., Inaba M., Amoh Y et al. Effect of bone marrow transplantation on antiphospholipid antibody syndrome in murine lupus mice. Immunobiology 1995; 192: 218-230 -78-
149. Jayne D.: Stem cell transplantation in systemic lupus erythematosus. Best Pract Research Clin Haematol 2004; 17: 291-304 150. Brandt J.T., Barma L.K., Triple«D.A. et al.: Laboratory identification of lupus anticoagulants. Thromb Haemost 1995; 74: 1597-1603 151. Jennings I., Kitchen S., Woods T.A.L., Presto F.E. Greaves M. (on behalf of the UK National external duality assessment scheme for blood coagulation): Potentially clinically important inaccuracies in testing for the lupus anticoagulant: an analysis of results from three surveys of the UK National external Duality assessment scheme (NEQAS) for blood coagulation. Thromb Haemost 1997; 77: 934-937 152. Myers B., Dolan G., Gould J.: Audit of laboratory investigation of antiphospholipid syndrome. British J Haematol 2001; 115: 229 153. Tripodi A., Biasiolo A., Chantarangkul V., Pengo V.: Lupus anticoagulant (LA) testing: Performance of clinical laboratories assessed by a national survey using lyophilized affinitypurified immunoglobulin with LA activity. Clin Chemistry 2003; 49: 1608 154. Jennings I., Arnout J., Kitchen S. et al.: Use plasma spiked with monoclonal antibodies in lupus anticoagulant (LA) screening; experience with UK NEQAS (blood coagulation) proficiency testing program. J Thromb Haemost 2003; Suppl. P1562a 155. Tripodi A., Chantarangkul V., Clerici M., Mannucci P.M.: Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment. Thromb Haemost 2002; 88: 583-586 156. Brandt J.T., Triplett D.A., Rock W.A. et al.: Effect of lupus anticoagulants on the activated partial thromboplastin time. Arch Patol Lab Med 1991; 115:109-114 157. Adcock D.M., Malar R.A.: Activated partial thromboplastin time reagent sensitivity to the presence of the lupus anticoagulant. Arch Pathol Lab Med 1992; 116: 837-840 158. Denis-Magdelaine A., Flahault A., Verdy E.: Sensitivity of sixteen aptt reagents for the presence of lupus anticoagulants. Haemostasis 1995; 25: 98-105 159. Härtung K.J., Lutze G., Luley C: Untersuchungen zur "Lupusantikoagulanz- Empfindlichkeit" verschiedener APTT-Reagenzien. J Lab Med 1997; 21:162-166 160. Goudemand J., Caron C, De Prost D. et al.: Evaluation of sensitivity and specificity of a standardized procedure using different reagents for the detection of lupus anticoagulants. Thromb Haemost 1997; 77: 336-342 161. Galli M., Finazzi G., Norbis F. et al.: The risk of thrombosis in patient with lupus anticoagulants is predicted by their specific coagulation profile. Thromb Haemost 1999; 81: 695-700 162. Pengo V., Biastiolo A., Rampazzo P., Brocco T.: drwt is more sensitive than KCT or TTI for detecting lupus anticoagulant activity of anti-ß2-glycoprotein I autoantibodies. Thromb Haemost 1999; 81: 258-258 163. Galli M., Dlott J., Norbis F. et al.: Lupus anticoagulants and thrombosis: clinical association of different coagulation and immunologic tests. Thromb Haemost 2000; 84: 1012-1016 164. Buliková A., Matýskova M., Dušek L. et al.: Význam screeningových testů pro diagnostiku lupus antikoagulans. Hematológia a transfuziológia 2000; 10:102-111 165. Sakakura M., Wada H., Watanabe R. et al.: Coagulation tests and anti-phospholipid antibodies in patients positive for lupus anticoagulant. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 2000; 6: 144-150 -79-
166. Lindhoff-Last E., Humpich M., Schmitt J. Et al.: MIXCON-LA: A precise, sensitive and specific aptt-based assay for detection of lupus anticoagulant. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 2002; 8: 163-167 167. Lawrie A.S., Mackie I.J., Purdy G., Machin S.J.: The sensitivity and specificity of commercial reagents for the detection of lupus anticoagulant show marked differences in performance between photo-optical and mechanical coagulometers. Thromb Haemost 1999; 81:758-762 168. Exner T., Hohnen-Behrens C, Newman P., Dargan W.: Effect of instruments on lupus anticoagulant testing. Thromb Haemost 2000; 83: 345-346 169. Gennari L.C., Blanco A.N., Grosso S.H. et al.: A simple relationship between two aptt reagents as a confirmatory test in the diagnosis of lupus anticoagulants (LA) in oral anticoagulated (OA) patients. Lupus 2002; Suppl 1: 626 170. Triplett D.A.: Diagnosis of antiphospholipid antibodies. Hämostaseologie 2001; 21: 54-59 171. Parke A.L., Weinstein R.E., Bona R.D- et al.: The thrombotic diathesis associated with the presence of phospholipid antibodies may be due to low levels of free protein S. Am J Med 1992;93:49-56 172. Oostin J.D., Derksen R.H.W.M., Bobbink I.W.G. et al.: Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phoshopholipids with prothrombin, protein C, or protein S: An explanation for their pathogenetic mechanisms? Blood 1993; 81: 2618-2625 173. Ames P.R-J., Tommasino C, lannaccone L. et al.: Coagulation activation and fibrinolytic imbalance in subjects with idiopathic antiphospholipid antibodies. A crucial role for acquired free protein S deficiency. Thromb Haemost 1996; 76: 190-194 174. Mori T., Takeya H., Nishioka M. et al.: ß2-glycoprotein I modulates the anticoagulant activity of activated protein C on the phospholipid surface. Thromb Haemost 1996; 75: 49-55 175. Kraus M., Noah M., Fickenscher K.: The PCAT - a simple screening assay for assessing the functionality of the protein C anticoagulant pathway. Thromb Res 1995; 80: 217-222 176. Kraus M., Zadner M., Fickenscher K.: Coagulation assay with improved specifity to factor V mutants insensitive to activated protein C. Thromb Res 1995; 80: 255-264 177. Kemkes-Matthes B., Matzdorff A., Niemann F.: Differentialdiagnostik zur Beurteilung des Thromboserisikos mit ProCglobal. Hämostaseologie 1999; 19: 153-156 178. Siegemund A., Vorberg B., Siegemund T. et al.: Einsatz des ProCglobal -Test zum Thrombophisiescreening. Hämostaseologie 1999; 19: 157-167 179. Galli M. Beretta G., Daldossi M. et al.: Kaolin clotting time and dilute Russel's viper venom time distinguish between prothrombin-dependent and ß2-glycoprotein I dependent antiphospholipid antibodies. Blood 1995; 86: 617-623 180. Ruggeri L., Barbui T., Galli M.: Acquired resistance to activated protein C due to specific subset of lupus anticoagulants: Evaluation by means of ProCglobal test. Thromb Haemost 1999; Suppl.: 102-103 181. Buliková A., Matýskova M., Zavřelová J. et al.: Stanovení rizika trombózy u osob s pozitivními antifosfolipidovými protilátkami. Závěrečná zpráva grantu č. IZ/4263-3 IGA Ministerstva zdravotnictví ČR 182. Buliková A., Penka M., Zavřelová J. et al.: Protein C pathway abnormalities in patients with antiphospholipid antibodies. Thrombophilia and atherothrombosis 2001; lectures and abstracts: 58-80-
183. Rosendaal F.R., van der Meer F.J.M., VisserT.H. et al.: ProC Global screening test and risk of thrombosis. Thromb Haemost 1999; 82 (Suppl): 731 184. Grand'Maison A., Bates S.M., Johnston M. et al.: ProC Global": A functional screening test that predicts recurrent venous thrombembolism. Thromb Haemost 2005; 93: 600-604 185. Matýskova M., Zavřelová J., Méhešová M.: ProC Global - laboratorní screeningový test pro trombofilii. Praktický lékař 2001; 12: 697-700 186. de Groot P.G., Derksen R.H.W.M.: Pathophysiology of the antiphospholipid syndrome. J Thromb Haemost 2005; 3: 1854-1860 187. Dostál C: Antifosfolipidový syndrom. Vnitřní lékařství 1994; 40: 48-52 188. Greaves M., Cohen H., Machin S.J. et al.: Guidelines on the investigation and management of the antiphospholipid syndrome. British J Haematol 2000; 109: 704-715 189. Out HJ., de Groot P.G, van Vliet M. et al.: Antibodies to platelets in patients with antiphospholipid antibodies. Blood 1991; 77: 2655-2653 190. Alarcón Segovia D., Pérez-Vázquez M.E., Villa A.R. et al.: Preliminary classification criteria ofr the antiphospholipid syndrome within systemic lupus erythematosus. Semin Arhtr Rheumat 1992; 5: 275-286 191. Arbuckle M.R., McClein M.T., Rubertone M.V. et al.: Development od autoantibodies before the clinical onset od systemic lupus erythematosus. N Engl J Med 2003; 349:1526-1533 192. Dostál C: Anticardiolipin antibodies in acute infectious mononucleosis. J Rheumatol 1990; 17: 1573-1574 193. Lawrie A.S., Purdy G., Mackie I.J., Machin S.J.: Monitoring of oral anticoagulant therapy in lupus anticoagulant positive patiens with the anti-phospholipid syndrome. Britisch J Haematol 1997; 98: 887-892 194. Moll S., Ortel T.L.: Monitorin warfarin therapy in patiens with lupus anticoagulatns. Ann Intern Med 1997; 127: 177-185 195. Arnout J., Vermylen J.: Lupus anticoagulant: Influence on the International normalized ratio. Thromb Haemost 1999; 81: 847-849 196. Robert A., Le Querrec A., Delahousse B. et al.: Control of oral anticoagulation in patients with the antiphospholipid syndrome - influence of the lupus anticoagulant on International normalized ratio. Thromb Haemost 1998; 80: 99-103 197. Tripodi A., Chantarangkul V., Clerici M. et al.: Laboratory control of oral anticoagulant treatment by the INR system in patients with the antiphospholipid syndrome and lupus anticoagulant. Results of a collaborative study involving nine commercials thromboplastins. Br J Haematol 2001; 115: 672-678 198. Carrasco C, Campbell B., Shiach C: Effects of the lupus anticoagulants on the control of oral anticoagulant treatment. British J Haematol 2004; 124: 555-563 199. Froom P., Miron E., Barak M.: Oral anticoagulants in the elderly. British J Haematol 2003; 120: 526-528 200. Froom P., Barak M.: An informed consent form for treatment with oral anticoagulants. J Thromb Haemost 2004; 2: 196-197 201. Locadia M., Van Geest-Daalderop J.H.H., Sprangers M.A.G. et al.: The relationship between adherence and quality of treatment with vitamin K antagonist. J thromb Haemost 2004; 2: 362-363 202. Schulman S.: Care of patients receiving long-term anticoagulant therapy. N Engl J med 2003; 349: 675-683 -81 -
203. Schurgers L.J., Shearer M.J., Hamulyák K. et al.: Effect of vitamin K intake on the stability of oral anticoagulant treatment: dose-response relationships in healthy subjects. Blood 2004; 104: 2682-2689 204. Khan T., Wynne H., Wood P. et al.: Dietary vitamin K influences intra-individual variability in anticoagulant response to warfarin. British J Haemtaol 2004; 124: 348-354 205. Hirsh J., Fuster V., Ansell J., Halperin J.L.: American Heart Association/American College of Cardiology Foundation guide to warfarin therapy. Circulation 2003; 107: 1692-1711 206. Young L, Ockerford P., Harper P.: Audit of community-based anticoagulant monitoring in patients with thrombembolic disease: is frequent testing necessary? Int Med J 2004; 34: 639-641 207. Samsa G.P., Matchar D.B., Goldstein L.B. et al.: Quality of anticoagulation management among patients with arterial fibrillation: results of a review of medical records from 2 communities. Arch Inter Med 2000; 160: 967-973 208. Buliková A., Zavřelová J., Némethová D. et al.: Přínos různé citlivosti aptt reagencie pro diagnostiku inhibitoru lupus antikoagulans. Transfuze a hematologie dnes 2005; 98-103 209. le Querrec A., Arnout J., Arnoux D. et al.: Quantification od lupus anticoagulants in clinical samples using anti-ß2gp1 anti anti-prothrombin monoclonal antibodies. Thromb Haemost 2001; 86: 584-589 210. Simmelink M.J.A., Derksen R.H.W.M., Arnout J., de Groot P.G.: A simple method to discriminate between ß 2 -glycoprotein I - and prothrombin-dependent lupus anticoagulants. J Thromb Haemost 2003; 1: 740-747 211. Pengo V., Biasiolo A., Pegoradro C, lliceto S.: A two-step coagulation test to identify antiß 2 -glycoprotein I lupus anticoagulants. J Thromb Haemost 2004; 2: 702-707 212. Buliková A., Némethová D., Penka M. et al.: ProCGIobal u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami. Transfuze a hematologie dnes (přijato k publikaci). 213. Buliková A.: Antifosfolipidový syndrom. Standard léčebného plánu. In Bouřek A., Forýtková L., Seifert B., Suchý M.: Programy kvality a standardy léčebných postupu, 2005. Verlag Dashofer, Praha: HEMA/3 1-14 214. Dostál C: Antifosfolipidové autoprotilátky - fenomén nových souvislostí? Vnitřní lékařství 2000; 50: 257-259 215. Buliková A., Némethová D., Penka M. et al.: Ovlivňuje přítomosti lupus antikoagulans antikoagulacní léčbu u pacientů s antifosfolipidovým syndromem? Transfuze a hematologie dnes (přijato k publikaci). -82-
Příloha č. 2: přehled použitých zkratek ACLA - antikardiolipinové protilátky (anticardiolipin antibodies) AIDS - syndrom získaného lidského imunodeficitu AIHA - autoimunitní hemolytická anémie ANA - antinukleámí protilátky (antinuclear antibodies) APA - antifosfolipidové protilátky APC - aktivovaný protein C APS - antifosfolipidový syndrom APSN - nefropatie antifosfolipidového syndromu ARDS - syndrom akutní respirační tísně ASA - kyselina acetylosalicylová aptt - aktivovaný parciální tromboplastinový test AT - antitrombin C- komplement CAPS - katastrofický antifosfolipidový syndrom CLL - chronická lymfatická leukémie CMV - cytomegalovirus CMMol - chronická myelomonocytámí leukémie CNS - centrální nervový systém COX - cyklooxygenáza DNA - deoxyribonukleová kyselina drwt - ředěný test s jedem Russelovy zmije ds-dna - dvouřetězcová deoxyribonukleová kyselina DVT - hluboká žilní trombóza EBV - virus Ebstein-Barrové EDTA - kyselina ethylén-di-animo-tetraoctová ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Essay" ENA - extrahovatelný nukleární antigen EP - embólie plieni ET - esenciální trombocytémie F - faktor FVL - Leidnenská mutace FV GÁBA - kyselina gama-amino-máselná GP - glykoprotein GVHD - reakce štěpu proti hostiteli HCL - vlasatobuněčná leukémie HELLP - hemolysis - liver enzyme - low platelet" HIV - virus získaného lidského imunodeficitu (human imunodefitiency virus) HLTV - virus lidské T leukémie (human leukemia T virus) HLA - histokompatibilní leukocytární antigen ICAM - intracelulární adhezivní molekula/molekuly IL - interleukin INR - mezinárodní normalizovaný poměr (International Normalized Ratio) ISTH - mezinárodní společnost pro trombózu a hemostázu ITP - idiopatická trombocytopenická purpura IUGR - intrauterinní růstová retardace K+ - draslíkové ionty KCT - kaolínový čas (Kaolin clotting time) LA - lupus antikoagulans LDL - lipoprotein nízké denzity LMWH - nízkomolekulámí heparin/y (low molecular weight heparin) M - nemoc (morbus) MA - manifestace arteriální trombózy -83-
MCTD - smíšené onemocnění pojiva (mixed conecting tissue disease) MHC - hlavní histokompatibilní systém MMS - monocyto-makrofágový systém MO - manifestace orgánová mrna - mediátorová ribonukleová kyselina MS-like - napodobující roztroušenou sklerózu MV - manifestace venózní trombózy N - počet (number) NAT - nepřímý antiglobulinový test NMR - nukleární magnetická resonance ORL - otorinolaryngologie PAI - plazminogen aktivátor inhibitor PAPS - primární antifosfolipidový syndrom PAT - přímý antiglobulinový test PET - pozitronová emisní tromografie PC - protein C PK - prekalikrein PS - protein S PV - pravá polycytémie PT - protrombinový čas RA - revmatoidní artritída PIA - Radio-Immuno-Assay" SIRS - syndrom systémové zánětlivé odpovědi SLE - systémový lupus erythematodes SPA - spontánní potrat (abort) ss-dna - jednořetězcová deoxyribonukleová kyselina TEN - trombembolická nemoc TFPI -inhibitor zevní cesty koagulace (tissue factor pathway inhibitor) TNF - tumorózní nekrotizující faktor t-pa - tkáňový aktivátor plazminogenu TSH - thyreostimulační hormon TTP - trobotická trombocytopenická purpura v. - véna VCAM - vaskulární celulární adhezivní molekula/molekuly VEGF - vaskulární endoteliální růstový faktor -84-
Příloha 3: Obrazová dokumentace I. VYHODNOCEN! PŘÍNOSU ZPŘESNĚNÍ DIAGNOSTIKY LUPUS ANTIKOAGULANS POUŽÍTÍM NECITLIVÉ APT! REAGENCIE Obr. č. 1.1: Základní charakteristika souboru pacientů Obr. č. 1.2: Pacienti bez antikoagulační léčby Obr. č. 1.3: Srovnání hodnot aptt, aptt-la a aptt-necitl.la u LA pozitivních a LA negativních pacientů Obr. č. 1.4: Srovnání indexu R _A u LA pozitivních a LA negativních pacientů Obr. č. 1.5: Pacienti léčení warfarinem. Vztah mezi INR, aptt-la, aptt-necitl.la Obr. č. I.6: Srovnání hodnot INR, aptt-la, aptt-necitl.la u LA pozitivních pacientů s dilucí a bez diluce a u LA negativních pacientů Obr. č. 1.7: Srovnání indexu RLA U skupin pacientů léčených warfarinem Obr. č. 1.8: Srovnání pacientů bez antikoagulační léčby a pacientů léčených warfarinem. Rozdíly mezi léčenými pozitivními pacienty bez diluce (1) a pozitivními pacienty bez antikoagulační léčby. Obr. č. 1.9: Srovnání pacientů bez antikoagulační léčby a pacientů léčených warfarinem. Rozdíly mezi léčenými pozitivními pacienty s dilucí (2) a pozitivními pacienty bez antikoagulační léčby. Obr. č. 1.10: Srovnání LA negativních pacientů. Rozdíly mezi léčenými negativními pacienty (3) a negativními pacienty bez antikoagulační léčby. II.VYUŽITÍTESTUPROCGLOBAL KPREDIKCIPROTROMBOTICKÉHORIZIKA UNEMOCNÝCH S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI Obr. č. 11.1: Věk ve skupině kontrolní a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami Obr. č. II.2: Hodnota ProCglobal ve skupině kontrolní a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami Obr. č. II.3: Hodnota ProCglobal v kontrolní skupině a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami v závislosti na manifestaci žilní, arteriální trombózy, resp. samovolných potratů Obr. č. II.4: Hodnota ProCglobal v kontrolní skupině a u nemocných s lupus antikoagulans a bez tohoto nálezu, s nálezem pozitivitiy antikardiolipinových protilátek a bez tohoto nálezu, při různé pozitivitě protilátek proti ß 2 -glykoproteinu U Obr. č.ll.5: Hodnota ProCglobal s NR < 0,8 u pacientů bez Leidenské mutace FV a s touto vrozenou trombofilií, a v závislosti na jiných koagulačních odchylkách Obr. č. II.6: Průměrné hodnoty ProCglobal v kontrolní skupině a skupině pacientů podle pohlaví, u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami podle pohlaví a klinické manifestaci trombózy (T+); stejná analýza v celém vyšetřovaném souboru -85-
I.DLOUHODOBÉSLEDOVÁNÍPACIENTŮ SANTIFOSFD PARAMETRŮ POTŘEBNÝCH K PÉČI O TYTO NEMOCNÉ Obr. č. III.1: Manifestace trombózy typu DVT/EP IV. VYHODNOCENÍ RIZIK NASTAVENÍ A SLEDOVÁNÍ ANTIKOAGULAČNI LÉČBY U PACIENTŮ S ANTIFOSFOLIPIDOVÝMI PROTILÁTKAMI Obr. č. IV. 1: Porovnání relativního počtu hdonot INR mimo cílový interval Obr. č. IV.2: Porovnání průměrné odchylky od cílového intervalu INR Obr. č. IV.3: Hodnoty INR mimo cílový interval podle klinické významnosti odchylky Obr. č. IV.4: Doba náležité antikoagulační léčby v cílovém intervalu INR Obr. č. IV.5: Porovnání dávky warfarinu Obr. č. III.2: Manifestace trombózy typu SVT Obr. č. III.3: Manifestace trombózy v atypické lokalizaci Obr. č. III.4: Manifestacce trombózy typu CMP Obr. č. III.5: Výskyt hypertenze v závislosti na věku pacientů Obr. č. III.6: Hladiny protilátek u pacientů s různými projevy onemocnění Obr. č. III.7: Počet trombocytů podle protilátek proti trombocytům Obr. č. III.8: Počet trombocytů s ACLA lgg+ a ACLA IgG- -86-
Obr. č. 1.1: Základní charakteristika souboru pacientů PACIENTI BEZ ANTIKOAGULACNI LEC 00 ^1 POZITIVNÍ NEGATIVNÍ N 100 100 PACIENTI LECENI WARFARINEM N Označení skupiny POZITIVNÍ BEZ DILUCE 18 1 POZITIVNÍ S DILUCÍ 33 2 NEGATIVNÍ 24 3
Obr. č. 1.2: Pacienti bez antikoagulační léčby Pozitivní pacienti Negativní pacienti Vztah mezi aptt, aptt-la, aptt-necitl.la Wilcoxonův test *** P< 0,001 00 00 Vztahy mezi aptt, aptt-la a aptt-necitl.la v rámci pozitivních pacientů a negativních pacientů byly hodnoceny Wilcoxonovým párovým testem. n = 10 Wilcoxonův test *** P< 0,001 n = 100 n = 100 n = 100 aptt aptt-la aptt- _ T necitl.la n median 25-75% ± 10-90% aptt aptt-la aptt- median 25-75% I 10-90% nec, "' LA Pozitivní pacienti Negativní pacienti aptt aptt-la aptt-necitl.la aptt aptt-la aptt-necitl.la průměr 1,64 2,63 1,25 1,26 1,50 1,40 sm.odch. 0,57 1,19 0,20 0,20 0,18 0,21 medián 1,47 2,35 1,20 1,25 1,47 1,36 min 0,98 1,38 0,90 0,88 1,26 1,06 max 3,35 6,50 1,88 1,87 2,11 2,08
Obr. č. 1.3: Srovnání hodnot aptt, aptt-la a aptt-necitl.la u LA pozitivních a LA negativních pacientů aptt aptt-necitl.la 6 Mannův- 5 Whitneyův U test 4 P< 0,001 5 n = 100 Mannův- Whitneyův U test P< 0,001 6 5 Mannův- Whitneyův U test 4 P< 0,001 3 0Ĺ n = 100 * ' 00 CD 2 ' l ^ ^ n = 100 1.*=? i 2 n = 100 1 - = - n = 100 A pozitivní negativní pozitivní negativní 0 pozitivní negativní n median 25-75% X 10-90% a median 25-75% X 10-90% a median M 25-75% X 10-90% aptt aptt-la aptt-necitl.la pacienti: pozitivní negativní pacienti: pozitivní negativní pacienti: pozitivní negativní průměr 1,64 1,26 prumer 2,63 1,50 prumer 1,25 1,40 sm.odch. 0,57 0,20 sm.odch. 1,19 0,18 sm.odch. 0,20 0,21 medián 1,47 1,25 medián 2,35 1,47 medián 1,20 1,36 min 0,98 0,88 min 1,38 1,26 min 0,90 1,06 max 3,35 1,87 max 6,50 2,11 max 1,88 2,08
Obr. č. 1.4: Srovnání indexu R LA u LA pozitivních a LA negativních pacientů RLA = (aptt-la - aptt-necitl.la)/aptt-necitl.la co o n = 100 Mannův- Whitneyův U test P< 0,001 n = 100 Pomocí logistické regrese byl vytvořen predikční model, který na základě hodnoty R^ umožňuje pacienta zařadit do skupiny pozitivních nebo negativních pacientů. p 1/[1 + exp(-5.986 + 22.356*R M )] Při nastavení kritické hranice na p = 0.5 má tento model korektní predikci u 95.5% pacientů. Model má statisticky významnou schopnost predikce pacientů s lupus antikoagulans (Hosmer and Lemeshow test). Sen: :itivita 1.88- pozitivní negativní n median 25-75% X 10-90% pacienti: pozitivní negativní prumer 1,12 0,08 sm.odch. 0,92 0,10 medián 0,88 0,09 min 0,14-0,25 max 4,19 0,31 O.03- / Tvar ROC křivky potvrzuje, že vytvořený model má velmi dobrou - schopnost predikce a tedy zároveň vysokou senzitivitu i specificitu k detekci pacientů s lupus antikoagulans. 1 II 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 M 1 1 1 1 1 3.0 0.1 02 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 09 1.0 1 - Specificita
Obr. č. I.S: Pacienti léčení warfarinem Vztah mezi INR, aptt-la, aptt-neciti.la Požit. pac. bez diluce 5 r i ns ^ i 1 1 1 i n = 4 118 n = 18 3 i 0Ĺ ill JH n 2 = 18 1 J_ I Em 0 Wilcoxonův test *** P< 0,001 ;ns: P > 0,05 INR aptt-la aptt- median 25-75% I 10-90% necítl.la 3 Pozitivní pac. s dilucí ' ns i r n = 33 Wilcoxonův test n = 33 *** P< 0,001 ;ns: P > 0,05 INR aptt-la aptt- median 25-75% I 10-90% necitl.la 6 4 3 DĹ 2 1 g Negativní pacienti n = 24 n = 24 ^ f^ n = 24 Wilcoxonův test ***P<0,001; *P<0,05 INR aptt-la aptt- D median 25-75% J_ 10-90% necíti.la Pozitivní pac. bez diluce Pozitivní pacienti s dilucí Negatívni pacienti INR aptt-la aptt-nec.la INR aptt-la aptt-nec.la INR aptt-la aptt-nec.la průměr 2,33 2,89 1,65 2,32 2,49 1,28 2,39 1,42 1,51 sm.odch. 0,49 1,08 0,28 0,58 0,99 0,13 0,54 0,27 0,21 medián 2,30 2,80 1,74 2,40 2,37 1,27 2,29 1,40 1,50 min 1,44 1,32 1,24 1,35 1,22 1,09 1,44 1,08 1,28 max 3,30 4,62 2,04 3,69 5,54 1,76 3,76 2,17 2,04
Obr. č. 1.6: Srovnání hodnot INR, aptt-la a aptt-necitl.la u LA pozitivních pacientů s dilucí a bez diluce a u LA negativních pacientů 1: požit. pac. bez diluce; 2: požit. pac. s dilucí; 3: negativní pacienti aptt-la aptt-necitl.la co ro OÉ ns ns i r ns n = 33 *s* n = 18 n = 24 4 n = 18 ns n = 24 Mannův-Whitneyův U test ns: P > 0,05 1 2 3 n median 25-75% X 10-90% Mannův-Whitneyův U test *** P < 0,001; ns:p> 0,05 1 2 3 D median 25-75% X 10-90% Mannův-Whitneyův U test ***P<0,001; ns:p>0,05 1 2 3 a median I 25-75% X 10-90% aptt-la aptt-necitl.la skupina: skupina: 1 skupina: 1 průměr 2,33 2,32 2,39 průměr 2,89 2,49 1,42 prumer 1,65 1,28 1,51 sm.odch. 0,49 0,58 0,54 sm.odch. 1,08 0,99 0,27 sm.odch. 0,28 0,13 0,21 medián 2,30 2,40 2,29 medián 2,80 2,37 1,40 medián 1,74 1,27 1,50 min 1,44 1,35 1,44 min 1,32 1,22 1,08 min 1,24 1,09 1,28 max 3,30 3,69 3,76 max 4,62 5,54 2,17 max 2,04 1,76 2,04
Obr. č. 1.7: Srovnání indexu RLA u skupin pacientů léčených warfarinem 1: LA pozit. pac. bez diluce; 2: LA pozit. pac. s diluci; 3: LA negativní pacienti R Index R, Mannův-Whitneyův U test ns 3 i r n = 33 0Ĺ co w Do logistické regrese byly zařazeny obě skupiny pozitivních pacientů společně, jelikož se mezi nimi hodnota indexu R^ nelišila. p = 1/[1 + exp(-0.980 + l l ^ ö x R ^ ) ] n = 18 2 LA = (aptt-la - aptt-necitl.la)/aptt-necitl.la n = 24 Při nastavení kritické hranice na p = 0.5 má tento model korektní predikci u 90.7% pacientu. Model má statisticky významnou schopnost predikce pacientů s lupus antikoagulans (Hosmer and Lemeshowtest). Senzitlvlta 1.0- P < 0,001; ns P > 0,05 1 2 3 n median 25-75% X 10-90% 0.90.B0.7 Tvar ROC křivky potvrzuje, že vytvořený model má velmi dobrou schopnost predikce a tedy zároveň vysokou senzitivitu i specificitu k detekci pacientů s lupus antikoagulans. 0.6 0.5- J 0.4- Skupina Průměr 0,76 0,93-0,06 sm.odch 0,64 0,69 0,12 medián 0,55 0,85-0,05 min -0,13-0,09-0,27 max 2,30 2,90 0,24 0.3 0.2 0.1 o.o H 0.0 1 I ' ' 0.1 1 I ' ' 0.2 0.3 ' I ' ' ' ' I ' 0.4 0.5 1 I ' ' ' ' I ' 0.6 07 1 -Specif icita 0.B 0.9 1.0
Obr. č. 1.8: Srovnání LA pozitivních pacientů bez antikoagulační léčby a léčených warfarinem Rozdíly mezi léčenými pozitivními pacienty bez diluce (1) a pozitivními pacienty bez antikoagulační léčby aptt-la aptt-necitl.la Index R, n = 18 n = 100 51 4 Mannův- Whitneyův U test P < 0,001 Mannův- Whitneyův U test P > 0,05 n = l8 n = 100 CD 4^ n = l8 n = 100 1 Mannův-Whitneyův U test P > 0,05 D median 1 pozitivní 25-75% I 10-90% 1 pozitivní o median I 25-75% X 10-90% 0 1 1 pozitivní n median 25-75% J 10-90% aptt-la skupina: pozitívni aptt-necitl.la skupina: pozitívni skupina: pozitivní průměr 2,89 2,63 prumer 1,65 1,25 prumer 0,76 1,12 sm.odch. 1,08 1,19 sm.odch. 0,28 0,20 sm.odch. 0,64 0,92 medián 2,80 2,35 medián 1,74 1,20 medián 0,55 0,88 min 1,32 1,38 min 1,24 0,90 min -0,13 0,14 max 4,62 6,50 max 2,04 1,88 max 2,30 4,19
Obr. č. 1.9: Srovnání LA pozitivních pacientů bez antikoagulační léčby a léčených warfarinem Rozdíly mezi léčenými pozitivními pacienty s dilucí (2) a pozitivními pacienty bez antikoagulační léčby aptt-la aptt-necitl.la Index R, Mannův- Whitneyův U test P > 0,05 n = 33 n = 100 6 Mannův- 5 Whitneyův U test P > 0,05 4 5r 4 3 Mannův- Whitneyův U test P > 0,05 3 D 1 * 3 5 2 n = 33 n = 100 to 2 2 n = 33 n = 10 1 2 pozitivní 0 2 pozitivní 2 pozitivní median I 25-75% X 10-90% n median 25-75% J 10-90% Q median 25-75% ± 10-90% aptt-la skupina: pozitivní aptt-necitl.la skupina: pozitivní skupina: pozitivní průměr 2,49 2,63 prumer 1,28 1,25 prumer 0,93 1,12 sm.odch. 0,99 1,19 sm.odch. 0,13 0,20 sm.odch. 0,69 0,92 medián 2,37 2,35 medián 1,27 1,20 medián 0,85 0,88 min 1,22 1,38 min 1,09 0,90 min -0,09 0,14 max 5,54 6,50 max 1,76 1,88 max 2,90 4,19
Obr. č.1.10: Srovnání LA negativních pacientů Rozdíly mezi léčenými negativními pacienty (3) a negativními pacienty bez antikoagulační léčby aptt-la aptt-necitl.la Index R, Mannův- Whitneyův U test P < 0,05 Mannův- Whitneyův U test P < 0,05 2 Mannuv- Whitneyův U test P < 0,001 UČ n = 24 n = 100 n = 24 n = 100 íl co O) 1 o n = 24 n = 100 3 negativní o median 25-75% X 10-90% 3 negativní D median 25-75% X 10-90% 3 negativní median 25-75% X 10-90% aptt-la skupina: negativní aptt-necitl.la skupina: negativní skupina: negativní průměr 1,42 1,50 průměr 1,51 1,40 prumer -0,06 0,08 sm.odch. 0,27 0,18 sm.odch. 0,21 0,21 sm.odch. 0,12 0,10 medián 1,40 1,47 medián 1,50 1,36 medián -0,05 0,09 min 1,08 1,26 min 1,28 1,06 min -0,27-0,25 max 2,17 2,11 max 2,04 2,08 max 0,24 0,31
Obr. č. 11.1: Věk ve skupině kontrolní a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami 90r 80 n = 126 Vek (v letech) CD ~. 70 JE 1 -SC 2 50 40 30 n = 64 n medián 25-75% I 10-90% skupina: kontrolní pacienti průměr 41,08 51,67 sm.odch. 12,15 18,90 medián 39 53 min 19 18 max 78 88 20 kontrolní sk. pacienti
Obr. č. 11.2: Hodnota ProCglobal ve skupině kontrolní a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami 1.2 ProCglobal n = 64 1.1 ProCglobal oo @ 1.0 E I) O- 9 Ü S O. 0.8 n = 126 n průměr skupina: kontrolní pacienti průměr 1,10 0,82 sm.odch. 0,25 0,24 medián 1,06 0,81 min 0,68 0,35 0.7 I průměr ± SE max 1,76 1,49 0.6 kontrolní sk. pacienti I 95% Cl
Obr. č. 11.3: Hodnota ProCglobal v kontrolní skupině a u nemocných s antifosfolipidovými protilátkami v závislosti na manifestaci žilní, arteriální trombózy, resp. samovolných potratů Žilní trombózy (MV) Arteriální tromb. (MA) Samovolné potraty (SPA) co 1.2 1.1 í 1-0 n = 64 "«5 Ja n = 96 n = 30 O 0.9 O) Ü o OH 0.8 l x r T 0.7 kontr. MV - MV + n e kontr. MA - M A + kontr. SPA- SPA + D průměr průměr ± SE J 95% CI D průměr průměr ± SE ][ 95% CI D průměr průměr ± SE J 95% Cl ProCglobal ProCglobal ProCglobal skupina: MV MV + skupina: MA - MA + skupina: SPA - SPA + průměr 0,88 0,73 průměr 0,83 0,78 průměr 0,85 0,83 sm.odch. 0,24 0,21 sm.odch. 0,23 0,26 sm.odch. 0,24 0,23 medián 0,89 0,73 medián 0,82 0,77 medián 0,87 0,75 min 0,35 0,35 min 0,35 0,35 min 0,35 0,56 max 1,49 1,36 max 1,49 1,35 max 1,41 1,49
Obr. č. 11.4: Hodnota ProCglobal v kontrolní skupině a u nemocných s lupus antikoagulans a bez tohoto nálezu, s nálezem pozitivity antikardiolipinových protilátek a bez tohoto nálezu, při různé pozitivitě protilátek proti ß 2 -glykoproteinu I Lupus antikoagulans Antikardiolipinové protil. anti ß 2 GP I 1.2 n = 64 o li 75 10 S o O) O 0.9 0.8 i i n = 43 n = 80 TT - -H i kontr. LA - LA + 0.7 kontr. ACLA- ACLA+ abiigpi kontr. neg. sl.poz. poz. D průměr průměr ± SE J 95% CI i 3 průměr průměr ± SE ~ 95% Cl průměr průměr ± SE J 95% Cl ProCglobal ProCglobal ProCglobal skupina: LA LA + skupina: ACLA - ACLA + skupina: negat. sl.pozit. požit. průměr 0,91 0,80 průměr 0,85 0,81 prumer 0,81 0,84 0,84 sm.odch. 0,24 0,24 sm.odch. 0,25 0,23 sm.odch. 0,21 0,40 0,23 medián 0,88 0,80 medián 0,83 0,81 medián 0,84 0,72 0,80 min 0,41 0,35 min 0,40 0,35 min 0,46 0,36 0,47 max 1,49 1,41 max 1,49 1,41 max 1,23 1,41 1,49
Obr. č. 11.5: Hodnota ProCglobal s NR < 0,8 u pacientů bez Leidenské mutace FV a s touto vrozenou trombofilií, a v závislosti na jiných koagulačních odchylkách Leidenská mutace (FV) 0.8 ProCglobal o p bi ó> 0.7 n = 46 0.4 0 3 m n = 13 FVL- FVL + průměr průměr ±SE J 95% CI FV a jiné koag. odchylky 0.8 r 0.7 «5-6 25.o o O 0.5 p 0.4 0.3 n = 32 n = 12 o průměr M průměr ± SE I 95% Cl FVL- FVL- FVL+ FVL+ ost- ost+ ost- ost+ FVL-/ost- FVL-/ost+ FVL+/ost- FVL+/ost+ jen přítomnost antifosfolipidových protilátek průkaz deficitu proteinu C, proteinu S, zvýšení aktivity FVIII nebo jejich kombinace přítomnost Leidenské mutace FV bez další koagulačni odchylky přítomnost Leidenské mutace FV v kombinaci s jinou koagulačni odchylkou ProCglobal ProCglobal skupina: FVL - FVL + skupina: FVL-/ost- FVL-/ost+ FVL+/ost- FVL+/ost+ průměr 0,64 0,51 průměr 0,66 0,59 0,51 0,52 sm.odch. 0,11 0,09 sm.odch. 0,10 0,13 0,10 0,11 medián 0,67 0,49 medián 0,68 0,64 0,54 0,47 min 0,35 0,35 min 0,35 0,36 0,35 0,41 max 0,77 0,66 max 0,77 0,71 0,60 0,66
Obr. č. 11.6: Průměrné hodnoty ProCglobal v kontrolní skupině a skupině pacientů podle pohlaví, u pacientů s antifosfolipidovými protilátkami podle pohlaví a klinické manifestace trombózy (T+); stejná analýza v celém vyšetřovaném souboru ProCglobal podle pohlaví Pacienti s antifosf. protil. Celý soubor o N3 1.3 r 1.2 1.1 «1.0 JO 5*0.9 8-0.8 0.7 0.6 I I n = 38 o průměr = 26 průměr ± SE 95% Cl n i = 84 n = 42 * ženy muži ženy muži kontrola pacienti 1.2 1.1 1.0 1 n o 8 O. 0.8 0.7 0.6 n I = 40 n = 44 * I I n průměr průměr ± SE 95% Cl n = 12 n = 30 T- T+ T- T+ ženy muži 1.2 1.1 1.0 "(5 j O 0.9 O) Ü 2 0.8 Q. 0.7 0.6 n i = 78 f n = 44 T- T+ ženy I í n průměr průměr ± SE 95% Cl n = 38 n = 30»t M é T- T+ muži ProCglobal podle pohlaví ProCglobal u pacientů ProCglobal v celém souboru skup: Ž_k M_k Ž_p M_p skup: T-ž T+ž T-m T+m skup: T-ž T+ž T-m T+m průměr 1,13 1,06 0,85 0,76 průměr 0,94 0,76 0,80 0,74 průměr 1,03 0,76 0,98 0,74 sm.od. 0,27 0,20 0,24 0,23 sm.od. 0,24 0,21 0,12 0,26 sm.od. 0,27 0,21 0,22 0,26 medián 1,12 1,02 0,85 0,71 medián 0,94 0,76 0,83 0,68 medián 0,96 0,76 0,96 0,68 min 0,68 0,78 0,35 0,35 min 0,46 0,35 0,60 0,35 min 0,46 0,35 0,60 0,35 max 1,76 1,58 1,49 1,36 max 1,49 1,22 0,98 1,36 max 1,76 1,22 1,58 1,36
Obr. č. III.1: Manifestace trombózy typu DVT/EP Manifestace DVT/EP o DVT/EP + cenzorovaný případ o OJ 3 1.00 C 0) 1 0.95 a " 0.90 a > 0.85 a 3 E 0.80 3 m 0.75 K*** 3i-iii-iiiiiiii;: ost++ iiiii ni i äii i ii-ii i n it- 20 40 60 80 100 120 140 160 měsíce Do 12 měsíců sledování dochází k DVT/EP u 2,58% pacientů.
Obr. č. III.2: Manifestace trombózy typu SVT Manifestace SVT o SVT + eenzorovaný případ o -1^ 3 1.00 *# c.2 "8 0.95 a O 0.90 a > 0.85 B OHHII KIIHIIIItH I ll-llllllllilllli IIIÜI IIHHH #-* H III I-II-I h E 0.80 3 JZ 0.75 20 40 60 80 100 120 140 měsíce 160 Do 12 měsíců sledování dochází k SVT u 0,86% pacientů.
Obr. č. III.3: Manifestace trombózy v atypické lokalizaci Manifestace AtypT o AtypT + cenzorov aný případ 3 1.00 C.2 I 0.96 a oi'lull ininüjüih ii -»im ÜIÜI mi i i» m-i HI äiii-i-ii-u-i in-i-ii-i h o O 0.90 a > 0.86 jb 3 E 0.80 3 0.76 20 40 60 80 100 120 140 měsíce 160 Do 12 měsíců sledování dochází k manifestaci atypické trombózy u 0,86% pacientů.
Obr. č. III.4: Manifestace trombózy typu CMP Manifestace CMP o O) 3 1.00 a O 0.90 o. > 0.86 3 E 0.80 3 2 0.76 o CMP + cenzorov aný případ K::II::::::::::::M :i :: H I lull MM III I IM IIII <>«-+ ô l-l-l-m-l 1-20 40 60 80 100 120 140 160 měsíce Do 12 měsíců sledování dochází k CMP u 0,43% pacientů.
Obr. č. III.5: Výskyt hypertenze v závislosti na věku pacientů Hypertenze a věk 90 o O > 80 70 60 50 40 30. 20 n = 72 n = 52 É ne ano hypertenze ö median 25-75% I 10-90% skupina: Věk pacientů a hypertenze hypertenze ano hypertenze ne prumer 59,77 43,83 sm.odch. 16,03 18,10 medián 62 40,5 min 20 18 max 91 83 Pacienti s hypertenzí byli starší než pacienti bez hypertenze (Mannův- Whitneyův U test, p<0,001)
Obr. č. 111.6: Hladiny protilátek u pacientů s různými projevy onemocnění Vztah hladiny protilátek a typů onemocnění Hladiny protilátek byly převedeny do semikvantitatívní stupnice (- 0; hran 0,5; + 1;++2; +++3) i o> CM Hladiny protilátek LA, ACLA A, ACLA M, ACLA G, antib2gpi a počet trombocytů byly zařazeny do analýzy jako aktivní proměnné. o 00-0.5 Výskyt onemocnění MV, MA, MO nebo SPA byly zařazeny do analýzy jako pasivní proměnné (tzv. supplementary). -0.5 0.0 0.6 Factor 1 :36.55% aktivní pasivní MV je silně ovlivněna pozitivitou LA a podprůměrným počtem trombocytů.
Obr. č. III.7: Počet trombocytu podle typu protilátek proti trombocytům Počet trombocytu Počet trombocytu v závislosti na typu protilátek o CD 220 200 % O 180 n E S 160 m* o g P 140 120 I n = 38 Q průměr průměr ± SE I 95% Cl n = 34 o Q E Q! 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 i n = 38 n n = 20 n = 6 = 2 n = 6 n průměr H průměr ± SE I 95% Cl 100 Pac. bez protil. s protilátou 0 Pac negativní DIFT ELISA TAT DIFT, ELISA Počet trombocytu Počet trombocytu v závislosti na typu protilátek Pacienti: bez protil. s protil. Pacienti: negat. DIFT ELISA TAT DIFT, ELISA průměr 180,32 128,18 průměr 180,32 132,85 143,50 71,50 116,17 sm.odch. 77,46 60,37 sm.odch. 77,46 61,33 21,80 72,83 79,99 medián 179,5 126,5 medián 179,5 126 136,5 71,5 102,5 min 10 19 min 10 33 125 20 19 max 335 250 max 335 240 183 123 250
Obr. č. 111.8= Počet trombocytů u pacientů s ACLA IgG + a ACLA IgG - Trombocyty a ACLA IgG 350 r 300 n = 60 Počet trombocytů a ACLA IgG 3 * 260 I E 200 p» 160 O Q. 100 60 n = 64 negativní pozitivní ACLA G n median 25-75% I 10-90% skupina: ACLA IgG - ACLAlgG + průměr 191,72 151,73 sm.odch. 99,12 62,00 medián 175,5 154 min 19 10 max 693 274 Počet trombocytů se u pacientů s pozitivními a negativními protilátkami ACLA IgG lišil (Mannův-Whitneyův U test; p 0,033).
- m - 3 3 rg Ä V Ol # M : ž 9 O (Q (O B) Relativní počet hodnot INR < 2 (%) -o s V Q> r or 1 > o s L TJ Cfl< f S ši IT u # * CD r- *< > < CD CA o Ol C» O u Ol 3 II I i. CO Relativní počet hodnot INR > 3 (%) * «* M M U G» Ä. O O l O O l O O l O O l O a median 25-75% X 10-90% LA pozit. LA negat. I n = 13 Mannůvn = 13 Whitneyův U test P > 0,05 D 3 5' 3 IO Ol I CD O 1 3 (D CD 0> Relatívni počet hodnot INR mimo cílový interval (%) š 3 V 0) P 3 g- CD C» < C čí c«o c» o G 3 w 0> o -4 o
-zu- Odchylka od cílové hodn. (INR < 2) < a o o p p p 13 ' * hi iů U Ot Mannův-Whitneyův U test P > 0,05 n = 13 n = 13 LA pozit. LA negat. n median 25-75% X 10-90% Odchylka od cílové hodn. (INR > 3) n I m ro O N Ol ö. X, r* Ol * I 3 (Q o b Odchylka od cílového intervalu (INR < 2 a INR > 3) o o k» CO m- n o č» o» v sr 3 1 s O»? T 0 (D C» 01 *< < C» ' <
Obr. č. IV.3: Hodnoty INR mimo cílový interval podle klinické významnosti odchylky Porovnání relativního počtu hodnot INR mimo cílový interval podle klinické významnosti odchylky u LA pozitivních a LA negativních pacientů LA pozitivní LA negath mí rni V? «v" *,- fc;r v- Interval INR Obrázek znázorňuje procentuální zastoupení hodnot INR mimo terapeutické hodnoty protrombinového času (menší než 2 nebo větší než 3) zjištěných u LA pozitivních a LA negativních pacientů.
Obr. č. IV.4: Doba náležité antikoagulační léčby v cílovém intervalu INR Doba v cílovém intervalu I 3" 100 tu (O >u 90 0) u N E li JO 'S > o 80 70 60 60 40 n = 13 LA pozit. n = 13 LA negat. n median 25-75% I 10-90% Doba v cílovém INR (v %) skupina: LA pozit LA negat průměr 72,45 70,00 sm.odch. 16,77 11,92 medián 76,82 73,07 min 44,75 49,94 max 94,30 85,02 K určení času strávenému v cílovém INR jsme dobu, za níž došlo k docílení náležité hladiny po jejím vychýlení, určili pomoci lineární interpolace mezi dvěma hodnotami INR LA pozitivní pacienti strávili v cílovém INR průměrně 273 dnů (72,5 % z celkového času), LA negativní pacienti 270,0 dnů (70,0%). Celkový čas, který pacienti strávili v cílovém INR, se mezi skupinou pozitivních a negativních pacientů statisticky nelišil (Mannův-Whitneyův U test, P > 0,05).
Obr. č.lv.5: Porovnání dávky warfarinu Dávka warfarinu o O) E, 3 C c (0 (B Q 70 60 50 40 30 20 10 n = 13 n = 13 ^ H i a median 25-75% I 10-90% Dávka warfarinu (mg/týden) skupina: LA pozit LA negat průměr 34,54 42,12 sm.odch. 15,64 19,76 medián 35 40 min 15 10 max 72,5 77,5 MÍ LA pozit. LA negat. f 7/ I* Průměrná dávka warfarinu podávána pozitivním pacientům byla 34,5 mg/týden, negativním pacientům 42,1 mg/týden. Udržovací dávka warfarinu vyjádřená počtem miligramu warfarinu za týden se mezi skupinou pozitivních a negativních pacientů statisticky nelišila (Mannův-Whitneyův U test, P > 0,05).