Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Kód K4000 115 ml Kód K4001 110 ml Použití In vitro diagnostikum. Tento návod platí pro výrobek Dako EnVision+ System-HRP. Tento výrobek je určen k používání v kombinaci s myšími primárními protilátkami dodanými uživatelem ke kvalitativní identifikaci antigenů pomocí světelné mikroskopie v normálních a patologických tkáních zalitých do parafínu, kryostaticky zpracovaných tkáních a buněčných preparátech. Lze použít tkáně zpracované pomocí různých fixačních prostředků, mezi něž může patřit etanol, fixační roztok B-5, Bouinův fixační roztok, vodný roztok formaldehydu a zinku a neutrální pufrovaný formalín. V části Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení nebo v části Pokyny pro detekční systémy v imunohistochemických postupech naleznete následující kapitoly: (1) Princip metody, (2) Potřebný materiál, který není součástí dodávky, (3) Uchovávání, (4) Příprava vzorků, (5) Postup barvení, (6) Kontrola jakosti, (7) Odstraňování problémů, (8) Interpretace barvení, (9) Obecná omezení Souhrnné informace a vysvětlení EnVision+ System-HRP je dvoustupňová imunohistochemická metoda barvení. Tento systém je založen na polymeru značeném křenovou peroxidázou (HRP), konjugovaném se sekundárními protilátkami. Značený polymer neobsahuje avidin ani biotin. Proto jsou eliminovány nebo výrazně redukovány nespecifické výsledky barvení, vznikající v důsledku endogenní avidin-biotinové aktivity v játrech, ledvinách, lymfatické tkáni a kryostatických řezech. Činidlo pro systém Dako EnVision+ System-HRP je ve stavu "ready-to-use", neboli připraveno k okamžitému použití. Tento systém představuje extrémně citlivou metodu a v důsledku toho jsou optimální ředění primární protilátky až dvacetkrát vyšší než ředění používaná při tradiční technice s využitím komplexu peroxidáza anti-peroxidáza (PAP) a nikolikrát vyšší než ředění používaná pro tradiční metody jako je ABC nebo metoda používající značený streptavidin-biotin (LSAB). Tento protokol nabízí vylepšený systém generování signálů sloužících k detekci antigenů přítomných v nízkých koncentracích nebo primárních protilátek s nízkým titrem. Primární protilátky produkované myšmi dobře reagují se značeným polymerem. Interpretace jakéhokoli pozitivního zbarvení nebo jeho nepřítomnosti by měla být doplněna morfologickými a histologickými studiemi s použitím vhodných kontrol. Principy metody Dodaná činidla Veškerá endogenní peroxidázová aktivita se potlačí inkubací vzorku s vhodným činidlem, blokujícím endogenní peroxidázu. Vzorek je pak inkubován se zředěnou myší primární protilátkou s vhodnými charakteristikami. Poté následuje inkubace se značeným polymerem, skládající se ze dvou po sobě následujících třicetiminutových inkubací. Je třeba si uvědomit, že pro protilátky vyžadující natrávení pomocí enzymů nebo odmaskování cílové struktury může být potřebné prodloužit časy inkubace s primární protilátkou a značeným polymerem o 5 až 10 minut. Barvení je dokončeno po 5 až 30 minutách inkubace s vhodnou kombinací substrát-chromogen. Kód K4000: Následující materiál stačí pro 150 tkáňových řezů při 100 µl na jeden řez. Množství 1x15 ml Popis Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti myším protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo. Kód K4001: Následující materiál stačí pro 1100 tkáňových řezů při 100 µl na jeden řez. Množství 1x110 ml Popis Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti myším protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo. (107507-004) 302059CZ_003 str. 1/6
Potřebný materiál, který není součástí dodávky Absorpční materiál pro otírání Kontrolní tkáň, pozitivní a negativní Kontrastní barvivo, na vodné bázi, jako například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho. (kód S3309) Krycí sklíčka Destilovaná voda Etanol, absolutní a 95% Světelný mikroskop (20x 800x) Média pro fixaci mikroskopického preparátu, jako například Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo fixační médium na bázi vody Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964) Primární protilátky a negativní kontrolní činidlo Podložní sklíčka, potažená poly-l-lysinem nebo silanizovaná (kód S3003) Barvící lázně nebo nádobky Časovač (kde je možné nastavit 3 až 40minutové intervaly) Promývací láhve Roztok promývacího pufru Xylen, toluen nebo náhrady xylenu Pro systémy K4000 nebo K4001 EnVision+, Peroxidase jsou navíc k výše uvedenému potřebná následující činidla: Činidlo blokující endogenní peroxidázu, např. Dual Endogenous Enzyme Block (kód S2003) Roztok substrát-chromogenu, např. AEC+ Substrate-Chromogen (kód K3469) 110 ml, ready-to-use) nebo Liquid DAB+ (kód S2002) Potřebné doplňkové materiály, které nejsou součástí dodávky Hydroxid amonný, 15 mol/l, zředěný na 0,037 mol/l PAP Pen (kód S2002) Upozornění Příprava činidel 1. Pouze pro profesionální uživatele. 2. Nepoužívejte činidla po datu expirace platném pro předepsanou metodu uchovávání. Jsou-li činidla uchovávána v jakýchkoli jiných podmínkách než je uvedeno na příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich validaci. 3. Nenahrazujte činidla činidly z jiných šarží nebo činidly ze systémů vyráběných jinými výrobci. 4. Pokud vystavíte enzymy nebo substrát-chromogen nadměrnému osvětlení, může je to negativně ovlivnit. Neuchovávejte součásti kitu v prostředí se silným osvětlením jako například na přímém slunečním světle, ani za takových podmínek neprovádějte barvení. 5. Jiné časy inkubace a inkubační teploty než ty, které jsou zde uvedeny, mohou být příčinou chybných výsledků. Jakékoli změny tohoto druhu musí uživatel validovat. 6. Stejně jako u jiných výrobků z biologických zdrojů i zde dodržujte správné postupy zacházení. 7. Aby nedošlo ke kontaktu s očima a kůží, používejte vhodné osobní ochranné pomůcky. 8. Nespotřebované roztoky je třeba zlikvidovat v souladu s místními, celostátními, případně federálními předpisy. Před barvením je vhodné připravit si následující činidla. Roztok promývacího pufru Doporučeným promývacím pufrem pro automatickou a manuální imunohistochemickou detekci je TBST, 0,05 mol/l, fyziologický roztok pufrovaný Tris s Tween (kód S3006). TBS, 0,05 mol/l fyziologický roztok pufrovaný Tris (kód S1968) a PBS, 0,02 mol/l fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (kód S3024) jsou rovněž vhodné roztoky promývacích pufrů pro ruční barvení. Nedoporučuje se používat roztoky promývacích pufrů obsahující azid sodný. Azid sodný inaktivuje peroxidázu (HRP), což má za následek negativní zbarvení. Nepoužitý pufr skladujte při teplotě 2 až 8 C. Pokud je pufr zakalen, zlikvidujte jej. Pro vypláchnutí činidla blokujícího peroxidázu, substrátu a kontrastního barviva lze použít destilovanou vodu. Primární protilátka Protilátky NP-Series Plus typu ready-to-use jsou optimalizovány pro použití při práci s vysoce citlivými detekčními systémy Dako Plus a jejich použití v kombinaci s těmito systémy se doporučuje. Společnost Dako dodává rovněž koncentrované protilátky. Optimalizaci koncetrovaných protilátek zajistí koncový uživatel. Zředěné roztoky je třeba připravit za použití roztoku pro ředění protilátek Antibody Diluent (kód S0809) nebo roztoku pro ředění, který obsahuje 0,05 mol/l pufr Tris-HCI a 1% hovězí sérový albumin (BSA). Protilátky Dako N-Series typu ready-to-use nejsou optimalizovány pro použití při práci s detekčními systémy Dako plus. Pro většinu primárních protilátek používaných při práci s tímto kitem je dostačující inkubační dobou 30 minut. Negativní kontrolní činidlo Při použití protilátek Dako NP-Series Plus typu ready-to-use se doporučuje používat jako negativní kontrolní činidlo Universal Negative Control+ (kód NP015), které je optimalizováno pro použití s myšími protilátkami NP- Series Plus typu ready-to-use. (107507-004) 302059CZ_003 str. 2/6
V ideálním případě obsahuje negativní kontrolní činidlo protilátku, která nevykazuje žádnou specifickou reaktivitu s lidskými tkáněmi nebo s normálním/neimunním sérem ve stejné matrix/roztoku jako zředěná primární protilátka. Negativní kontrolní činidlo by mělo mít stejnou podtřídu a mělo by pocházet od stejného živočišného druhu jako primární protilátka, mělo by být zředěno na stejnou koncentraci imunoglobulinu nebo proteinu jako zředěná primární protilátka a mělo by být ředěno pomocí stejného roztoku pro ředění. Čas inkubace pro negativní kontrolní činidlo by měl odpovídat času inkubace primární protilátky. Kontrastní barvivo Barevný konečný produkt barvicí reakce je rozpustný v alkoholu. Při této metodě by se vždy mělo používat barvení kontrastním barvivem na vodné bázi, jakým je například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho (kód S3309). Kotrastní barvení hematoxylinem by mělo být následováno důkladným propláchnutím destilovanou vodou a ponořením sklíček s tkání do lázně 0,037 mol/l amoniaku nebo podobného modřidla. Vodný roztok amoniaku 0,037 mol/l se připraví smícháním 2,5 ml (koncentrovaného) 15 mol/l hydroxidu amonného s 1 litrem vody. Nepoužitý 0,037 mol/l amoniak lze uchovávat při pokojové teplotě (20 25 C) v pevně uzavřené láhvi po dobu maximálně 12 měsíců. Jiné postupy pro kontrastní barvení jsou uvedeny v pokynech výrobce. Fixační média Pro fixaci ve vodném médiu se doporučuje Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025). Glycergel je třeba těsně před použitím zahřát na teplotu nejméně 50 C. Je rovněž možné použít bezvodé permanentní fixační médium Ultramont (kód S1964). Uchovávání EnVision+ System-HRP uchovávejte při teplotě 2 8 C. Nevystavujte mrazu. Nepoužívejte po datu e xpirace uvedeném na lahvičkách s činidlem a na etiketě produktu. Změna vzhledu kteréhokoli činidla, jako například precipitace, může znamenat nestabilitu nebo zhoršení vlastností. V takovém případě nemají být činidla používána. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými příznaky. Testujte proto současně se vzorky od pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde ke zbarvení neočekávaného typu, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s kitem, kontaktujte službu technické podpory společnosti Dako. Příprava vzorků Tkáňové řezy zalité do parafínu Informace naleznete naleznete v části Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení anebo ve specifikacích protilátek. Před imunohistochemickým barvením je třeba tkáně fixovat a zpracovat. Fixace zabraňuje autolýze a hnilobě odebraných tkání, zachovává antigenní vlastnosti, zvyšuje index lomu součástí tkání a zvyšuje odolnost buněčných elementů při zpracování tkání. Postupy pro zpracování tkání zahrnují dehydrataci, odstranění dehydratačních činidel, infiltraci média pro zalévání, vlastní zalití a přípravu tkáňových řezů. Popis fixačních prostředků nejběžněji používaných při přípravě tkání pro imunohistochemické barvení je uveden v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Jedná se však pouze o obecné pokyny. Optimální postupy musí stanovit uživatel. Uživatel rovniž musí provést jejich verifikaci. (Specifické informace o fixaci a zpracování tkání uvádí literární odkazy číslo 1 a 2.) Postup barvení Poznámky k postupu Před použitím by si měl uživatel tyto pokyny pečlivě přečíst a seznámit se s obsahem produktu. Dodaná činidla a pokyny byly vyvinuty tak, aby poskytovaly optimální výsledky. Další ředění činidel, jež jsou součástí produktu, nebo změna doby nebo teploty inkubace mohou být příčinou chybných výsledků. Všechna činidla by měla být před imunologickým barvením temperována na laboratorní teplotu (20 25 C). Podobně všechny inkubace by měly být prováděny při laboratorní teplotě. Tkáňové řezy nesmí během barvení vyschnout. U vyschlých tkáňových řezů může dojít ke zvýšenému nespecifickému barvení. Pokud jsou sklíčka vystavena průvanu, přikryjte je. Pokud použijete prodlouženou inkubaci, umístěte tkáně do vlhkého prostředí. Citlivost systému EnVision+ System-HRP lze dále zvýšit prodloužením doby inkubace v kroku 2 a 3 o 5 až 10 minut. Protokol barvení KROK 1 PEROXIDASE BLOCK (ČINIDLO BLOKUJÍCÍ PEROXIDÁZU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru. Pomocí materiálu, který nepouští vlákna (jako například gázové tampony nebo tampony Kimwipe) pečlivě otřete okolí vzorku, aby se odstranila zbývající tekutina a činidla zůstala pouze ve zpracovávané oblasti. Naneste takové množství činidla blokujícího peroxidázu, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 5 (±1) minut. (107507-004) 302059CZ_003 str. 3/6
Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou nebo roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. KROK 2 PRIMÁRNÍ PROTILÁTKA NEBO NEGATIVNÍ KONTROLNÍ ČINIDLO Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství optimálně ředěné primární protilátky nebo negativního kontrolního činidla, aby byl vzorek pokryt Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Jemně vzorek opláchněte roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. Pokud je nutné barvení přerušit, je možné ponechat sklíčka po inkubaci primární protilátky v pufrové lázni (krok 2) při laboratorní teplotě (20 25 C) maximálně po dobu jedné hodiny, aniž by byly výsledky barvení ovlivněny. KROK 3 LABELLED POLYMER-HRP ANTI-MOUSE Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství značeného polymeru, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Opláchněte sklíčka stejným způsobem jako v kroku 2. KROK 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN (SUBSTRÁT-CHROMOGEN) Otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství roztoku substrát-chromogen, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 5-30 minut. Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň). Použitý roztok substrát-chromogen shromažďujte v nádobce na nebezpečné materiály, aby mohl být zlikvidován náležitým způsobem. KROK 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (KONTRASTNÍ BARVIVO) (volitelný krok) Ponořte sklíčka do lázně vodného hematoxylinu (kód S3309). Délka inkubace závisí na koncentraci použitého hematoxylinu. Jemně sklíčka opláchněte v lázni s destilovanou vodou. Ponořte sklíčka 10krát do lázně 0,037 mol/l amoniaku nebo podobného modřidla Oplachujte sklíčka v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou po dobu 2-5 minut. KROK 6 FIXACE MIKROSKOPICKÉHO PREPARÁTU Vzorky lze fixovat na sklíčka a pokrýt krycími sklíčky s použitím fixačního média na bázi vody jako je například Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo fixační médium Faramount (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Non-aqueous permanent mounting medium, Ultramount (kód S1964). Poznámka: Sklíčka lze prohlížet kdykoli. Pokud však jsou sklíčka vystavena silnému světlu po dobu jednoho týdne, mohou preparáty poněkud vyblednout. Aby bylo vyblednutí minimální, uchovávejte sklíčka v temnu při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola jakosti Odlišnosti při zpracování tkání a technických postupech používaných v laboratoři uživatele mohou být příčinou signifikantní proměnlivosti výsledků, takže kromě níže uvedených postupů je nutné pravidelné provádění kontrolních vyšetření v rámci příslušného pracoviště. Další informace naleznete v pokynech týkajících se kontroly jakosti v certifikačním programu organizace College of American Pathologists (CAP) pro imunohistochemii a v literárních odkazech 3 až 5. Podrobnosti týkající se citlivosti a imunoreaktivity naleznete ve specifikacích jednotlivých primárních protilátek. Další informace o pozitivních a negativních kontrolách naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Interpretace barvení Omezení Pokyny týkající se interpretace naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Informace o obecných omezeních naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Použití starých nebo nepufrovaných fixačních prostředků nebo vystavení tkání nadměrně vysoké teplotě (vyšší než 60 C) v průběhu zpracovávání může mít za následek sníženou citlivost pro barvení. V hemoproteinech, jako je například hemoglobin, myoglobin, cytochrom a kataláza, a rovněž v eosinofilech lze zjistit aktivitu endogenní peroxidázy nebo pseudoperoxidázy. 6,7 Tuto aktivitu lze zablokovat inkubací vzorků s činidlem blokujícím peroxidázu (Peroxidase Block) po dobu pěti minut před nanesením primární protilátky. Toto činidlo lze rovněž použít pro krevní roztěry, roztěry kostní dřeně a zmrzlé tkáně. Tento postup však neodstraní červenohnědý pigment hemoproteinů. Jako alternativu lze použít roztok metanolu a peroxidu vodíku. Při použití tohoto postupu může dojít k denaturaci některých antigenů. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy typu B, obsahující povrchový antigen viru hepatitidy B (HbsAg), se mohou nespecificky barvit křenovou peroxidázou. 8 (107507-004) 302059CZ_003 str. 4/6
Pokud jsou jako sekundární antiséra v blokačních krocích použita normální a neimunní séra stejného živočišného druhu, mohou být příčinou falešně negativních nebo falešně pozitivních výsledků, způsobených autoprotilátkami nebo přirozenými protilátkami. Činidla dodaná v tomto kitu byla optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu schopnosti detekovat antigeny. Odstraňování problémů Problém Pravděpodobná příčina Navrhovaná akce 1. Žádné sklíčko není vybarveno. 1a. Činidla nebyla použita ve správném pořadí. 1b. Azid sodný. 1a. Zkontrolujte aplikaci činidel. 1b. Použijte čerstvý pufr bez azidu. 2. Slabé vybarvení všech sklíček. 2a. Po promytí zůstalo v řezech příliš mnoho roztoku. 2a. Jemným poklepáním odstraňte přebytek roztoku a pak otřete okolí řezu. 2b. Sklíčka nebyla inkubována 2b. Je třeba zkontrolovat 3. Nadměrné zbarvení pozadí u všech sklíček. dostatečně dlouho. 3a. Vzorky mají vysokou aktivitu endogenní peroxidázy. 3b. Nebyl úplně odstraněn parafín. 3c. Řezy nebyly pořádně opláchnuty. 3d. Reakce substrátu byla rychlejší než obvykle například kvůli příliš vysoké laboratorní teplotě. 3e. Řezy během barvení vyschly. 3f. Nespecifická vazba činidel na tkáňové řezy. 3g. Protilátka je příliš koncentrovaná. inkubační časy. 3a. Použijte delší čas inkubace s činidlem blokujícím peroxidázu. 3b. Použijte čerstvou xylenovou nebo toluenovou lázeň. Pokud barvíte několik sklíček současně, druhá xylenová lázeň by měla obsahovat čerstvý xylen. 3c. Používejte čerstvé roztoky pro pufrové lázně a promývání. 3d. Použijte kratší čas inkubace s roztokem substrátchromogen. 3e. Použijte vlhkou komůrku. Před aplikací činidla otřete současně pouze tři až čtyři sklíčka. 3f. Použijte blokující roztok, který obsahuje irelevantní protein. 3g. Použijte více naředěnou primární protilátku. POZNÁMKA: Pokud nelze vznik problému připsat žádné z výše uvedených příčin nebo pokud navrhovaná nápravná akce jako řešení problému selže, obraťte se s žádostí o další pomoc na službu technické podpory společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků lze najít v následujících pramenech: Handbook - Immunochemical Staining Methods 2 (dostupné u společnosti Dako), Atlas of Immunohistology 9 a Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 Literatura 1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81 2. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 (107507-004) 302059CZ_003 str. 5/6
Doplňková literatura Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 11/12 (107507-004) 302059CZ_003 str. 6/6