RCD s.r.o. Americká 632 252 29 Dobichovice DI": CZ47052511 VLIV PREPARÁTU BIOCOL NA RST LIDSKÉHO KARCINOMU COLON (LINIE HCT 116) U NU/NU MY"Í Zadavatel: ASCOLOR-BIOTEC s.r.o. #ídící pracovník studie: Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc Vedoucí pokusu: RNDr. Marie Zadinová Technická spolupráce: Eleonora Wenclová, Milena Altnerová, Olga Tachecí Kontrolovala: Ing. Jiina Polívková, CSc Zprávu vypracovaly: Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc RNDr. Marie Zadinová Provedeno v RCD s.r.o. ve dnech 9. 6. 2005-18. 8. 2005
VLIV PREPARÁTU BIOCOL NA RST LIDSKÉHO KARCINOMU COLON (LINIE HCT 116) U NU/NU MY"Í 1. Cíl studie: Cílem pedkládané studie bylo stanovit protinádorov% ú$inek preparátu BIOCOL na r&st lidského karcinomu colon (linie HCT 116) subkutánn' (s.c.) transplantovaného do podko(í nu/nu my)í. 2. Materiál a metody 2.1. Testovaná látka: BIOCOL #$%&'()#'*+*$,'-./+012%1'-+3.0-.,45+60$7&89 :)#' ;.*2,' 6+*#.,$-+*8 *+*',45+ <'*'-'%.#.19 =6#>&+-',? 0+<%+& @. 6;>60'-+-'# (.<60+@%;.*,2 6;.* &'A*+8 '6#>&'BCD ()# ;.*2, 6>%,+8 -+*+8D '6#>&+-$,()#*.,,26.0+0$#,2E69+9F-*$-B."GH1IJ&IDEG1IJ"HIFD-+(K.18HD" 1#J"HIELH1#J&IF%2#.@,451+%,+@%>9 M+,%0+#,C1 @&86>,$1 ()# '6#>&+-$, *.,,2 D 69+9D @5+*,? +(K.1 6>%,4 -+*) EHD"1#J"HIDLH1#J&I%2#.@,451+%,+@%>F9 2.2. Nádorové linie M 6+&8@8 ()#' 6+8A>%' #>*@&$,$*+0+-$ #>,>. &'0B>,+18 B+#+, ENOPQLLRFD ()#' 60>1$0,2<C@&$,'<S-0+6@&4,$*+0+-4(',&)SO=OOES80+6.',O+##.B%>+,+/O.## O8#%80.@DO=TUDV'#>@('0)DW>#%@5>0.VXYZ[\D],>%.*M>,I*+1F9^%&$_+-4&8#%8;. ()#' %'%+,$*+0+-$ #>,>.,'1,+A.,' ',8J,8 1)7C1 ()#+ @9B9 '6#>&+-$,+ #`#Z a,$*+0+-?b5(8,2&@6+#.3,2@hd#1#t'%0>i.#8q,'60'-?(+&1)7>9 2.3. Laboratorní zví#ata K pokusu byly pou(ity outbrední nu/nu my)i kmene CD-1, samice, t'lesné hmotnosti 18-20g, celkem 32 ks, 16 my)í pokusn%ch a 16 my)í kontrolních (Dodavatel: AnLab s.r.o. Praha). My)i byly chovány v air laminal flow boxech KAT- F/SZ-1000 (AnLab s.r.o.), podest%lány radia$n' sterilizovanou podest%lkou (SAWI Research Bedding, AnLab s.r.o.praha), krmeny radia$n' sterilizovanou dietou ST-1 (AnLab s.r.o. Praha) a napájeny autoklávovanou vodou ad libitum. "
2.4. Vlastní postup Den ped zahájením podávání terapeutické látky BIOCOL (den 0) byla 3 my)ím odebrána krev z o$ního plexu a byl stanoven v%chozí krevní obraz. Za 24 hodin po odb'ru bylo nu/nu my)ím CD-I zahájeno perorální podávání preparátu BIOCOL po dobu 10 dní. (Pokusn%m my)ím bylo peroráln' sondou aplikováno 250 mg/kg preparátu BIOCOL), 11. den byly nu/nu my)ím s.c. inokulovány nádorové bu*ky, na prav% bok my)i, a to v po$tu 1 x 107/my). Po inokulaci nádorov%ch bun'k bylo plynule pokra$ováno v terapii preparátem BIOCOL u pokusné skupiny, kontrolním my)ím byl po stejnou dobu sondou podáván shodn% objem pitné vody. Pokus byl ukon$en 36. den po zahájení perorálního podání preparátu BIOCOL. Pokusná skupina: P1 16 outbredních nu/nu my)í kmene CD-I, s.c. ca colon- linie HCT116 + p.o. 250 mg/kg látky BIOCOL. Kontrolní skupina: K1 16 outbredních nu/nu my)í kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT 116 + p.o. pitná voda Rostoucí nádory byly v pr&b'hu pokusu ka(d% 3.-4. den m'eny a byl kalkulován objem rostoucího nádoru podle vzorce V= a x b2 x Jt/6, kde a = délka tumoru, b = )íka tumoru. Sou$asn' byly my)i ka(d% 3. 4. den vá(eny. Pokus byl ukon$en 36. den po zahájení terapie. 2.5. Hodnocení pokusu Hodnocení pokusu bylo provedeno na základ' porovnám r&stov%ch kivek tumor& u pokusné skupiny - ve srovnání se skupinou kontrolní. V pr&b'hu a na konci pokusu bylo spo$ítáno % inhibice r&stu nádoru - %TGI (tumor growth inhibition), pro pr&m'rn% objem tumoru, (%TGI = (1 -(pr&m'rn% objem tumoru v lé$ené skupin'/pr&m'm% objem tumoru v kontrolní skupin')) x 100. Získané v%sledky byly statisticky hodnoceny neparametrick%m oboustrann%m Studentov%m t-testem. V pr&b'hu pokusu a na konci pokusu byla provedena fotodokumentace ú$innosti terapie ve srovnání s kontrolní skupinou. b
3. V$sledky a diskuze Získané v%sledky jsou uvedeny v tabulkách $. 1-11 a na grafech $. 1-9 Pokusná skupina: 16 outbredních nu/nu myí kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT116 + p.o. 250 mg/kg látky BIOCOL Kontrolní skupina: 16 outbredních nu/nu myi kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT 116 + pitná voda Preparát BIOCOL po preventivním perorálním podání 10 dní ped s.c. aplikací nádorov%ch bun'k a následn' denn' podávan% i po jejich aplikaci - prodlu(oval statisticky v%znamn' dobu latence nár&st& ca colonu (HCT -116) u pokusn%ch nu/nu my)í, v pr&m'ru o 7,93 dne na 18,56 dne (o 74%) na 174,6% proti kontrolní - nelé$ené skupin', v které byl nár&st tumoru zji)t'n za 10,63 dne (100%) (Tab. 1,2, grafy 1,2) Preparát BIOCOL $áste$n' inhiboval r&st lidského karcinomu colon, linie HCT- 116 na nu/nu my)ích. Dosa(ená inhibice byla statisticky v%znamná od 18. do 36. dne pokusu, a to na 1% hladin' v%znamnosti. Dosa(ené % inhibice r&stu tumoru proti kontrolní skupin' bylo (%TGI) 18. den pokusu 64,4%, 22. den pokusu 56,1%, 25. den 53,8%, 29. den 47,04%, 32. den 39,53%, 36. den 31,61%. (Tab. 3,4,5,6,7 grafy 3,4,5,6) V pípad' sledování vlivu preparátu BIOCOL na hmotnost nu/nu my)í, dávka 250 mg/kg vyvolávala ztrátu t'lesné hmotnosti pokusn%ch nu/nu my)í a po 5. t%dnu podávání i r&(ov'- $ervené zbarvení poko(ky nu/nu my)í. Ztráta t'lesné hmotnosti nu/nu my)í byla statisticky v%znamná na 1% hladin' v%znamnosti od 11. dne do 36. dne terapie (Tab.8,9,10,11 grafy 7,8,9) Z v"sledku je z#ejmé, $e preparát BIOCOL %áste%n& inhiboval r'st lidského karcinomu colon u nu/nu myí, zvlát& p#ízniv& se projevil efekt preventivního podávání preparátu od prvního dne pokusu jet& p#ed transplantací nádorov"ch bun&k. S p#ib"vající dobou podávání preparátu se % dosa$ené inhibice inhibice r'stu tumoru postupn& sni$ovalo. Podle vzhledu myí p#edpokládáme, $e dolo k p#edávkování podávaného preparátu (viz foto). Y
4. Záv%ry a) Preventivní podávání preparátu BIOCOL 10 dní ped s,c. inokulací nádorov%ch bun'k (následn' denn' podávan% i po jejich aplikaci), statisticky v%znamn' prodlu(ovalo dobu latence s.c. nár&st& ca colon - linie HCT-116 u pokusn%ch nu/nu my)í proti kontrolní skupin', a to o 74%. (o 7,93 dne). b) Preparát BIOCOL m'l statisticky v%znamn% inhibi$ní ú$inek na s.c. r&st lidského ca colon linie HCT 116 u nu/nu my)í kmene CD-I. 18. den pokusu bylo dosa(eno 64,4% inhibice r&stu tumoru proti kontrolní skupin' c) S pib%vající dobou podávání preparátu BIOCOL se % dosa(ené inhibice r&stu tumoru postupn' sni(ovalo, 36. den bylo dosa(eno 31,61% inhibice tumoru proti kontrolní skupin'. d) Preparát BIOCOL v podávané denní perorální dávce 250 mg/kg statisticky v%znamn' sni(oval t'lesnou hmotnost pokusn%ch my)í. V Praze dne 15. 9. 2005 Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc. RCD spol. s r.o. G
my doba latence (dny) ": kontroly pokusné 1 11 18 2 15 18 3 11 18 4 11 18 5 8 22 6 11 18 7 8 18 8 8 18 9 11 18 10 8 22 11 15 18 12 8 18 13 11 18 14 11 18 15 8 15 16 15 22 pr#m$r. hodnota 10,63 18,56 sm$rodat. odchylka 2,5 1,8 vyjád%ení In % 100 174,6 Tab. 1 : asov" interval mezi transplantací nádorov"ch bun#k (den 1) a nár$stem m#%iteln"ch nádor$. Testovan" preparát BIOCOL se za&al aplikovat 10 days p%ed transplatací nádorov"ch bun#k karcinomu colon HCT 116
vypo&ítaná hodnota doba latence hladina v"znamnosti kontroly: pokusné 1,31 x 10-10 1 Tab. 2 : Statistické hodnocení doby latence po transplantaci nádorov"ch bun#k. Pokusn"m my'ím byl podáván testovan" preparát BIOCOL. Student$v t test. Colon HCT 116. 1 = 1% hladina v"znamnosti
den pokusu - 3 ) 1 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 1 0 0 0 0 0 0,113 0,132 0,15 0,256 0,397 0,529 2 0 0 0 0 0 0,087 0,132 0,192 0,265 0,445 0,575 3 0 0 0 0 0 0,118 0,144 0,192 0,294 0,572 0,721 4 0 0 0 0 0 0,085 0,103 0,16 0,218 0,285 0,59 5 0 0 0 0 0 0 0,087 0,132 0,205 0,23 0,269 6 0 0 0 0 0 0,103 0,144 0,245 0,346 0,472 0,657 7 0 0 0 0 0 0,132 0,232 0,268 0,302 0,429 0,728 8 0 0 0 0 0 0,095 0,155 0,205 0,34 0,47 0,796 9 0 0 0 0 0 0,079 0,122 0,205 0,268 0,403 0,664 10 0 0 0 0 0 0 0,111 0,192 0,279 0,445 0,628 11 0 0 0 0 0 0,118 0,155 0,218 0,302 0,445 0,654 12 0 0 0 0 0 0,113 0,144 0,23 0,366 0,543 0,75 13 0 0 0 0 0 0,126 0,15 0,199 0,279 0,323 0,509 14 0 0 0 0 0 0,119 0,177 0,23 0,575 0,98 1,227 15 0 0 0 0 0,085 0,132 0,23 0,319 0,397 0,488 0,53 16 0 0 0 0 0 0 0,122 0,192 0,319 0,436 0,551 hodnota 0 0 0 0 0,05 0,089 0,148 0,209 0,313 0,462 0,649 odchylka 0,045 0,039 0,045 0,087 0,164 0,192 Tab. 3: BIOCOL. HCT 116.
den pokusu - 3 ") 1 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 1 0 0 0 0.095 0,132 0,199 0,302 0,352 0,466 0,706 0,855 2 0 0 0 0 0,132 0,177 0,23 0,265 0,416 0,68 0,83 3 0 0 0 0,095 0,142 0,221 0,279 0,359 0,403 0,466 0,549 4 0 0 0 0,103 0,235 0,302 0,466 0,601 0,796 0,98 1,288 5 0 0 0,087 0,179 0,221 0,359 0,523 0,728 0,934 1,238 1,595 6 0 0 0 0,113 0,192 0,205 0,285 0,359 0,466 0,721 0,98 7 0 0 0,072 0,132 0,155 0,179 0,221 0,285 0,359 0,488 0,606 8 0 0 0,132 0,192 0,256 0,282 0,359 0,488 0,551 0,692 0,83 9 0 0 0 0,095 0,141 0,177 0,279 0,403 0,466 0,523 0,575 10 0 0 0,141 0,235 0,302 0,378 0,454 0,635 0,83 1,023 1,336 11 0 0 0 0 0,111 0,188 0,199 0,235 0,382 0,466 0,606 12 0 0 0,092 0,179 0,294 0,338 0,473 0,732 0,886 1,149 1,383 13 0 0 0 0,113 0,205 0,268 0,321 0,435 0,575 0,791 0,95 14 0 0 0 0,087 0,179 0,268 0,285 0,382 0,472 0,606 0,796 15 0 0 0,111 0,177 0,205 0,268 0,403 0,523 0,728 0,855 1,023 16 0 0 0 0 0,132 0,198 0,319 0,448 0,728 0,83 0,98 hodnota 0 0 0,106 0,138 0,19 0,25 0,337 0,452 0,591 0,764 0,949 odchylka 0,025 0,046 0,058 0,065 0,096 0,15 0,188 0,231 0,304 Tab. 4: HCT 116.
"#$%&'()(* +,-. / 0...1.0 22 21 23 +2 +4 9 9 9 9 9:91 9:903 9:./1 9:293 9:+.+ 9:/42 9:4/3 )56&"786 9:9/1 9:9+3 9:9/1 9:904 9:.4/ 9:.32 '&$;<&=>?56&"786 9 9 9:9/ 9:91+ 9:..2 9:940 9:.3 9:910 9:21 9:941 9:++@ 9:/129:.1 9:13.9:.009:@4+9:2+.9:3/39:+9/ 9:934 ABC61DEFGHGI"# 7&=&$$%&''("
hodnoty 1 4 8 11 den pokusu - 15 18 22 25 29 32 36 2,8x10 7 7 1,2x10-5 3,7x10' 5 0,0003 0,0034 den pokusu - 1 4 8 11 15 18 22 25 29 32 36 1 1 1 1 1 1 Tab. 6: BIOCOL. colon HCT 116. 1=1%
"#$ $ %$ %$ &'()*)$ $ ('#+,'-.$ /01$ 23$ 45436$ 7859$ 9:59$ ;;$ 452:3$ :756$ 8952$ ;8$ 45;46$ :95;$ 8753$ ;6$ 45727$ 8;569$ :<54:$ 7;$ 45:9;$ 945:<$ 76587$ 79$ 459:6$ 93576$ 72592$ /=>?$<$@$$$$$$$$$$$$$A>B"C$&'()*$=$%$'>B"C)$ $ $
"#$%&'()(* +, - ++ +. +- // /. /0 1/ 12 + //3. //32 //3- //30 /13/ /13. /132 /13- /, /,3/ /,3/ / /13/ /131 /13. /134 /, /,3+ /,31 /,3. /,32 /,3- /. 1 //30 /1 /13+ /131 /13. /13. /134 /, /,3/ /,31 /,3,, //3, //32 //3- /1 /131 /13. /13- /,3+ /,3/ /,3. /,54. //32 //34 /1 /13/ /13. /132 /13- /, /,5+ /,31 /,3. 2 /13- /, /,3/ /,3. /,32 /,3- /,30 /.3/ /.3. /.54 /.30 4 //32 //32 //3- //30 /13+ /131 /13, /132 /130 //,3/ /,3. - //3. //32 //3- /1 /13/ /13. /132 /13- /,5+ /,31 /,32 0 /13/ /13, /132 /130 /,3/ /,3. /,32 /,3- /. /.3/ /.3, +6 //3/ //3/ //31 //3, //32 //3- /13+ /131 /13. /13- /,3+ ++ /13/ /13, /132 /130 /,3+ /,3, /,32 /,32 /,3- /.3+ /.3/ +/ //3, //32 //3- /1 /131 /13. /132 /13- /, /,5/ /,3. +1 // //31 //3. //32 //3- /1 /131 /13, /132 /130 /,5+ +, //3+ //31 //3, //34 //3- /1 /1 /13/ /13. /134 /130 +. //3. //32 //34 //30 /13+ /131 /13. /13- /130 /, /,31 +2 /132 /13, /13. /13- /130 /,3+ /,31 /,3. /,34 /,30 /.3/ "#$%#&' (()*+ ((),- (+).- (+)(+ (+)/- (+)0* (+)0, (/).0 (/)/1 (/)// (/)00 #$2"345'.)/,.)/1.)-.)--.)--.)-0.)--.)--.)--.)-/.)-+ 78950: 6789905
"#$%&'()(* )34&"564 +, - ++ +. +- // /. /0 1/ 12 //78. 97.8 //78 97.2 //728 97.. //7.- 97.+ //7,2 97./ //71+ 97.2 //790 97., /+701 97./ /+78, 97./ /+7.1 97. /+71+ 97., '&$:;&<= )34&"564 //781 97,- //7-. 97,0 /179. 97. /17/1 97.. /17,. 97.. /1728 97.2 /172-97.. /,792 97.. /,7,0 97.. /,7,, 97., /,722 97.1 "#$%&'("#$#% )*+,-.#%/#01-.231242.&$'())*%
"#$%#&' $(%)#*+,+- " #" $" " %" $" &&" &%" &'" (&" ()" *+'&%%" *,##(&" *,*-#%" *,**&(" %" ("."*/-",".*/'" &",(."01(",".*1%" #,)."01-" 234"567898":"" " #" $" " %" $" &&" &%" &'" (&" ()" " " " #" #" #" #" #" #" #" #" "./01223"#$#% 4#5#%&$'())*1 2 +
% "#$%&% "#$%&$'()*(+),-%
" " *$%&'$(+","-../" "#$%&'$()" kontroly 0'+1"2"
Graf 3
"#$%&
"#$%&% r
" #$%"" 18 22 25 29 32 36 '()"*+,-.-" "#$%&% "#$%"&"""
"#$%$&' "#$%&
Graf 8
"#$%&
"#$%&'%%%%%%%%%"#$%%&'$()%&*% (% "#$%+'%%%%%%"#$%%&($ %
HCT 116. HCT 116.
"#$%&'