HYDRAGEL BENCE JONES K20

HYDRAGEL BENCE JONES K20 Ref. 3038 2018/12

POUŽÍTÍ KÍTU HYDRAGEL BENCE JONES K20 kit je určen k identifikaci i kvalitativnímu stanovení Bence Jonesovy bílkoviny (volných monoklonálních řetězců kappa a lambda v lidské moči) a volných lehkých řetězců v séru imunofixační elektroforézou na agaróze. Detekce Bence Jones bílkovin pomáhá v identifikaci monoklonálních gamapatií. Každý agarózový gel HYDRAGEL BENCE JONES K20 je určen pro analýzu jednoho vzorku. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou vyvolávat podezření na výskyt monoklonálních proteinů a tím gamapatie. K identifikaci těchto abnormálních proužků slouží imunofixace. Imunofixační elektroforéza umožní zafixování proteinů v gelu, kde tvoří nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami. Provedení testu : 1. Vzorek se simultánně elektroforeticky dělí v šesti stopách na alkalicky pufrovaném agarózovém gelu. 2. Po elektroforéze první stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop Je použito k nanesení specifických antisér trivalentní proti těžkým řetězcům (G, A, M), anti-kappa a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům a anti kappa a anti lambda volným řetězcům. 3. Nezprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelovém nosiči. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány barvením kyselou violetí. Přebytek barvičky je odstraněn kyselým roztokem. Proužky s imunoprecipitáty jsou porovnány s odpovídajícími abnormálními frakcemi elektroforézou rozděleného vzorku a identifikovány podle reakce s odpovídajícími antiséry. Tato jednoduchá a rychlá technika poskytuje jasné a lehce interpretovatelné výsledky. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL BENCE JONES K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č. 3038 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů Pufr Tris-Barbital (zásobní roztok) 3 lahv. po 75 ml Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv. 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Aplikátory (6 zubů) (připraveno k použití) 1 bal. po 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks Hřebínky z tlustého filtračního papíru 1 bal. po 10 ks Tlusté filtrační papíry 2 bal. po 10 ks POZN. : Fixační roztok a antiséra jsou dodávána zvlášť vyjma soupravy kit (viz článek DALŠÍ POTŘEBNÉ REAGENCIE). OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu a imunofixaci. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 108 - SEBIA NÁVOD - Czech

2. TRIS-BARBITAL PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5. Elektroforetický pufr. Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní několik let, při nejmen-ším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. 3. KYSELÁ VIOLEŤ Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 5. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 6. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 7. HŘEBENY Z TLUSTÉHO FILTRAČNÍHO PAPÍRU K odsátí přebytečného fixačního roztoku a antisér z povrchu gelu po imunofixačním kroku. 8. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsátí nezaprecipitovaných proteinů z gelu po imunofixaci. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. - 109 -

POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. SOUPRAVA ANTISÉR A FIXAČNÍ ROZTOK Balení antisér a fixačního roztoku pro imunofixaci GAM, K a L se standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4835, obsahuje 3 lahvičky s antiséry (proti těžkým řetězcům gama, alfa a mu a volným a vázaným lehkým řetězcům kappa a volným a vázaným lehkým řetězcům lambda) každou o objemu 1 ml, a 1 lahvičku s fixačním roztokem o objemu 2.5 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1 BENCE JONES, SEBIA. 1.1 ANTISÉRA Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny protilátky proti lidským bílkovinám, ihned použitelná k analýze. Ke snadnějšímu rozlišení jsou antiséra obarvena různými barvami. Štítky na lahvičkách jsou zbarveny stejně. Lehký zákal, který se může vyskytnout v antisérech a zůstává i po 10 minutách při pokojové teplotě, při imunologické reakci nevadí. K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforezou. POZNÁMKA : Antiséra jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1 BENCE JONES. Antiséra mohou pocházet od různých živočišných druhů. Nemíchejte proto antiséra ze dvou různých lahviček ani pokud jsou specifikována stejně. Při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičku pipety. DŮLEŽITÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňte jejich víčka. Skladujte v chladničce při 2-8 C. Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu a na štítcích lahviček. Pokud se výrazným způsobem změní vzhled antisér díky mikrobiální kontaminaci, vyřaďte je z použití. 1.2 FIXAČNÍ ROZTOK Hotov k použití. Obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K usnadnění identifikace je zbarven žlutě, což odpovídá i barvě nálepky na lahvičce. K fixaci separovaných proteinů v referenční (ELP) stopě. POZNÁMKA : Fixační roztok je specifický pro imunofixační postup s maskou 1 BENCE JONES. DŮLEŽITÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňujte jejich víčka po použití. Fixační roztok skladujte v chladu při teplotě 2 až 8 C. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky fixačního roztoku. Fixační roztok nesmí obsahovat sraženiny. 2. SOUPRAVA ANTISÉR VOL. LEHKÝCH ŘETĚZCŮ Balení s antiséry anti-kappa volné lehké řetězce a anti-lambda volné lehké řetězce, SEBIA, kat. č. 4836, obsahuje 2 lahvičky s antiséry po 1 ml. Jsou specifická pro imunofixační postup s maskou 1 BENCE JONES, SEBIA., použití, sladování, stabilita a známky znehodnocení viz předcházející čl. 1.1. POZNÁMKA : Během přepravy je možné uchovávat antiséra a fixační roztok při pokojové teplotě (15 až 30 C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na jejich vlastnosti. 3. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Musí se připravit v laboratoři 0.9 g/dl NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě. K oplachování gelů po inkubaci s fixačním roztokem a antisery. Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 μm) a musí mít vodivost nižší než 3 μs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, obsahující aplikační zařízení HYDRAGEL K20 a standardní masku 1 BENCE JONES k aplikaci antisér a fix. roztoku. 3. Vlhká Komůrka kat. č. 1270. - 110 -

4. Elektroforetická Komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi - HYDRAGEL Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 10 μl, 20 μl, 100 μl a 200 μl. 7. Sušička - Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Analýzy by se měly převážně provádět čerstvou močí odebranou nejdéle před 24 hodinami (není-li to možné, je doporučeno analyzovat vzorky moči odebrané při prvním či druhém ranním vylučování). Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu : Bez přidání dalších látek je doporučeno skladovat moč zmraženou na - 70 / - 80 C. S přídavkem konzervantu je možné vzorky zmrazit na - 18 / - 30 C. Mražení s roztokem HEPES 0,1 M (ph 6,75) a/nebo azidem sodným 0,02 g/dl zvýší stabilitu při skladování. Zmražené vzorky moči jsou stabilní nejméně jeden měsíc. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vykazovat známky degradace proteinů a jsou-li přítomné imunoglobuliny i fragmentaci těžších řetězců a anodickou mobilitu (v zónách alfa-2 beta) bez odpovídajících těžších řetězců. DŮLEŽITÉ: Nepoužívejte kyselinu boritou jako konzervant. POZNÁMKA: Vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! Odběr séra pro analýzu musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. V případě potřeby lze séra skladovat při teplotě 2 až 8 C až po dobu jednoho týdne. Pro delší skladovací doby uchovávejte vzorky zmrazené. Zmražené vzorky séra jsou stabilní nejméně jeden měsíc. Rozmražené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu. vzorků Moče Používá se nezahuštěná moč. Hladina detekce Bence Jonesovy bílkoviny se pohybuje obecně v rozmezí 0.01-0.05 g/l. Požadujeme-li vyšší citlivost stanovení, je nutno vzorek zahustit běžným postupem zavedeným v laboratoři. Obvykle stačí 20-ti až 100 násobné zahuštění. POZN. : Je -li zákal v analyzované moči, může být bržděna difúze do špiček aplikátoru. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací ( např. : stříkačkový filtr 0.45 μm). Séra K analýze se používá v případě nutnosti potvrzení nálezu volných lehkých řetězců. Sérum se ředí fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 (1 díl diluentu, 3 díly deionizované nebo destilované vody) : 1/10 pro stopy ELP, GAM, K, L (1 díl séra + 9 dílů fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) pro zóny (stopy) kappa free a lambda free (Kf, Lf). POZN. : Pokud je celková hladina imunoglobulinů menší než 5 g/l, doporučuje se nižší ředění Sérum se ředí fyziologickým roztokem nebo diluentem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 (1 díl diluentu, 3 díly deionizované nebo destilované vody) : 1/5 pro stopy ELP, GAM, K, L (1 díl séra + 4 díly fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) a 1/2 (1 díl séra + 1 díl fyziologického roztoku nebo ředěného diluentu) pro zóny (stopy) kappa free a lambda free (Kf, Lf). K analýze Ig D a Ig E použijte stejné ředění jako v případě volných a vázaných řetězců kappa a lambda. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte vzorky plasmy proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin. Některé vzorky moče obsahují vysoké koncentrace solí, které mohou způsobit deformaci gelu během migrace a následovně pokřivení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků. Proto by soli v těchto močích měly být odstraněny dialýzou. Paraproteiny v moči mohou být proteolyticky změněny v důsledku mikrobiální kontaminace. Nastává pozitivní reakce s antiséry proti volným lehkým řetězcům. V takovém případě sérový paraprotein vylučovaný do moče se může s trivalentním antisérem, s jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům a s antisérem proti odpovídajícímu volnému lehkému řetězci jevit jako monoklonální proužek. Polymerizace Bence Jones proteinů snižuje citlivost detekce antiséry proti volným lehkým řetězcům ; polymerizace totiž blokuje epitopy, které normálně reagují s těmito antiséry. V případě podezření na přítomnost Bence Jonesových proteinů, proveďte před elektroforézou depolymerizaci : smíchejte 100 μl moči s 5 μl beta-merkaptoethanolu zředěného v poměru 1:10 fyziologickým roztokem nebo destilovanou či deionizovanou vodou a vložte do aplikátoru. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 111 -

PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 μl destilované (deionizované) vody na dolní třetinu rámečku vyznačeného na základové desce aplikačního zařízení. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujte, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu - hrozí dehydratace gelu! 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku (gelem k sobě). 6. Nyní gel ohněte a položte na plochu nosiče do vyznačeného rámečku tak, aby se kapka destilované vody pod ním rovnoměrně, bez tvorby bublin rozprostřela. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz Obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (Obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 μl vzorku dle následující tabulky. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut. IMUNOFÍXAČNÍ STOPA ČÍSLO JAMKY ELP 1 GAM 2 K 3 L 4 Kf 5 Lf 6 - Použijte aplikátor okamžitě - Pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopte za plastikovou část chránící zoubky a celou komoru umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Po aplikaci vzorků nebo po vynětí aplikátoru z vlhké komory odlomte spodní část, která chrání zoubky. 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 6 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 13. Po 5-ti minutách aplikátor uvolněte, vyjměte jej a vyhoďte. 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGELovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. SEBIA K20 150 ml 300 ml 20 minut 100 V 16 ± 3 ma II. IMUNOFIXACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu. 2. Napipetujte 120 μl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu vyznačeného rámečku na nosiči. 3. Opřete plotnu dolním okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 2) gelem k sobě. 4. Gel ohněte a pokládejte na plochu s kapkou vody tak, aby se tato rovnoměrně pod ním rozprostřela bez tvorby vzduchových bublin (viz Obr. 2). 5. Aplikační šablonu 1 BENCE JONES nastavte na nosiči následujícím způsobem (viz Obr. 5) : - Umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky. - Držte šablonu za ouško a položte ji na gel. - Stopy na šabloně musí být přesně srovnány s vyznačením zubů aplikátoru vlevo na gelu. 6. Reagencie pipetujte dle následující tabulky : STOPA OBJEM REAGENCIE BARVA ELP 40 μl fixační roztok žlutá GAM 25 μl trivalentní antisérum fialová K 25 μl antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům kappa zelená L 25 μl antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům lambda modrá Kf 25 μl antisérum proti lehkým řetězcům kappa oranžová Lf 25 μl antisérum proti lehkým řetězcům lambda červená - 112 -

POZN. : Aby nedošlo k záměně, zbarvení antisér a barvy na štítcích lahviček antisér odpovídají barevnému označení jamek aplikační šablony. - Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasátí bublin do špičky pipety. - Napipetujte reagencie (viz Obr. 6) : - Pipetu držte kolmo a při aplikaci špičku zlehka opřete o dno jamky. - Antisérum musí zaplnit celou zónu pod jamkou bez bublin. 7. Následuje inkubace 10 min. při teplotě místnosti. III. ODSTRANĚNÍ REAGENCIÍ 1. Odstraňte přebytek reagencií hřebenem z tlustého filtračního papíru (viz Obr. 7). 2. Reagencie odstraňte v průběhu 30 sekund. - Papírový hřeben lehce zasuňte pod úhlem 30 do štěrbiny na dolním konci aplikační šablony tak, aby se jeho zuby lehce dotkly hladin antisér (viz obr. 7). - Jemným vychýlením hřebene od sebe do úhlu maximálně 45 lze odsát přebytečnou reagencii (viz Obr. 8). DŮLEŽITÉ : Hřeben musí zůstat nakloněn do úhlu maximálně 45. Pokud by byl kolmo ke gelu, mohl by jej poškodit. IV. ODSTRANĚNÍ NEZPRECIPITOVANÝCH PROTEINŮ 1. Vyjměte hřeben. 2. Zkontrolujte, zda jsou antiséra dobře odsáta, t.j. : - na gelu nejsou žádná antiséra, - zuby hřebene jsou obarveny po celé jejich délce. Pokud není odsátí antisér úplné, vložte stejný papírový hřeben znovu do téže pozice a zopakujte předchozí postup. 3. Vyjměte aplikační šablonu. 4. Na gel položte na 4 minuty jeden tlustý filtrační papír. DŮLEŽITÉ : Dokonale přitiskněte tlustý filtrační papír k celému povrchu gelu a přesvědčte se, že dobře přilnul. 5. Filtrační papír sejměte. V kolmé poloze promývejte ve fyziologickém roztoku po dobu 5 minut. Gel musí být umístěn tak, aby stopa ELP byla na dolním konci držáku. 6. Gel položte na rovnou plochu. 7. Na gel přiložte nový tlustý filtrační papír tak, aby celou plochou přilnul k povrchu gelu. 8. Osušte gel v sušičce při 80 C tak, aby filtrační papír kompletně vyschl. 9. Aplikační šablonu očistěte malým kartáčkem (např. kartáčkem na zuby) podle postupu uvedeného v části "POSTUP ČIŠTĚNÍ MASKY". Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; pomocí sacího papíru odstraňte z jamek kapky vody. V. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení ponořte usušený gel kolmo do fyziologického roztoku na 3 minuty. 2. Na 4 minuty vložte v kolmé poloze do barvícího roztoku. 3. Odbarvěte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 4. Osušte gel v proudu 80 C teplého vzduchu. Zadní stranu gelu očistěte vlhkým, měkkým papírem. KONTROLA KVALITY Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být normální kontrolní roztok séra SEBIA, kat. č. 4785 použit jako negativní kontrola. VÝSLEDKY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Přítomnost Bence Jones bílkoviny v moči je charakterizována : - monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa nebo lambda stopy K nebo L, - stejným monoklonálním proužkem detekovaným antiséry proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda stopy Kf a Lf, - žádná reakce s trivalentním antisérem stopa GAM. Vzhledem k rozdílu v citlivosti protilátek (protilátky proti volným a vázaným lehkým řetězcům jsou citlivější než protilátky proti volným lehkým řetězcům) je přítomnost Bence Jonesovy bílkoviny v moči charakterizována také : - monoklonální frakcí zjištěnou protilátkami proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa nebo lambda (stopy K nebo L), - nepřítomností reakce s odpovídající protilátkou proti volným lehkým řetězcům, - nepřítomností reakce s trivalentním antisérem (stopa GAM). Sérum by mělo být dříve analyzováno, aby se vyloučila přítomnost Ig D nebo Ig E. Pro její ověření musí být vzorek rovněž analyzován po zkoncentrování. Sérový paraprotein vyloučený do moče bez Bence Jones bílkoviny je charakterizován : - jeden monoklonální proužek detekovaný trivalentním antisérem, - stejný proužek detekovaný jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - žádnou reakcí s antisérem proti odpovídajícím volným lehkým řetězcům. - 113 -

Sérový paraprotein vylučovaný do moče doprovázený Bence Jones bílkovinou je charakterizován : - jedním monoklonálním proužkem detekovatelným trivalentním antisérem, - tentýž proužek detekovaný jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - jedním monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům. Tento proužek nemigruje ve stejné rovině jako proužek detekovatelný trivalentním antisérem, - stejný proužek detekovaný jedním z antisér proti volným lehkým řetězcům, - ve vzácných případech 2 proužky migrující společně zbarvení ve stopě pro lehký řetězec je silnější než ve stopě GAM. Polymerizované formy Bence Jones proteinu jsou charakterizovány : - chyběním reakce s trivalentním antisérem, - několika proužky detekovanými pomocí jednoho z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, - stejné proužky mohou být detekovány odpovídajícím antisérem proti volným lehkým řetězcům. Omezení jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití standardní masky, může mít špatný vliv na výsledky. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. HODNOTY Byly použity standardní materiály, příprava vzorků a techniky. Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně. Reprodukovatelnost mezi vzorky a specificita Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na třech různých vzorcích : jeden normální sérový vzorek a dva močové vzorky s Bence Jonesovou bílkovinou jeden Kappa a druhý Lambda volnými lehkými řetězci. Po elektroforetické separaci na HYDRAGEL BENCE JONES K20 gelech stejné šarže byl aplikován fixační roztok na všechny dráhy na gelu, při použití barvení kyselou violetí (4 gely pro sérový vzorek a 2 gely pro každý vzorek moče). Všechna opakování na všech 4 gelech dala identický výsledek a jak se očekávalo pro normální sérum žádný monoklonální proužek nebyl detekován fixačním roztokem a pro patologické moče všechny dráhy na 2 gelech daly identický výsledek s tím, že v každém vzorku byl detekován jeden monoklonální proužek. Reprodukovatelnost mezi gely a specificita Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích (jednom séru se dvěmi monoklonálními komponentami Ig G - Kappa a Ig G - Lambda, močí s Kappa volnými lehkými řetězci a močí s Lambda volnými lehkými řetězci). Tyto vzorky byly podrobeny testům na třech HYDRAGEL BENCE JONES K20 gelech stejné šarže, při použití barvení kyselou violetí. Všechna opakování dala identický výsledek na gelech a jak se očekávalo i shodný typ testovaného vzorku. Výsledky na HYDRAGEL BENCE JONES K20 gelech indikují velice dobrou reprodukovatelnost pro všechny testované aspekty. Nebyly zde žádné vizuálně detekovatelné rozdíly mezi opakováními. Přesnost Dvacet pět (25) patologických močových vzorků (24 močových vzorků s volnými lehkými řetězci Kappa nebo Lamba) a šestnáct (16) patologických sér (12 s volnými lehkými řetězci Kappa nebo Lamba) bylo podrobeno analýze na HYDRAGEL BENCE JONES K20 gelech a jiných komerčně dostupných agarózových gelových systémech. Výsledky obou imunofixačních procedur byly v naprosté shodě. Citlivost Detekční limit pro Bence Jonesovu bílkovinu stanovený následným ředěním patologických vzorků byl okolo 1-4 mg/dl pro močové vzorky a okolo 4-10 mg/dl pro vzorky séra pro HYDRAGEL BENCE JONES K20 proceduru. - 114 -

BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir 1. et 2.: For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1. and 2.: 1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité. Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97. 4. JB Oudart et al (2014) Place des explorations urinaires dans le diagnostic et le suivi des gammapathies monoclonales en pratique quotidienne. Ann. Biol. Clin., 72 (2) : 147 152. - 152 -

SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Figure 5 Figure 6-153 -

SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8-154 -

Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan, 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil. Rua Barão do Triunfo, 73, Cj 74 CEP 04602-000 São Paulo Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/A 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it Swiss GmbH Verenastrasse, 4b CH-8832 Wollerau Switzerland Tel. : 41 44 787 88 10 Fax : 41 44 787 88 19 e-mail : contact.ch@sebia.com UK Ltd River Court, The Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : sales@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn 2018/09