OBSH 1. ÚVOD.. 13 2. TEORETICKÁ ČÁST... 14 2.1 Charakteristika biogenních aminů.. 14 2.2 Rozdělení biogenních aminů podle chemické struktury 14 2.3 Vznik biogenních aminů 15 2.4 Nejdůležitější bakteriální druhy produkující biogenní aminy...... 16 2.5 Nejvýznamnější faktory ovlivňující výskyt biogenních aminů.... 17 2.6 Biologické účinky biogenních aminů... 21 2.7 Fyziologické funkce biogenních aminů.... 22 2.8 Toxicita biogenních aminů... 23 2.9 Legislativa... 25 2.10 Výskyt biogenních aminů a jejich obsahy v potravinách. 26 2.10.1 Obsah biogenních aminů v rybách... 26 2.10.2 Obsah biogenních aminů v mase a masných výrobcích...... 27 2.10.3 Obsah biogenních aminů ve vybraných zrajících sýrech... 29 2.11 Metody stanovení biogenních aminů..... 36 3. CÍL... 37 4. MTERIÁL METODY..... 38 4.1 Materiál.. 38 4.1.1 Vzorky sýrů... 38 4.2 Materiál a použité metody... 38 4.2.1 Přístroje a zařízení..... 38 4.2.2 Chemikálie a roztoky. 39 4.2.3 Přípravy použitých roztoků 39 4.3 Stanovení biogenních aminů. 40 4.3.1 Extrakce biogenních aminů... 40 4.3.2 Derivatizace extraktu..... 40 4.3.1 Indikace látek a kvantitativní vyhodnocení... 41 4.4 Statistické vyhodnocení. 41 5. VÝSLEDKY DISKUZE. 42 5.1 Vliv výrobce, tučnosti sýru, startovací kultury a části sýru na obsah 42 biogenních aminů...
5.2 Vliv doby zrání na tvorbu biogenních aminů. 47 5.3 Porovnání vzorku sýru eidamského typu v průběhu zrání... 49 5.4 Změny obsahů biogenních aminů v průběhu zrání u sýru 55 eidamského typu... 5.5 Množství bakterií v sýru v průběhu zrání... 64 5.6 Korelace mezi obsahem biogenních aminů a počty mikroorganismů.. 66 6. ZÁVĚR 67 7. SEZNM LITERTURY. 69
SEZNM TBULEK Tab. 1 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů u jednotlivých výrobků (mg.kg -1 ) (Greif a kol., 1997) Tab. 2 Koncentrace biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích (mg.kg -1 ) při různých teplotách s různými startovacími kulturami (Komprda a kol., 20 Tab. 3 Koncentrace biogenních aminů u sýrů vyrobených z nepasterizovaného a pasterizovaného mléka (Schneller a kol., 1997) Tab. 4 Koncentrace biogenních aminů (mg.kg -1 ) (Schneller a kol., 1997) Tab. 5 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg.kg -1 ) (Greif a kol., 1993) Tab. 6 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg.kg -1 ) (Greif a kol., 2003) Tab. 7 Koncentrace biogenních aminů (mg.kg -1 ) (Velíšek, 2002) SEZNM OBRÁZKŮ Obr. č. 1 Obsah histaminu (HIS) u dvou výrobců (R, H), v okrajové a středové části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 2 Obsah tyraminu (TYR) u dvou výrobců (R, H), v okrajové a středové části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele.
Obr. č. 3 Obsah tryptaminu (TRY) u dvou výrobců (R, H), v okrajové a středové části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 4 Obsah sumy biogenních aminů (ΣB) u dvou výrobců (R, H), v okrajové a středové části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 5 Obsah histaminu (HIS) v okrajové (E) a středové (C) části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%), dvou různých startovacích kulturách (YY a LL) a při dvou různých dobách zrání (26 a 176). Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 6 Obsah sumy biogenních aminů (ΣB) v okrajové(e) a středové (C) části sýru, při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%), dvou různých startovacích kulturách (YY a LL) a při dvou různých dobách zrání (26 a 176). Průměry s různými exponenty v rámci daného ukazatele se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subspp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subspp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp.
cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 7 Obsah histaminu (HIS) u jednotlivých vzorků sýru pro 26. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 8 Obsah histaminu (HIS) u jednotlivých vzorků sýru pro 176. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris. Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 9 Obsah tyraminu (TYR) u jednotlivých vzorků sýru pro 26. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou různých startovacích kulturách a dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%). Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele.
Obr. č. 10 Obsah tyraminu (TYR) u jednotlivých vzorků sýru pro 176. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou různých startovacích kulturách a dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%). Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 11 Obsah sumy biogenních aminů (ΣB) u jednotlivých vzorků sýru pro 26. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou různých startovacích kulturách a dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%). Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele. Obr. č. 12 Obsah sumy biogenních aminů (ΣB) u jednotlivých vzorků sýru pro 176. den zrání v okrajové části (E) a středové části (C), od dvou výrobců (R, H), při dvou různých startovacích kulturách a dvou rozdílných tučnostech (30 a 45%). Průměry s různými exponenty v rámci dané kombinace se liší při P<0,05. (Kultura YY: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus; Kultura LL: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris). Při posuzování daného parametru byly všechny vzorky spadající pod daný ukazatel uvažovány jako dva celkové soubory bez ohledu na všechny ostatní ukazatele.
SEZNM ZKRTEK polyaminy P biogenní aminy B fenylethylamin PE histamin HIS agmatin GM putrescin PUT tyramin TYR tryptamin TRY spermidin SPD spermin SPE kadaverin CD monoaminooxidáza MO mikroorganismy MO diaminooxidáza DO polyaminooxidáza PO bakterie mléčného kvašení LB anaerobní bakterie N enterokoky ENC enterobakterie ENB celkový počet mikroorganismů CPM koliformní bakterie KOL
1. ÚVOD V dnešní době se stále více spotřebitelů zajímá o zdravotní nezávadnost potravin. Na tento požadavek reaguje legislativa České republiky tak i legislativa ostatních států Evropské unie a dalších vyspělých států světa. V ČR jsou požadavky na jakost a zdravotní nezávadnost potravin definovány podle zákona č. 120/2008 o potravinách a tabákových výrobcích a podle vyhlášek č. 467/2006 Sb., o mikrobiologických požadavcích a vyhláška č. 53/2002 Sb., o chemických požadavcích na zdravotní nezávadnost a podmínkách použití přídatných a pomocných látek a doplňků. Spotřebitelé si všímají nejen látek přidávaných do potravin při jejich výrobě, které mají negativní vliv na lidské zdraví, ale i toxikologicky významných látek vznikajících při samotné výrobě potraviny. Do této skupiny toxikologicky významných látek patří i biogenní aminy. Jde o látky vznikající z aminokyselin působením dekarboxyláz (dekarboxyláz obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát) nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transamináz. Na každého jedince mají biogenní aminy jiný vliv, který je navíc ovlivněn zdravotním stavem spotřebitele, příjmem léků nebo i genetickými dispozicemi. Kromě makrelovitých ryb se množství biogenních aminů vyskytuje ve fermentovaných potravinách živočišného původu a to jak tepelně opracovaných tak i neopracovaných. Vznik biogenních aminů ovlivňuje spousta faktorů, které se výrobci snaží minimalizovat. Tato diplomová práce se zabývá obsahem biogenních aminů ve vybraných zrajících sýrech.
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy (B) jsou skupinou alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází odvozených od aminokyselin, které vykazují různé biologické účinky. Některé B mají sami významné biologické vlastnosti, neboť jsou např. tkáňovými hormony (histamin, HIS), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenylethylamin, PE), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin. 2.2 Rozdělení biogenních aminů podle chemické struktury alifatické - alifatické diaminy H 2 N (CH 2 ) 4 NH 2 H 2 N (CH 2 ) 5 NH 2 putrescin kadaverin - alifatické polyaminy H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH 2 spermidin H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NH 2 spermin NH H 2 N C NH (CH 2 ) 4 NH 2 agmatin
aromatické CH 2 CH 2 NH 2 OH CH2 CH 2 NH 2 fenylethylamin tyramin heterocyklické N CH 2 CH 2 NH 2 CH2 CH 2 NH 2 N H N H histamin tryptamin 2.3 Vznik biogenních aminů B vznikají z aminokyselin působením dekarboxyláz (dekarboxyláz obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát) nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transamináz. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxygenázy a methyltransferázy (Kalač, Křížek, 2005). Příkladem dekarboxylace je vznik HIS z histidinu působením histidindekarboxylázy, CD z lysinu lysindekarboxylázou, PE z fenylalaninu, TYR z tyrosinu, jehož oxidací vzniká oktopamin. Dekarboxylací argininu vzniká GM a dále PUT. Ten vzniká také přímo dekarboxylací ornithinu ornithindekarboxylázou. Z PUT vzniká methylací S-adenosylmethioninem SPD a dále SPM. Mezi polyaminy (P) se řadí PUT, SPD a SPM. Tyto dva aminy nevznikají bakteriální činností, ale biochemickou syntézou v živých organismech od bakterií po člověka. PUT se tedy vyskytuje v jakési dvojroli svým vznikem patří mezi B, ale tím, že z něj vznikají přirozené P SPD a SPM, se řadí i mezi P (Kalač, Křížek, 2005).
ž donedávna byly tyto látky (B, P) chápány jako jedna skupina přírodních látek. Nyní se však uvádějí jako dva typy příbuzných látek, a to z hlediska jak vzniku, tak biologických účinků. Pro vznik B jsou nutné tři podmínky: - výskyt volných aminokyselin, - bakterie vybavené dekarboxylázami, - prostředí příznivé pro množení těchto bakterií. 2.4 Nejdůležitější bakteriální druhy produkující biogenní aminy Bakterie způsobující dekarboxylaci aminokyselin patří do mnoha rodů, zejména rodu Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella a Shigella, dekarboxylázy aminokyselin se vyskytují i v bakteriích mléčného kvašení rodu Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus. Situaci však komplikuje skutečnost, že v rámci určitého druhu mohou existovat kmeny s dekarboxylační schopností i bez ní. Dekarboxylační aktivita mezi kmeny určitého druhu se může lišit dokonce až o tři řády. Odstranit alespoň část vytvořených B z potravin je komplikované, rozhodující je však omezit jejich vznik. Toho lze dosáhnout dodržováním zásad správné výrobní praxe, směřujících k potlačení nežádoucích skupin bakterií. Ve fermentovaných masných výrobcích: Pediococcus pentosaceus; Staphylococcus carnosus; Lactobacillus spp.; Pseudomonas spp.; Streptococcus spp.; Micrococcus spp.; čeleď Enterobacteriaceae. V sýrech: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. brevis; Streptococcus faecium, Streptococcus mitis; Bacillus macerans; Propionibacterium spp.; druh Leuconostoc. V rybím mase: Proteus morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris; Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens, Hafnia alvei, Enterobacter aerogenes, Bacillus spp.; Staphylococcus xylosu. Ve fermentovaných nápojích: víno Pediococcus cerevisiae, pivo kvasinky: Debaryomyces hansenii, Candida tamara. V mléce se nachází Pseudomonas, Enterobacteriaceae a Micrococcaceae
2.5 Nejvýznamnější faktory ovlivňující výskyt biogenních aminů Dostupnost substrátu: 2 %) Přítomnost volných aminokyselin a cukrů (optimální koncentrace glukózy je 0,5 Teplota: např. HIS se tvoří při 5 C řádově méně než při 20 C nalytické rozbory ukázaly (Greifová a kol., 2003), že Escherichia coli při všech sledovaných teplotách (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 C) produkovala CD a PUT. Optimální teplota růstu Escherichia coli je 37 C. Již po devíti hodinách, při teplotě 37 C začala Escherichia coli produkovat CD, maximální obsah CD byl dosažen po 45 hodinách při teplotě růstu 10 C. Za deset hodin, po naočkování potraviny při teplotě 37 C začala Escherichia coli produkovat PUT. Maximální obsah PUT byl dosažen po 70 hodinách, při teplotě 10 C. PUT byl tvořený z argininu, zatímco přímý prekurzor pro tvorbu PUT (ornithin) se v substrátu nevyskytoval. ph: Enterobacter aerogenes produkoval lysin- a histidindekarboxylázu, přičemž vznikal CD a HIS. Nejvyšší koncentrace CD byla při ph = 5,8 (2863 µg/ml) a HIS při ph = 7,3 (330 µg/ml). Nejvyšší rychlost nárůstu CD byla při ph = 5,8 a se stoupající hodnotou ph výrazně klesala. Nejvyšší rychlost nárůstu HIS byla při ph = 7,3. Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium měly nejvyšší růstovou rychlost při ph = 7. Při vyšším ph rychlost růstu klesala. E. faecalis a E. faecium jsou schopné produkovat enzym tyrosindekarboxylázu, v důsledku čehož vzniká TYR. E. faecalis produkoval 1,5 až 2 násobně vyšší koncentrace TYR než E. faecium (Greifová a kol., 2003). Specifická rychlost nárůstu TYR sledovanými enterokoky byla nejvyšší při ph = 7. Růstová schopnost bakterií ovlivňuje více tvorbu B než podmínky růstu. Značné zpomalení nárůstu kinetiky dekarboxyláz pozitivních mikroorganismů spolu s nízkou teplotou mohou redukovat zdravotní riziko spojené s přítomností těchto sloučenin v potravinách.
Přítomnost soli: Přítomnost soli inhibuje tvorbu B, ale na druhé straně HIS nebo TYR působí na některé bakterie osmoprotektivně a jeho syntéza je tedy v přítomnosti NaCl někdy zvýšena. NaCl se používá při výrobě mlékárenských, masných a rybích výrobků. Na + ionty všeobecně podporují enzymatické reakce. Koncentrace soli do 2,2 % příznivě ovlivňuje rychlost nárůstu TYR produkovaného E. faecium, avšak v případě E. coli rychlost nárůstu TYR klesala (Greifová a kol., 2003). Greifová (2003) uvádí, že NaCl podporuje tvorbu aminů tak, že aktivuje enzym tyrosindekarboxylázu, i když v přítomnosti soli se zhorší růst E. faecalis. Koncentrace soli 1,3 % měla příznivý vliv na růst E. faecalis a E. faecium (Greifová a kol., 2003). Je důležité, aby počty mikroorganismů, které produkují B v potravinách nepřesahovaly limity, které by mohly mít na lidské zdraví negativní účinek. Přístupnost kyslíku: Tento faktor je však nejednoznačný, protože na tvorbě B se mohou podílet mikroorganismy aerobní, anaerobní i fakultativně anaerobní. Doba skladování výrobku: V této oblasti se názory autorů rozcházejí, což je způsobeno jednak podmínkami pokusů a jednak různými druhy skladovaných potravin. Silla-Santos (1996) uvádí, že skladovací teplota nemá prokazatelný vliv na obsah TYR v ančovičkách. Opačný názor uvedli Sayem El Daher a kol. (1984), že hladina TYR v potravinách živočišného původu je v pozitivní korelaci se skladovací teplotou a časem, zatímco koncentrace HIS není podmínkami skladování ovlivněna. Mnoho autorů uvádí, že obsah B vzrůstá s časem a teplotou skladování (Suzzi, Gardini 2003). Silla Santos (1996) uvádí vzrůstající koncentraci TYR a HIS s časem a skladovací teplotou v sýrech. Komprda a kol. (2001) uvedli vyšší tvorbu B u salámů skladovaných při pokojové teplotě (22 C) ve srovnání se salámem skladovaným při chladírenské teplotě (4 C). Stejně tak i Bover Cid a kol. (2000b) uvedli u fermentovaných salámů skladovaných při teplotě 4 C nižší koncentraci B ve srovnání se salámy skladovanými při 22 C.
Při sledování B v průběhu fermentačního procesu při výrobě trvanlivého salámu se sledovaly koncentrace B během skladování za laboratorní teploty ve vakuovém balení a v nebaleném stavu. Již po dvou týdnech skladování byl obsah TYR vyšší než připouští toxikologický limit, ke konci skladovací doby se koncentrace dokonce ztrojnásobila (Křížek, Kalač, 1998). V případě vakuovaných salámů nebyl pozorován žádný vliv na obsah aminů. V případě P (SPD, SPM) zůstává obsah konstantní nebo se naopak snižuje, proto není nutné sledovat jejich obsah během celého procesu (Komprda a kol., 2001). Vodní aktivita: Vysoké hodnoty vodní aktivity podporují dekarboxylázovou aktivitu a tím i tvorbu B (Gonzáles-Fernándes., 2003). Dodržování hygienických podmínek během výroby a skladování: Při získávání a zpracovávání surovin je nutná přísná aplikace hygienických zásad. Při zrání sýrů dochází k výrazné tvorbě B jen v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry jen poměrně malá množství B (Velíšek, 2002). Pro zabezpečení zdravotní nezávadnosti potravin je jedním z nejúčinnějších nástrojů systém HCCP. Systém HCCP musí být aplikován při výrobě potravin a musí být zaměřen na zajištění zdravotní nezávadnosti (Komprda, 2004). Startovací kultury: Startovací kultury jsou vybrané kmeny mikroorganismů, které jsou aplikovány do potravin během výroby za účelem vyvolání požadovaných změn. Výsledkem přídavku startovací kultury do díla při výrobě např. fermentovaných salámů je zajištění správného a rychlejšího průběhu zrání, snížení ph vlivem vytvořené kyseliny mléčné, redukce dusičnanů a dusitanů, štěpení bílkovin a lipidů, vytváření typického aroma, chuti a pevné textury. Startovací kultury nesmějí být patogenní a musí vykazovat příslušnou biochemickou aktivitu. V souvislosti s obsahem B spočívá význam startovacích kultur v tom, že inhibují růst kontaminující mikroflóry a tím nepřímo také tvorbu B, především PUT a CD. Přímo pak ovlivňují množství HIS a TYR.
Řada publikovaných studií (Masson a kol., 1996; Silla Santos, 1996) se zabývala schopností určitých druhů mikroorganismů používaných ve startovacích kulturách při výrobě fermentovaných masných výrobků produkovat B. Masson a kol. (1996) zjistili, že L. plantarum a L. curvatus mohou produkovat velká množství B, celkově více než 200 mg/kg, zatímco u druhu L. sakei nebyla prokázána zvýšená tvorba B. Jeho použití do průmyslově vyráběných startovacích kultur je tedy velmi vhodné. Při výrobě fermentovaných potravin je nutno vybírat startovací kultury bez dekarboxylázové aktivity (Komprda, 2004). Účinek startovací kultury se podílí na produkci B během zrání potravin. Pokud startovací kultura obsahuje mikroorganismy netvořící B a naopak potlačují růst nativních mikroorganismů podílejících se na tvorbě B, pak můžeme výrazně snížit produkci B (Suzzi, Gardini, 2003). Startovací kultury nejsou vždy schopny kontrolovat kmeny s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou. Rozpory ve schopnosti startovacích kultur redukovat tvorbu B, které pozorujeme, mohou být způsobené různou mikrobiologickou kvalitou výchozích materiálů (Suzzi, Gardini, 2003). Laktobacily ve startovacích kulturách soutěží s nativními bakteriemi během zrání a skladování a zabraňují tak nadměrné produkci B. Suzzi a Gardini (2003) uvádí, že L. casei je schopen redukce obsahu B (s výjimkou TYR) i v přítomnosti laktobacilů s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou. Podobné výsledky uvádí i Bover-Cid a kol. (2000a), kteří zmiňují pokles tvorby B v salámu za přídavku startovací kultury obsahující L. casei ve směsi s S. carnosus a S. xylosus. Bover-Cid a kol. (1999) zveřejnili velký rozdíl v obsahu TYR mezi vzorky se dvěma různými startovacími kulturami. Protože startovací kultura dokáže nejvíce ovlivnit vznik B, patří proto mezi nejdůležitější faktory. Další faktory jako obsah soli, vodní aktivita, ph, přístupnost kyslíku mají na vznik B také značný podíl, ale jejich účinek není tak významný jako vliv startovacích kultur, skladovacích podmínek a technologie výroby dané potraviny a s tím spojená přísná aplikace hygienických zásad. Z uvedených faktorů vyplývá, že tvorbu B lze při výrobě a uchovávání potravin potlačit. Nezbytné je používání výchozích surovin a materiálů s dobrou hygienickou kvalitou a také dodržování hygienických pravidel při výrobě a skladování.
Tyto zásady vedou k inhibici mikroorganismů a tím k menší tvorbě B. Význam výše uvedených opatření je mimo jiné zdůrazněn termostabilitou B. Již vytvořené B nelze zničit ani tepelnou úpravou při 200 C. 2.6 Biologické účinky biogenních aminů B jsou pro organismus nepostradatelné, ale ve vysokých koncentracích se mohou projevovat jako látky: psychoaktivní vasoaktivní Psychoaktivní aminy působí jako neurotransmitery v centrálním nervovém systému, vasoaktivní aminy působí přímo nebo nepřímo na vaskulární systém. Z B jsou zdravotně nejzávažnější HIS, TYR a PE. Ovlivňují krevní tlak HIS jej snižuje, další dva zvyšují. HIS má rovněž psychoaktivní účinky. Projevy otravy jsou nervové a kožní (dýchací potíže, bušení srdce, bolesti hlavy, pálení v ústech). Zdraví jedinci se obvykle vyrovnají i se zvýšeným příjmem B jen s minimálními problémy, protože jsou vybaveni dostatečně účinným detoxikačním mechanismem, a to střevními aminooxidázami. Detoxikační kapacita enzymů je však značně individuální, je omezená v dětství a snižuje se s rostoucím věkem. K výraznému oslabení může dojít při některých onemocněních. ktivitu nejúčinnějšího z těchto enzymů, monoaminooxidázy (MO), snižuje alkohol, ale ještě podstatněji některé léky, především ze skupiny psychofarmak. Pro pacienty léčené těmito léky představuje riziko především TYR, protože způsobuje silné zvýšení tlaku, které může vést až k ohrožení života. ktivitu enzymu diaminooxidázy (DO), který se podílí na odbourávání netoxických diaminů PUT a CD, snižují např. léky mbroxol a cetylcystein, používané pro odkašlávání hlenů. V takovém případě rostou nároky na aktivitu MO, která pak může chybět pro detoxikaci především HIS a TYR. Biologické role SPD a SPM jsou odlišné. Podílejí se na množství základních dějů v živých organismech, především na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Proto je jejich obsah vyšší v mladých a metabolicky aktivních rostlinných pletivech a živočišných tkáních, mimo jiné i ve tkáních nádorových. To vyvolalo velmi obsáhlý,
stále pokračující výzkum vztahů mezi obsahem P a růstem nádorů. Je však třeba zdůraznit, že P nejsou karcinogeny ani iniciátory nádorového bujení (Smělá a kol., 2004). Lidský organismus využívá P ze tří zdrojů: vytvořené vlastní biosyntézou z aminokyselin, produkované střevními bakteriemi a přijímané potravou. Proto se jako jedna z cest zastavení, či alespoň zpomalení růstu nádorů ověřuje snížení příjmu či využitelnosti potravních P. P obsažené v potravě mohou být i žádoucí pro intenzivnější tvorbu či regeneraci tkání, např. v období pooperační rekonvalescence nebo při léčbě poranění. U zdravého člověka je nadbytečný příjem P odstraněn střevními enzymy polyaminooxidázou (PO) a již zmíněnou DO, SPD a SPM nejsou proto pokládány za zdravotně rizikové. Zatím však není stanovena výše jejich potřeby (Kalač, Křížek, 2005). 2.7 Fyziologické funkce biogenních aminů Některé B mají v organismu živočichů a člověka významné fyziologické funkce. B mohou být zdrojem dusíku v různých biochemických reakcích, případně mohou sloužit jako prekurzory některých hormonů, nukleových kyselin nebo proteinů. B mají v organismu řadu funkcí a mohou zásadně ovlivnit pohodu a zdraví člověka. Pro životní funkce jsou nepostradatelné některé monoaminy zejména katecholaminy a serotonin. Serotonin je neurotransmiterem v mozku, účastní se např. vzniku nálady, je obsažen v krevních destičkách a dalších tkáních. Zúžením cév napomáhá zastavit krvácení. Účastní se také zánětlivých a alergických reakcí (Vokurka a kol., 2000). Katecholaminy jsou hormony nadledvinek, které se uplatňují jako neurotransmitery a také při řízení krevního tlaku. Dopamin a noradrenalin zvyšují krevní tlak. drenalin rozšiřuje cévy a podporuje srdeční činnost. Zvyšují obsah glukózy v krvi. Uplatňují se tak v situacích, kdy organismus překonává zátěžové situace jako je hlad, infekce nebo stres. P mají významné funkce při regulaci buněčného růstu, zvláště pak při diferenciaci a růstu buněk střevní tkáně a v rámci metabolické aktivity střeva. P dále ovlivňují imunologický stav střevní tkáně a spolupůsobí při vychytávání volných radikálů (Komprda, 2005).
2.8 Toxicita biogenních aminů Při hodnocení toxicity je nutno zvažovat nejen přítomnost konkrétního aminu, ale i ostatních faktorů jako množství spotřebované potraviny, přítomnost jiných toxických látek atd.. Z tohoto důvodu je velmi těžké stanovit hranici toxicity jednotlivých B (Velíšek, 2002). Pro HIS se uvádějí hodnoty 8 40 mg jako dávka vyvolávající projevy lehké otravy, 40 100 mg otravy střední a nad 100 mg migrénu. Pro TYR se uvádí, že příjem 10 80 mg může vyvolat otoky, dávka nad 100 mg migrénu. Pro třetí toxikologicky nejzávažnější B, a to PE se obdobné údaje zatím neudávají. Sýr je nejběžnější potravinou, která je spojena s otravou HIS. Další B, které se nacházejí v sýrech jsou TRY, PUT a CD. Spanjer a van Rood navrhli, že suma TYR, HIS, PUT a CD by neměla přesahovat 900 mg/kg v sýru. Uvedli, že v EU a US není stanovena zákonná horní mez B kromě HIS. To platí pro sýry i pro ryby. Toxické dávky B je obtížné stanovit. Velice závisí na individuálních rozdílech mezi lidmi a na přítomnosti různých B v potravině. Na druhé straně, pro pacienty konzumující neselektivní inhibitory MO je předpokládaná toxická dávka již 6 mg TYR (Komprda, 2005). TYR a PE způsobují zvýšení krevního tlaku a migrény (Křížek, 1999). PUT, CD, GM a TRY jsou méně toxické než HIS. Toxicita histaminu HIS se nachází ve většině tkání, vysoké koncentrace jsou v plicích, kůži a trávícím ústrojí. Histamin, který může zasahovat do řady fyziologických funkcí, je dvojího původu. V lidském organismu je uložen v žírných buňkách a v basofilních granulocytech. Odtud se při alergické reakci uvolňuje do krevního oběhu. Druhým zdrojem je potrava. HIS projevuje svou toxicitu pomocí interakcí s receptory na buněčných membránách. Ovlivňuje nervový systém, cévní soustavu, trávící a dýchací soustavu. Způsobuje bolesti hlavy, třes, pocení a návaly horkosti spojené se závratěmi. Kůže červená a objevuje se vyrážka kolem úst. Podílí se na kontrakcích intestinálního hladkého svalstva a je odpovědný za břišní křeče, průjmy a zvracení (Silla Santos,1996).
Příjem HIS potravou může vést ke stejným potížím, jako jeho uvolnění z tělních depozit. Projevy jsou obdobné jako alergie na určité potraviny, takže se intoxikace často mylně diagnostikuje jako alergická reakce (Brink a kol., 1990). Rychlost, s jakou se dostaví účinky po příjmu HIS (někdy dokonce do pěti minut) nasvědčuje vstřebávání alespoň části HIS, případně i dalších B již z dutiny ústní, tedy dříve než může být detoxikován střevními aminooxidázami (Silla Santos, 1996). I když se pro otravu HIS traduje zesilující účinek dalších současně přijatých B, existují názory, že se tyto synergické účinky neuplatňují. Inkubační doba je obvykle do 30 minut po požití. Projevy obvykle trvají několik hodin, někdy však až několik dnů. Metabolismus histaminu v lidském organismu je dvojí: dusík v imidazolovém cyklu je metylován pomocí histamin-n-metyltransferázy za vzniku N-metyl-histaminu, který je dále oxidován MO na N- metylimidazoloctovou kyselinu působením DO je oxidován na imidazoloctovou kyselinu, která se váže na ribózu (Stratton a kol., 1991). Toxicita tyraminu TYR je nejúčinnější ze skupiny tzv. vasoaktivních aminů, tj. látek, které zvyšují krevní tlak. TYR může při podávání léků inhibujících MO vyvolat hypertenzní krizi se silnými bolestmi hlavy, krvácením do mozku až selháním srdce. Mírnější intoxikace se projevují jako migrény (Velíšek, 2002). V 60. letech bylo poprvé zjištěno zvýšení krevního tlaku TYR u pacientů léčených inhibitory MO po konzumaci sýrů. Proto se intoxikace TYR často označuje jako reakce na sýry (angl. Cheese reaction).
2.9 Legislativa Ustanovení aktuálně platné Vyhlášky MZd č. 305/2004, harmonizované s legislativou EU, uvádí pouze přípustné množství histaminu 100 mg/kg v rybách a rybích výrobcích s tím, že uvedený obsah může být u dvou z devíti vzorků odebraných z jedné šarže překročen až do 200 mg/kg. Laboratorní kontrola je v tomto případě na místě, protože v literatuře jsou uváděny hodnoty až přes 1000 mg/kg, tedy 0,1 %. Pro pivo a víno je stanoveno přípustné množství 20 mg/l. Takto vysoké hodnoty se vyskytují jen zřídka. Pro TYR činí přípustná množství 50 mg/l pro červená vína, 100 mg/kg pro základní potraviny a 200 mg/kg pro sýry. V literatuře se pro většinu potravin uvádí jako přijatelný obsah široké rozmezí 100 800 mg/kg (Kalač, Křížek, 2002). Zatím v žádné zemi neurčuje legislativa výrobcům deklarovat obsah HIS a TYR v potravinách. Tento údaj by však jisté ocenili především jedinci trpící migrénami a dietologové. Pro výrobce by však tato povinnost byla značně obtížná, což vyplývá z již uvedeného velkého kolísání obsahu aminů v rámci určitého druhu potraviny. Výzkum by proto měl vyvinout jednoduché, rychlé a levné, alespoň semikvantitativní metody stanovení obsahů především HIS a TYR v potravinách. Některé země legislativně stanovily maximální přípustné množství HIS v některých potravinách. Maximální přípustné množství bylo stanoveno např. pro ryby ve Francii (NPM = 100mg/kg), ve Švédsku a Izraeli (NPM = 200mg/kg) (Kalač, Křížek, 1998). Legislativa evropských zemí zatím nevyžaduje označení obsahu aminů na etiketách potravinářských výrobků (Kalač, Křížek, 2002).
2.10 Výskyt biogenních aminů a jejich obsahy v potravinách Obsahy biogenních aminů v potravině určitého druhu kolísají ve velmi širokých mezích, někdy až o dva řády. To téměř znemožňuje poskytnout lékařům věrohodné tabulkové údaje. Přesto se již podařilo nashromáždit značné množství informací o obsazích B a v menší míře i P a také poznatků o faktorech ovlivňujících jejich tvorbu v různých druzích potravin. Největší zájem je o HIS, jehož rozsáhlé databáze jsou např. v Německu nebo Dánsku (Kalač, Křížek, 2005). Z hlediska výskytu se obvykle potraviny dělí na nefermentované, v nichž B vznikají především činností hnilobných bakterií, a na fermentované, v nichž je rozhodující působení bakterií mléčného kvašení. Obvyklé obsahy jednotlivých obsahů aminů v potravinách se pohybují v řádu jednotek až desítek miligramů v kilogramu, hodnoty ve stovkách mg/kg se již pokládají za vysoké až velmi vysoké. Někdy dochází i k překročení hladiny 1000 mg/kg (Kalač, Křížek, 2005). B nejčastěji vznikají při fermentačních procesech. Není proto problém je najít např. ve zrajících sýrech, fermentovaných masných výrobcích, rybách, pivu nebo vínu. 2.10.1 Obsah biogenních aminů v rybách Velmi často se B vyskytují v některých typech ryb, a to ne jako důsledek fermentačního procesu, ale při nedodržení hygienických podmínek při zpracování ryb a porušení chladírenského řetězce. Důvodem, proč se B vyskytují ve větší míře u určitých druh ryb, je jednak zvýšený obsah příslušných aminokyselin, a to především histidinu, a také fakt, že v rybách s tmavým masem je vyšší obsah volného histidinu než v bílém rybím mase nebo v mase jatečných zvířat. Nejčastěji se B tvoří ihned po vylovení ryb, které nejsou patřičně zchlazeny na teplotu kolem +1 C. Další rizikovou operací je tepelné opracování, především uzení ryb, hlavně makrel. Záleží hlavně na době od přípravy ryb na uzení k vlastnímu tepelnému ošetření. Pokud je tato doba dlouhá a ryby jsou vystaveny vyšším teplotám, dochází k pomnožování mikroorganismů. Uzení ryb probíhá za nižších teplot a některé mikroorganismy proces uzení mohou přežít, ve vhodných podmínkách se pomnožovat a tvořit především HIS (Steinhauserová, 2004).
V rybách bývají hlavními B HIS, CD, PUT a TYR. V čerstvém rybím mase je obsah B malý, např. v mase tuňáka bývá 0 10 mg/kg HIS a 0 2 mg/kg TYR. Obsah B však roste při nevhodném skladování. Při skladování ryb při teplotách kolem 0 C a nižších vznikají B v téměř zanedbatelném množství. Při vyšších teplotách je přítomnou mikroflóru dekarboxylován hlavně histidin a tkáně zejména makrelovitých ryb (Scrombroidae, kam patří hlavně tuňák a makrela) mohou obsahovat až 3000 mg/kg (makrela) nebo dokonce 8000 mg/kg HIS (tuňák; Velíšek, 2002). Minoritním B zpravidla bývá GM, který se v mase a v mase ryb nachází běžně v množství 1 3 mg/kg. 2.10.2 Obsah biogenních aminů v mase a masných výrobcích Při skladování masa dochází vlivem enzymové aktivity přítomné mikroflóry k růstu obsahu B, a obsah některých z nich lze proto využít jako indikátor čerstvosti masa (Velíšek 2002). Čerstvé vepřové maso např. obsahuje do 7 mg/kg CD a PUT, zatímco zkažené maso až 60 mg/kg a více. Obsah B vzrůstá při výrobě fermentovaných salámů. Tento nárůst je patrný hlavně v počátečních fázích fermentace výrobků a je závislý na druhu přítomných mikroorganismů. Na vzniku B v trvanlivých salámech se mohou podílet mikroorganismy použité ve startovacích kulturách i mikroorganismy zpracovávané suroviny. Greif a kol. (1997) se zaměřili na měření B v tepelně opracovaných, neopracovaných masných výrobcích a konzerv z ryb. Z tabulky vyplívá, že nejvyšší koncentrace HIS byla naměřena u tuňáka (1820 mg/kg). Tab.1 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů u jednotlivých výrobků (mg/kg) (Greif a kol., 1997) Vzorek Počet Kadaverin (mg/kg) Putrescin (mg/kg) Histamin (mg/kg) Tyramin (mg/kg) dietní párky 6 80 167 72 220 0 20 0 lovecký salám 3 105 190 80 186 2 49 10 58 domácí klobása 8 24 140 35 93 8 35 20 445 suchý salám 3 14 255 7 101 1 30 1 31 treskový salát 4 0 15 0 24 11 75 30 182 rybí salát 4 1 20 0 35 1 5 109 136 tuňák-konzerva 3 20 180 124 171 35 1820 0 35 Obdobná situace je u fermentovaných trvanlivých masných výrobků. Hůře ošetřená surovina vnáší do výrobku zejména zvýšené obsahy PUT a CD. V závislosti
na technologii výroby a použitých startovacích kulturách mléčných bakterií se může konečný obsah a zastoupení jednotlivých aminů značně lišit. U mikroflóry charakteristické pro maso a masné výrobky se zjistilo, že existují kmeny bakterií, které dokáží odbourávat část vytvořeného TYR. Při výrobě domácích klobás, které patří do skupiny výrobků tepelně neopracovaných byl vysoký obsah TYR, který poukazuje na pomnožení grampozitivních koků, a to především na rody E. faecalis a E. faecium, které jsou odpovědné za produkci TYR a jsou indikátorem úrovně hygieny a sanitace v dané výrobě. PUT a CD jsou indikátory pomnožení bakterií z čeledi Enterobacteriaceae, a to především E. coli, Enterobacter, Proteus, Klebsiella a pseudomonád (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa), a také skutečnosti, že v trávicím traktu oslabují činnost MO a DO, což má za následek zvýšení koncentrací histaminu a tyraminu v krvi (Greif, 1997). V zahraničí i u nás byly proběhlo několik výzkumů zabývajících se touto problematikou. Hernández-Jover a kol. (1997b) zjišťovali obsahy biogenních aminů v různých typech španělských fermentovaných masných výrobků (salchichon, choriso, fuet, sobraza) a mezi těmito výrobky nenalezli žádný průkazný rozdíl. Hlavními stanovenými B byly TYR a PUT. Jejich koncentrace velmi kolísaly a dosahovaly hodnot několika stovek mg/kg, přičemž převažujícím aminem byl TYR. Dále se zde vyskytovaly v nižších koncentracích HIS, CD a také TRY a PE. Podobné experimenty byly provedeny u finských fermentovaných masných výrobků. Eerola et al. (1998) potvrdili, že TYR je nejběžnějším B, dále byly přítomny další vazoaktivní aminy jako HIS, PE a TRY. Ve většině vzorků se vyskytovaly indikátory kažení PUT a CD v koncentracích i několik stovek mg/kg. Treviňo et al. (1997) sledovali výskyt B v salám cervelat, ve kterém převažovali - PUT a TYR, dále se vyskytoval HIS, SPM a SPD. Standara a kol. (1995) sledovali B u šesti druhů fermentovaných masných výrobků. Jednalo se o Paprikový salám, Poličan, Herkules, Gombaseckou klobásu, Dunajskou klobásu a Prim. Téměř všude byl nalezen TYR a PUT v koncentracích přes 100 mg/kg, v nízkých koncentracích byl přítomen HIS a jen vyjímečně CD. Komprda a kol. (2001) sledovali obsah B v Poličanu. Vzorky byly uložené v chladících komorách s regulovanou teplotou nebo při pokojové teplotě (22 C). Experiment s typickým českým fermentovaným masným produktem Poličanem.
Startovací kultury obsahující Lactobacillus sakei, Staphylococcus carnosus a Staphylococcus xylosus (kultura ), a L. sakei, S. carnosus a Pediococcus pentosaceus (kultura B). (Komprda a kol., 2001). Tab.2 Koncentrace biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích (mg/kg) při různých teplotách s různými startovacími kulturami (Komprda a kol., 2001) Vzorek 0.den 10.den 20.den 30.den 40.den 50.den 60.den B B B B B B B histamin mg/kg tyramin mg/kg putrescin mg/kg Σ B Mg/kg 8 C 22 C 8 C 22 C 8 C 22 C 8 C 22 C 25 25 86 86 54 54 183 183 32 32 92 92 54 54 197 197 25 23 85 86 50 52 177 186 31 29 157 217 77 94 291 360 23 23 83 85 64 56 193 190 29 34 154 230 80 107 289 398 23 25 88 83 65 52 193 182 31 34 159 228 79 105 290 392 23 22 89 83 64 56 194 181 31 38 154 233 83 104 287 402 24 22 104 87 92 77 240 205 35 43 152 250 80 103 286 422 24 24 104 95 96 75 241 216 36 46 154 273 80 104 291 448 Již po dvou týdnech skladování byl obsah TYR vyšší (120 mg/kg) než připouští toxikologický limit (100 mg/kg), ke konci doby minimální trvanlivosti byl jeho obsah již kolem 300 mg/kg. 2.10.3 Obsah biogenních aminů ve vybraných zrajících sýrech Sýr vytváří ideální prostředí pro tvorbu aminů, ale jejich koncentrace se velmi mění a tyto změny závisí na celé řadě faktorů, jako je např. druh sýru, doba zrání a mikroflóra. Velké změny v obsahu B byly také pozorovány u různých druhů sýrů, zvláště u sýrů vyrobených z nepasterizovaného mléka. Tvorba B v sýrech je závislá na koncentraci aminokyselin nebo peptidů, které působí jako prekurzory pro jejich tvorbu, přítomnost bakterií schopných dekarboxylace aminokyselin, ph, koncentraci soli, vodní aktivita, doba zrání a skladování, množství
mikroorganismů a přítomnost kofaktorů jako je pyridoxalfosfát (ve velkém množství přítomen v sýrech). Podmínkou vzniku toxického množství B v sýrech je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýru. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteázy z mléka, proteázy zákysových kultur, syřidlové enzymy, proteázy kontaminující mikroflóry, ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subs. Bulgaricus, E. faecalis a E. faecium). Nejvyšší obsahy těchto aminů jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvarůžků či romaduru) a v sýrech poloměkkých a plísňových. Další skupinou jsou sýry vyráběné z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek (např. brynza). Ve tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny B nižší. U sýrů z nepasterizovaného mléka byla zjištěna vyšší koncentrace TYR a HIS. Nejvyšší obsah B byl zjištěn u sýru z nepasterizovaného mléka (702,1 mg/kg) (Schneller a kol., 1997). Tab.1 Koncentrace biogenních aminů u sýrů vyrobených z nepasterizovaného a pasterizovaného mléka (Schneller a kol., 1997) Vzorek (poloměkký sýr) pasterizované mléko nepasterizované mléko Fenylethylamin (mg/kg) Putrescin (mg/kg) Kadaverin (mg/kg) Histamin (mg/kg) Tyramin (mg/kg) Celkový obsah B (mg/kg) 9,4 55 146 3,4 131,9 345,9 24,6 52,1 87,2 243,3 294,9 702,1 Tab.2 Koncentrace biogenních aminů (mg/kg) (Schneller a kol., 1997) Vzorek Fenylethylamin (mg/kg) Putrescin (mg/kg) Kadaverin (mg/kg) Histamin (mg/kg) Tyramin (mg/kg) Celkový obsah B (mg/kg) poloměkký sýr 12,3 21,6 111,4 96,2 141 373,8 tvrdý sýr 1,5 7,08 27,5 136,2 47,2 220,2 měkký sýr 0,05 2,7 11,7 0 1,5 16 Nejvyšší koncentrace B byla u poloměkkého sýru, následně u tvrdého sýru a sýrů měkkých. Pouze HIS měl nejvyšší koncentraci u tvrdého sýru, jinak jednotlivé koncentrace byly nejvyšší u poloměkkého sýru.
Při zrání sýrů dochází k výrazné tvorbě B jen v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry jen poměrně malá množství B. Koncentrace B v čerstvém mléce je nepatrná, převažujícími aminy jsou propylamin, hexylamin, alifatické di- a P, HIS a TYR. Obsah HIS v mléce se pohyboval od 0,5 0,8 mg/kg. Co do četnosti otrav jsou z fermentovaných potravin nejzávažnější sýry. Zvlášť vysoké koncentrace B jsou v tvrdých a v plátkových sýrech, obsah však může mít u každého druhu značný rozptyl. Z hlediska množství jsou v popředí zájmu HIS a TYR, přičemž u 2 3 % vzorků sýrů je třeba počítat s obsahy nad 1000 mg/kg. PE je zjišťován občas v množstvích 10 100 mg/kg. Výskyt B je v mléce nízký pod 1 mg/kg, ale v sýrech se udává až nad 1 g/kg. Množství TYR v sýru může dosáhnout hodnotu až 500 mg/kg, jestliže jsou přítomné proteolytické enzymy a tyramindekarboxyláza pozitivní kmeny E. faecalis subspp. Liquiefaciens (Stratton a kol., 1991). Valsamaki, Michaelinou (2000) zjistili v sýru Feta přítomnost TYR, PUT, HIS, CD, TRY a PE. Po 120 dnech zrání obsah TYR byl 246 mg/kg. Koncentrace HIS za 60 dnů zrání byla 47 mg/kg, ve 120. dnu zrání se koncentrace zvýšila na 84,6 mg/kg. Tento obsah je mnohem nižší než u sýru ementál (Stratton a kol., 1992; Taylor a kol., 1982). Koncentrace PUT v sýru Feta (77,7 a 193 mg/kg v 60 a 120 dnech) se podobala výsledkům, které uvedli Joosten, Northolt (1987). Nejvyšší koncentrace se objevovaly okolo 15. dne a pak mezi 60. dnem a 120. dnem. Nicméně celkový obsah B v sýru Feta je zřejmě vyšší než ukázaly výsledky experimentu z důvodu slané vody, která měla vliv na bílkoviny obsažené v sýru. Koncentrace TYR a PUT byly nejvyšší (69,7 % v 60. dnu zralosti a 71,2 % ve 120. dnu zralosti), zatímco koncentrace TRY a PE byly velmi nízké ve všech obdobích zrání (Valsamaki, Michaelidou, 2000). Innocente, D gostin (2002) se zabývali stanovením B v sýru Montasio. Experiment prokázal, že koncentrace hlavních B (HIS a TYR) byly ve všech obdobích zrání nízké. Obsahy TRY a PE byly ještě nižší než u HIS a TYR. Koncentrace HIS a TYR byla ve 150. dnu zrání 39 40 mg/100g sýru. Byla tedy vyloučena otrava tímto sýrem, protože koncentrace HIS by se musela pohybovat mezi 100 180 mg/100g sýru. Koncentrace CD byla velmi nízká a pohybovala se v rozmezí 2,58 16,75 mg/100g sýru. Zatímco koncentrace PUT se pohybovala
v toxických hodnotách a to mezi 54,98 110,46 mg/100g sýru. Vysoký obsah PUT je spojován především s kontaminací koliformními bakteriemi. Greif a kol. (1993) se zabývali zastoupením B (HIS, TYR, PUT, CD) v sýrech. B jsou významným indikátorem mikrobiální kontaminace a jejich vliv na lidský organismus je zkoumán celosvětově. Tab.5 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg/kg) (Greif a kol., 1993) Vzorek Tyramin (mg/kg) Histamin (mg/kg) Putrescin (mg/kg) Kadaverin (mg/kg) sýr "Zlato" 65 10,2 9,8 21,0 bryndza 410,0 201,2 500,8 856,2 Tab.6 Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg/kg) (Greif a kol., 2003) Vzorek Počet Kadaverin (mg/kg) Putrescin (mg/kg) Histamin (mg/kg) Tyramin (mg/kg) sýr Niva 6 25 705 7 61 1 28 3 82 sýr Primátor 6 1 42 5 30 1 20 2 120 sýr Ementál 8 5 30 4 20 5 50 130 420 Bryndza jarní 4 930 1208 520 610 180 202 408 435 sýr Balkán 3 1 20 1 35 58 102 3 29 sýr Hrudka 3 1 24 5 40 5 83 0 10 jogurt 5 0 0 1 5 10 45 Z tab. 6 vyplývá, že koncentrace TYR je překročena u vzorku ementálského sýru a jarní bryndzy. Přísun B z následujících potravin kromě ementálu a bryndzy, by za předpokladu normálního konzumu neměl u zdravých lidí vyvolat zdravotní problémy (Greif a kol., 2003). Jiná je však otázka u nemocných lidí, kteří užívají léky s inhibičními účinky na MO a DO, jako jsou antihistaminika (lfadryl, Bromadryl), tuberkulostatika (Ninrazid), ale především psychofarmaka s antidepresivním účinkem (Narval). Dle Velíška (2002) koncentrace B mohou dosahovat hodnoty až 2000 mg.kg -1 (HIS). Záleží na druhu sýru a dalších faktorech podporujících vznik B.
Tab.7 Koncentrace biogenních aminů (mg/kg) (Velíšek, 2002) Vzorek Kadaverin (mg/kg) Putrescin (mg/kg ) Histamin (mg/kg) Tyramin (mg/kg) Cheddar 4 408 1 996 0 1300 0 1500 Emmental 0 460 1 130 stopy 2000 1 1000 Gouda 1 140 1 200 0 850 0 670 Eidam stopy stopy 0 88 stopy 320 Roquefort 42 905 44 830 0 4100 stopy 1350 Martuscelli et al. (2005) se zabývali tvorbou B v průběhu zrání sýru Pecorino bruzzese, který je vyráběn z ovčího mléka. Sýry byly připraveny ze syrového mléka bez startovací kultury () a z pasterovaného mléka po přídavku startovací kultury (B). Produkce Pecorino bruzzese sýru z ovčího mléka je významně rozšířená v regionu bruzzo (střed Itálie). Tento sýr je vyráběn v různých podmínkách, kdy závisí na tradiční výrobě, objemu produkce. Pecorino bruzzese je polotvrdý nebo tvrdý ovčí sýr vyráběný ze syrového nebo tepelně upraveného mléka a často za použití vybraných startovacích kultur. Ve většině průmyslových odvětvích je mléko pasterizováno na teplotu 72 C po dobu 15 sekund. Zatímco u tradiční výroby je mléko pasterizováno na 57 68 C po dobu 15 sekund či déle. Toto mírnějším ošetření dovoluje přežít části divoké mikroflóry mléka, která může přispívat ke zrání sýrů společně s přidanými sekundárními mikroorganismy. Tato mikroflóra hraje významnou roli při vývoji organoleptických vlastností sýrů, ale je taky zodpovědná za ukládání nežádoucích látek, kterými jsou B (Stratton, Hutkins and Taylor, 1991; Suzzi and Gardini, 2003). Nicméně, jejich přítomnost může způsobit několik problémů citlivě reagujícím osobám jako např. nevolnost, respirační potíže, pocení, srdeční aritmie, bolesti hlavy, pálení v ústech, hyper- nebo hypotensi. Tyto potíže jsou závislé na kvantitativních rozdílech B v potravinách (Stratton a kol., 1991). Informace o zdravotní nezávadnosti P sýru je přesněji limitována. Především informace o obsahu B v těchto sýrech nejsou dostupná. Toto je nicméně zajímavé pro obě odvětví - vědu i veřejné zdraví. Jsou zkoumány formace B během zrání těchto sýrů. kumulace B byla studována během zrání sýrů ve vztahu s dynamikou mikrobiální populace při změně nejdůležitějších fyzikálně-chemických parametrů (Martuscelli et al., 2005). Obsah B ve skupině byl 697 mg/kg a v B 1086 mg/kg. Ve skupině se celkový obsah B zvýšil ze 34 mg/kg na 401 mg/kg během 14 dnů zrání a mírné zvýšení nastalo v době od 14 do 60 dnů. V porovnání se skupinou B byla pozorována