Mutace s dobrou prognózou, mutace se špatnou prognózou omezené možnosti biologické léčby pro onkologické pacienty J.Berkovcová, M.Dziechciarková, M.Staňková, A.Janošťáková, D.Dvořáková, M.Hajdúch Laboratoř experimentální medicíny www.lem-olomouc.cz
Biologická léčba Cílené působení na určitý protein monoklonální protilátky konjugáty ligand + toxin nízkomolekulární látky inhibující fosforylaci intacelulární části receptoru zastavení patologické signální dráhy Minimální toxicita proti standardní chemo a radioterapii Nová léčba = nové problémy
Chronická myeloidní leukémie gen BCR 1986 objev proteinu 210kDa chromozom 22 produkt fúzního genu BCR/ABL (Ben Neriah Y. et al.) gen ABL chromozom 9 gen BCR/ABL Ph chromozom
Imatinib mesylát STI 571 chimerický protein Bcr/Abl reaguje na patologickou funkci nádorové buňky přináší nové problémy REZISTENCE tyrozinkinázová aktivita nekontrolovaná a konstitutivní fosforylace aktivuje řadu přenašečů různých signálních drah inhibice tyrozinkinázy Bcr/Abl
Mechanismus rezistence na imatinib 1) amplifikace BCR/ABL genu zmnožení Ph chr., tandemové duplikace overexprese BCR/ABL genu 2) bodové mutace ATP vazebné domény BCR/ABL genu 3) zamezení vstupu imatinibu do buňky: overexprese P-glykoproteinů overexprese Bcl-X L overexprese α-1 acid glykoproteinů Progrese CML po terapii imatinibem imatinibu zamezena vazba ke katalytické Abl doméně proteinu Bcr/Abl leukémie na Bcr/Abl kináze nezávislá
Bodové mutace v katalytické doméně Bcr/Abl BCR ABL ATP binding activator loop --WEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIITEFMTYG NLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKFPIKWTAPE SLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDRSQVYELLEKDYRMKRPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSFAEIHQAFET-- 1. bodové mutace v oblastech interakce k imatinibu přímé znemožnění vazby 2. bodové mutace v přilehlých oblastech změna konformace proteinu
Detekce mutace M244L Trp Glu Met Glu Arg Thr Asp gen. kód ATG => Met polární aminokyselina gen. kód CTG => Leu neutrální aminokyselina A >C Met >Leu změna struktury kinázové domény ABL Relaps onemocnění další inhibitory???
Overexprese Egfr1 u nádorů epiteliálního původu Head & neck 80-100% Renal cell 50-90% NSCLC 40-80% Glioma 40-50% Ovarian 35-70% Pancreatic 30-50% Colorectal 25-77% Breast 14-91% Gastric 40% Signální dráha AKT a STAT přežívání buněk Signální dráha MAPK proliferace buněk
Cílené působení na Egfr1 Anti-EGFR1- blocking antibodies Anti-ligandblocking antibodies TK inhibitors P P Ligand toxin conjugates P P Antibody toxin conjugates Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.
Patologická aktivace Egfr1 Amplifikace genu egfr1 Overexprese genu egfr1 Aktivující mutace tyrozinkinázové domény Používané preparáty TK inhibitory: Iressa (gefitinib, ZD1839) NSCLC Tarceva (erlotinib, OCI774) NSCLC Humanizové protilátky: Erbitux (cetuximab) metastazující kolorektální ca Vectibix (panitumumab) metastazující kolorektální ca
Nízkomolekulární inhibitory tyrozinkináz Arora et Scholar, 2005
Aktivující mutace Egfr1 Přítomné v tyrozinkinázové části receptoru Bodové mutace záměna aminokyselin Delece (spojené s inzercí) bez posunutí čtecího rámce
Rezistence k inhibitorům - odpověď na léčbu u < 10% pacientů s NSCLC Jeden z důvodů mutace v genu k-ras (v dalších členech signální dráhy?) Velikost 21 kda GTP-vázající protein Tvorba různých isoforem v tkáních Součást transdukční kaskády Účastní se přenosu signálu
Mutace ve 12 a 13 kodonu celkově špatná prognóza rezistence na konvenční chemoterapii
Automatizace čtení značení radioaktivně ruční čtení fluorescenční značení automatické čtení
Úskalí sekvenace DNA po mikrodisekci aberantní nukleotid (T) DNA z celkové tkáně wt nukleotid (A)
Metoda detekce bodových mutací BM izolace RNA reverzní transkripce PCR sekvenace PCR produktu ligace plazmidu, transformace bakterií sekvenace pozitivních kolonií AAAAAAAAA NH 2 RT-PCR produkt 1327bp sekvenovaný úsek Bcr Abl SH1 SH2 SH3 katalytická doména COOH
Zpracování materiálu - zamražená nádorová tkáň - parafinové bločky - cytologické preparáty tkáň před disekcí selekce buněk k disekci tkáň po disekci uchycení buněk na víčku natrávení buněk proteinázou K uvolnění DNA do roztoku
Autorský kolektiv: Jitka Berkovcová Marta Dziechciarková Marcela Staňková Anna Janošťáková Dana Dvořáková Marián Hajdúch Podporováno: firmou Astra-Zeneca granty: MSM6198959216 IGA MZCR NC7506-3 NC7495 Děkuji za pozornost