Vyšetřování molekulárních markerů v prognóze onemocnění a predikci účinku protinádorové léčby u solidních tumorů: Kde jsme a kam se ubíráme?

Transkript

1 Vyšetřování molekulárních markerů v prognóze onemocnění a predikci účinku protinádorové léčby u solidních tumorů: Kde jsme a kam se ubíráme? Marek Minárik Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac International, s.r.o., Praha Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Praha

2 Determinanty léčebného výsledku v onkologii Rozsah onemocnění (progrese, staging) Biologické vlastnosti nádoru (molekulární profil) Léčebný výsledek Léčba (typ, dávkování,atd.) Individuální predispozice

3 Stadia vývoje zhoubného nádoru může zahrnovat mutace v genech pro opravu DNA normální buňka zvýšená proliferace časná neoplázie mutace v genu A mutace v genu B mutace v genu C metastáza karcinom progredujíc í neoplázie chromozomové ztráty rostoucí aneuploidie chromozomů

4 Progrese nádorového onemocnění Hereditární formy, nádorová susceptibilita Prediktivní faktory, Nežádoucí účinky Minimální residuální nemoc Prognostické faktory, Predispozice Léčba a monitoring Prognóza přežití Molekulárně-genetické metody

5 Defekty DNA Genetické: Genové mutace Alelické delece Chromozomální aberace Genové amplifikace (CNV, copy number variation) Overexprese EpiGenetické Hypermetylace RNA interference

6 Vrozené vs. somatické defekty DNA Vrozené (zárodečné) - vyšetřování v periferní krvi - nenáročné na detekční limit - definují predispozice pacienty Somatické (získané) - vyšetřování v postižené tkáni - náročné na detekční limit - definují biologické chování nádoru

7 Genetická podstata zhoubného bujení (1) genetické onemocnění sporadické forma (somatické mutace) hereditární forma (vrozené mutace) familiární výskyt nekontrolovaná buněčná proliferace iniciace nádorového procesu geny kódující: proteiny signalizačních drah pro buněčnou proliferaci regulátory mitotického cyklu složky aparátu apoptózy proteiny odpovědné za detekci a opravu mutací

8 Genetická podstata zhoubného bujení (2) postupné molekulárně genetické změny aktivace onkogenů inaktivace tumor supresorových genů chromozomální translokace

9 Diagnosticko-léčebný postup Klinická diagnostika - identifikace tumoru, staging (zobrazovací techniky, endoskopie, histologie, ) Molekulární diagnostika - nalezení defektní signální dráhy (histologie, molekulární genetika, ) Léčba - potlačení nebo kompletní vyřazení (inaktivace) dané signální dráhy - management vedlejších účinků

10 Molekulární mechanismy rakoviny

11 Cílená terapie Monoklonální protilátky - antierbb2 (Trastuzumab) - antierbb1 (Cetuximab) - antivegf (Bevacizumab) Nízkomolekulární TK inhibitory - gefitinib, erlotinib - sunitinib, sorafenib

12 Cetuximab, Panitumumab Terapie zacílená na HER1/EGFR Anti-HER1/EGFRblokující protilátky Protilátky proti ligandám TK inhibitory komplexy liganda toxin komplexy protilátka toxin Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344: ; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19: ; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59: ; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:

13 Predikce účinnosti cílené biologické léčby Blokace EGF-signální dráhy EGF EGF AMPLIFIKACE EGFR EGFR Shc Grb2 Sos1 Ras Ras GTP GDP Raf EGFR JAK PI3K MEK KRAS STAT AKT RalGDS ERK PŘEŽITÍ INHIBICE APOPTOZY ZMĚNY CYTOSKELETONU PROGRESE BUNĚČNÉHO CYKLU BUNĚČNÁ PROLIFERACE DIFERENCIACE

14 Predikce odpovědi na léčbu Odpověď na léčbu v závislosti na přítomnosti mutace EGFR u nemalobuněčného karcinomu plic Pešek et al., Anticancer Res, 2009

15 Molekulární diagnostika Základní metodické požadavky - citlivost - robustnost/spolehlivost - jednoduchost - rychlost - nízkonákladovost

16 Metodika detekce mutací Denaturační kapilární elektroforéza (DCE) PCR kapilární elektroforéza vyhodnocení fl. značené primery 96 bp produkt specifická teplota bez purifikace PCR fr. mírná zkušenost bez speciálního sftw. GenoScan kit wt mutace

17 Detekce mutací Vyšetřování přítomnosti delece v exonu 19 genu EGFR Vzorek bez delece Analýza 120 sec 15 bp delece Vzorek s delecí

18 Detekce mutací Vyšetřování přítomnosti mutace v exonu 21 genu EGFR Vzorek bez mutace Analýza 60 sec Vzorek s mutací

19 Vyšetřování EGFR amplifikací Fluorescenční in-situ hybridizace (FISH)

20 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Metoda založená na kombinaci selektivní ligace a amplifikace Rutinní metoda pro vyšetřování zárodečných delecí v lékařské genetice (BRCA1, BRCA2, MSH2 and MLH1..)

21 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Metoda založená na kombinaci selektivní ligace a amplifikace Rutinní metoda pro vyšetřování zárodečných delecí v lékařské genetice (BRCA1, BRCA2, MSH2 and MLH1..)

22 Experimentální data Negativní kontrola Negativní vzorek

23 Experimentální data Negativní kontrola Positivní vzorek

24 FISH MLPA Zpracování vzorku (krájení, mikrodisekce) Zpracování vzorku (vyjmutí, mikrodisekce) Příprava DNA (DNA unmasking) Izolace DNA Denaturace vzorku a próby Ligace Hybridizace vzorku a próby PCR reakce Omytí próby Kapilární Elektroforéza Detekce mikroskopem Vyhodnocení

25 Terapeutický algoritmus EGFR KRAS AMPLIFIKACE MUTACE MUTACE T790M CITLIVOST RESISTENCE RESISTENCE? Vzájemné kombinace

26 Dvojité mutace

27 Terapeutický algoritmus EGFR KRAS AMPLIFIKACE MUTACE MUTACE T790M CITLIVOST RESISTENCE RESISTENCE? Vzájemné kombinace

28 Přežití epidermoidních tumorů 100 Survival probability (%) p EGFR = 0,5967 p KRAS = 0,9277 MUTATION EGFR KRAS NONE Days

29 Terapeutický algoritmus EGFR KRAS AMPLIFIKACE MUTACE MUTACE T790M CITLIVOST RESISTENCE RESISTENCE? Vzájemné kombinace

30

31 Screening vrozené susceptibility

32 Buněčný cyklus a poškození DNA Mitosis (division) Interphase (resting) G1 growth S DNA synthesis G2 - growth Zastavení cyklu Poškození Oprava Apoptóza

33 Sledování DNA polymorfismů DNA polymorfismus drobná variace, která může ovlivnit funkci Systém DNA oprav Systému kontroly buněčného cyklu Systém aktivního transportu

34 Významné polymorfismy ve farmakogenomice solidních nádorů Kontrola růstu na buněčné úrovni - buněčný cyklus a proliferace: CCND1, CDKN2A (p14 a p16), CDKN1A (p21), MYC, p53 - růstové faktory: EGFR1 - cytoskeleton: TUBB - apoptóza: p53, APO-1 (FAS) Geny DNA oprav - bázová excisní oprava: XRCC1, XRCC3 - nukleotidová excisní oprava: ERCC1, ERCC2 - mutátorová oprava: hmsh2 Faktory tumorové invazivity a metastáz - immunitní odpovědi: TNF-alfa, TNF-beta, IL-6, IL-10 - extracelulární matrice: MMP-1, MMP-3 - angiogeneze: VEGF, NOS-3 - buněčná adheze: ITGA2, ITGB3BP, CDH1 Polymorfismy genů syntézy a metabolismu - androgenní syntéza: SRD5A2 - metabolismus: CYP17, CYP19, COMT1, MTHFR, UGT1A1 - hormonální receptory: AR, VDR1 Polymorfismy membránových transporterů P-glykoprotein (MDR1)

35 Genotypování polymorfismů GG TT AG CT AA CC C T

36 Závislost frekvence odpovědí na kombinacích genotypů 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Respondeři Nerespondeři ERCC1 a XRCC3 0 CCTT CTTT CCCT CCCC TTTT CTCT CTCC TTCT TTCC

37 Monitorování a prognóza

38 Monitorování progrese Model progrese nádorového onemocnění zdroj: Thibodeau/Patton, 2002 primární nádor nádorové buňky v krevním řečišti vzdálené metastázy

39 Minimální reziduální choroba Cirkulující nádorové buňky (CTC - circulating tumour cells) Engell HC. Cancer cells in the circulating blood; a clinical study on the occurrence of cancer cells in the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation. Acta Chir Scand Suppl. 1955;201:1-70. Roberts SS, Watne AL, McGrew EA, McGrath RG, Nanos S, Cole WH. Cancer cells in the circulating blood. zdroj: Nature 450, , 2007 Surg Forum. 1957;8: koncentrace 5 CTC/5ml přítomnost epiteliálně-specifických antigenů exprese nádorově specifických mrna výskyt u 50% pacientů

40 Minimální reziduální choroba Volná nádorová DNA (CFDNA - cell free DNA) Bendich A, Wilczok T, Borenfreund E. Circulating DNA as a possible factor in oncogenesis. Science Apr 16;148: Anker P, Lefort F, Vasioukhin V, Lyautey J, Lederrey C, Chen XQ, Stroun M, Mulcahy HE, Farthing MJ. K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. zdroj: Gastroenterology Apr;112(4): původ z CTC - apoptóza nebo aktivní uvolňování fragmenty o velikosti 200bp výskyt somatických DNA variací přítomných v primárním tumoru výskyt u 40-70% pacientů

41 Monitorování progrese KRCA Schéma experimentu Laboratorní část Klinická část ODBĚR VZORKŮ IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN DETEKCE NÁDOROVÝCH MARKERŮ tkáň plazma, moč periferní krev tkáňová DNA volná DNA mrna z CTC DNA mutace KRAS, APC, TP53 DNA mutace pozitivní ve tkáni mrna exprese CEA, GA733-2, EGFR

42 Monitorování progrese KRCA Časový průběh odběrů Během operace primární tumor uzlina, metastáza krev plazma moč Časový průběh onemocnění Před operací (kolonoskopie) primární tumor krev plazma moč Po operaci (1. den) Po operaci (7. den) krev plazma moč Sledování (3. měsíc) Sledování (6-12. měsíc)

43 Set of acquired samples Primary tumors 49 Local nodes 9 Metastases 5 Plasma and blood prior to surgery 2 x 48 Plasma and blood at the surgery 2 x 28 Plasma and blood 24 hours after surgery 2 x 28 Plasma and blood 7-10 days after surgery 2 x 25 Plasma and blood 3 6 months after surgery 2 x 8 Total samples 307

44 Correlation of cfdna in plasma to disease stage Patients with mutation in primary tumour 20 Stage I III (without metastases) 10 Plasma examined 10 Plasma positive 2 (20%) Plasma negative 8 (80%) Stage IV (metastatic disease) 10 Plasma examined 9 Plasma positive 7 (78%) Plasma negative 2 (22%)

45 Monitorování progrese onemocnění Detekce exprese mrna RT-PCR + fragmentační analýza na čipu (Agilent BioAnalyzer) - amplifikace nádorově specifických markerů - vyhodnocení přítomnosti a množství PCR produktů

46 Kvantifikace nádorové DNA W M Mutace 45% Wildtype 65% Primární nádor W Uzlina M Mutace 60% Wildtype 40% Metastáza W M Mutace 80% Wildtype 20%

47 Možnost časového sledování

48 Kazuistiky

49 Post-surgery follow-up (Case 1) Male patient, age 62 with rectal tumour, Stage IV, liver + lung meta undergoing paliative surgery (sigmoideostomy) and bevacizumab therapy Sampling Plasma mut. quantity Circulating cells Pre-surgery 0,69 positive 1st day post-operation 0,48 positive 14th day post-operation 0,24 negative 3 months follow-up 0 negative

50 Post-surgery follow-up (Case 1) Male patient, age 62 with rectal tumour, Stage IV, liver + lung meta undergoing paliative surgery (sigmoideostomy) and bevacizumab therapy

51 Post-surgery follow-up (Case 2) Female patient, age 71 with rectal tumour, Stage IV, liver meta undergoing neoadjuvant bevacizumab therapy with subsequent pelvic exenteration Sampling Plasma mut. quantity Circulating cells Pre-surgery 1,30 negative 1st day post-operation 0,45 negative 14th day post-operation 0,75 negative 3 months follow-up 0,9 negative

52 Post-surgery follow-up (Case 2) Female patient, age 71 with rectal tumour, Stage IV, liver meta undergoing pelvic exenteration and neoadjuvant bevacizumab therapy

53 Aplikace molekulárně-genetických metod Pochopení molekulárních mechanismů Detekce časných stádií Detekce reziduální choroby Monitoring biologického chování - progrese,metastázy Prediktivní onkologie - testy rezistence - farmakogenomika Genová terapie

54 Poděkování Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac, Praha RNDr. Anna Mészárosová, Barbora Belšánová, Andrea Krajčová LF Plzeň, Klinika TRN, FN Plzeň Prof. Miloš Pešek, MUDr. Ondřej Fiala, MUDr. Dana Jančaříková 1.LF UK, Interní klinika, Ústření vojenská nemocnice, Praha Prof. Miroslav Zavoral, MUDr. Cyril Šálek, MUDr. Štěpán Suchánek 1.LF UK, Chirurgická klinika, Fakultní Thomayerova nemocnice, Praha Doc.Vladimír Visokai, MUDr. Ludmila Lipská, MUDr. Miroslav Levý

55 Děkuji vám za pozornost