Problematika imunoanalytického stanovení tyreoidálních hormonů a faktorů. Doc. Ing. Radovan Bílek, CSc. Endokrinologický ústav v Praze CZ/EUT/0317/0005
Disclosure Tato prezentace je sponzorována společností Merck
Tyreopatie v České republice diagnózy E00-E07 Data VZP (6 000 000 pojištěnců) za období 2012-2015
Správnost imunoanalýzy je určená její pravdivostí a přesností PRAVDIVOST: souhlas mezi deklarovanou referenční hodnotou vzorku (etalonu) a jeho naměřenou hodnotou. Mírou pravdivosti je odchylka (bias) mezi naměřenou a deklarovanou hodnotou vyjadřující systematickou chybu stanovení. PŘESNOST: rozptyl opakovaného stanovení téhož vzorku. Mírou přesnosti je směrodatná odchylka (% CV) nebo mezikvantilové rozmezí vyjadřující náhodnou chybu stanovení. Kvalitativní kritéria stanovení: analytická správnost a biologická variabilita určující referenční rozmezí a akceptovatelnou nejistotu měření.
Problematika imunoanalýzy Imunoanalýza je založena na specifické interakci mezi protilátkou a antigenem nebo haptenem. Imunoanalytická kvantita nemusí přesně odpovídat biologické aktivitě sledované látky.
Analytická sensitivita a specificita imunoanalýzy je daná: analyticky klinicky vlastností protilátky vlastnostmi antigenu, haptenu imunoanalýza nemusí rozeznat normální a biologicky změněné isoformy Ag interakce Ag-Ab může být u isoforem Ag pozměněná přítomností autoprotilátek přítomností heterofilních protilátek nespecifickými interakcemi změnou koncentrace a afinity vazebných proteinů medikací těhotenstvím vážností netyreoidálních onemocnění rezistencí na tyreoidální hormony stresem, hladověním, depresí, cirkadiánními variacemi, etnikem
Vlastnosti analytické protilátky SPECIFICITA imunoanalýzy: specifická protilátka nejsilněji interaguje s imunisačním Ag, ale může také zkříženě interagovat s látkami strukturálně podobnými. SENSITIVITA (citlivost) imunoanalýzy: je daná afinitní konstantou, čím je specifická interakce slabší, tím více zkříženě interagujících látek se na interakci může podílet. Analytická citlivost (mez detekce) kvalitativní údaj nejnižší možná koncentrace analytu, jejíž odezva je statisticky význačně odlišná od nulového vzorku Funkční citlivost (mez, limit kvantifikace, stanovitelnosti) kvantitativní údaj nejnižší koncentrace, která může být stanovena s přijatelným stupněm nejistoty, tj. s přijatelnou úrovní pravdivosti a přesnosti imunochemie - funkční citlivost je dána % CV = 20 % IUPAC % CV = 10 %
Vlastnosti antigenu TSH- 29 kda (a 92 aa, b 118 aa), glykoprotein, imunometrické metody isoformy TSH lišící se glykosidickým obalem centrální porucha = TSH se biologickou aktivitou danou glykosylací, ale sialysací hypofyzární tumory = TSH se biologickou aktivitou makrotsh = komplex TSH s IG (Mw > 150 kda) se sníženým vylučováním (falešné TSH) a nízkou biologickou aktivitou prevalence 0.8 % pacientů se subkl. hypotyreoidismem, falešný subklinický hypotyreoidismus endogenní antitsh falešné TSH, prevalence 2/300000, prostup placentou Tyreoglobulin (Tg) 660 kda (homodimér, podj. 2749 aa), jodoglykoprotein, imunometrické metody isoformy Tg lišící se posttranslačními glykosylačními, jodačními, sulfatačními, fosforylačními modifikacemi i primární strukturou více imunogenní je Tg u DTC pacientů (25 % prevalence antitg) obsahu I vede ke interakce Ab-Ag a k falešnému Tg (a opačně) nádorový Tg má velmi snížený obsah I pacienti s GB mají snížený obsah I pacienti s tyreoiditidou mají imunogenicitu přítomnost antitg u nekompetitivních metod falešně Tg přítomnost heterofilních protilátek u nekompetitivních stanovení falešně Tg
Vlastnosti haptenu tt4, tt3 - kompetitivní imunoanalýza s použitím 8-anilin-1-naftalensulfonové kyseliny a veronalového pufru k uvolnění TH z vazby na tyreoidální vazebné proteiny (TBP) TBP: TBG, transtyretin, albumin syntetované v játrech snížení nebo zvýšení koncentrace vazebných proteinů (zásadní je úloha TBG) vede ke snížení či zvýšení celkových tyreoidálních hormonů i mimo referenční rozmezí, ale volná frakce tyreoidálních hormonů je v referenčním rozmezí a jedinec je v eutyreoidálním stavu tt4: 60-75% na TBG, 15-30% na TBPA, 10% na albumin tt3: 75% na TBG, < 5% na TBPA, 20 % na albumin ft4, ft3 (0.03 % tt4, 0.3 % tt3) kompetitivní imunoanalýza všechny analytické metody porušují rovnováhu PŘÍMÉ METODY: rovnovážná dialýza (referenční metoda), ultrafiltrace nezávislé na TBP, ale obtížné a málo dostupné NEPŘÍMÉ INDEXOVÉ METODY: založené na stanovení vazebné kapacity séra IMUNOANALÝZA metoda zpětné titrace, analogová metoda, metoda značené protilátky, neměly by být ovlivněny vazebnými proteiny, ale existuje závislost na koncentraci a vazebné kapacitě TBP Problémy změna koncentrace vazebných proteinů antith => ft4 klinická hypotyreosa se mění na subklinickou, postihuje to i tth podání T4 a léků vytěsňujících TH z vazebných proteinů perfluoroalkylové polutanty vytěsňují TH z vazby na TBG i TBPA medikace měnící biol. aktivitu TRH, TSH, dejodáz
T3[nmol/L](1.3-3.1) FT3[pmol/L](3.1-6.8) T4[nmol/L](66-181) FT4[pmol/L](12-22) Závislost volných frakcí hormonů štítné žlázy na transportních proteinech (TBG) 200.0 30.0 150.0 22.5 100.0 15.0 50.0 7.5 0.0 10 23 35 48 60 TBG[mg/L] (10.7-23.1) 0.0 10 23 35 48 60 TBG[mg/L] (10.7-23.1) 4.0 10.0 3.3 8.0 2.5 6.0 1.8 4.0 1.0 10 23 35 48 60 TBG[mg/L] (10.7-23.1) 2.0 10 23 35 48 60 TBG[mg/L] (10.7-23.1)
Autoprotilátky TSHr 7TM glykoprotein GPCR Topolčan et al.: In vitro diagnostika 22(2012)5-15 TRAK (%) Obecná populace 0 Hashimotova tyreoditida 15 GB thyreoiditida 90 Toxická uzlovitá struma 15 Nádory štitné žlázy 5 Těhotenství 1 Autoimunní onemocnění 10 antitshr (TRAb) stimulující TSHr (TSAb) GB inhibující TSHr (TBAb) myxedem TRAK: v přítomnosti TRAb dochází k inhibici vazby značeného TSH* na lidský rekombinantní TSHr není možné rozeznat TBAb a TSAb % CV intereseje > 10 antith běžně se nestanovují častá asociace s autoimunním a zánětlivým onemocněním, v menším rozsahu přítomny i u zdravých lidí, vysoká korelace mezi antitpo/antitg a antith ~ 2 % v obecné populaci, ~ 30 % u pacientů s autoimunním onemocněním štítné žlázy ANALYTIKA: antith koncentraci fth i tth u kompetitivních imunoanalýz=omezují dostupnost TH* antit4 mají koncentraci i afinitu dostatečnou k interakci s ft4 ale nedostatečnou k interakci s tt4 (tth jsou ovlivněny méně než fth) antitg => antith => ft4 (i tth) klinicky se manifestující hypotyreóza se mění na falešnou subklinickou hypotyreoózu antith mohou proniknout přes placentu=>falešně negativní screening kongenitálního hypotyreoidismu u novorozenců
antitg prevalence 11 % (20 %) normální populace falešně-negativní interference v imunometrickém stanovení Tg falešně pozitivní i negativní interference v kompetitivní imunoanalýze Tg antitpo Analytika: imobilizovaný Tg (TPO) : antitg (antitpo) : Ab* vůči lidským IG antitg, antitpo často asociovány s autoimunním a zánětlivým onemocněním, v menším rozsahu jsou přítomny i u zdravých lidí Interference: heterofilní Ab a revmatoidní faktory, heterogenita Tg, TPO Isoformy TPO, Tg dané alternativním štěpením mrna, posttranslační glykosylační (Tg jodační, sulfatační, fosforylační modifikace, TPO vazba na HEM), ovlivňují specificitu i afinitu interakcí mezi epitopy a paratopy Topolčan et al.: In vitro diagnostika 22(2012)5-15 Anti-Tg anti-tpo Obecná populace 5-25 5-20 Hashimotova tyreoditida 70-80 90-100 GB thyreoiditida 50-60 70-80 Nádory štitné žlázy 30-60 10-40 Těhotenství 8-14 8-14 Autoimunní nemoci 40 40 Diabetes mellitus 1. typu 40 40 Nadledvinková insuficience 30 60 Perníciózní anemie 30 40 Revmatoidní artritida 40 60 Ca prsu 5 50 Ca kolorekta 0 40 Tyreoidální peroxidasa (TPO) hem-obsahující glykoprotein s 1 TM oblastí, 933 aa prevalence 11 % v oblastech bez jodového deficitu (USA, Japonsko) v porovnání se 6 % v jodově deficitní Evropě zvýšená je i u netyreoidálních autoimunitních onemocnění a ve stáří přítomnost antitpo u eutyreoidních subjektů je rizikovým faktorem vývoje onemocnění ŠŽ
Heterofilní protilátky Multispecifické polyreaktivní Ab, revmatoidní faktory (IgM) lidské anti-zvířecí protilátky (prevalence ~ 3.1 % ) HAMA (human anti-mouse antibodies) jsou autoab vůči myším IG, které se vážou na analytické myší IgG prevalence 0.26 % (1901 pacientů se subkl. hypofunkcí) kontakt se zvířetem, diagnostika nebo terapeutika pomocí mab revmatoidní faktory vázající se na zvířecí specifické analytické protilátky prevalence ~5 % v obecné populaci, až 70 % u revmatických pacientů v imunometrických esejích využívajících monoklonální protilátky existují pozitivní interference s prevalencí 1-2 pacienti z 1000 falešné zvýšení TSH, Tg u nekompetitivních imunoanalýz přemostění immobilisovaných a značených analytických protilátek i bez přítomnosti stanovovaného antigenu v kompetitivní imunoanalýze je menší vliv na interakci Ab-Ag než u nekompetitivních imunoanalýz, projevují se hlavně negativní interference (blokuje se analytická protilátka) falešné snížení např. TSH Heterofilní Ab prostupují placentou prevalence do 3 % problém s neonatálním screeningem
Nespecifické vlivy Jestliže lab. výsledky nesouhlasí s klinickým obrazem, je nejlepší analýzy opakovat s jiným fyzikálně-chemickým způsobem stanovení nebo alespoň použít kit jiného výrobce. hemolýza, lipémie, antikoagulancia, uložení vzorku, ph, pi lipidy a silikonové oleje ve zkumavkách, fibrin v plasmě mohou maskovat jak epitopy, tak i paratopy Mg 2+, Ca 2+ mohou měnit konformaci Ag v plasmě, mění aktivitu ALP Podání biotinu pacientům ve vysokých koncentracích mělo za následek interference v streptavidin-biotinové technologii imunoesejí falešné u kompetitivních imunoanalýz ft4, tt3, antitshr falešné u nekompetitivních analýz TSH laboratorní diagnostika odpovídala u 6 dětských pacientů falešné GB hyperfunkci ŠŽ
Standardizace řeší analytickou problematiku imunoanalýzy Nastavení všech imunoanalýz různých výrobců tak, aby pro totožný vzorek dávali stejně správný, tj. analyticky přesný a pravdivý výsledek. the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) Committee for Standardization of Thyroid Function Tests Bias ft4 i ft3 vyšší než 20 % průměru - EQAS Immunocheck (1000 laboratoří) FT4 negativní bias ve středním pásmu koncentrací do 30 %, v nízkém pásmu koncentrací až 90 % oproti referenční metodě rovnovážné dialýzy s LC-MS/MS vyhodnocením TSH selhávalo na okraji fyziologických pásem Variace v referenčních rozmezích i v laboratorní platformě vedou především k vyššímu počtu diagnóz (sub)klinického hypotyreoidismu v závislosti na použitých přístrojích Standardizace je možná tehdy, jestliže všichni výrobci budou používat pro daný analyt stejnou analytickou protilátku a kalibrátory budou navázány na mezinárodní referenční standardy (etalony). Každý výrobce používá různou analytickou protilátku rozeznávající různé epitopy heterogenního antigenu, popř. využívá ke stanovení autoprotilátek heterogenní antigen. Interakce Ab-Ag má různou afinitu a naměřené koncentrace daného analytu se liší. Užití Tg standardu CRM-457 od Community Bureau of Reference of EC redukovalo koeficient variace intereseje z 43 % na 29 % - tj. pořád existují podstatné rozdíly mezi výsledky získanými pomocí různých kitů pro Tg (Zimmermann MB et al.: J Clin Endocrinol Metab 91(2006)4881-7)
Thienpont LM et al.: IFCC Working Group for Standardization of Thyroid Function Tests. Clin Chem Lab Med. 2010;48(11):1577-83 referenční postup: kapalinová chromatografie/tandemová hmotnostní spektrometrie (ID-LC/tandem MS) Abbott DiagnosticsArchitect i2000, AxSYM (htsh_ii) Beckman Coulter, Inc. Access 2 biomérieux s.a. VIDAS(TSH and TSH3) and VIDIA DiaSorin S.p.A. Liaison Ortho-Clinical DiagnosticsVITROS ECi / ECiQ Immunodiagnostic Systems Olympus Life Science Europa GmbH AU3000i Roche Diagnostics GmbH Elecsys 2010 Siemens Healthcare Diagnostics ADVIA Centaur (TSH-3), Dimension RxL, Dimension EXL, Dimension Vista 1500, IMMULITE 2000 Tosoh Corporation AIA-1800
SEKK - externí hodnocení kvality: cyklus E14/16, TM1/16, AT2/16 medián; interval 16%-84% kvantil, dolní a horní mez stanovení Výrobce Typ analýzy n TSH (miu/l) n ft4 (pmol/l) n ft3 (pmol/l) n tt4 (nmol/l) n tt3 (nmol/l) n TG (mg/l) antitpo; anti TG; ant i TSHr 1,03 1,46 1,90 17,7 24,5 31,3 7,13 10,5 13,9 98,9 138 176 2,39 3,51 4,62 2,51 8,35 14,2 CELKEM 1520 1434 1313 176 227 221 n = 192 B.R.A.H.M.S RIA 36 40 40 Immunotech RIA 5 7 7 Euroimmun RIA 22 21 16 MEDIPAN Diagn. RIA 9 8 8 Demeditec RIA 28 31 34 DRG EIA 15 Abbott FIA 6 biomérieux FIA 34 20 20 B.R.A.H.M.S FIA 26 TOSOH FIA 26 23 18 5 8 85 % úspěšnost v kvalitativním vyhodnocení Abbott LIA 220 207 187 30 32 Beckman Coulter LIA 128 111 105 15 16 16 Siemens (DPC) LIA 153 125 102 14 31 51 Johnson&Johnson LIA 5 Roche LIA 644 565 520 52 75 87 Siemens (Dade) LIA 86 68 56 DiaSorin LIA 16 23 24 17 Siemens (Bayer) LIA 74 163 158 37 45
LC-MS/MS referenční metoda pro tyreoidální analytiku simultánní stanovení celkových TH a jejich metabolitů v 50 ml séra s detekčním limitem v subjednotkách pg/50 ml stanovení tth a fth rovnovážnou dialýzou s LC- MS/MS kvantifikací stanovení Tg po jeho digesci trypsinem pomocí peptidů charakteristických pro Tg digescí se eliminuje antitg
Harmonizace řeší klinickou problematiku imunoanalýzy Nastavení referenčních rozmezí s přihlédnutím k pohlaví, stáří, těhotenství, etniku tak, aby bylo dosaženo co nejlepší klinické sensitivity a klinické specificity. referenční intervaly různých výrobců jsou nesignifikantně různé pro TSH a signifikantně různé pro ft4 pro TSH, ft4 existují významné rozdíly mezi pohlavím (ženy vyšší hodnoty), etnikem, denním časem odběru (TSH nejvyšší v noci), pro ft3, tt3 existují významné rozdíly ve stáří (4544)
Over 70 60 To 70 50 To 60 40 To 50 30 To 40 20 To 30 10 To 20 Up To 10 Over 70 60 To 70 50 To 60 40 To 50 30 To 40 20 To 30 10 To 20 Up To 10 Over 70 60 To 70 50 To 60 40 To 50 30 To 40 20 To 30 10 To 20 Up To 10 Vliv stáří na koncentraci TSH a volných frakcí tyreoidálních hormonů 2.40 TSH (general population) Mean TSH (miu/l) 2.15 1.90 1.65 1.40 AGE (years) FT4 (general population) FT3 (general population) 17.00 7.00 Mean FT4 (pmol/l) 16.50 16.00 15.50 Mean FT3 (pmol/l) 6.25 5.50 4.75 15.00 4.00 AGE (years) AGE (years)
EUthyroid - evropský výzkumný projekt pro harmonizaci, udržení a zlepšení příjmu jódu a pro předcházení nemocí souvisejících se štítnou žlázou v Evropě. Součást strategického programu HORIZON 2020 pro výzkum a inovace EU, hlavním koordinátorem je prof. Vőltzke z Německa, vedoucím v ČR je prof. V. Zamrazil Cílem EUthyroid je vyhodnotit IDD prevenci a monitorování v 23 členských státech EU a v Islandu, Izraeli, Makedonii, Norsku, Švýcarsku ve spolupráci s Iodine Global Network, data budou standardizována a harmonizována. Úloha Endokrinologického ústavu v projektu EUthyroid WP1: sběr dat z národních a regionálních registrů za poslední 3-4 roky obsahující údaje o tyreopatiích a jejich léčbě (léky, radiojód, chirurgie). WP2: harmonizace laboratorních a ultrazvukových vyšetření mezilaboratorní porovnání výsledků stanovení UIC, TSH, antitg a antitpo, neoficiálně i ft4, ft3 a Tg, u 75 vzorků s výsledky akreditovaní laboratoře v Helsinkách internetové školení a certifikace sonografistů pomocí programu ARCUS 1. obecné vyhodnocení sonografických záznamů, 2. vyhodnocení uzlin ŠŽ, 3. měření rozměrů ŠŽ, v každém modulu bude náhodně vybráno 2 x 25 ultrazvukových záznamů pro vyhodnocení WP2: provedení standardizovaného průzkumu financovaného z národních zdrojů, který se bude týkat vztahu mezi zásobením jodem a tyreoidálními poruchami u školních dětí, těhotných žen a dospělých.