Název: Vypracovala: Datum: 7. 2. 2014. Zuzana Lacková

Název: Vypracovala: Zuzana Lacková Datum: 7. 2. 2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu

MĚLI BYCHOM ZNÁT: informace, které má analýza poskytnout (př. AMK) analyty a jejich předpokládané obsahy (koncentrace) další složky materiálu a jejich obsahy (obsah proteinu) požadavky a parametry analytické metody (způsob úpravy vzorku, přesnost) skupenství vzorku (u tuhých vzorků velikost částic, mechanické vlastnosti) a stabilita vzorku VZOREK: nesmí být degradovaný, plesnivý, zkažený či jinak poškozený Mezinárodní norma. [online]. [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: web.vscht.cz/~koplikr/1_odb%c4%9br_vzork%c5%af.pdf

záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN 2) GFP

3) METHALOTIONEIN 3 4) LAKTOFERIN 5) MAXIMIN H5 + 6 bodových mutací??

rozdělení složek vzorku na základě jeho fyzikálních a chemických vlastností separace peptidů vyžaduje vysokou separační účinnost, protože jsou složité a mají vysoký počet komponent založená na rozdílné pohyblivosti částic unášených mobilní fází při průchodu stacionární fází Ing. Dr. Otakar, MIKEŠ, DrSc., LABORATORNÍ CHROMATOGRAFICKÉ METODY. Praha: SNTL, 1980, 676 s.

interakce molekul solutu podle jejich polarity (hydrofobní interakce se stacionární fází) s klesající polaritou látek vzrůstá jejich retence (zadržení) v koloně polární mobilní fázi (směs vody a zředěných kyselin či zásad) nepolární stacionární fázi (silikagel-c řetězce), sorbent či oxidy kovu) separace peptidů, léčiv či biochemických sloučenin X NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 235 s. ISBN 978-80-260-4244-0.

výměna iontů mezi mobilní a stacionární fází na základě rozdílných nábojů (silné elektrostatické interakce-přitahování opačných nábojů) analyt v průběhu separace prostupuje směrem k měniči iontů, poté prochází měničem a dochází k vlastní výměně iontů stacionární fáze je tvořena ionexem (měnič ionů) anex-kladný náboj (-NH2, -NHR, -NR2, -N + R3) katex-záporný náboj (-OH, -COOH, -PO(OH)2, -SO3H) mobilní fáze-vodné roztoky (vzorek či eluční činidlo) interakce iontu s ionexem stoupá s jeho nábojem (polaritou) a klesá s jeho velikostí chování aminokyselin, peptidů, bílkovin VAŇKOVÁ, Hana. PEPTIDOVÉ MAPY. Chemické listy 93. 1999, s. 120-127.

Ionex (anex) Způsoby uvolňování iontů z kolony: a)eluce vytěsněním (gradientem iontové síly): ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38.

Ionex (anex) Způsoby uvolňování iontů z kolony: b)eluce přenábojováním (gradientem ph): ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38.

LAKTOFERIN

rozdělování molekul podle jejich velikosti a tvaru ve svislé koloně, která je naplněna pórovitým polymerním gelem stacionární fáze-gel (složený z dextrinů zesítěných epichlorhydrinem) gel slouží jako molekulové síto-kolonou protéká konstantní rychlostí mobilní fáze stejného složení jako má roztok v pórech gelu a látky procházejí kolonou různou rychlostí dělení makromolekulárních látek, proteinů, enzymů, polysacharidů apod. Doc. Ing. Milan POPL a DrSc. Ing. Jaroslav KUBÁT, CSc. Separace látek. Praha: SNTL, 1986, 172 s.

Current (x10-5 A) MT: LEDVINY Rack Pos.: Tube #: 2.00 100.0 % Buffer B 1.75 1.00 50.0 0.00 0.0-0.25 AU 1.50 1.25 0.75 0.50 0.25 A B Fractions 0.00 30.00 60.00 Min.Tenth 10 mm Tris+150 mm NaCl, ph 8,6 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00-0.25 AU 254 nm 205 nm A 2 Fractions 5 6 7 8-0.200-0.175-0.150-0.125-0.100-0.075-0.050-0.025-5 0 0.025-1.750-1.500-1.250 Potential -1.000 (V) -0.750-0.500 2.00 1.75 1.50 od 10 μg/ml 215 nm 1.25 280 nm 1.00 0.75 0.50 0.25 0 0.00 Intens. [a.u.] x104 0.00 30.00 60.00 90.00 Min.Tenth 1.75 A Rack Pos.: Tube #: 2.00 B 100.0 % Buffer B -0.25 AU BSA (Albumin from bovine serum) 1,5 mg/ml Fractions 2.00 1.75 1.5 1.50 1.50 1.25 1.25 1.0 1.00 50.0 0.75 1.00 0.75 0.50 0.50 0.5 0.25 0.00 0.0 0.25 0.00-0.25-0.25 0.0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 m/z AU 0.00 30.00 60.00 Min.Tenth AU

specifické interakce vhodných partnerů: enzym - inhibitor, substrát protilátka - antigen receptor - hormon stacionární fáze je tvořena nosičem (agarosa), na který je chemicky navázán jeden z partnerů mobilní fáze navazovací pufr promývací pufr eluční činidlo separace bioaktivních látek, oddělení proteinu z komplexní směsi aplikace v lékařství a proteomice, analýza látek ZOUHAR, Jan. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINU NA VÁZANÝCH KOVOVÝCH IONTECH. Chemické listy 93. 1999, s. 683-685.

NOSIČ NOSIČ NOSIČ SORBENT SORBENT SORBENT SORBENT aktivace nosiče promytí navázání ligandu promytí a deaktivace navázání látky promytí desorpce a rekonstituce

MT-3 25000 20000 15000 10000 5000 0 445 545 645 745

gradientová eluce se snižující se iontovou sílou mobilní fáze retence solutů je ovlivňována přídavkem organických nebo anorganických solí do vody stacionární fáze A. homogenní povrch (silikagel) na selektivitu separace má vliv: B. nízký obsah hydrofobních skupin (propyl, bytyl) stacionární fáze typ soli (síran amonný, chlorid sodný, síran sodný) teplota ph mobilní fáze zvýšení koncentrace soli v mobilní fázi přechod solutu do stacionární fáze zvýšení retence separace proteinů a velkých peptidů Future aspects in peptide chemistry: selected contributions presented at the Ringberg conferences. Editor Gunter Fischer, Wolfgang Voelter. Prague: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, 1999, viii, 243 s. Collection symposium series. ISBN 80-862-4103-3.

GFP 1.00 0.75 0.50 50.0 0.25 0.00 0.0 AU 100.0 % Buffer B 0.00 2.00 4.00 6.00 Min.Tenth 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00-0.25 AU 25000 20000 15000 10000 5000 GFP (6.11.) water 0 445 545 645 745

Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Mgr. et Bc. Markéta Komínková Celému týmu laboratoře metalomiky a nanotechnologií Práce vznikla za podpory CZ.1.07/2.4.00/31.0023

Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu

1) Future aspects in peptide chemistry: selected contributions presented at the Ringberg conferences. Editor Gunter Fischer, Wolfgang Voelter. Prague: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, 1999, viii, 243 s. Collection symposium series. ISBN 80-862-4103-3. 2) ZOUHAR, Jan. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINU NA VÁZANÝCH KOVOVÝCH IONTECH. Chemické listy 93. 1999, s. 683-685. 3) ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38. 4) NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 235 s. ISBN 978-80- 260-4244-0. 5) MOTYKA, Kamil a Jan HLAVÁČ. Stručný přehled separačních metod. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2009, 45 s. ISBN 978-80-244-2304-3. 6) LEHOTAY, Jozef a Slovenská technická UNIVERZITA. Separačné metódy v analytickej chémii. Bratislava: Slovenská technická univerzita, 2009. ISBN 978-802-2730-365. 7) Ing. Dr. Otakar, MIKEŠ, DrSc., LABORATORNÍ CHROMATOGRAFICKÉ METODY. Praha: SNTL, 1980, 676 s. 8) Doc. Ing. Milan POPL a DrSc. Ing. Jaroslav KUBÁT, CSc. Separace látek. Praha: SNTL, 1986, 172 s. 9) VAŇKOVÁ, Hana. PEPTIDOVÉ MAPY. Chemické listy 93. 1999, s. 120-127. 10) Mezinárodní norma. [online]. [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: http://web.vscht.cz/~koplikr/1_odb%c4%9br_vzork%c5%af.pdf