Universita Karlova v Praze. 2.lékařská fakulta

Universita Karlova v Praze 2.lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2008 Martin Matějček

1 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem tuto práci zpracoval samostatně a veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využil, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v Univerzitní knihovně UK 2. LF. Praha 7. dubna 2008 podpis

Děkuji vedoucímu práce MUDr.Květě Petrtýlové za odborné vedení při tvorbě bakalářské práce, MUDr.Luboru Krausovi, Mgr.Jaroslavě Machálkové a prof.mudr.otomaru Kittnarovi DrSc., za poskytnutí cenných rad a připomínek při tvorbě bakalářské práce. Dále děkuji Mgr.Kateřině Vašatové za pomoc a ochotu při řešení administrativních a technických záležitostí spojených s tvorbou této práce, dále Ing.Jakubu Víchovi a Ing.Jiřině Chvojkové za pomoc při odborném česko-anglickém překladu. Univerzita Karlova v Praze

2. lékařská fakulta Oddělení krevní banky FN Motol Bakalářská práce Prenatální diagnostika a hemolytické onemocnění novorozence Vypracoval: Martin Matějček Vedoucí bakalářské práce: Studijní program: Studijní obor: Prim. MUDr. Květoslava Petrtýlová Specializace ve zdravotnictví Zdravotní laborant

SOUHRN V první části práce je popsán stav hemolytického onemocnění novorozence (HON), jeho etiopatogeneze a klinický průběh s možnostmi jeho léčby. Dále jsou popsány imunohematologické vyšetřovací metody pro diagnostiku a monitorování aloimunizace v průběhu gravidity včetně rutinně používaných laboratorních diagnostických systémů a diagnostik. Jsou zde uvedeny některé zajímavé kasuistiky vyšetřovaných gravidních žen za období let 2001-2005. Závěrem je rovněž zmíněna důležitost správné laboratorní praxe (SLP) a kontrol kvality imunohematologických vyšetřovacích metod. Klíčová slova: HON, imunohematologie, aloimunizace, gravidní žena, SLP SUMMARY The first part of my thesis describes the Hemolytic Disease of Newborn (HDN), its etiology, pathogenesis and clinical process including the possibilities of its medication. Further, the paper outlines immunohematology methodical approaches used for diagnostics, for monitoring of the gravidity process alloimunization and also for the laboratory diagnostic systems in common use. There are several interesting casuistries of examinant pregnant women during the period 2001-2005 mentioned. Finally, the thesis mentions the importance of a good laboratory practice (GLP) and quality control of methods. Keywords: HDN, immunohematology, alloimunization, pregnant woman, GLP

OBSAH ÚVOD...9 I TEORETICKÁ ČÁST...11 1 2 3 4 HEMOLYTICKÉ ONEMOCNĚNÍ NOVOROZENCE...12 1.1 ETIOPATOGENEZE, KLINICKÝ PRŮBĚH A TERAPIE...12 PRENATÁLNÍ IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ...15 2.1 KLINICKÁ VÝZNAMNOST PROTILÁTEK...15 2.2 AB0 SYSTÉM...15 2.3 ANTIGEN D...16 2.4 SCREENING NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM...16 2.5 IDENTIFIKACE NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM...16 2.6 FENOTYP MATKY...17 2.7 TITRACE NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK...17 2.8 URČOVÁNÍ PODTŘÍDY IGG...18 NÁVRH ALGORITMU TESTOVÁNÍ GRAVIDNÍCH ŽEN...19 3.1 VSTUPNÍ VYŠETŘENÍ...19 3.2 DALŠÍ VYŠETŘENÍ PŘI NEGATIVNÍM SCREENINGU NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK...19 3.3 DALŠÍ VYŠETŘENÍ PŘI POZITIVNÍM SCREENINGU NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK...20 3.3.1 Testování po profylaktickém podání imunoglobulinu anti-d...20 3.3.2 Imunohematologické testování otce...21 3.3.3 Imunohematologické testování plodu...21 3.4 VYŠETŘENÍ PO PORODU...22 3.4.1 Vyšetření matky...22 3.4.2 Vyšetření novorozence...23 METODY POUŽÍVANÉ K IMUNOHEMATOLOGICKÉMU TESTOVÁNÍ...26 4.1 DETEKCE PROTILÁTEK V IMUNOHEMATOLOGII...26 4.1.1 Přímý antiglobulinový test...26 4.1.2 Nepřímý antiglobulinový test...27 4.1.3 Přímá aglutinace...27 4.1.4 Gelová filtrace...27 4.2 IMUNOHEMATOLOGICKÉ LABORATORNÍ TECHNIKY...28 4.2.1 Sloupcová aglutinace...28 4.2.2 Gelová afinitní metoda...29 4.2.3 Metoda pevné fáze na mikrotitračních destičkách...30 4.2.4 Zkumavková metoda...31 II PRAKTICKÁ ČÁST...32

5 6 ZAJÍMAVÉ IMUNOHEMATOLOGICKÉ KAZUISTIKY GRAVIDNÍCH ŽEN VYŠETŘENÝCH VE FN MOTOL...33 5.1 JEDNOTLIVÉ PŘÍPADY...33 PŘEHLED IMUNOHEMATOLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ GRAVIDNÍCH ŽEN S POZITIVNÍM SCREENINGEM PROTILÁTEK S URČENÍM SPECIFITY A DYNAMIKY TITRU PROTILÁTEK NA ODDĚLENÍ KREVNÍ BANKY FN V MOTOLE V OBDOBÍ 2002 2005...39 6.1 POUŽITÉ LABORATORNÍ METODIKY...39 6.1.1 Krevní skupina v AB0 systému, RhD, slabé D...39 6.1.2 Screening protilátek proti erytrocytům...39 6.1.3 Identifikace protilátek...39 6.1.4 Vyšetření antigenů Rh systému a ostatních systémů...39 6.1.5 Titrace protilátek...39 6.2...40 STATISTIKA OBDOBÍ 2001-2005 6.3 VÝČET SPECIFITY ALOPROTILÁTEK V OBDOBÍ 2001-2005...41 6.3.1 Specifické aloprotilátky v Rh systému...41 6.3.1.1 Anti-D...41 6.3.1.2 Anti-C+D...41 6.3.2 Specifické aloprotilátky v Rh systému mimo anti-d...42 6.3.3 Ostatní směsi protilátek v Rh systému...42 6.3.4 Jiné, klinicky významné aloprotilátky...42 6.3.5 Jiné, klinicky nevýznamné aloprotilátky...42 ZÁVĚR A DISKUZE...43 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...44 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK...46

ÚVOD Imunohematologické vyšetření patří v České republice k základním vyšetřením gravidních žen. Účelem imunohematologického vyšetření je určit ženy s rizikem hemolytického onemocnění novorozence (HON) v prenatálním období 1. Hemolytické onemocnění novorozence patří mezi závažné stavy v perinatálním období. Mezi klinicky významné protilátky, které můžou způsobit těžké HON patří protilátky anti-d, -Kell, -c a E. Vyšetření plodu či novorozence pak umožní následně potvrdit diagnózu a tíži HON, způsobeného inkompatibilitou erytrocytárních antigenů mezi matkou a plodem 1. Imunohematologická vyšetření provádějí v ČR četná imunohematologická pracoviště, nejčastěji transfuzní oddělení, krevní banky, ale i různé typy multioborových laboratoří a privátní laboratoře. Přestože se jedná o vyšetření užívaná již mnoho let, nejsou dosud stanoveny jednotné postupy a algoritmus vyšetřování se v různých zařízeních liší. Cílem práce je poukázat na závažnost HON v perinatologické praxi a také diskutovat o vhodném návrhu algoritmu imunohematologického vyšetřování v graviditě a po porodu. Imunohematologická laboratorní vyšetření gravidních žen: mezi základní vyšetření patří určení krevní skupiny v systému AB0, antigenu D a screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům, v případě pozitivity screeningu pak identifikace protilátek. U klinických významných protilátek je nutné stanovení jejich titru. Přesnější metodiky stanovení hladiny protilátek v séru (stanovení koncentrace protilátky, buněčné funkční testy) zatím nejsou v ČR používány, ale je diskutováno jejich zavedení do budoucna. Imunohematologická laboratorní testování plodu: je vypracována metodika izolace extracelulární DNA z mateřské cirkulace pro neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem hemolytického onemocnění plodu 2. Diskutují se postupy a úskalí této metody. Při invazivním výkonu v průběhu gravidity (kordocentéza) lze imunohematologicky testovat odebranou pupečníkovou krev a stanovit tak riziko pro aloimunizaci. Imunohematologická laboratorní vyšetření po porodu: většinou se u matky jedná o součást předtransfuzního vyšetření nebo kontrolní vyšetření. Také se provádí průkaz imunních protilátek anti-a a anti-b v mateřském séru, jeho přínos je však sporný. Z dostupných imunohematologických vyšetření novorozence je nejdůležitější určení krevní

skupiny v systému AB0 a to především u matek s krevní skupinou 0, určení antigenu D (u RhD negativních matek) a vyšetření přímého antiglobulinového testu (PAT). V případě suspektního HON z AB0 inkompatibility i vyšetření imunních IgG protilátek anti-a a anti- B. Pro správnou dávku profylaktického imunoglobulinu anti-d je možné i kvantifikovat fetomaternální krvácení, avšak toto vyšetření není v ČR rutinně používáno.

I. TEORETICKÁ ČÁST

2 HEMOLYTICKÉ ONEMOCNĚNÍ NOVOROZENCE 2.1 Etiopatogeneze, klinický průběh a terapie Hemolytické onemocnění novorozence vzniká na podkladě imunizace matky antigeny plodu nejen v Rh systému, ale i v jiných skupinových systémech erytrocytů a následně k tvorbě specifických protilátek a aktivnímu průniku vytvořených protilátek placentou do krevního oběhu plodu. Erytrocyty plodu s navázanými protilátkami mají zkrácené přežívání a ve většině případů dochází k jejich destrukci 3. Zdědí-li plod po otci antigen, který organismus matky nemá a erytrocyty plodu se dostanou do oběhu matky (fetomaternální krvácení), může nastat u matky primární imunitní reakce na základě kontaktu s cizím antigenem. Intenzita fetomaternálního krvácení vzrůstá během gestačního procesu. Bowman a kol.uvádí alespoň 0,01 ml fetálních erytrocytů u 3%, 12% a 46% žen v každém trimestru 19. V rámci humorální imunity se začnou rozmnožovat B- lymfocyty, které byly aktivovány cizím antigenem na erytrocytech plodu a také T- lymfocyty. B-lymfocyty se diferencují v plazmatické buňky, které v průběhu primární imunologické odpovědi produkují v první fázi protilátky třídy IgM. Tyto však pro svou velkou molekulovou hmotnost (900 000 D) nejsou pro erytrocyty plodu nebezpečné, neboť neprocházejí placentární bariérou. Po několika dnech se začnou však vytvářet protilátky třídy IgG, které mají molekulovou hmotnost jen asi 130 000 D a jsou tak schopné proniknout placentární bariérou a senzibilizovat erytrocyty plodu s jejich následnou hemolýzou.nejčastější příčinou HON je inkompatibilita v AB0 systému. Příčinou je vytváření imunních IgG protilátek anti-a či anti B v organismu matky s krevní skupinou 0 jako reakce na průnik erytrocytů plodu s krevní skupinou A nebo B do krevního oběhu matky. Nejčastější příčina HON z tohoto důvodu je dána výskytem krevních skupin v naší populaci (0 42 %, A 46 %, B 8 %, AB 4 %). Za nejvážnější je považován HON v důsledku inkompatibility v Rh a systému a to konkrétně protilátka anti-d. Antigen D se vyskytuje v 85 % populace. Za další závažné protilátky považujeme protilátky anti-kell, anti-c a anti-e. Teoreticky může být příčinou HON každá protilátka schopná proniknout placentární bariérou a senzibilizovat erytrocyty plodu. Z destruovaných erytrocytů plodu se uvolňuje velké množství hemoglobinu, který je degradován na biliverdin a ten bezprostředně redukován na bilirubin. Právě produkt

rozpadu hemoglobinu bilirubin, může ve zvýšených hladinách způsobit vážné poškození až úmrtí plodu. Hyperbilirubinémie je bez ohledu na věk definována jako zvýšení koncentrace bilirubinu v krvi nad 25 mol/l. K rozvoji fyziologického ikteru u novorozence vede snížená eliminační schopnost bilirubinu v játrech (zejména snížená aktivita uridyl-difosfoglukuronyltransferázy) při zvýšené zátěži bilirubinem v časném postnatálním období (vyšší rozpad erytrocytů, vyšší procento bilirubinu nepocházející z erytrocytů, zvýšená aktivita - glukuronidázy ve střevě a vyšší enterohepatální oběh bilirubinu). Vznik kernikteru (jádrového ikteru) je nejzávažnější komplikací hyperbilirubinémie. Kernikterus vzniká ukládáním nekonjugovaného bilirubinu do mozkové tkáně, bazálních ganglií a mozkového kmene. Výsledkem depozice bilirubinu je těžké funkční poškození centrální nervové soustavy. Úloha bilirubinu v patofyziologii vzniku kernikteru však není doposud přesně objasněna. V případě, že sérová hladina nekonjugovaného bilirubinu překročí vazebnou kapacitu albuminu, může volný, v tucích rozpustný nekonjugovaný bilirubin přestupovat přes hematoencefalickou bariéru. Bilirubin vázaný na albumin však může v průběhu různých patologických stavů (asfyxie, acidóza, hypoperfúze, hyperosmolalita, sepse) přecházet také do centrálního nervového systému. Přesná hodnota koncentrace bilirubinu, která vede ke vzniku kernikteru, není známa. Toxické hladiny mohou kolísat v závislosti na zralosti novorozence, etnické příslušnosti a přítomnosti hemolýzy. U zdravých donošených novorozenců bez hemolýzy je toxicita bilirubinu velmi pravděpodobně zanedbatelná do 428 mol/l, na rozdíl od donošených novorozenců s přítomností hemolytického onemocnění, kde za bezpečnou hodnotu bilirubinu je považována hladina 342 mol/l. Působení bilirubinu na mozkovou tkáň je devastující a velmi často ireverzibilní. Iniciální neurologické příznaky postižení jsou mírné a nespecifické, objevují se od třetího dne života. Ke vzniku kernikteru může docházet kdykoliv v průběhu neonatálního období. Po prvním týdnu života se začínají u postiženého dítěte projevovat pozdní příznaky toxického působení bilirubinu. U novorozenců, kteří přežijí úvodní neurologické inzulty, dochází k rozvoji chronické encefalopatie - retardaci vývoje, motorickému postižení, hluchotě a mentální retardaci 4. Bazální metodou léčby hyperbilirubinémie u novorozenců je fototerapie (FT). Cílem FT je eliminace bilirubinu. Princip FT je založen na schopnosti molekuly bilirubinu přijmout foton, a tím změnit svou strukturu. Vzniklé konfigurační a strukturální izomery, z nichž nejvýznamnější je lumirubin, jsou hydrofilní a mohou být vyloučeny do žluče a moče bez konjugace s kyselinou glukuronovou. Nejúčinnější pro FT je modré světlo (vlnová délka

460 nm je nejblíže k absorpčnímu spektru bilirubinu). V terapii se používá dále zelené světlo (525 nm), které je příjemnější pro oči ošetřujícího personálu, a bílé světlo (380-700 nm), které neovlivňuje opticky prokrvení kůže 4. Z farmakologické léčby hyperbilirubinémie se v současné době používá profylaktické podávání imunoglobulinů u dětí s HON, které nesplňují kritéria pro výměnnou transfuzi. Intravenózní aplikace imunoglobulinu v dávce 0,5 g/kg vede k vyvázání cirkulujících mateřských protilátek a snížení rizika hemolýzy. Další možností je výměnná (exsanguinační) transfuze. Výměnná transfúze představuje účinnou, ale invazivní eliminační metodu, při které dochází k odstranění významné části bilirubinu a v případě hemolytické nemoci i senzibilizovaných erytrocytů a protilátek podílejících se na hemolýze 4..

3 PRENATÁLNÍ IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ 3.1 Klinická významnost protilátek Ne všechny nepravidelné protilátky proti erytrocytům se uplatňují v patogenezi HON. Teoreticky mohou HON způsobovat jakékoliv antierytrocytové protilátky třídy IgG. V kavkazoidní populaci jsou nejčastější příčinou těžkého HON již ve II.trimestru (s nutností intrauterinní transfuze) protilátky anti-d (85 %), anti-kell (10 %), anti-c (3,5 %) 5, 6, 7 a anti-e 6, 7. Protilátka anti-c může způsobit opožděnou anémii novorozence 5. Za klinicky významné protilátky z hlediska možného HON se dále považují protilátky AB0 systému (viz výše), protilátky anti-e, anti-k, anti-s, -s, -Fy a a -Fy b. Mezi klinicky nevýznamné protilátky lze zařadit protilátky anti-p 1, anti-lewis, anti-hi, anti-n a anti-lutheran. Dále protilátky reagující s celým panelem diagnostických erytrocytů a s vlastními erytrocyty, chladové protilátky a protilátky reagující jen v enzymatických testech. Avšak protilátky stejné specifity či síly se nechovají in vivo vždy stejně. Protilátky, prokazatelné u gravidních žen můžou také být následkem předchozích podaných transfuzí, nejčastěji anti-c, anti-kell. 3.2 AB0 systém Vyšetření krevní skupiny v AB0 systému slouží především k identifikaci gravidní ženy, ale je také základní částí předtransfuzního vyšetření. Záznamy se musí vždy shodovat a jakékoliv diskrepance se musí vždy dořešit. Výpovědní hodnota pro předpověď HON je však malá 1. U gravidních žen s krevní skupinou 0 se dá předpokládat výrazně vyšší výskyt HON způsobený AB0 inkompatibilitou než u matek se skupinou A či B.

3.3 Antigen D Vyšetření antigenu D (RhD) určuje skupinu D-negativních žen, u nichž je indikované profylaktické podání anti-d protilátky (Partobulin) 5. Vyšetřování slabého antigenu D (D weak ) se nepovažuje za přínosné 5. V této problematice však nepanuje jednoznačná shoda, neboť při vyřazení vyšetřování D weak z algoritmu prenatální imunohematologické diagnostiky podstoupí gravidní ženy s kvantitativně zeslabeným antigenem D profylaxi anti-d, kterou však nepotřebují. Naopak nositelky variantních antigenů (hlavně D VI ) jsou bez provedení antiglobulinového testu považovány za D negativní a profylaxi anti-d podstoupí. Při nejasném nálezu při vyšetření antigenu D je tak na místě zcela dořešit výsledek vyšetření v referenční laboratoři. 3.4 Screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům Asi u 1 % vyšetřovaných gravidních žen lze prokázat klinicky významné nepravidelné aloimunní protilátky proti erytrocytům (dále jen nepravidelné protilátky ) 8. Screening nepravidelných protilátek umožňuje detekovat klinicky významné protilátky, které by mohly ohrozit plod a/nebo novorozence. Vyšetření má význam jak u D- negativních žen, tak u D-pozitivních, i když dle některých autorů je screening protilátek v prvním trimestru u D-pozitivních žen nepřínosný 20, protože se u HON klinicky mohou uplatňovat i jiné specifické protilátky než anti-d (viz výše). Dále je nutno uvést, že screening nepravidelných protilátek je jednou z hlavních součástí rutinního předtransfuzního vyšetření a nález nepravidelné aloprotilátky je důležitý i pro transfuzi erytrocytů. 3.5 Identifikace nepravidelných protilátek proti erytrocytům Provádí se vždy při pozitivním screeningu protilátek. Identifikace má za úkol přesně určit typ protilátky a její klinickou významnost vzhledem k HON a v souvislosti s transfuzí.

3.6 Fenotyp matky V případě zjištěné protilátky je nutné provést typování antigenu, proti kterému je daná protilátka namířená. Účelem je jednak potvrzení specifity protilátky a také vyloučení autologní protilátky (autoprotilátky), která nemá z hlediska HON význam. Dále je vhodné stanovit Rh fenotyp a to konkrétně antigeny C, c, E, e, Cw. 3.7 Titrace nepravidelných protilátek Stanovení titru klinicky významných protilátek proti erytrocytům u gravidních žen má sloužit pro identifikaci gravidit, které jsou v riziku HON a predikovat novorozence, kteří budou pravděpodobně vyžadovat léčbu HON 5. Přesto má titrace při odhadu závažnosti HON omezený význam. Přesnost předpovědi se uvádí 15-62 % (lit. 9 ). Korelace mezi výší titru protilátky a jejím chování in vivo není totiž jednoznačná. Hemolýza erytrocytů závisí více na aviditě protilátky než na výši titru. Protilátky s nízkými titry jsou někdy schopné způsobit těžký průběh HON. Například o protilátce anti-kell je známo, že vedou k imunní supresi erytropoezy a výše jejich titru se závažností anemie prakticky nekoreluje 10. V literatuře se někdy uvádí tzv.minimální kritický titr, což je účinnost protilátek, nad jejíž hodnotou může dojít ke klinicky závažnému HON. Například u protilátky anti-d v nepřímém antiglobulinovém test (NAT) se považuje za minimální kritický titr 1:16, jiní autoři uvádí 1:4. Zvýšení titru o dva stupně se považuje za signifikantní 1, 6. Náhlý pokles titru o víc jak 3 stupně může být známkou těžkého postižení plodu nebo i intrauterinního exitu plodu. Někteří autoři doporučují, aby si každá laboratoř stanovila svoji hodnotu. Významná je samozřejmě i zvolená metodika pro titrování protilátek, manuální zručnost pracovníků provádějících vyšetření a dodržování SLP.

3.8 Určování podtřídy IgG Těžkou hemolýzu mohou způsobit protilátky podtřídy IgG 1 a IgG 3 samotné nebo v kombinaci. V případě podtřídy IgG 1 nebo při kombinaci IgG 1 +IgG 3 je průběh HON těžší, než v přítomnosti protilátky pouze podtřídy IgG3(lit. 11 ). IgG 1 způsobuje větší destrukci erytrocytů in utero, kdežto IgG 3 postnatálně 12. Určování podtříd IgG se rutinně neprovádí, v současné době však jeho zavedení nemusí představovat v ČR závažný ekonomický problém, testovací soupravy jsou běžně dostupné v nabídce diagnostik.

4 NÁVRH ALGORITMU TESTOVÁNÍ GRAVIDNÍCH ŽEN 4.1 Vstupní vyšetření Vstupní vyšetření by mělo být provedeno co nejdříve od potvrzení gravidity, v prvním trimestru, nejpozději do 13.týdne 1. Doporučená rozmezí kolísají mezi 10. a 16.týdnem 5, 6. Toto vstupní vyšetření by mělo obsahovat vyšetření krevní skupiny v AB0 systému, antigenu D, slabé D a screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům 1, 5, 6. 4.2 Další vyšetření při negativním screeningu nepravidelných protilátek U D pozitivních gravidních žen je vhodné další vzorek imunohematologicky vyšetřit ve 28.-30.týdnu gravidity 1, 5 a to především tehdy, pokud existuje v anamnéze nález signifikantních protilátek, transfuze erytrocytů nebo komplikované porody. U D negativních je nutné vyšetřit další vzorek o něco dříve, uvádí se ve 24.-28.týdnu 1 a zde platí totéž, co u D pozitivních matek. Požadavek některých autorů na měsíční monitorování D negativních gravidních je sporný a ekonomicky zbytečně nákladný 1. Imunohematologické vyšetření by se však mělo provést po každém invazivním vyšetření plodu (amniocentéza, kordocentéza) 1. Poslední kontrola nepravidelných protilátek se má dle některých autorů provádět ještě ve 34.- 36.týdnu, její význam je však sporný. Opakování vyšetření krevní skupiny v AB0 systému se zdá být neekonomické a zbytečné. Nelze však vyloučit administrativní chyby a chyby v preanalytické fázi (odběr krve), ale i tak není při každé kontrole nutné vyšetřovat kompletní AB0 systém, ale dostačující je ověřit krevní skupinu gravidní ženy vyšetřením aglutinogenů (tzv.přední řada) a RhD na sklíčku, popř.zkumavkovým testem. Pokud je gravidní žena vyšetřována opakovaně, avšak poprvé na jiném laboratorním pracovišti, měla by být krevní skupina v AB0 systému vyšetřena kompletně včetně aglutininů.

4.3 Další vyšetření při pozitivním screeningu nepravidelných protilátek Při pozitivním výsledku screeningu nepravidelných protilátek je nutné protilátku identifikovat a určit její titr. Dále je vhodné matku typovat na antigeny Rh systému a antigen, proti kterému je eventuelně protilátka namířena (viz výše). Je také možné určit podtřídy IgG protilátky za účelem možné předpovědi tíže HON (viz výše). Vyšetření je nutné opakovat v minimálně měsíčních intervalech. Dvoutýdenní interval má smysl tam, kde existuje v anamnéze těžký průběh HON, vysoký titr protilátek nebo problematický průběh gravidity 1. Monitorování množství protilátek (titr) se používá pro identifikaci gravidity s rizikem HON a k předpovědi, které plody nebo novorozenci mohou potřebovat léčbu HON (viz výše). Vyšetření má identifikovat další mateřské protilátky. Ženy, které si již jednu nebo více protilátek vytvořily, si mohou vytvářet protilátky jiné specifity 5. U protilátek anti-d, -c, -Kell a u jiných protilátek, kdy je v anamnéze gravidní ženy těžký průběh HON, se další vzorek imunohematologicky vyšetřuje v 18.-20.týdnu včetně titrace. Pokud není jednoznačně prokázáno, že otec dítěte je pro daný antigen negativní, provádí se kontrolní vyšetřování v měsíčních intervalech, od 28.týdne ve dvoutýdenních intervalech, dokud není dosaženo klinicky významného titru 5. Kromě výše zmíněných případů se ostatní klinicky významné protilátky kontrolují až ve 28.týdnu. 4.3.1 Testování po profylaktickém podání imunoglobulinu anti-d Pro laboratoř, která provádí imunohematologické testování gravidní ženy, je důležitá informace od ošetřujícího lékaře a informace o podání anti-d musí být uvedena na žádance o laboratorní vyšetření. Je-li záznam o podání anti-d v posledních 8 týdnech a reakce anti- D je slabá, pak se ve vyšetření pokračuje jako u žen, které nebyly senzibilizovány 5. Při absenci záznamu o profylaxi se doporučuje provádět identifikaci protilátek a titrovat v měsíčních intervalech. Pokud protilátka anti-d přestane být v NAT testu detekovatelná a titr klesá, jedná se pravděpodobně o profylaktické anti-d, stabilní či zvyšující se titr indikuje imunní protilátky anti-d.

4.3.2 Imunohematologické testování otce Vyšetřením otce se určuje riziko imunizace plod - matka. V případě nálezu specifických klinicky významných protilátek, především anti-d, -c, -Kell, se doporučuje vyšetřit přítomnost korespondujícího antigenu u otce a určit, zda je otec pro daný antigen homozygot či heterozygot a tím určit pravděpodobnost, s jakou plod antigen zdědí. Je-li otec pro daný antigen negativní, pak se těhotná sleduje v režimu, jakoby neměla žádné specifické protilátky 1, 5. 4.3.3 Imunohematologické testování plodu Je možné po odběru vzorku pupečníkové krve při invazivním vyšetření. Vyšetření krevní skupiny plodu v AB0 systému nepřináší žádnou užitečnou informaci. Stanovení antigenu D u plodu se může použít pro průkaz inkompatibility. Také výsledek vyšetření přímého antiglobulinového testu (PAT) je sporný a k provádění dalších testů (eluce) většinou nebývá dostatek materiálu. Důležitým testem se stává v současné době genotypizace plodu z mateřské DNA pomocí PCR reakce. Stanovení genotypu lze uplatnit u systému Rh (D, c, E), systému Kell (K), Kidd (Jk a ) a Duffy (Fy a ). Největší význam má genotypizace pro gen RHD. Pro testování DNA v mateřské plazmě se dnes používá výhradně real-time PCR s využitím specifických primerů 2. Další možností je použití amniové tekutiny nebo choriových klků 14, byla též zkoumána možnost určení fetálního RhD z fetálních buněk izolovaných z mateřské krve 15-18.

4.4 Vyšetření po porodu 4.4.1 Vyšetření matky Imunohematologické vyšetření ihned po porodu se obvykle provádí pouze u D negativních matek, dále matek s anamnézou HON z předchozí gravidity a tam, kde jsou zjištěny klinicky významné protilátky. Vyšetření AB0, D má smysl pouze tam, kde nejsou k dispozici předchozí výsledky vyšetření z téhož pracoviště, kde matka rodila nebo jako součást předtransfuzního vyšetření 5, 9. Vyšetření slabého D není vhodné z důvodu možné kontaminace mateřské krve krvinkami plodu 1. Rutinní screening protilátek se nedoporučuje, protože nepřináší po porodu žádnou užitečnou informaci. Má smysl pouze jako součást předtransfuzního vyšetření, nebo tam, kde nebyla matka před porodem vyšetřována. V případě pozitivního screeningu je nutné určit specifitu protilátky a to hlavně jako součást předtransfuzního vyšetření. Titrace protilátky se již neprovádí, neboť vyšetření nemá žádný klinický význam. V případě nutnosti transfuze novorozence, by se měl test kompatibility provést s mateřským sérem/plazmou, protože protilátky v mateřském séru/plazmě jsou jediné, které se mohou vyskytovat v séru/plazmě novorozence. Uvádí se, že jsou li u novorozence známky HON, ale výsledek screeningu protilátek je negativní, je vhodné provést testování séra/plazmy matky s erytrocyty otce (není-li přítomna AB0 inkompatibilita) k zachycení reakce proti antigenu s nízkou frekvencí výskytu 9. Tento postup však není v ČR obvyklý. U suspektního AB0 HON lze vyšetřovat imunní protilátky anti-a a anti-b třídy IgG metodou gelové filtrace (Sephadex). Při tomto vyšetření dochází v gelu k rozdělení IgG a IgM protilátek a poté je stanoven titr imunních protilátek zkumavkovou metodou nepřímého antiglobulinového testu (NAT). Otázkou je, zda je toto vyšetření potřebné a přínosné. Jakákoliv korelace s pozitivitou PAT, eventuelně klinickým stavem novorozence nebyla zatím uspokojivě prokázána.

4.4.2 Vyšetření novorozence Vždy se vyšetřuje krevní skupina v AB0 systému. Rutinní vyšetření antigenu D se sice nedoporučuje 9, ale vzhledem k sestavám používaných diagnostických systémů (karty sloupcové aglutinace) se krevní skupina vyšetřuje kompletně i s D antigenem. Význam vyšetření slabého či variantního D je sporný. Někteří autoři doporučují vyšetřovat D weak a variantu D VI, protože v případě jejich pozitivity u novorozence by se u matky měla provádět anti-d profylaxe 9. Jiní autoři zase uvádějí, že není prakticky dokázáno, že by erytrocyty plodu nesoucí D VI variantu senzibilizovaly matku 5. Vždy se také vyšetřuje přímý antiglobulinový test (PAT) a ten je také považován za základní vyšetření novorozence se suspektním HON 1. U HON v Rh systému a ostatních kromě AB0 bývá PAT jednoznačně pozitivní. U AB0 HON tomu však tak nebývá, až 90 % PAT bývá negativních či slabě pozitivních 1, což je dáno nevyzrálostí antigenů A a B u novorozence, zvláště nedonošených. U vysokých titrů anti-a či anti-b však bývá pozitivita PAT jednoznačná. U pozitivních PAT je vhodné provést eluci protilátky z krvinek novorozence 5. V eluátu se pak určí specifita protilátky pomocí testování s erytrocyty nesoucími antigen korespondující s protilátkou 5. Pokud je však u matky jednoznačně v průběhu gravidity identifikována protilátka, není eluce nutná 9. Vyšetření imunních protilátek IgG anti-a či anti-b se provádí kvalitativním průkazem v LISS-NAT, většinou jsou detekovány při předtransfuzním vyšetřením u novorozence. Novorozenecké sérum/plazma obsahující IgG protilátky anti-a, -B totiž reaguje v testu kompatibility s erytrocyty dárce se skupinou A, B a pak je nutné podávat transfuzi erytrocytů krevní skupiny 0.

Schéma č.1 Grafický návrh algoritmu testování gravidních žen 10. 16.týden všechny gravidní ženy AB0, RhD, slabé D, screening protilátek (NAT, enzym) RhD neg. HON v anamnéze Anti-D, -c, -K (C, E, e) (v NAT) vyš.protilátek negativní měsíční interval vyšetření genotypu otce vyšetření plodu AB0, RhD, slabé D, PAT (eluce + identifikace), DNA jiné protilátky 24.týden všechny gravidní ženy AB0, RhD, vyšetření protilátek 28. (- 30.) týden všechny gravidní ženy AB0, RhD, vyšetření protilátek Anti-D, -c, -K jiné protilátky vyšetření protilátek (-C, -E, -K) negativní 34. 36.týden RhD negativní HON v anamnéze Vyšetření protilátek Schéma č.1

Po porodu RhD negativní, klinicky významné protilátky, HON v anamnéze Novorozenec Matka AB0, RhD, slabé D, PAT susp.ab0 HON (event.eluce) imunní anti-a, -B Po invazivním vyšetření nebo intrauterinní transfuzi Vyšetření protilátek

5 METODY POUŽÍVANÉ K IMUNOHEMATOLOGICKÉMU TESTOVÁNÍ 5.1 Detekce protilátek v imunohematologii Nejvhodnější a obecně nejpoužívanější metodou pro detekci protilátek v imunohematologii je aglutinace erytrocytů. Při tomto postupu jsou erytrocyty, které jsou senzibilizovány navázanými protilátkami, aglutinovány, což lze hodnotit makroskopicky. Pokud jsou na erytrocytech navázány protilátky třídy IgM, aglutinace nastává přímo (přímá aglutinace). K detekci IgG je nutné použít nepřímou metodu. Molekula IgG totiž není vzhledem ke své menší velikosti schopná překonat přirozenou vzdálenost mezi erytrocyty (asi 16 nm), která je dána stejným nábojem povrchu erytrocytů a tedy vzájemnou odpudivostí. Je tedy nutné buď snížit zeta potenciál, aby došlo ke snížení vzdálenosti mezi erytrocyty a Fab fragmenty imunoglobulinu G byly schopny vzdálenost přemostit nebo pomocí protilátek proti lidskému globulinu (AGH) vytvořit na dvou IgG molekulách můstek a vzdálenost přemostit nebo kombinovat oba tyto postupy. Pro snížení iontové síly v médiu se užívá roztok o nízké iontové síle (LISS) a pro přemostění IgG molekul se používá komerční králičí antiglobulin. V praxi se užívají dva druhy antiglobulinového testu, přímý, pro detekci protilátky senzibilizované na erytrocytu a nepřímý, pro detekci volných protilátek v séru/plazmě in vitro. 5.1.1 Přímý antiglobulinový test Přímý antiglobulinový test (PAT) je určen k detekci senzibilizace erytrocytů pacienta in vivo. Je to jedna z nejdůležitějších vyšetřovacích technik v imunohematologii 13. Při této metodě se k vyšetřovaným erytrocytům pacienta přidává pouze AGH, které je v případě senzibilizace schopno aglutinovat vyšetřované erytrocyty. Pozitivita PAT znamená buď přítomnost autoprotilátek na erytrocytech nebo přítomnost protilátek pocházejících od matky proti erytrocytům jejího novorozeného dítěte a nebo aloprotilátek vytvořených po předchozí transfuzi erytrocytů.

5.1.2 Nepřímý antiglobulinový test Nepřímý antiglobulinový test (NAT) je určen k detekci protilátek v séru/plazmě pacienta in vitro. NAT se používá k detekci přítomnosti protilátek při screeningu protilátek, identifikaci protilátek a testu kompatibility. Při této metodě se inkubuje vyšetřované sérum/plazma s testovacími erytrocyty v roztoku s LISS a až poté se přidává AGH. Pozitivita NAT znamená, že v séru/plazmě pacienta jsou přítomny protilátky proti antigenům na diagnostických erytrocytech (screening a identifikace) nebo na erytrocytech dárce (test kompatibility). 5.1.3 Přímá aglutinace Přímá aglutinace je metoda určená k průkazu IgM protilátek s optimem 4-25 C. Protilátka v séru/plazmě pacienta reaguje přímo s diagnostickými či vlastními erytrocyty. Přímé aglutinace se využívá při průkazu antigenů (např.v AB0 systému), kdy známá protilátka IgM (diagnostické sérum) reaguje s antigenem na vyšetřovaných erytrocytech, proti kterému je namířena. 5.1.4 Gelová filtrace Gelová filtrace umožňuje rozdělení protilátek IgG a IgM a jejich následnou detekci některým vhodným testem (NAT). Principem je oddělování látek s velmi rozdílnými molekulovými hmotnostmi. Molekulová hmotnost IgG (130 000) je téměř sedmkrát menší než IgM (900 000), proto lze tuto technologii na jejich rozdělení aplikovat.

5.2 Imunohematologické laboratorní techniky 5.2.1 Sloupcová aglutinace Koncem 80.let byla vyvinuta technologie sloupcové (gelové) aglutinace, založená na nepřímém antiglobulinovém testu. Při této metodě je aglutinace senzibilizovaných erytrocytů suspendovaných v LISS docílena v gelovém sloupci pomocí AGH séra. Erytrocyty a sérum se inkubují na povrchu gelu. Po inkubaci se sloupec centrifuguje, což způsobí putování erytrocytů gelem. Po centrifugaci zůstanou aglutináty v gelu, který má funkci síta. Nesenzibilizované erytrocyty, které nereagují s AGH, prostupují gelem na dno sloupce. Fyzikální separace aglutinátů je založena na jejich velikosti a filtraci přes gel. Pomocí centrifugace jsou erytrocyty odděleny od séra a tímto i od nenavázaných imunoglobulinů, které zůstávají v horní, inkubační části gelového sloupce. Nejznámější výrobci sloupcově aglutinačních systému jsou DiaMed (ID-systém), Grifols (DG Gel), BioRad (ScanGel) a Ortho (BioVue). Každý z těchto systémů využívá unikátních LISS roztoků, karet i centrifug. Obr. 1 Sloupcově aglutinační systém DG Gel Zdroj: RNDr.M.Körnerová, Grifols Česká republika

5.2.2 Gelová afinitní metoda Od poloviny 90.let je k dispozici další technologie druhé generace, tzv.pevná fáze, která je označována jako sloupcová afinitní metoda. Test není založen na aglutinaci senzibilizovaných erytrocytů, ale na přímé vazbě na gelovou matrix uvnitř sloupce. Imunoafinitní gelový sloupec obsahuje aktivní fázi v médiu s vysokou hustotou. Senzibilizované erytrocyty jsou fixovány přímo na aktivní fázi ve sloupci. Tato imunoreaktivní fáze obsahuje protein G, protilátku anti-igm a anti-c3d komplementovou složku fixovanou na gelovou matrix. Protein G je bílkovina z buněčné stěny Streptokoka, která se váže k Fc částem lidského IgG. Senzibilizované erytrocyty zůstanou ve vrchní části sloupce, zatímco všechny nesenzibilizované budou migrovat ke dnu sloupce. Výrobce tohoto systému je Sanquin (CellBind). Obr. 2 Sloupcová afinitní metoda CellBind Zdroj: http://www.sanquin.nl/

5.2.3 Metoda pevné fáze na mikrotitračních destičkách V 90.letech byly vyvinuty další metody pro imunohematologické testování, které využívají techniku tzv.pevné fáze na mikrotitračních destičkách. U této technologie je jedna z reagencií předem fixována na mikrotitrační destičce (MP). Pro screening a identifikaci protilátek jsou používány systémy Capture R (Immucor) a Solid Screen (Biotest). Capture R je metoda pevné fáze, kde jsou diagnostické erytrocyty předem fixovány na dně jamek MP. Následně jsou inkubovány s testovaným sérem. Po promytí se přidají erytrocyty senzibilizované IgG protilátkou. Následuje centrifugace a odečtení typu reakce. V případě pozitivního výsledku, kdy jsou IgG protilátky z vyšetřovaného séra navázány na spodní vrstvu diagnostických erytrocytů, se indikátorové erytrocyty v tenké vrstvě navážou na tyto IgG protilátky nad senzibilizovanými erytrocyty na celém povrchu dna jamky. Při negativní reakci, pokud nejsou na diagnostické erytrocyty navázané žádné protilátky, se indikátorové krvinky soustředí do středu dna jamky. Obr. 3 Capture Solid Phase Immucor Zdroj: http://www.immucor.com/site/ps_capture.jsp

5.2.4 Zkumavková metoda Je nejstarší používanou technikou v laboratořích. V současné době je ústup od skleněných zkumavek ve prospěch plastových materiálů a to převážně z ekonomických důvodů (mytí skla). I přesto, že při současném trendu převážná většina laboratoří používá systémy sloupcové aglutinace či jiné systémy, role zkumavek je stále nezastupitelná. Většina erytrocytárních antigenů je stále vyšetřována zkumavkovou metodou a svou roli mají zkumavky vzácně i při předtransfuzním vyšetření pacientů, jejichž sérum/plazma nespecificky pozitivně reaguje v systémech sloupcové aglutinace. Také z ekonomických důvodů se v některých imunohematologických laboratořích stále vyšetřuje zkumavkovou metodou, což však lze považovat za obsoletní. Obr. 3 Vyšetření krevní skupiny AB0 zkumavkovou metodou Zdroj: http://www.vetmed.wsu.edu//lab_tests/transfusion_medicine.htm

II. PRAKTICKÁ ČÁST

6 ZAJÍMAVÉ IMUNOHEMATOLOGICKÉ KAZUISTIKY GRAVIDNÍCH ŽEN VYŠETŘENÝCH VE FN MOTOL 6.1 Jednotlivé případy KAZUISTIKA 1 Pacientka: Krevní skupina: žena, 38 let B RhD negativní Počet předchozích gravidit: 2 Fenotyp: Prokázané aloprotilátky: Použitá metodika: ccddee, Cw negat., kk, NN, ss, Kp a negat. anti-s, D, Kp a, M, Cw sloupcová aglutinace Tab. č.1 Průběh imunohematologického vyšetření kazuistiky 1 POŘ. ČÍSLO VYŠETŘENÍ TITR PROTILÁTKY TITR PROTILÁTKY Anti-S Anti-D 1. 1:128 NAT nebyla zjištěna 2. 1:128 NAT 1:16 NAT 3. 1:64 NAT 1:32 NAT 4. 1:32 NAT 1:32 NAT 5. 1:32 NAT 1:256 NAT 6. + anti-kp a 7. 1:64 NAT 1:1024 NAT 8. + anti-m, anti-cw

VYŠETŘENÍ KORDOCENTÉZY Krevní skupina: B RhD pozitivní Přímý antiglobulinový test: pozitivní (4+) Krevní obraz: Hb 131-109-91 g/l ery 3,72-3,0-2,39 x 10 12 /l htk 0,395-0,321-0,261 DALŠÍ INVAZIVNÍ ZÁKROKY Intrauterinní transfuze: ano, 1 x Exsanguinační transfuze: ano Transfuze narozenému dítěti: ano, 2 x, v 5. a 8.týdnu věku POZNÁMKY Velmi obtížná logistika erytrocytárních transfuzních přípravků pro intrauterinní a exsanguinační transfuze z důvodu nutnosti dodržení negativity antigenů korespondujících s prokázanými protilátkami u matky. KAZUISTIKA 2

Pacientka: Krevní skupina: žena, 25 let B RhD pozitivní Počet předchozích gravidit: 1 Fenotyp: Prokázané aloprotilátky: Použitá metodika: CCD.ee, Cw negat., kk, MN, ss anti-kell, S, M sloupcová aglutinace Tab. č.2 Průběh imunohematologického vyšetření kazuistiky 2 TÝDEN GRAVIDITY TITR PROTILÁTKY Anti-Kell 16 1:1024 NAT 20 1:2048 NAT 24 1:4096 NAT 26 1:2048 NAT 28 1:1024 NAT 30 1:1024 NAT 32 1:1024 NAT 35 1:1024 NAT VYŠETŘENÍ KORDOCENTÉZY

Krevní skupina: Fenotyp plodu: 0 RhD pozitivní Kell negativní Přímý antiglobulinový test: negativní Krevní obraz: Hb 104 g/l ery 2,83 x 10 12 /l htk 0,309 KAZUISTIKA 3

Pacientka: Krevní skupina: žena, 35 let A RhD negativní Počet předchozích gravidit: 4 Fenotyp: Prokázané aloprotilátky: Použitá metodika: ccddee, kk anti-d sloupcová aglutinace Tab. č.3 Průběh imunohematologického vyšetření kazuistiky 3 TÝDEN GRAVIDITY TITR PROTILÁTKY Anti-D 23 1:32 NAT 26 1:64 NAT 29 1:256 NAT VYŠETŘENÍ KORDOCENTÉZY

Krevní skupina: A RhD pozitivní Přímý antiglobulinový test: pozitivní (4+) Fenotyp plodu: Prokázané aloprotilátky: Krevní obraz: CcD.ee, kk, Cw negat. anti-d mateřského původu Hb 99-84-80 g/l ery 2,58-2,08-2,04 x 10 12 /l htk 0,286-0,239-0,224 DALŠÍ INVAZIVNÍ ZÁKROKY Intrauterinní transfuze: Exsanguinační transfuze: ano, 2 x, ve 31. a 32.týdnu ne Transfuze narozenému dítěti: ano, ihned po porodu na porodním sále

7 PŘEHLED IMUNOHEMATOLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ GRAVIDNÍCH ŽEN S POZITIVNÍM SCREENINGEM PROTILÁTEK S URČENÍM SPECIFITY A DYNAMIKY TITRU PROTILÁTEK NA ODDĚLENÍ KREVNÍ BANKY FN V MOTOLE V OBDOBÍ 2002 2005 7.1 Použité laboratorní metodiky 7.1.1 Krevní skupina v AB0 systému, RhD, slabé D Zkumavková metoda 7.1.2 Screening protilátek proti erytrocytům Sloupcová aglutinace v NAT a enzymatickém prostředí (bromelin), ID-systém DiaMed 7.1.3 Identifikace protilátek Sloupcová aglutinace v NAT a enzymatickém prostředí (bromelin, papain), ID-systém DiaMed a systém Diana Grifols, panelové erytrocyty Exbio, Diana a Dynex 7.1.4 Vyšetření antigenů Rh systému a ostatních systémů Zkumavková metoda, sloupcová aglutinace ID-systém DiaMed 7.1.5 Titrace protilátek Sloupcová aglutinace ID-systém DiaMed

7.2 Statistika za období 2001-2005 Graf č.1 Statistika vyšetření 170 gravidních žen 2001-20 Počet vyšetření 150 100 50 0 31 23 116 Normální imunohematologický nález Nespecifická reakce v enzymu Antierytrocytární protilátky Graf č.2 Procentuální zastoupení vyšetřených aloprotilátek v období 2001-2005 3% 1% 18% 1% 3% 1% 3% anti-d anti-kell 2% anti-cw anti-e 1% 6% anti-c anti-m anti-c anti-s 5% 47% anti-lea anti-leb anti-jkb směsi 9% anti-jra

7.3 Výčet specifity aloprotilátek v období 2001-2005 7.3.1 Specifické aloprotilátky v Rh systému 7.3.1.1 Anti-D Počet gravidních žen 28 Počet vyšetření 92 (min.1, max.9) Rozmezí výše titru PAT u novorozence 1:2 až 1:2048 NAT 11 x pozitivní, 5 x negativní, 12 x nevyšetřen Počet kordocentéz 2 Počet intrauterinních transfuzí 2 Počet exsanguinačních transfuzí 2 7.3.1.2 Anti-C+D Počet gravidních žen 11 Počet vyšetření 29 Rozmezí výše titru anti-c 1:2 až 1:128 NAT Anti-D 1:16 až 1:4096 NAT PAT u novorozence 8 x pozitivní, 2 x negativní, 1 x nevyšetřen Počet kordocentéz 2 Počet intrauterinních transfuzí 2 Počet exsanguinačních transfuzí 1

7.3.2 Specifické aloprotilátky v Rh systému mimo anti-d Anti-C 1 gravidní Anti-c 1 Anti-E 6 Anti-Cw 6 7.3.3 Ostatní směsi protilátek v Rh systému Anti-c + E Anti-E + Cw Anti-c + E + Fy a Anti-c + E +S 2, PAT u novorozence pozitivní 1, PAT u novorozence pozitivní 1, PAT u novorozence pozitivní 1, PAT u novorozence negativní 7.3.4 Jiné, klinicky významné aloprotilátky Anti-Kell Anti-Kell + S + M Anti-M Anti-S 10, PAT u novorozence 2 x pozitivní, 5 x negativní, 3 x nevyšetřen 1, PAT u plodu negativní (kordocentéza) 4, PAT u novorozence 3 x negativní, 1 x nevyšetřen 1, PAT u novorozence nevyšetřen Anti-Jk b 1, PAT u novorozence pozitivní (2+) Anti-Jr a 1, PAT u novorozence slabě pozitivní (1+) 7.3.5 Jiné, klinicky nevýznamné aloprotilátky Anti-Le a 4 Anti-Le b 4

ZÁVĚR A DISKUZE Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu jsou nepostradatelná při diagnostice a léčbě hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Tato práce shrnuje používané metodiky při imunohematologickém testování a sestavuje možný algoritmus vyšetření gravidních žen. Ukazuje se, že některé rutinně používané metody nejsou tolik významné při diagnostice HON (eluční testy) a také, že není přesně prokázána korelace mezi výší titru protilátky a klinickým stavem. Příslibem do budoucna je další rozvoj neinvazivního testování plodu DNA metodikami. V období 2001-2005 bylo provedeno na Oddělení krevní banky FN Motol celkem 436 imunohematologických vyšetření u 170 těhotných žen s nálezem pozitivního screeningu nepravidelných protilátek. Největší podíl antierytrocytárních protilátek byl stanoven v Rh systému : anti-d u 28 těhotných, po aplikaci anti-d u 26 žen a ve směsi protilátek bylo anti-d prokázáno u 15 těhotných.protilátka anti-c byla prokázána u 1 těhotné a ve směsi s jinými aloprotilátkami u 14 žen. Anti-c zachyceno 2x, ve směsi 4 x, anti-e 6x, ve směsi 6x, anti-cw 6x, ve směsi 1x. Aloprotilátky v ostatních skupinových systémech byly prokázány: anti-kell u 10 těhotných, ve směsi 1x, anti-jk(a) 1x, anti-le(a) 4x, anti-le(b) 4x, anti-m 4x, anti-s 1x., anti-jr(a) 1x. Směsi aloprotilátek byly nalezeny u 21 těhotných.za pozornost stojí těhotná s nálezem směsi imunních aloprotilátek anti-d+c+ Kp(a),+S,+M, které se vytvářely během gravidity. U 22 těhotných s pozitivním screeningem nepravidelných protilátek jsme neprokázali žádnou specifickou aloprotilátku, nespecifické reakce v enzymovém testu byly zachyceny u 33 gravidních. U 8 těhotných bylo nutné během těhotenství provést opakovaně invazivní vyšetření jako je kordocentéza a aplikace intrauterinní transfuze. V 7 případech gravidity skončily příznivě, i když bylo nutné po porodu provést výměnné transfuze a v neonatálním období podat transfuze. Je bezpodmínečně nutné dodržovat systém SLP při všech činnostech souvisejících s laboratorním testováním, dodržovat platné postupy a SOP a kontrolovat kvalitu diagnostik a použitých metodik v souladu s doporučením SÚKL a odborné společnosti STL JEP.

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] Masopust, J., Marečková, O. Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu. Hematologie a transfuze dnes. 1998, č. 4, s. 2-5. [2] Hromadníková, Ilona, et al. Neinvazivní RHD genotypizace plodu na DNA izolované z periferní krve RhD negativních těhotných žen. Transfuze a hematologie dnes. 2003, č. 4, s. 152-158. [3] Petrtýlová, Květa. Anémie v dětském věku. VOX PEDIATRIAE : Časopis praktických dětských lékařů. 2003, roč. 9, č. 3, s. 25-28. [4] Novorozenecký ikterus. Postgraduální medicína. 2007, č. 25, s. 21-22. [5] Gooch A, Parker J, Wray J, Qureshi H. Guideline for blood grouping and antibody testing in pregnancy. British Committee for Standards in Haematology, 2006. www.bcshguidelines.com [6] De Silva M. New guidelines for pre and perinatal immunohaematology. ISBT 2003; Istanbul; S109-111 [7] Klein HG, Anstee DJ. Haemolytic Disease of the fetus and the newborn. In Mollison s blood transfusion in clinical medicine. Blackwell Publishing 2005, 11 th edition, p.496-545 [8] Howard, H., Martlew, V., Bromilow, I., (1998) Consequences for fetus and neonate of maternal red cell alloimunisation. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed., 78 F62-F66. [9] Judd WJ. Practice guidelines for prenatal and perinatal immunohematology, revisited. Tranfuzion 2001; 41: 1445-1452. [10] Vaughan JI, Warwick RM, Letsky EA. Inhibition of erythroid progenitor cells by anti-kell antibodies in fetal alloimune anemia. New Engl J Med 1998; 338; 798-803. [11] Zupanska B, Thompson EE, Merry AH. Fc receptors for IgG1 and IgG3 on human mononuclear cells an evaluation with known levels of erythrocyte bound IgG. Vox Sang 1986: 97-103.

[12] Wong ECC. Pathogenesis of haemolytic disease of the fetus and newborn. AABB Annual meeting. Seattle 2005. [13] Jaiprakash, J, Gupta, P K, Kumar, H. Role of gel based technique for Coomb's test. Indian J Pathol Microbiol.. 2006, vol. 3, no. 49, s. 370-372. Dostupný z WWW: <http://lib.bioinfo.pl/pmid:17001887>. [14] Bennett PR, Le Van Kim C, Colin Y, et al. Prenatal determination of fetal RhD type by DNA amplification. N Engl J Med 1993;329:607-10. [15] Lo YMD, Bowell PJ, Selinger M, et al. Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers. Lancet 1993;341:1147-8. [16] Geifman-Holtzman O, Bernstein IM, Berry SM, et al. Fetal RhD genotyping in fetal cells flow sorted from maternal blood. Am J Obstet Gynecol 1996;174:818-22. [17] Sekizawa A, Watanabe A, Kimura T, Saito H, Yanaihara T, Sato T. Prenatal diagnosis of the fetal RhD blood type using a single fetal nucleated erythrocyte from maternal blood. Obstet Gynecol 1996;87:501-5. [18] Toth T, Papp C, Toth-Pal E, Nagy B, Papp Z. Fetal RhD genotyping by analysis of maternal blood: a case report. J Reprod Med 1998;43:219-22. [19] Kumar, S, Regan, F. Management of pregnancies with RhD alloimmunisation. BMJ [online]. 2005, no. 330 [cit. 2008-03-27], s. 1255-1258. Dostupný z WWW: <http://bmj.com/cgi/content/full/330/7502/1255>. [20] Lurie, S, Eliezer, E, Piper, I. Is antibody screening in Rh (D)-positive pregnant women necessary?. J Matern Fetal Neonatal Med. : The journal of maternal-fetal & neonatal medicine : the official journal of the European Association of Perinatal Medicine [online]. 2003, vol. 14, no. 6 [cit. 2008-03-30], s. 404-406.

SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK AGH DNA ery FT GLP Hb HDN HON htk IgG IgM LISS NAT PAT SLP SOP Anti-globulinum humanum, protilátka proti lidské bílkovině Deoxyribonukleová kyselina erytrocyty v krevním obraze fototerapie Good laboratory practice, správná laboratorní praxe Hemoglobin v krevním obraze Hemolytic disease of newborn, hemolytické onemocnění novorozence Hemolytické onemocnění novorozence hematokrit v krevním obraze Imunoglobulin G Imunoglobulin M Low Ionic Strength Saline, roztok o nízké iontové síle Nepřímý antiglobulinový test Přímý antiglobulinový test Správná laboratorní praxe Standardní operační postup STL JEP Společnost pro transfuzní lékařství J.E.Purkyně SÚKL Státní ústav pro kontrolu léčiv