PŘÍSPĚVEK KE STUDIU DEGRADACE TENKÝCH VRSTEV Z ALIFATICKÝCH POLYESTERŮ

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ TECHNOLOGIE PŘÍSPĚVEK KE STUDIU DEGRADACE TENKÝCH VRSTEV Z ALIFATICKÝCH POLYESTERŮ RIGORÓZNÍ PRÁCE Vedoucí rigorózní práce: Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Hradec Králové 16 Mgr. Veronika Müllnerová

Děkuji vedoucímu práce Doc. RNDr. Milanu Dittrichovi, CSc. za odborné a trpělivé vedení při vypracování této rigorózní práce a za poskytnutí cenných rad.

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, který jsem vypracovala samostatně (pod vedením konzultanta). Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Hradec Králové, 16 Mgr. Veronika Müllnerová

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie Kandidát: Konzultant: Název rigorózní práce: Mgr. Veronika Müllnerová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Příspěvek ke studiu degradace tenkých vrstev z alifatických polyesterů V teoretické části rigorózní práce je pojednáno o biodegradabilních polymerních matricích. Hlavní pozornost je věnována lineárnímu kopolymeru kyseliny mléčné a kyseliny glykolové (PLGA) a blokovým kopolymerům s polyethylenglykoly (PEG) a jejich využití při formulaci systémů pro řízené uvolňování léčivých látek. Další část je věnována degradaci sloučenin daného typu, jejich toxicitě a metodám výroby nosičů a přípravě částic a implantátů včetně potenciálních přípravků pro hojení ran a regeneraci kůže. V experimentu byly studovány dva parametry degradace, bobtnání a eroze, tří různých polyesterů s odlišnou molekulovou hmotností a konstitucí molekuly. Byl studován vliv aktuální acidity a iontové síly na oba jevy po dobu 21 dní. Bylo prokázáno, že eroze je parametr, který je velmi málo citlivý na změny molekulové hmotnosti a stupně větvení kopolymerů. Průběh bobtnání v čase měl pulzní charakter, počet pulzů a jejich intenzita byly ovlivněny vnitřními parametry polymerních matric a také složením vnějšího vodného prostředí. 1

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Technology Candidate: Consultant: Title of thesis: Mgr. Veronika Müllnerová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Contribution to a study of thin layers degradation made from aliphatic polyesters Theoretical part of the thesis is concentrated primarily on biodegradable polymer matrices. Main focus deals with linear copolymer of lactic and glycolic acid (PLGA), block copolymers with polyethylene glycols (PEG) and their usage at formulation of systems for controlled release of active substances. Another part deals with degradation of compounds of above mentioned types, their toxicity and methods of drug carrier production, preparation of particles and implants, including potential systems for wound healing and skin regeneration. The experimental study was concentrated on two degradation parameters swelling and erosion. Three different polyesters with various molecular weight and its constitution were studied. The goal was to study the influence of actual acidity and ionic force on both parameters during 21 days period. It was proven that erosion is a parameter very little sensitive to changes of molecular weight and branching degree of copolymers. The swelling process in time had a pulsing character, number of pulses and their intensity were influenced by internal parameters of polymer matrices and also by composition of external aqueous environment. 2

Obsah 1. Zadání práce... 5 2. Seznam použitých zkratek... 6 3. Úvod... 7 4. Teoretická část... 8 4.1 Biodegradabilní polymerní matrice... 8 4.2 PLGA a její fyzikálně-chemické vlastnosti... 8 4.3 Kopolymery PLGA... 1 4.4 Degradace PLGA... 11 4.4.1 Faktory ovlivňující degradaci PLGA... 12 4.4.2 Toxicita... 14 4.5 Metody výroby PLGA nosičů... 14 4.5.1 Metody přípravy mikročástic... 15 4.5.2 Metody přípravy nanočástic... 16 4.5.3 Metody přípravy implantátů... 17 4.5.4 Smíšené systémy... 18 4.6 Systémy dodávající růstové faktory... 19 4.6.1 Hojení ran a regenerace kůže... 19 4.6.2 Růstové faktory jako nadějný přístup k hojení ran... 4.6.3 Konkrétní systémy uvolňující růstové faktory... 5. Experimentální část... 23 5.1 Použité přístroje... 23 5.2 Použité chemikálie... 23 5.3 Postup přípravy... 23 5.3.1 Příprava pufru... 23 5.3.2 Příprava vzorků... 24 5.3.3 Stanovení stupně bobtnání a stupně eroze... 24 5.4 Vzorce pro výpočet... 26 6. Výsledky tabulky a grafy... 27 7. Diskuze... 59 7.1 Bobtnání a eroze... 59 3

7.2 Vliv konstituce a velikosti molekuly polymeru na bobtnání a erozi... 6 7.3 Vliv aktuální acidity prostředí na bobtnání a erozi... 6 7.4 Vliv iontové síly kapalného prostředí na bobtnání a erozi... 62 8. Závěry... 64 9. Použitá literatura... 65 4

1. Zadání práce Téma rigorózní práce bylo zadáno v návaznosti na výsledky experimentů publikovaných v diplomové práci. Hlavním záměrem bylo ověřit, jestli se pulzní charakter objemových změn matric polyesterů, lišících se molekulovou hmotností a konstitucí molekuly, projevuje také v podmínkách umístění matrice v nádobě s kontaktem s vodným médiem omezeným stěnami nádoby a konstantní plochou kontaktu s vodným médiem. Dále bylo zadáno zjistit, do jaké míry je průběh bobtnání a eroze matric ovlivněný aktuální aciditou a iontovou silou vodného média. 5

2. Seznam použitých zkratek bfgf - základní růstový faktor fibroblastů GA - glykolová kyselina LA - mléčná kyselina MS - mikrosféry Mw - hmotnostní střed relativní molekulové hmotnosti polymeru M3 - terpolymer kyseliny mléčné a glykolové s přídavkem mannitolu NS - nanosféry PCNA - proliferační antigen buněčného jádra PDGF-BB - růstový faktor BB (homodimer) produkovaný trombocyty PDLA - poly-d-mléčná kyselina PEG - polyethylenglykol PEO - polyethylenoxid PEtU-PDMS - polyetherurethan-polydimethylsiloxan PGA - poly-glykolová kyselina PLA - poly-mléčná kyselina PLLA - poly-l-mléčná kyselina PLGA - kopolymer kyseliny mléčné a glykolové rhegf - rekombinantní lidský epidermální růstový faktor T3 - terpolymer kyseliny mléčné a glykolové s přídavkem tripentaerythritolu Tg - teplota skelného přechodu VEGF - cévní endoteliální růstový faktor 6

3. Úvod Polyestery odvozené od α-hydroxykyselin patří díky své biodegradabilitě a biokompatibilitě mezi nejatraktivnější materiály používané ve farmacii. Jedním z nejvíce využívaných polyesterů je PLGA (kopolymer kyseliny mléčné a glykolové). PLGA jakožto biologicky rozložitelný polymer podléhá v těle hydrolýze za vzniku původních oligomerů a monomerů rozpustných ve vodě, které jsou snadno metabolizovány lidským tělem nebo nezměněné eliminovány. Z toho vyplývá minimální systémová toxicita polymeru, což je jeho další nesporná výhoda. PLGA můžeme použít pro přípravu nebo výrobu mikročástic, nanočástic nebo implantátů, do kterých lze inkorporovat léčivé látky, které jsou v polymerní matrici dopraveny na cílové místo účinku, kde dochází k jejich postupnému uvolňování. Výhodou cíleného terapeutického účinku léčiva, který se využívá například při léčbě nádorového onemocnění, je možnost prodlouženého uvolňování léčivé látky a snížení vedlejších účinků, čímž se zlepšuje compliance pacienta. 7

4. Teoretická část 4.1 Biodegradabilní polymerní matrice Biodegradabilní materiály mohou být přírodní nebo syntetické a jsou degradovány in vivo buď enzymaticky nebo neenzymaticky nebo kombinovaně. Při jejich degradaci jsou produkovány biokompatibilní, toxikologicky bezpečné produkty, které jsou později odstraněny metabolickou cestou. Biodegradabilní polymery jsou velmi používané při vývoji řízených systémů dodávajících léčiva, které mohou zlepšit pacientovu compliance a snížit vedlejší účinky díky prodlouženému intervalu dávkování a cílené biodistribuci. Základní kategorie biomateriálů používaných v těchto systémech mohou být klasifikovány jako (a) syntetické biodegradabilní polymery, které zahrnují relativně hydrofobní materiály, jako jsou α-hydroxykyseliny, polyanhydridy atd. a (b) v přírodě se vyskytující polymery (biopolymery), odvozené od cukrů (hyaluronan, chitosan) a anorganických látek (hydroxyapatit). Všeobecně biodegradabilní polymery obsahují nestabilní vazby, jako jsou vazby esterové, amidové nebo anhydridové, které jsou náchylné k hydrolýze nebo enzymatické degradaci. (1) Polyestery tvoří jednu skupinu polymerů, která je charakterizována přítomností esterových vazeb v hlavním makromolekulárním řetězci. Patří sem například PLA (poly-mléčná kyselina), PGA (poly-glykolová kyselina), PLGA (kopolymer kyseliny mléčné a glykolové) atd. PLGA patří mezi jeden z nejvíce používaných biodegradabilních polymerů ve vývoji systémů dodávajících léčiva. (2) Je to především díky dlouhodobým klinickým zkušenostem, výhodným degradačním charakteristikám a možnostem prodlouženého uvolňování léčiv. PLGA je syntetizována kopolymerací dvou různých monomerů cyklických dimerů (1,4- dioxan-2,5-diony) kyseliny glykolové a mléčné. Degradace PLGA probíhá hydrolýzou jejich esterových vazeb v přítomnosti vody. (3) 4.2 PLGA a její fyzikálně-chemické vlastnosti Kyselina poly-mléčná se může nacházet v D nebo L formě, protože má asymetrický alfa uhlík. Enantiomerní formy polymeru PLA se označují jako PDLA 8

(poly-d-mléčná kyselina) a PLLA (poly-l-mléčná kyselina). PLGA je kopolymer kyseliny poly-d,l-mléčné a glykolové, kde D a L forma kyseliny mléčné je zastoupena ve stejném poměru. (4) Pro navržení systému s řízeným uvolňováním léčiva je nezbytné porozumět fyzikálním, chemickým i biologickým vlastnostem PLGA. Na fyzikálně-chemické vlastnosti tohoto polymeru má vliv mnoho faktorů, mezi které patří molekulová hmotnost, poměr kyseliny mléčné a glykolové, velikost tělesa celého systému, vystavení vodě a skladovací teplota. (5) Fyzikálně-chemické vlastnosti opticky aktivního polyesteru PLA jsou téměř stejné. Díky nepravidelným polymerním řetězcům může být polymer PLA obecně vyroben ve vysoce krystalické formě (PLLA) nebo kompletně amorfní (PDLA). Poly-glykolová kyselina neobsahuje žádné postranní methylové skupiny a na rozdíl od kyseliny poly-mléčné se nachází ve vysoce krystalické struktuře, a proto se stupeň krystalinity PLGA snižuje s vyšším zastoupením PDLA v molekule. Přítomnost methylových skupin činí PDLA více hydrofobní než PGA, takže kopolymer PLGA bohatší na kyselinu mléčnou je méně hydrofilní, absorbuje méně vody, a proto degraduje pomaleji. (6) Schéma 1: Schématická struktura PLGA (náhodný kopolymer; x-proměnlivý počet jednotek kyseliny mléčné, y-proměnlivý počet jednotek kyseliny glykolové). (2) PLGA může být zpracována do téměř každého tvaru a velikosti a může enkapsulovat molekuly prakticky všech velikostí. Je rozpustná v mnoha 9

rozpouštědlech, jako jsou například chlorované uhlovodíky, tetrahydrofuran, aceton nebo ethylacetát. V přítomnosti vody PLGA podléhá hydrolýze a dochází tak ke štěpení esterových vazeb. Parametry, které jsou u pevných formulací obvykle považovány za neměnné, se mohou při hydrolýze měnit s časem. Týká se to například molekulové hmotnosti, obsahu vlhkosti nebo teploty skelného přechodu (Tg). Tyto změny ve vlastnostech PLGA během hydrolytické degradace ovlivňují míru uvolňování a degradace zabudovaného léčiva. Mechanická odolnost PLGA je ovlivněna fyzikálními vlastnostmi, jako je molekulová hmotnost a koeficient polydisperzity. (6) Mechanická odolnost, schopnost bobtnání, schopnost podrobit se hydrolýze a následně biodegradaci polymeru jsou přímo ovlivněny stupněm krystalinity PLGA, který je závislý na typu a molárním poměru jednotlivých monomerních jednotek v kopolymerním řetězci. Vyšší zastoupení PGA v molekule vede k rychlejší degradaci. Avšak k nejrychlejší degradaci dochází, když je poměr PLA:PGA přesně 5:5. Stupeň krystalinity a bod tání přímo souvisejí s molekulovou hmotností polymeru. (4) 4.3 Kopolymery PLGA Potřeba lepšího systému, který by dokázal zabudovat různé typy léčiva a mohl být podáván různými způsoby, vedla k vývoji několika typů blokových kopolymerů obsahujících polyethylenglykol (PEG). PLGA/PEG blokový kopolymer může být zpracován jako diblok (PLGA/PEG) nebo triblok, a to buď jako ABA (PLGA-PEG- PLGA) (7) nebo jako BAB (PEG-PLGA-PEG) (8), kde A označuje hydrofobní polyesterový blok (PLGA) a B hydrofilní polyethylenglykolový blok (PEG). V diblokovém typu jsou řetězce PEG orientovány směrem k okolnímu vodnému médiu. Tato vrstva PEG se chová jako bariéra a omezuje interakce s cizími molekulami, čímž zlepšuje stabilitu. Nicméně přidání PEG do systému také vede ke snížené účinnosti enkapsulace pro léky a proteiny, dokonce i při použití nejvhodnějších technik zpracování. Snížená schopnost zabudovat léčivo může být způsobena tím, že řetězce PEG stericky brání interakcím mezi léčivem/proteinem a polymerem. Ale přesný mechanismus tohoto efektu není úplně jasný. (9) 1

Triblokové kopolymery ABA i BAB se mohou chovat jako termogel, kde A blok je kovalentně spojen s B blokem esterovými vazbami. Kopolymer je při nízké teplotě obvykle volně tekoucí roztok a při tělesné teplotě může vytvářet vysoce viskózní gel. Hydrofobní segment (PLGA) tvoří příčné vazby a hydrofilní segment (PEG) dovoluje kopolymerním molekulám zůstat v roztoku. Při nižších teplotách převládá ve vodném médiu vodíková vazba mezi hydrofilním PEG a molekulami vody, což má za následek jeho rozpouštění ve vodě. Se zvyšující se teplotou vodíkové vazby slábnou a hydrofobní síly mezi PLGA segmenty zesilují, což vede k přechodu roztoku na gel. Uvolňování léčiva a/nebo proteinu z obou typů kopolymerů se děje dvěma základními mechanismy: (a) difuze z hydrogelu během počáteční fáze uvolňování a (b) uvolňování erozí z matrice hydrogelu během pozdější fáze. Během degradace PEG-PLGA-PEG je výhodnější ztráta hmoty z části bohaté na PEG, a proto zbývající gel ve vodném prostředí zůstává více hydrofobní, což vede k menšímu obsahu vody. (7,8) 4.4 Degradace PLGA Kopolymer PLGA podléhá degradaci, což spočívá především v hydrolýze, kdy dochází k rozštěpení esterových vazeb na oligomery a nakonec na monomery. Degradační proces tohoto polymeru se děje převážně objemovou degradací, což znamená, že pronikání vody dovnitř matrice je rychlejší než míra degradace polymeru. Výsledkem biodegradace je zvyšování počtu koncových karboxylových skupin, které autokatalyzují celý proces. Degradace kopolymeru PLGA je komplexní proces objemové difuze, povrchové difuze, objemové eroze a povrchové eroze. Ale protože existuje mnoho parametrů, které ovlivňují degradační proces, způsob uvolňování je vlastně nepředvídatelný. Míra degradace závisí na poměru kyseliny mléčné a glykolové v řetězci, molekulové hmotnosti polymeru, stupni krystalinity a na teplotě skelného přechodu polymeru. (1) Role enzymů při degradaci PLGA není úplně jasná. Většina prací uvádí, že degradace PLGA nezahrnuje žádnou enzymatickou aktivitu a děje se jen přes hydrolýzu. Někteří vědci však přicházejí s myšlenkou, že enzymatická aktivita při rozpadu PLGA závisí na rozdílu míry degradace in vitro a in vivo. Kopolymer PLGA 11

degraduje na kyselinu mléčnou a glykolovou. Kyselina mléčná vstupuje do citrátového neboli Krebsova cyklu (cyklus trikarboxylových kyselin) a je metabolizována a následně odstraněna z těla jako oxid uhličitý a voda. Glykolová kyselina je buď vyloučena nezměněná ledvinami, nebo také vstupuje do citrátového cyklu a poté je z těla eliminována stejně jako kyselina mléčná. (11) 4.4.1 Faktory ovlivňující degradaci PLGA Mezi faktory, které mají vliv na degradaci PLGA, patří: - složení polymeru - krystalinita nebo teplota skelného přechodu - hmotnostní střed relativní molekulové hmotnosti polymeru (Mw) - typ léčiva - velikost a tvar matrice - ph - enzymy - množství vloženého léčiva. Abychom mohli zlepšit požadované vlastnosti PLGA, je nutné pochopit všechny faktory, které degradaci PLGA ovlivňují. Složení polymeru je jedním z nejdůležitějších faktorů, který určuje hydrofilitu a míru degradace matrice, což ovlivňuje celkovou míru degradace. Výsledky studie ukazují, že zvyšování procenta kyseliny glykolové v oligomerech urychluje pokles hmotnosti polymeru. PLGA v poměru 5:5 (PLA:PGA) vykazuje rychlejší degradaci než PLGA v poměru 65:35, a to díky vyšší hydrofilitě kyseliny glykolové. To znamená, že absolutní hodnota míry degradace se zvyšuje úměrně obsahu kyseliny glykolové. Množství kyseliny glykolové je zásadní parametr v nastavování hydrofility matrice a následně míry degradace a uvolňování léčiva. (12) Složení polymeru také ovlivňuje důležité vlastnosti, jako je teplota skelného přechodu polymeru a krystalinita, které mají nepřímý vliv na míru degradace. V současné době jsou názory na vliv krystalinity na míru degradace různé. Někteří autoři tvrdí, že se zvyšováním krystalinity vzorku dochází ke zpomalování degradace. 12

(13) Na druhou stranu jiné studie konstatují, že krystalinita kyseliny mléčné zvyšuje míru degradace, protože degradace polokrystalického polymeru je urychlena díky zvyšující se hydrofilitě. (14) Dalším faktorem je hmotnostní střed distribuce relativní molekulové hmotnosti polymeru (Mw). Polymery s vyšší molekulovou hmotností obecně vykazují nižší rychlost degradace. A také polymery, které mají vyšší molekulovou hmotnost, mají delší polymerové řetězce, a proto potřebují na degradaci více času než kratší řetězce polymeru. Ačkoliv u PLLA je tomu naopak, neboť stupeň krystalinity a molekulová hmotnost jsou inverzně úměrné. (15) Přítomnost léčiva může ovlivnit mechanismus degradace, stejně jako míru degradace. Profil uvolňování léčiva, který je definován jako doba nezbytná pro uvolnění 1% léčiva, se také může lišit. Vliv chemických vlastností léčiva musí být zohledněn při vysvětlování mechanismu uvolňování léčiva ze systému na bázi biodegradabilních polymerů. (16) Poměr povrchové plochy a objemu je významným faktorem ovlivňujícím degradaci rozměrných systémů. Vyšší poměr povrchové plochy vede k rychlejší degradaci matrice. Studie také ukazují, že objemová degradace PLGA je rychlejší než ryze povrchová degradace, což znamená, že uvolňování léčiva je rychlejší ze systémů s vyšším poměrem povrchové plochy k objemu. (17) Studie in vitro ukazují, že degradaci PLGA urychluje jak alkalické, tak silně kyselé prostředí, ačkoliv rozdíl mezi mírně kyselým a neutrálním prostředím je méně výrazný díky autokatalýze způsobené koncovými karboxylovými skupinami. (18) Jak již bylo zmíněno výše, vliv enzymů na mechanismus degradace (hydrolytické versus enzymatické štěpení) je nejasný. To se děje zčásti kvůli tomu, že degradace in vivo úplně nekoreluje s degradací pozorovanou in vitro. Bylo zjištěno, že kopolymer PLGA degraduje především hydrolytickou degradací, ale i enzymatická degradace může v tomto procesu hrát svou roli. (19) Množství léčiva, které je vloženo do systému, má výrazný vliv na míru a průběh uvolňování léčiva. Matrice s vyšším obsahem léčiva mají větší počáteční rychlé uvolňování než ty, které obsahují méně léčiva, protože mají menší poměr polymeru 13

k léčivu. Ale tento vliv se zmírňuje, když obsah léčiva dosáhne určitého stupně, který závisí na typu léčiva. () 4.4.2 Toxicita Toxikologické studie se systémy obsahující PLGA ukazují, že se občas může objevit lokální reakce v místě aplikace. Ačkoliv jsou tyto reakce obecně mírné a PLGA je prezentována jako velmi bezpečný materiál pro makroskopické a mikročásticové systémy, ojediněle se mohou při použití nanometrových aplikací objevit závažnější reakce. Některé studie ukazují, že nanočástice jakéhokoliv materiálu mohou vytvořit specifickou biodistribuci a toxikologický profil. (21) 4.5 Metody výroby PLGA nosičů Nejrychleji rostoucí skupinou farmaceutik, pro které jsou používány systémy s řízeným nebo cíleným uvolňováním, jsou léčiva a proteiny. Zvyšuje se tak specificita, snižuje se toxicita a klesá riziko spojené s léčbou. Nicméně problémy se stabilitou a dodáním léčiv a proteinů omezily počet produktů na trhu. Zachování optimální použitelnosti peptidových a proteinových léčiv obvykle vyžaduje pevný stav, aby se omezilo riziko hydrolytické degradace. (22) Dodání peptidů a proteinů může vyžadovat parenterální podání, aby se zabránilo degradaci v trávicím traktu a first pass metabolismu. Krátký poločas peptidů a proteinů také přispívá k potřebě parenterálního podání, čímž se snižuje interval podávání. Abychom se vyhnuli nepohodlnému chirurgickému vkládání velkých implantátů, mohou být pro řízené uvolňování použity biodegradabilní a biokompatibilní PLGA částice (mikrosféry, mikrokapsuly, nanokapsuly, nanosféry). Kromě biokompatibility, kompatibility s léčivem, vhodné kinetiky odbourávání a mechanických vlastností, PLGA může být snadno zpracována a vyrobena v různých formách a velikostech. (1) 14

4.5.1 Metody přípravy mikročástic Mezi metody, kterými se připravují mikročástice, patří odpařování rozpouštědla, koacervace a sprejové sušení. Metoda, při které dochází k odpařování rozpouštědla, může probíhat buď jako jednoduchá emulzní metoda, nebo jako dvojnásobná (mnohonásobná) emulzní metoda. V prvním případě můžeme uvést jako příklad olej ve vodě. Nejdříve je polymer ve vhodném množství rozpuštěn ve vodě nemísitelném, těkavém organickém rozpouštědle (např. dichlormethan), čímž se připraví jednofázový roztok. Poté je do roztoku přidáno léčivo o velikosti zhruba - 3 μm a vytvoří se disperze. Tento polymer je dále při vhodné teplotě emulgován za stálého míchání ve velkém objemu vody v přítomnosti emulgátoru (např. polyvinylalkohol). Organické rozpouštědlo je poté za vhodných podmínek odpařeno nebo extrahováno, aby se zpevnily olejové kapičky. Výsledné pevné mikrosféry jsou nakonec promyty a sušeny. Tato metoda je ideální pro léčiva nerozpustná ve vodě, jako jsou steroidy. (23) Jako příklad dvojnásobné emulgace můžeme uvést vodu v oleji ve vodě. Tato metoda je vhodná na enkapsulaci ve vodě rozpustných léčiv, jako jsou peptidy, proteiny a vakcíny. Nejprve je vhodné množství léčiva rozpuštěno ve vodné fázi a poté je tento roztok léčiva přidán do organické fáze, která se skládá z roztoku PLGA nebo PLA v dichlormethanu nebo chloroformu. Za intenzivního míchání dojde ke vzniku emulze voda v oleji. Tato primární emulze je přidána do vodného roztoku polyvinylalkoholu a dále je za vhodných stresových podmínek míchání emulgována zhruba jednu minutu. Organické rozpouštědlo je poté odpařeno nebo extrahováno. (24) Mezi další metody přípravy nebo výroby mikročástic patří fázová separace neboli koacervace. Tento proces poskytuje dvě kapalné fáze, a to fázi obsahující polymer a fázi supernatantu. Léčivo, které je rozpuštěno nebo dispergováno v roztoku polymeru je obaleno koacervátem. Proces koacervace zahrnuje následující tři kroky: fázovou separaci roztoku polymeru, adsorpci koacervátu okolo částic léčiva a ochlazování mikrosfér. (25) Roztoky jsou připraveny mícháním polymeru a rozpouštědla ve vhodném poměru. Hydrofilní léčiva, jako peptidy nebo proteiny, jsou rozpuštěna ve vodě a dispergována v roztoku polymeru (emulze voda v oleji). Hydrofobní léčiva, jako například steroidy, jsou buď solubilizována, nebo dispergována v roztoku polymeru (emulze olej ve vodě). Postupným přidáváním 15

organického média do fáze obsahující polymer, léčivo a rozpouštědlo dochází k extrakci polymeru a rozpouštědla, což vede k fázové separaci polymeru vytvářením jemného koacervátu léčiva obsahujícího kapičky. Tento systém je potom rychle ponořen do média, ve kterém není rozpustný, aby došlo k ochlazení těchto mikrokapiček. Konečná forma mikrosfér je tvořena promýváním, proséváním, filtrací, centrifugací nebo mrazovým sušením. (26) Sprejové sušení je velmi rychlé, výhodné a má velmi málo výrobních parametrů, takže je vhodné pro průmyslové zpracování. Mikrosféry naplněné léčivem, proteinem nebo peptidem jsou připraveny sušením disperze s/o (pevná látka v oleji) nebo emulze v/o (voda v oleji) v proudu horkého vzduchu. Hlavní nevýhodou tohoto procesu je adheze mikročástic na vnitřní stěny sušičky. Typ léčiva (hydrofobní nebo hydrofilní) rozhoduje o volbě rozpouštědla. Povaha použitého rozpouštědla, teplota odpařování rozpouštědla a rychlost podávání ovlivňuje morfologii mikrosfér. Tato metoda je vhodná pro zabudování všech druhů léčiv, peptidů nebo proteinů do mikročástic bez významné ztráty jejich biologické aktivity. (27) 4.5.2 Metody přípravy nanočástic Všechny metody používané na přípravu mikročástic mohou být při změně některých výrobních parametrů použity také na přípravu PLGA nanočástic (nanosfér a nanokapsul). Nejznámější metodou používanou pro přípravu pevných nanočástic z polymerů je emulgace s odpařením rozpouštědla. Tato metoda je v první řadě používána pro enkapsulaci hydrofobních léčiv, ale úpravou metodiky (místo jednoduché emulgace dvojnásobná nebo mnohonásobná emulgace) se tato technika stala preferovanou i pro enkapsulaci hydrofilních sloučenin a proteinů. (28) Další technikou, kterou lze použít, je nanoprecipitační metoda. Polymer a léčivo se rozpustí v acetonu a poté se to přidá do vodného roztoku, který obsahuje Pluronic F68. Nakonec je aceton za vhodné teploty a sníženého tlaku odpařen. (29) Vysolování je další metoda, ve které je jako první vytvořena emulze voda v oleji, která obsahuje polymer, rozpouštědlo (obvykle nechlorované rozpouštědlo jako je aceton), sůl (např. magnezium acetát) a stabilizátor. Poté je do roztoku přidávána voda 16

v takovém množství, dokud aceton nepronikne do vody, což vede k vytvoření nanočástic. (3) 4.5.3 Metody přípravy implantátů Mezi metody, kterými se připravují implantáty, patří metoda vymývání rozpouštědla a tvarování tlakem a technika extruze. První metoda je proces, kterým se připravují milimetrová tělíska, která mohou být při dlouhodobé léčbě implantována nebo vsunuta do těla. Tato velká makroskopická tělíska se chovají jako rezervoár, ze kterého se může léčivo uvolňovat po určitou dobu. Směs polymeru a léčiva je ve vhodném poměru rozpuštěna v běžném rozpouštědle (např. aceton) a rozpouštědlo je vymýváno při 6 C do úplného odpaření. Výslednou strukturou je složený materiál obsahující léčivo spolu s polymerem. Tento materiál je následně stlačován do požadovaných tvarů při zhruba 8 C. Tato metoda není vhodná pro průmyslové zpracování a to hned z několika důvodů. Zaprvé proces vyžaduje velké množství organického rozpouštědla, aby se rozpustil polymer a léčivo. Také je tento systém kvůli použití organického rozpouštědla náchylný k denaturaci léčiva a/nebo proteinu během enkapsulace. Denaturované léčivo se stává neúčinným a může vyvolat nepředvídatelné vedlejší účinky. Zadruhé trvá dlouho, než se úplně odstraní rozpouštědlo z výsledného materiálu. A zatřetí tato metoda není kontinuální, což může zvýšit rozdílnost mezi jednotlivými šaržemi, stejně jako náklady na výrobu. (31) Technika extruze neboli protlačování je kontinuální proces, který spočívá v tažení směsi polymer-léčivo přes vytlačovací hubici, takže dojde k vytvoření implantátu o určitém tvaru bez použití rozpouštědla. Proces vyžaduje extrudér neboli vytlačovací lis a směs polymeru a léčiva o požadované mikronové velikosti. Během procesu je směs zahřívána do polotekutého stavu kombinací vytápěcích prvků a smykového napětí z vytlačovacího šroubu. Šroub protlačuje směs přes trysku. Výsledný extrudát je potom ochlazován, čímž ztuhne, a nakonec je rozkrájen na implantáty o požadované délce. Vystavení léčiva vysokým teplotám může být nevýhodné kvůli riziku denaturace. Proto mohou být použita jen některá léčiva, jejichž výběr závisí např. na bodu tání, polymorfní stabilitě a chemických interakcích s PLGA. (32) 17

4.5.4 Smíšené systémy Prvním systémem tohoto typu je zařízení, kterým se může podávat více léčiv. Někdy je výhodnější přerušované uvolňování léčiva než jeho nepřetržitá přítomnost, což ale může vést k downregulaci receptorů nebo k vývoji tolerance. Proto byly vyvinuty systémy s pulzujícím uvolňováním léčiva, u kterých je předem určená doba klidu, po které následuje rychlé uvolňování. To se opakuje v cyklech, dokud systém není úplně degradován. Tato zařízení jsou také schopná uvolňovat více léčiv v určitých sekvencích. Vhodným kandidátem na výrobu těchto systémů je PLGA. (33) Dalším systémem je systém používající nadkritický oxid uhličitý jako pěnidlo. Tradiční metody vyžadují velké množství organického rozpouštědla, což posléze vyžaduje přídavné kroky k jeho odstranění. Na rozdíl od těchto tradičních metod použití nadkritického oxidu uhličitého minimalizuje nebo dokonce úplně vylučuje použití organického rozpouštědla. Polymer s léčivem nebo proteinem je obvykle vyroben použitím emulgace. Tento roztok je ihned po emulgaci vložen do tlakové komůrky s oxidem uhličitým. Pod vysokým tlakem je teplota skelného přechodu PLGA snížena, což vede k tekutému polymeru rozpuštěnému v oxidu uhličitém. Po sekvenci zvyšování a poté rychlého snižování tlaku dochází kvůli termodynamické nestabilitě molekul oxidu uhličitého k jejich seskupování uvnitř tekutého polymeru. Jakmile oxid uhličitý vyprchá, z emulze se stane porézní polymerní struktura. (34) Dalším systémem jsou multifunkční PLGA mikro nebo nanočástice. PLGA mikro nebo nanočástice se také používají pro vícenásobné podání léčiv v jednom systému. PLGA částice mohou být použity k enkapsulaci absorpčních a fluorescenčních barviv spolu s léčivy pro multimodální zobrazení používající fluorescenci, ultrazvuk nebo fotoakustickou tomografii. Takové multifunkční částice se mohou také vytvořit ze speciálního materiálu, aby se zabránilo vedlejším účinkům léčiva. Tyto částice nejsou pouze systémem pro podávání léčiv, ale díky cílenému podávání také omezují škodlivé vedlejší účinky. Nicméně je potřeba odhadnout jejich chemickou reaktivitu před určením finálního produktu. Výroby těchto multifunkčních částic se obvykle dosáhne použitím emulzních metod. (35) 18

4.6 Systémy dodávající růstové faktory Současné pokroky ve vývoji systémů uvolňujících růstové faktory představují skvělou příležitost k vývoji nových terapií nebo ke zlepšení stávající léčby. Tyto pokroky se týkají především hojení chronických ran a následné regenerace kůže. Za tímto účelem je studována spousta biokompatibilních materiálů. V posledních letech se prevalence lidí trpících chronickým zraněním rapidně zvýšila. Mezi faktory, které zpomalují hojení chronických ran, patří například věk, kouření, obezita a chronické nemoci, jako je diabetes nebo venózní nebo arteriální nedostatečnost, a proto se zlepšení hojení těchto ran stalo hlavní potřebou. Současné postupy terapie obvykle zahrnují použití různých typů obvazů, které mají primárně zvýšit kvalitu života pacientů a snížit bolest. V současné době se vývoj nesoustředí pouze na hledání nové léčby chronických ran, která by zkrátila délku hojení, byla odolná proti proteázám, stimulovala by endogenní cytokiny a růstové faktory atd., ale také na zlepšení účinnosti stávajících terapeutických postupů. Nové strategie se snaží zlepšit stabilitu růstových faktorů v místě rány, umožnit prodloužené uvolňování a tím zvýšit bezpečnost terapie. (36) 4.6.1 Hojení ran a regenerace kůže Hojení kožních ran je komplex fyziologických jevů navržený nejenom k obnově funkce kožní bariéry a homeostázy, ale také k zabránění riziku infekce a následným komplikacím. Chronické rány jsou takové rány, u kterých obnova anatomické a funkční celistvosti kůže trvá déle než tři měsíce. Takovéto rány, na rozdíl od akutních ran, zůstávají v patologické zánětlivé fázi. Následkem toho prozánětlivé buňky a cytokiny podněcují proteolytické mikroprostředí, které vyvolává degradaci růstových faktorů. Takto je funkce růstových faktorů potlačena, což vede ke zpoždění nebo poškození normálního hojícího procesu. Mimo to tyto typy ran obvykle vykazují velké bakteriální zatížení, což může později komplikovat jejich hojení. (37) Nejznámější etiologie chronických ran zahrnuje tlak, diabetickou nohu a cévní vředy (venózní a arteriální vředy). Vředy způsobené tlakem můžeme charakterizovat jako lokalizovanou změnu na kůži nebo v podkožní tkáni. Diabetická noha je jednou z nejobávanějších komplikací diabetu. Je způsobena kombinací různých faktorů, jako 19

jsou mechanické změny v kostní architektuře nohy, periferní neuropatie a periferní vaskulární onemocnění. Všechny tyto faktory se v mnohem větší míře vyskytují u diabetické populace. Cévní vředy jsou způsobené poruchou cirkulace, která může vést ke sníženému arteriálnímu krevnímu toku nebo ke zhoršenému žilnímu návratu krve. Tyto vředy jsou obvykle lokalizovány na dolních končetinách a kvůli jejich vysoké prevalenci představují skupinu poranění se speciální závažností. Navíc jsou hlavní příčinou morbidity u pacientů trpících periferním vaskulárním onemocněním. (38) 4.6.2 Růstové faktory jako nadějný přístup k hojení ran Růstové faktory jsou biologicky aktivní polypeptidy, které se účastní buněčného růstu, dělení, proliferace, migrace a metabolismu buněk. Účinky růstových faktorů jsou způsobeny specifickou vazbou na jejich receptory, která aktivuje celou kaskádu molekulárních jevů. Všechny fáze procesu hojení jsou kontrolovány růstovými faktory a cytokiny. Růstové faktory jsou velmi důležité při hojení ran, protože hrají významnou roli při stimulování granulační tkáně, vytváření zánětlivé odpovědi a podporování angiogeneze. Dále jsou také nezbytné pro úspěšné utváření matrix a pro remodelační a reepitelizační procesy. U chronických ran se počet růstových faktorů snižuje, a proto je jednou ze strategií podporujících proces hojení jejich vnější podání. Dodávání růstových faktorů má však také určitá omezení, a to zejména kvůli jejich nízké stabilitě in vivo. K překonání tohoto nedostatku bylo v posledních letech vyvinuto několik systémů, které zlepšují stabilitu růstových faktorů v místě rány. Toho bylo docíleno především jejich prodlouženým uvolňováním, což v zásadě optimalizuje účinnost léčby. (39) 4.6.3 Konkrétní systémy uvolňující růstové faktory Některé z nejslibnějších systémů pro řízené uvolňování peptidů a proteinů obsahují léčivo zabudované do biokompatibilních polymerů. Mikro a nanočástice jsou koloidní systémy připravené z přírodních nebo syntetických materiálů, jako je PLGA, alginát, želatina, chitosan atd. Tyto typy polymerů jsou velmi rozšířené při vývoji systémů pro terapii chronických ran, protože umožňují řízené uvolňování, snižují

degradaci léčiva způsobenou proteázami a prodlužují účinnost léčby. Někdy také snižují dávky podávaného léčiva, proto mohou být omezeny vedlejší účinky, které se vážou na vysoké dávky, což celkově zvyšuje bezpečnost terapie. Syntetické polymery mají obrovský význam díky své biokompatibilitě, dobrým mechanickým vlastnostem, nízké imunogenitě a toxicitě a předvídatelné degradační kinetice. PLGA je jedním z nejrozšířenějších polymerů, které se používají pro zachytávání růstových faktorů v chronických ranách, a to zejména díky své biokompatibilitě, biodegradabilitě, menší hydrofilitě a také díky tomu, že absorbuje méně vody, je tedy pomaleji degradována, a tím umožňuje prodloužené uvolňování léčiva. Při degradaci PLGA produkuje rovněž laktát, který urychluje angiogenezi, aktivuje prokolagenní faktory a doplňuje endoteliální progenitorové buňky do místa rány. (4) Pro léčbu chronických ran byl vyvinut systém rhegf-plga-ms, což je systém mikrosfér z PLGA, do kterých je inkorporován rekombinantní lidský epidermální růstový faktor. Tento systém vyvinul Dong et al. Studie prováděné in vivo potvrdily, že oproti podávání samotného rhegf topické podávání systému rhegf- PLGA-MS zvyšuje rychlost proliferace fibroblastů a hojení ran. Kromě toho se ukázalo, že při léčení tímto systémem se v místě rány zvýšilo množství proliferačního antigenu buněčného jádra (PCNA), který způsobuje buněčnou proliferaci v epidermis. (41) Chu a kolegové vyvinuli systém rhegf-plga-ns, tj. systém nanosfér z PLGA, do kterých je zabudován rekombinantní lidský epidermální růstový faktor. Tento systém byl vyroben dvojnásobnou emulgací. RhEGF-PLGA-NS vykazuje podobné výsledky jako předchozí systém a umožňuje řízené uvolňování růstových faktorů až po dobu 24 hodin. (42) Dalším systémem, který byl vyvinut pro zlepšení hojení ran, je systém rhegf- PLGA-alginát-MS. In vitro se z tohoto systému uvolňuje růstový faktor až po dobu 41 dní, což je oproti předchozím systémům velká výhoda. Studie in vivo ukazují, že oproti podávání samotného růstového faktoru podání rhegf-ms přímo do léze představuje skvělé řešení zánětu, což napomáhá reepitelizaci a zmenšuje poraněnou oblast. (43) Aby mohl být vyvinut sofistikovanější a účinnější systém podávání léčiva pro lepší hojení ran, mohou se kombinovat systémy se synergistickými účinky. Například nanovlákna mohou být použita v kombinaci s nanočásticemi polymerů. Xie a 21

kolegové vyvinuli systém, kde byl použit elektrospining k výrobě nanovláken obsahujících chitosan, polyethylenoxid (PEO) a cévní endoteliální růstový faktor (VEGF) a také k výrobě nanočástic z PLGA obsahujících růstový faktor BB (homodimer) produkovaný trombocyty (PDGF-BB). Nanočástice z PLGA s PDGF- BB jsou vloženy do nanovláken a tím dojde k urychlení regenerace a remodelace tkání. Tento systém umožňuje časné uvolňování VEGF a tím podporuje vytváření nových cév, ale na druhou stranu také umožňuje prodloužené uvolňování PDGF-BB během celého procesu hojení. Nanovlákna díky chitosanu podporují buněčnou proliferaci a potlačují aktivitu bakterií Escherichia coli a Staphylococcus aureus. In vivo studie ukázaly, že vývoj nanovláken zlepšil proces hojení díky tomu, že urychlují uzavření rány, podporují angiogenezi a reepitelizaci a zlepšují ukládání kolagenu a přestavbu extracelulární matrix. (44) Losi a kolegové vyvinuli systém, kde je do nanočástic z PLGA inkorporován cévní endoteliální růstový faktor (VEGF) a základní růstový faktor fibroblastů (bfgf) a jsou vloženy do fólie z polyetherurethan-polydimethylsiloxanu (PEtU-PDMS). Nanočástice jsou připravené upravenou metodou s difuzí rozpouštědla. Studie prováděné in vivo ukazují, že oproti kontrolním skupinám bez růstových faktorů topické podávání jednou týdně podporuje reepitelizaci, vytváření granulační tkáně a ukládání kolagenu. Tato data dokazují, že se tento systém chová jako dvojnásobný systém pro podávání růstových faktorů jako první musejí růstové faktory proniknout přes PLGA a poté přes fibrinové polymery. Proto se počáteční rychlé uvolňování a unikání částic z místa rány může po topickém podání snížit, což umožňuje prodloužené dodávání růstových faktorů. (45) 22

5. Experimentální část 5.1 Použité přístroje Digitální váhy Kern, max. 6g, d=,5g Analytické digitální váhy Kern ABS, max. 2g, d=,1mg ph metr, HI 221 Microprocessor ph Meter Elektromagnetická míchačka, Heidolph MR 31 Biologický termostat, BT 1 Laboratorní přístroje Praha Vakuová sušárna, Binder Horkovzdušná sušárna, Memmert 5.2 Použité chemikálie Polymerní nosiče: PLGA (kopolymer kyseliny mléčné a glykolové), T3 (terpolymer kyseliny mléčné a glykolové s přídavkem tripentaerythritolu) a M3 (terpolymer kyseliny mléčné a glykolové s přídavkem mannitolu), Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy, Katedra farmaceutické technologie Fosfát-citrátový pufr: Kyselina citronová monohydrát, Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Lach-Ner Neratovice 5.3 Postup přípravy 5.3.1 Příprava pufru Pro studium stupně bobtnání a eroze byl jako médium použit fosfát-citrátový pufr. Nejprve byly připraveny dva roztoky, a to roztok monohydrátu kyseliny citronové a roztok dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu disodného. Výsledný pufr jsme připravili jejich smísením v různém poměru, abychom dosáhli požadovaného ph. Pro přípravu 1 ml prvního roztoku bylo použito 21,g kyseliny citronové, která 23

byla rozpuštěna v 979,g destilované vody. Pro přípravu 1 ml druhého roztoku byla navážka hydrogenfosforečnanu disodného 71,5g. Tato navážka byla rozpuštěna v 928,5g destilované vody. Pro přípravu 1 ml pufru o ph 5. musely být roztoky smíseny v poměru 49 ml roztoku kyseliny citronové a 51 ml roztoku hydrogenfosforečnanu disodného. Aby bylo dosaženo ph 6., bylo pro přípravu 1 ml pufru použito 37,4 ml roztoku kyseliny citronové a 62,6 ml hydrogenfosforečnanu disodného. A dále bylo smíseno 19, ml roztoku kyseliny citronové a 81, ml roztoku hydrogenfosforečnanu disodného pro přípravu 1 ml pufru o ph 7.. Hodnoty ph jsme ověřili pomocí ph metru a případně pomocí připravených roztoků upravili na požadovanou hodnotu. Koncentrace c = 1 je koncentrace, která je isotonická s krevní plazmou. K přípravě dalších koncentrací byla použita destilovaná voda, kterou byla naředěna část připraveného fosfát-citrátového pufru o ph 7.. Pro přípravu hypotonického pufru o koncentraci c=,5 jsme naředili v poměru 1:1 část pufru o ph 7. destilovanou vodou, další část jsme naředili v poměru 1:3 (koncentrace c =,25) a v poměru 1:7 (tento pufr jsme označili jako koncentrace c =,125). 5.3.2 Příprava vzorků Pro studium stupně bobtnání a eroze v této rigorózní práci bylo potřeba připravit polymerní tělíska o hmotnosti 1g. K dispozici jsme měli blok polymeru, který jsme v třecí misce s třenkou mechanicky rozdrobnili na prášek. Do všech připravených scintilačních lahviček bylo na analytických vahách naváženo 1 mg ± 2%. Poté byly lahvičky s polymerním tělískem umístěny do horkovzdušné sušárny, aby se při teplotách 8 až 1 C polymer roztavil. Po vyjmutí ze sušárny došlo ke ztuhnutí polymeru a vytvořila se tak souvislá vrstva na dně scintilační lahvičky. 5.3.3 Stanovení stupně bobtnání a stupně eroze Všechny scintilační lahvičky obsahující polymer o hmotnosti 1g (mlt) byly pečlivě označeny štítky, na kterých byl zaznamenán den odebírání vzorků, označení paralelního stanovení A nebo B a hodnota ph, u některých i koncentrace pufru. Souvislá vrstva polymeru na dně takto označených lahviček byla zalita pufrem. Takto 24

připravené a řádně uzavřené vzorky byly vloženy do biologického termostatu, kde jsme nastavili teplotu na 37 C. Vzorky byly v termostatu uloženy na požadovanou dobu a jejich odebírání probíhalo v předem stanovených intervalech - 1, 3, 7, 14 a 21 dní. Po vyjmutí lahviček z termostatu byl opatrně vylit pufr a pomocí vatových tyčinek a vysoušeče vlasů byly osušeny stěny lahvičky a vzorku. Vysoušení nadbytečných kapek muselo být velmi opatrné. Žádoucí bylo odstranit z lahvičky veškerou kapalinu, ale nevysušit polymer. Pro zjištění stupně bobtnání byly vysušené lahvičky s nabobtnalým polymerem zváženy na analytických vahách a hmotnosti zaznamenány (mlb). Poté pro zjištění stupně eroze byly scintilační lahvičky umístěny do vakuové sušárny, kde se vzorky sušily minimálně 7 dní. Po vyjmutí ze sušárny byly lahvičky s vysušeným polymerem opět zváženy na analytických vahách (mls). Ze zaznamenaných hmotností byly nakonec podle vzorců uvedených na další stránce vypočítány stupně bobtnání a stupně eroze. U polymerů PLGA a 3T byl pro studium v této experimentální práci použit jako médium fosfát-citrátový pufr o ph 5., 6. a 7.. U polymerů 3M jsme ke stanovení také použili pufry o ph 5., 6. a 7., ale navíc ještě pufr o ph 7. o koncentraci c =,5, c =,25 a c =,125. K výměně pufrů během experimentu docházelo každý den. 25

5.4 Vzorce pro výpočet Stupeň bobtnání B = ( m b m s ) 1 m s B stupeň bobtnání (%) mb hmotnost nabobtnalého tělíska (g) ms hmotnost vysušeného tělíska (g) Stupeň eroze E = [1 ( m m s )] 1 m E stupeň eroze (%) m počáteční hmotnost polymerního tělíska (g) ms hmotnost vysušeného tělíska (g) 26

6. Výsledky tabulky a grafy 1) Chování PLGA tělísek o hmotnosti 1 mg ± 2% ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu 1. 21. dne - tabulky Tabulka 1: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 5 14,241 14,2564 1,154 14,2483 1,73,841 1,73 3/A/pH 5 14,5181 14,773 1,1892 14,52 1,21 18,678 1,21 7/A/pH 5 14,7314 14,5421,817 14,4686,7372 9,972 73,7 14/A/pH 5 14,72 13,8644,1424 13,8481,1261 12,9263 12,61 21/A/pH 5 14,32 13,3374,172 13,3371,169 1,7751 1,69 Tabulka 2: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 5 14,5733 14,5886 1,153 14,585 1,72,842 1,7 3/B/pH 5 14,795 14,8724 1,1629 14,7117 1,22 16,347 1,2 7/B/pH 5 14,7628 14,5736,818 14,495,7322 1,7348 73,2 14/B/pH 5 14,2654 13,4122,1468 13,3941,1287 14,637 12,87 21/B/pH 5 14,784 13,7915,75 13,7914,74 1,3514,74 Tabulka 3: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze PLGA vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1,842 1,725 3 17,3528 1,215 7 1,3525 73,47 14 13,495 12,74 21 1,5633 1,215 27

Tabulka 4: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 6 14,5874 14,698 1,224 14,594 1,66 1,5696 1,66 3/A/pH 6 14,6266 14,844 1,1778 14,63 1,34 17,389 1,34 7/A/pH 6 14,7884 14,6778,8894 14,5191,737 21,7189 73,7 14/A/pH 6 14,8157 13,9216,159 13,9119,962 1,832 9,6 21/A/pH 6 14,2976 13,3196,2 13,31,225-2,2222 2,25 Tabulka 5: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 6 15,8859 15,9128 1,269 15,8957 1,98 1,6934 1,98 3/B/pH 6 14,5235 14,741 1,186 14,5217,9982 18,2729 99,8 7/B/pH 6 14,6342 14,5588,9246 14,3673,7331 26,12 73,31 14/B/pH 6 14,7334 13,869,1275 13,8481,1147 11,1596 11,47 21/B/pH 6 14,3982 13,3852 -,13 13,385 -,132-1,5152-1,3 Tabulka 6: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze PLGA vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 1,6315 1,8 3 17,8269 1,8 7 23,95 73,19 14 1,6214 1,545 21-1,8687,465 28

Tabulka 7: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 7 14,714 14,7546 1,532 14,751 1,37 4,9318 1,37 3/A/pH 7 14,3654 14,7794 1,414 14,3553,9899 42,8427 98,99 7/A/pH 7 15,8169 15,723,8854 15,5378,79 22,8187 72,9 14/A/pH 7 14,6735 13,7585,85 13,7518,783 8,5568 7,83 21/A/pH 7 14,7194 13,718 -,176 13,6971 -,223-21,762-2,23 Tabulka 8: Stupeň bobtnání a eroze PLGA vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 7 14,3791 14,443 1,612 14,3838 1,47 5,6236 1,47 3/B/pH 7 14,5839 14,9776 1,3937 14,5636,9797 42,2578 97,97 7/B/pH 7 14,4923 14,3435,8512 14,1994,771,379 7,71 14/B/pH 7 14,5484 13,6247,763 13,6171,687 11,626 6,87 21/B/pH 7 14,3351 13,3637,286 13,3627,276 3,6239 2,76 Tabulka 9: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze PLGA vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 5,2777 1,4 3 42,553 98,48 7 21,5989 71,4 14 9,897 7,35 21-8,7262,265 29

2) Chování 3T tělísek o hmotnosti 1 mg ± 2% ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu 1. 21. dne tabulky Tabulka 1: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 5 14,5696 14,6194 1,498 14,5678,9982 5,1693 99,8 3/A/pH 5 14,5675 14,6761 1,186 14,539,9715 14,1122 97,15 7/A/pH 5 14,7158 14,4659,751 14,3981,6823 9,937 68,23 14/A/pH 5 14,8244 14,677,2433 14,49,2165 12,3788 21,65 21/A/pH 5 14,3531 13,4548,117 13,4347,816 24,6324 8,16 Tabulka 11: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 5 14,8139 14,863 1,491 14,8132,9993 4,9835 99,93 3/B/pH 5 15,3522 15,4698 1,1176 15,3255,9733 14,8259 97,33 7/B/pH 5 14,7648 14,4838,719 14,4161,6513 1,3946 65,13 14/B/pH 5 14,3283 13,5674,2391 13,5425,2142 11,6247 21,4 21/B/pH 5 14,245 13,3375,97 13,3275,87 11,4943 8,7 Tabulka 12: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze 3T vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 5,764 99,875 3 14,4691 97,24 7 1,1658 66,68 14 12,18 21,535 21 18,634 8,43 3

Tabulka 13: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 6 14,8639 14,9624 1,985 14,8625,9986 1,4 99,86 3/A/pH 6 14,7979 15,8 1,2841 14,7778,9799 31,44 97,99 7/A/pH 6 14,7144 14,4421,7277 14,3686,6542 11,2351 65,4 14/A/pH 6 14,5392 13,7761,2369 13,755,2158 9,7776 21,58 21/A/pH 6 15,4425 14,5436,111 14,5351,926 9,1793 9,26 Tabulka 14: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 6 14,8145 14,9158 1,113 14,882,9937 1,8282 99,37 3/B/pH 6 14,836 15,116 1,298 14,778,9744 33,212 97,44 7/B/pH 6 14,4364 14,1691,7327 14,998,6634 1,4462 66,34 14/B/pH 6 14,8225 14,621,2396 14,41,2176 1,113 21,76 21/B/pH 6 14,8172 13,9154,982 13,943,871 12,744 8,71 Tabulka 15: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze 3T vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 6 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 1,4161 99,615 3 32,1271 97,715 7 1,847 65,88 14 9,944 21,67 21 1,9617 8,985 31

Tabulka 16: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 7 14,555 14,5598 1,543 14,5,9945 6,131 99,45 3/A/pH 7 14,6846 15,1686 1,484 14,6611,9765 51,9713 97,65 7/A/pH 7 14,5384 14,256,7122 14,1783,6399 11,2986 63,99 14/A/pH 7 14,3896 13,6216,23 13,59,4 15,7685,4 21/A/pH 7 14,7351 13,8686,1335 13,8422,171 24,6499 1,71 Tabulka 17: Stupeň bobtnání a eroze 3T vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 7 14,4866 14,5387 1,521 14,4792,9926 5,9944 99,26 3/B/pH 7 14,787 15,2177 1,437 14,763,9796 46,6925 97,96 7/B/pH 7 15,1131 14,8521,739 14,7824,6693 1,4139 66,93 14/B/pH 7 14,6272 13,8438,2166 13,882,181 19,6685 18,1 21/B/pH 7 15,656 14,8169,169 14,7847,1287 25,194 12,87 Tabulka 18: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze 3T vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 7 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 6,38 99,355 3 49,3319 97,85 7 1,8563 65,46 14 17,7185 19,7 21 24,8347 11,79 32

3) Chování 3M tělísek o hmotnosti 1 mg ± 2% ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu 1. 21. dne - tabulky Tabulka 19: Stupeň bobtnání a eroze 3M vzorků A v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/A/pH 5 15,2613 15,369 1,456 15,2581,9968 4,8957 99,68 3/A/pH 5 14,7819 14,719,9 14,6284,8465 8,6828 84,65 7/A/pH 5 14,7764 14,3944,618 14,329,5526 11,835 55,26 14/A/pH 5 14,668 13,7669,161 13,756,952 11,4496 9,5 21/A/pH 5 14,8483 13,8491,8 13,849,7 14,2857,7 Tabulka : Stupeň bobtnání a eroze 3M vzorků B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. m Lt m Lb m b m Ls m s B E 1/B/pH 5 14,6581 14,79 1,59 14,6535,9954 5,5756 99,54 3/B/pH 5 14,2764 14,232,9538 14,1583,8819 8,1529 88,19 7/B/pH 5 15,588 15,1553,5745 15,127,5219 1,786 52,19 14/B/pH 5 14,5748 13,6652,94 13,662,854 5,8548 8,54 21/B/pH 5 14,6971 13,7147,176 13,713,159 1,6918 1,59 Tabulka 21: Průměrné hodnoty stupně bobtnání a eroze 3M vzorků A a B v prostředí fosfát-citrátového pufru ph 5 v průběhu 1. 21. dne. Dny B E 1 5,2357 99,61 3 8,4179 86,4 7 1,9568 53,725 14 8,6522 9,3 21 12,4888,83 33