Aplikace elektromigračních technik Capillary electrophoresis D.L.Barker High Performance Capillary electrophoresis M.G. Khaledi Analysis and detection by capillary electrophoresis M.L.Marina (ed.) Electrophoresis in practice R. Westermeier 1
Aplikace kapilární elektroforézy 0 až +/- 30 kv Zdroj napětí Detektor v ee e elektroforetická mobilita + - Elektrody inlet outlet Separace nabitých molekul (solutů) ve stejnosměrném elektrickém poli ve vodivém prostředí pracovního elektrolytu. 2
Kvalitativní analýza v CE Kvalitativní analýza může nejjednodušeji být provedena srovnáním migračních časů standardů s analyty v realném vzorku. Tato identifikace je nejednoznačná, navíc v jednom píku (migrující zóně) může být víc analytů. Správnější postupy identifikace analytů v separované směsi: 1) Spikování (fortifikace) vzorku standardem 2) srovnáním UV spekter a stanovením poměru odezev pro 2 odlišné vlnové délky (DAD detektor) 3) Využití detektorů a detekčních systémů poskytující identifikační údaje (MS, IR, enzymatická reakce apod.). 3
odezva detektoru odezva detektoru odezva detektoru 1) Spikování Vzorek Vzorek + standardní přídavek látky b 1 2 3 1 2 b 3 čas Vzorek + standarní přídavek a 2 (a) 1 3 Vzorek obsahuje látku a, ale neobsahuje látku b čas čas 4
odezva detektoru odezva detektoru 2) Identifikace na základě stanovení poměrů odezeve pro 2 odlišné vlnové délky Standardy 1 l (A) Vzorek 1 l (A) 2 2 1 2 l (B) 1 2 l (B) Pík #1 l( A)1 l( B)1 Pík #2 l( A)1 l( B)1 1 0.69 0.5 0.85 čas 1.45 0.59 Pík #1 l( A)1 l( B)1 Pík #2 l( A)1 l( B)1 0.53 1.16 0.5 0.85 čas 0.46 0.59 5
Migrační čas (min) Identifikace píků v CGE Separace biopolymerů, fragmentů NA a polysacharidů. V případě CGE je možné korelovat migrační čas s: - délkou fragmentů - počtem basí v NA Počet párů basí 6
Nejčastější zdroje chyb pří identifikaci analytů v CE Správnost identifikace závisí především na opakovatelnosti migračních časů separovaných analytů. Při změně EOF dochází ke změně migračních časů analytů. Opakovatelnost EOF závisí především na kondicionaci kapiláry před analýzou. Pro minimalizaci chyb při identifikaci z migračních časů lze využít: 1) Měření EOF pomocí vhodného markeru Univerzální metoda korekce, nevhodná pro metody s velmi pomalým nebo potlačeným EOF, může prodlužovat čas analýzy. 2) Využití tzv. markeru migračního času tj. do vzorku se přidá analyt, který není součástí vzorku a migruje spolu se separovanými analytu. Vůči markeru migračního času lze porovnávat a korigovat migrační časy ostatních identifikovaných analytů. Počítá se relativní migrační čas: RMT t t m,analyt m, migrači marker Diference migračních časů standardů analytů a migračního standardu je proporcionální diferenci migračních časů analytů vzorku a migračního standardu. 7
Kdy je použití migračního markeru správné? Pokud se liší rychlosti migrací analytů v jednotlivých analýzách, ale neliší se rychlost migrace během jediné analýzy. Identifikace analytů v MEKC Při MEKC separaci se uplatňuje elektroforetický a chromatografický mechanismus. Identifikace na základě porovnání migračního času analytu a standardu zde není vhodná. 8
Pro identifikaci se využívá kapacitního faktoru k (relativní retenční parametr): k ( tr t t t0(1 t 0 R ) MC ) t R retenční čas analytu t 0 migrační čas EOF markeru (MeOH) t MC migrační čas markru micel (SUDAN III) 9
Kvantitativní analýza v CE V CE se využívají nejčastěji koncentrační detektory (např. UV/VIS, CCD, LIF) Koncentrační detektory reagují na změnu hmotnostní koncentrace složky v efluentu dm/dt nezávisle na přívodu složky do detektoru výška píku a plocha píku je přímo úměrná koncentraci analytu. Pro kvantitativní analýzu se využívají identické postupy jako pro HPLC. 1) Metoda vnějšího standardu (kalibrační křivka) Při metodě kalibrační křivky se analyzuje série standardů o známé, ale různé koncentraci c S a hledá se závislost kalibrační funkce X = fk(c). Neznámý obsah stanovované složky se pak určí pomocí analytické vyhodnocovací funkce c = fa(x). Budeme-li používat k vyhodnocení koncentrace plochu píku A, pak rovnice bude mít tvar: A i = kc i + b Je-li statisticky ověřené, že kalibrační přímka prochází počátkem (b = 0): A i = kc i pak můžeme použít k vyhodnocení metodu porovnání s jedním vnějším standardem. Stanovovanou koncentraci je možné vypočítat podle vztahu: c i A i plocha stanovované látky o neznámé koncentraci c i, A S plocha standardu získaná proměřením standardu o koncentraci c S. Ai A S c s 10
Použití metody kalibrační křivky je oprávněné v případě, že všechny vzorky a standardy jsou si svými vlastnostmi rovnocenné, tzn. že můžeme zanedbat vliv matrice vzorku. 2) Metoda standardního přídavku Porovnávání analytického signálu vzorku se signálem, získaným po přidání známých přídavků standardů stejného druhu jako je stanovovaná látka. Předpokladem použití metody standardního přídavku je splnění podmínky linearity mezi plochou píku a stanovovanou koncentrací. Princip: ke vzorku přidá přesné množství té samé látky u které se má stanovit neznámá koncentrace. Vždy se musí udělat nejméně dva nástřiky vzorku při prvním se dávkuje přesné množství vzorku, při druhém se dávkuje přesné množství směsi vzorku a standardu. Tato technika má několik variant. Metoda jednoho standardního přídavku Metoda více standardních přídavků Metoda standardních přídavků za konstatního objemu. 2a) Metoda jednoho standardu U metody standardního přídavku se musí provést dvě analýzy. První analýzou známého objemu vzorku V i o neznámé koncentraci látky c i dostaneme plochu píku A i. Ke vzorku se přidá známý objem standardu V s o známé koncentraci standardu c s a po analýze dostaneme plochu píku Ais. Platí následující rovnice pro neznámou koncentraci c i : 11
c i A is Ac i svs.( V V ) i S AV Je-li splněna podmínka Vi >> Vs (poměr Vi/Vs = 1000), pak můžeme napsat: i i c i Ac i svs ( A A ). V is i i Metoda jednoho standardního přídavku snižuje riziko systematických chyb, ale naopak může být zdrojem náhodných chyb. Tyto chyby částečně odstraňuje metoda jednoho standardního přídavku s dvěma roztoky, kdy se pracuje při konstantním celkovém objemu nebo metodu více standardních přídavků. 2b) Metoda více standardních přídavků Měřením plochy píku před a po přídavku dvou a více standardních přídavků ke vzorku analytu umožňuje stanovit koncentraci stanovované složky použitím extrapolace regresní přímky závislosti měřené plochy A ze změn koncentrace Δc od záporné oblasti, přičemž musí být splněna podmínka linearity. Jednotlivé postupy vyhodnocení se liší podle toho, zda jsou jednotlivé přídavky konstantní, pracuje-li se při konstantním nebo proměnlivém objemu a přidává-li se vzorek ke standardu či naopak. 12
2c) Metoda standardních přídavků za konstatního objemu Připraví se série roztoků, ze kterých každý obsahuje stejný podíl vzorku o objemu V i o neznámé koncentraci c i. K jednotlivým roztokům se přidá N objemových jednotek standardu V S (N = 0,1,2, ) o koncentraci c s. Všechny roztoky se doplní na stejný objem V is a změří se plocha píku. A N b. c N ci. Vi ( V is N csv V Rovnice je rovnicí přímkové závislosti, kdy směrnice b a posunutí a se určí graficky nebo výpočtem metodou nejmenších čtverců. Úsek na ose úseček je mírou stanovované koncentrace c i.: a cs. V ci ( ).( b V i s ) is S ) S S x - c x 0 c s 13
3) Metoda vnitřního standardu Celá analýza se uskuteční jedním dávkováním a dávkovaný objem vzorku není třeba znát. Princip: Vzorek se naředí roztokem standardu přičemž původní koncentrace standardu musí být známá. Uvedená technika má dvě varianty a to metoda přímého porovnání a metoda kalibrační křivky. 3a) Metoda přímého srovnání Postup: Ke vzorku o objemu V i a neznámé koncentraci c i přidáme definovaný objem standardu V s o známé koncentraci c s, přičemž platí i s, látky se musí dobře separovat a standard by měl migrovat v blízkosti stanovované c i látky. Získaná směs se nadávkuje a vyhodnotí se plochy standardu A s a stanovované látky A i. Pak pro koncentraci vzorku platí: V s i c i Ris.. Vi As Kde R is je relativní odezva detektoru stanovované látky vůči vnitřnímu standardu. A c s 14
3b) Metoda kalibrační křivky Připravíme se sérii standardních roztoků látky x o koncentrací c xi (i = 1,2, ) a z jednotlivých roztoků odebereme objem V xi a naředíme jej objemem V si standardu S o známé koncentraci c si, přičemž platí x s. Získaná směs se nadávkuje a vyhodnotí se plochy standardu A s a stanovované látky A x. Pak pro kalibrační přímku platí: c xi Axi Vsi f (.. csi) A V K objemu vzorku V x přidáme objem standardu V s o koncentrací c s a směs se nadávkuje. Najde se plocha A x a A s, vypočte se hodnota výrazu (A x /A s ).(V s /V x ).c s a z kalibrační přímky se odečte hodnota pro koncentraci c x. 4) Metoda vnitřní normalizace si Použitelná pouze tehdy, když jsou známy odezvové faktory CRF x a CRF i Základním nedostatkem této metody je nutnost znalosti všech odezvových faktorů a to znamená úplnou identifikaci elektroferogramu. Dostáváme pouze bezrozměrné číslo, udávající procentové zastoupení určité složky ve vzorku. Omezení, které vylučují použití této metody vyhodnocení: - některé komponenty nevymigrovali přes detektor nebo jsou nedetekovatelné, některé komponenty se nedělí dostatečně (nedají se určit jejich plochy) nebo jsou některé složky neidentifikovatelné. 15 xi
c x x A CRF i 1 x i x ACRF V CE se nejčastěji využívá metoda kalibrační křivky a metody využívajícího vnitřního standardu. Oproti HPLC dochází v CE k poklesu účinnosti separace s klesající mobilitou analytů. Odezva detektoru 1 2 3 čas Pro kvantitativní analýzu se pak využívá korekce: Korigovaná plocha (corrected area) i CA Ai t M, i A i plocha analytu t M,i migrační čas analytu CA se pak dosazuje do uvedených vztahů při výpočtu 16
Další nevýhodou CE je horší opakovetelnost dávkovaného množství (objemu) vzorku. Tento problém se koriguje použitím interního standardu (IS). Požadavky na vlastnosti IS: 1) Musí být dobře separovatelný od analytů a interferujících složek, 2) Jeho migrační čas by měl být v okolí migračních časů stanovovaných analytů, 3) Nesmí být přítomen ve vzorku, 4) Měl by být k dispozici v dostatečné čistotě, 5) Nesmí interagovat s analyty, složkami pufru a stěnou kapiláry, 6) Jeho odezva v detektoru by měla být srovnatelná s odezvou stanovovaných analytů. Při vyhodnocování se téměř výhradně vychází z ploch píků, nikoliv z výšek Proměnná Výška píku Vyvolaná změna Plocha píku Rychlost migrace NE ANO Dávkované množství ANO ANO Symetrie píku ANO NE On-line prekoncentrace ANO NE Odezva detektoru ANO ANO Adosrpce analytu na stěnu kapiláry ANO ANO 17
Mez detekce a mez stanovitelnosti Mez detekce (LOD) odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu. Mez stanovitelnosti (LOQ) odpovídá koncentraci, při které je přesnost stanovení taková, že dovoluje kvantitativní vyhodnocení. Podle dohody se v separačních metodách LOD vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie a LOQ jako desetinásobek šumu základní linie. Mez citlivostí a oběma limity pak můžeme odvodit vztah: 10. h LOQ k LOD 3. h k B B kde h B je šum na základní linii a m je směrnice kalibrační křivky (zde ale f (c)=h závislosti výšky píku na koncentraci). Předpokladem správného výpočtu je, aby šum a výška píku byly ve stejných jednotkách. 18
h B Z výpočtu pro LOD a LOQ je zřejmé, že čím vyšší bude odstup signálu od šumu, tím se dostaneme na nižší hodnoty LOQ a LOD. Kromě již výše uvedených přístupů se ještě můžeme setkat s obdobným výpočtem, kde namísto šumu základní linie h B se počítá se směrodatnou odchylkou posunutí lineární závislosti A i = kc i + b. 3sb LOD k 10sb LOQ k Počítá-li se LOD a LOQ ze směrodatné odchylky posunutí linární závislosti dostáváme obvykle nižší hodnoty. Velmi důležité je si uvědomit, že vypočtená hodnota LOQ by měla být součástí hodnocení linearity metody a hodnota LOQ musí být součástí kalibrační přímky, jinak tato hodnota zcela postrádá smysl. 19
Derivatizace v CE Derivatizace se v CE používá z několika důvodů: 1) zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec, 2) zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec, 3) zamezení nežádoucí sorpce látek v kapiláře. Způsoby derivatizace: Podle místa derivatizace můžeme rozdělit derivatizační techniky na tři kategorie: Předkolonová derivatizace (pre-capillary derivatization); chemická reakce probíhá mimo kapiláru před analýzou Postkolonová derivatizace (post-capillary derivatization); chemická reakce probíhá po separaci po vymigrování analytů z kapiláry Derivatizace na koloně (on-capillary derivatization) chemická reakce probíhá přímo v kapiláře 20
Podmínky předkapilární derivatizace 1. derivát musí být chemické individuum a měl by být dostatečně stabilní 2. derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně 3. derivatizační reakce nemusí probíhat rychle 4. reakce by měla být pokud možno selektivní 5. reakce by měla být bez vedlejších produktů a měla by probíhat za mírných reakčních podmínek (ph, teplota) tak, aby nebyla nutná předseparace vzniklého individua 6. při použití nadbytku derivatizačního činidla musí být dobře separovatelné od svých produktů v kapiláře a pokud možno by mělo mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti (nevykazuje fluorescenční vlastnosti). Experimentálně poměrně náročná a vyžaduje experimentální zručnost pro dosažení opakovatelných výsledků. 21
Podmínky postkapilární derivatizace 1. derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické individuum 2. derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce 3. derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může probíhat za extrémních podmínek (ph, teplota) 4. používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke zřeďování eluátu migrujícího z kapiláry a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí 5. reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu 6. není nutné hledat nové podmínky separace, analyty se separují v nezměněné podobě 7. veškeré manuální operace jsou eliminovány Vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace. Instrumentace post-capillary derivatizace 22
23
Podmínky on-capillary derivatizace 1. Nevyžaduje žádné úpravy experimentálního zařízení 2. Derivatizační reakce musí být rychlá a poskytovat jednoznačné produkty 3. Nadbytek derivatizačního činidla musí být separovatelný od derivátů separovaných analytů 4. Derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně a opakovatelně Inlet technika analyty a derivatizační činidlo jsou dávkovány: -Derivatizační činidlo a vzorek jsou smíchány předem a nadávkovány do kapiláry Detektor inlet Vzorek + der. činidlo Elektrolyt pro separaci outlet Derivatizační činidlo a vzorek jsem dávkovány za sebou v individuálních zónách a k jejich promíchání a reakci dochází difúzí nebo migrací ( sandwich technika). Je nutno optimalizovat čas reakce Detektor inlet Vzorek der. činidlo Vzorek der. činidlo Elektrolyt pro separaci outlet 24
Zone-passing technika Analyt a derivatizační technika jsou dávkovány za sebou (tandemová technika), ale k jejich promíchání dochází pomocí migrace v elektrickém poli Elektrické pole Detektor inlet Vzorek der. činidlo Elektrolyt pro separaci outlet Platí, že m der. Činidla > m analytu derivatizační činidlo se dávkuje za zónu vzorku m der. Činidla < m analytu derivatizační činidlo se dávkuje před zónu vzorku Throughout-capillary technika Derivatizační činidlo je součástí pracovního elektrolytu a k derivatizaci dochází postupně během migrace Elektrické pole Detektor inlet Vzorek der. Činidlo+ pracovní Elektrolyt elektrolyt pro pro separaci separaci elektrolyt outlet 25
A,B - tandem mód C sandwich mód AA - aminokyseliny ACN - acetonitril Pokud má dojít k vzájemnému promíchání zón der. činidla a analytů alespoň jeden reaktant migrovat v elektrickém poli! 6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidylkarbamát 26
Derivatizace se používá pro všechny typy detektorů: UV/VIS Nejvíc derivatizačních činidel a nejčastěji užívané derivatizace Fluorescenční, LIF Chemiluminiscenční MS vodivostní Po derivatizaci se změní chemické i fyzikální vlastnosti původních analytů. Vzniklé produkty, které jsou separovány pak mají naprosto odlišné migrační chování, např. při derivatizaci R-NH 2 vznikají karboxylové kyseliny, takže je nutné optimalizovat metodu separace již přímo s deriváty. 27
Derivatizační činidla používané v CE 1. Derivatizace primárních aminů a sekundárních aminů Reagují i sekundární aminy 28
NDA = naftalen-2,3-dikarboxaldehyd CBQCA = 3-(4-karboxybenzoyl)-2- chinolinkarboxaldehyd Reagují i sekundární aminy AEOC = 2-(9-Anthryl)ethylchlorfomiát 29
Excitační a emisní spektra derivátu putrescinu s AEOC FLEC chirální derivatizační činidlo pro derivatizaci a separaci enantiomerů chirální centrum 30
Marfyho činidlo chirální derivatizační činidlo Dansylchlorid 4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) 2. Derivatizační činidla pro hydroxyderiváty 31
2. Derivatizační činidla pro hydroxyderiváty Fluorescein-5-karbonylazid Reaguje s primárními amina a s hydroxysloučeninami 3. Derivatizace sacharidů 9-aminopyrene-1,4,6 trisulfonate 9-aminonaphthalene-1,4,6-trisulfonate fluorescamine
ABA:2-Aminobenzoic acid 2-ABAD:2-Aminobenzamide 3-ABAD:3-Aminobenzamide ABEE:Ethyl p-aminobenzoate ABN:p-Aminobenzonitrile ACP:2-Amino-6-cyanoethylpyridine AMAC:2-Aminoacridone AMC:7-Amino-4-methylcoumarin ANTS:8-Aminonaphthalene-1,3,6- trisulfonic acid ANDS:7-Aminonaphthalene-1,3- disulfonic acid AP:2-Aminopyridine APTS:8-Aminopyrene-1,3,6- trisulfonic acid
4. Derivatizace thiolové skupiny (aminokyseliny, peptidy, proteiny) 5-(Iodoacetamido)fluorescein 4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (viz. Derivatizace aminů) 5. Derivatizace aldehydické skupiny a ketoskupiny fluorescein-5-thiosemicarbazide
5. Derivatizace karboxylových kyselin
Vybrané příklady derivatizicí pro CE-LIF Aminokyseliny a katecholaminy
Oligosacharidy Separace probíhá v kyselémp ph 2.5 ve formě aminů Derivatizační činidlo: 1-aminopyren-3,6,8-trisulfonát
Homocystein Derivatizační činidlo: 5-iodoacetamidfluorescein 10 mm SDS, 50 mm borát sodný ph 10