Studijní materiál EXTRAKČNÍ METODY 1. Obecná charakteristika extrakce 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE 3. Alkalická hydrolýza 4. Soxhletova extrakce 5. Extrakce za zvýšené teploty a tlaku PLE, ASE, PSE 6. Extrakce na pevné fázi - SPE 7. Přehled dalších druhů extrakcí 8. Čištění extraktů V Brně dne 25. 11. 2013 Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Mgr. Romana Kostrhounová, Ph.D.
1. Obecná charakteristika extrakce Je to separační (dělící) proces, při kterém jsou v kontaktu dvě vzájemně nemísitelné fáze. Analyty se rozdělují mezi tyto fáze na základě různé rozpustnosti (rozdílných rozdělovacích koeficientů) v použitých rozpouštědlech. Čím větší je rozdíl mezi rozdělovacími koeficienty látek, tím dokonalejší je jejich oddělení. Cílem extrakce je selektivní až specifické oddělení analytu od ostatních složek vzorku nebo naopak oddělení rušících složek od analytu. Rozdělení extrakcí: a) podle zúčastněných frakcí 1. plyn kapalina headspace metoda extrakce těkavých látek plynem z kapaliny, použití např. v plynové chromatografii 2. kapalina kapalina - LLE liquid liquid extrakce 3. tuhá fáze kapalina selektivní rozpouštění, loužení b) podle způsobu provedení 1. jednostupňová dochází k ustavení jedné rovnováhy mezi fázemi, např. třepání v dělící nálevce 2. mnohostupňová proces ustavení rovnováhy se mnohokrát opakuje v oddělených krocích. 3. kontinuální fáze jsou při protiproudem pohybu v neustálém styku, např. extrakce v Soxhletově extraktoru c) podle charakteru extrahovaných látek 1. extrakce organických látek 2. extrakce kovových chelátů 3. extrakce iontových asociátů Proces extrakce lze rozdělit do třech po sobě jdoucích kroků: - vytvoření extrahovatelné formy sledované látky - úprava vzorku - ustavení rozdělovací rovnováhy - vlastní extrakce - případná izolace stanovované látky z organické fáze reextrakce, odpaření rozpouštědla
2. Extrakce kapalina/kapalina - LLE Je to metoda, která umožňuje oddělit velké množství rušivých látek nebo izolovat stopové množství složky. Extrakce z kapaliny do kapaliny je založena na přechodu rozpuštěné látky z jedné kapalné fáze do druhé. Pokud nalezneme vhodné extrakční činidlo, je extrakce velmi účinnou separační metodou. V praxi bývá jedním rozpouštědlem voda (nebo vodný roztok), zatímco druhé rozpouštědlo je organické, s vodou nemísitelné. Látky mohou být ve vodné fázi rozpuštěny, emulgovány či suspendovány a lze je získat extrakcí jiným rozpouštědlem, které se nemísí s původním roztokem (fází), takže se vytvářejí dvě zřetelně ohraničené vrstvy. Takové vrstvy vznikají např. při smíšení vody s četnými organickými rozpouštědly (hexanem, etherem, chloroformem, benzenem, cyklohexanem). Látka rozpuštěná v jedné fázi (např. vodné) přechází při protřepávání obou kapalin do fáze druhé. Po ustavení rovnováhy je poměr koncentrací rozpuštěné látky v obou fázích konstantní. Distribuční konstanta - popisuje přechod látek při extrakci v systému voda organická fáze (např. hexan, toluen, diethylether). Je dána vztahem: K D = c org / c vod K D... distribuční konstanta c org... koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi c vod... koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi Závisí na typu rozpouštědel, rozpuštěné látce, teplotě, dalších látkách,. K extrakčnímu dělení se používají nejčastěji dělící nálevky.
Eluotropní řada rozpouštědel- rozpouštědla seřazena podle rostoucí polarity - Rozpouštědla umístěná v řadě blízko sebe dobře mísitelná - Rozpouštědla z protilehlých konců - nemísitelná 3. Alkalická hydrolýza zmýdelnění Saponifikace, tedy alkalická hydrolýza, je efektivní procedura k uvolnění neutrálních lipidů, zejména triglyceridů, z biologické matrice. Dochází k hydrolýze esterových vazeb a uvolnění mastných kyselin z glycerolu nebo glyceridů a fosfolipidů a z esterifikovaných sterolů a karotenoidů. Metoda je založena na přidávání silné zásady do reakční směsi. Nazývá se též zmýdelnění (z latinského sapon mýdlo), protože se tato reakce používala při přípravě mýdla z tuků. Při použití KOH vznikala draselná mýdla - mazlavá, při použití NaOH mýdla sodná, tuhá. Proces alkalické hydrolýzy můžeme pozorovat i v přírodě, při rozkladu organického materiálů ve slabě alkalických půdách za přispění půdních bakterií. Můžeme jej zaznamenat také i v tenkém střevě za asistence trávicích enzymů. Hodnota zmýdelnění (HZ) hmotnost KOH (mg) potřebná k hydrolýze 1 g tuku nebo oleje za standardních podmínek. Čím vyšší je hodnota HZ, tím nižší je průměrná molekulová hmotnost mastné kyseliny v triacylglycerolech.
4. Soxhletova extrakce - metoda kontinuální extrakce fáze jsou při protiproudém pohybu v neustálém kontaktu - slouží i izolaci jedné nebo více organických látek z pevné matrice Do střední části (3) přístroje se vkládá papírová extrakční patrona, která má válcový tvar a kulaté dno a která se naplní vzorkem. Baňka (2) se naplní vhodným rozpouštědlem, v němž se dobře rozpouští složka, kterou chceme oddělit. Varná baňka se zahřívá k varu rozpouštědla a jeho páry stoupají postranní trubičkou kolem střední části extraktoru do chladiče (5), kde kondenzují. Rozpouštědlo kape na vzorek obsažený v papírové patroně. Střední část extraktoru se postupně plní zkondenzovaným rozpouštědlem, jehož hladina stoupá i v tenké přepadové trubičce(4). Stoupne-li hladina rozpouštědla ve střední části extraktoru k nejvyšší části přepadové trubičky, přeteče roztok do destilační baňky,z níž se těkavé rozpouštědlo znovu destiluje. Nakonec se získá roztok jedné nebo více složek v destilační baňce, z níž po ukončené extrakci rozpouštědlo vydestilujeme. V baňce tak zůstane jen izolovaná složka, popř. složky. 5. Extrakce za zvýšené teploty a tlaku PSE, PLE, ASE PSE pressurized solvent extraction PLE Pressurized liquid extraction ASE Accelerated solvent extraction Základní princip je stejný jako u extrakce dle Soxhleta. Dochází k extrakci pevných matric organickým rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a rozpouštědla. Zvýšením tlaku se zvýší bod varu použitého rozpouštědla, extrakce je účinnější a současně se zkrátí doba nutná pro extrakci. Výhody: rychlejší než klasická extrakce, menší spotřeby rozpouštědel, lepší opakovatelnost a srovnatelná výtěžnost jako u Soxhleta.
6. Extrakce na pevnou fázi - SPE SPE Solid Phase Extraction Metoda je jednoduchou formou kapalinové chromatografie. Je založena na rovnovážné distribuci analytu mezi vodnou a tuhou fázi, přičemž rovnováha je posunuta ve prospěch tuhé fáze. Tuhá fáze (sorbent) může být tvořen polární stacionární fází (nemodifikovaný silikagel, alumina, iontoměniče) nebo nepolární stacionární fází (modifikovaný silikagel uhlovodíkovými řetězci C18). Roztok analytu je přiveden do kontaktu s tuhým aktivovaným sorbentem, který sorbuje analyt a pouze v minimální míře ostatní složky vzorku. Analyt je následně uvolněn elucí vhodným elučním činidlem a analyticky stanoven. Funkce SPE: 1. Zachycení sledovaných analytů z roztoku, jejich zkoncentrování a následná eluce 2. Přečištění extraktu na kolonce jsou zachyceny nežádoucí složky, nečistoty, rušící látky Provedení SPE: 1. Kondicionace příprava kolonky na interakci složek vzorku se sorbentem 2. Aplikace vzorku nanesení vzorku 3. Promytí odstranění nežádoucích koextrahovaných látek 4. Sušení vzduch, inertní plyn 5. Eluce desorpce analytů z pevné fáze 7.Další typy extrakcí Superkritická fluidní extrakce kapalný CO 2 + modifikátory, extrakce lipofilních látek Matrix solip phase dispersion MSPD Vzorek se rozetře se sorbentem. Vzniklá sypká směs se nasype do krátké kolony a je extrahována příslušným rozpouštědlem. Extrakce na mikrovlákno SPME Head space, použití ve spojení s plynovou chromatografií, izolace těkavých sloučenin z roztoků. Stiib bar extrakce na polysiloxanovou vrstvou modifikované míchadélko, extrakce analytů z roztoku Extrakce na disperzní fázi QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe
Původně vyvinuta pro izolaci pesticidů z rostlinných materiálů. Postupně byla aplikována na nepolární látky a matrici živočišného původu např. RIL ze svalové tkáně, mléka, vajec, PAHs z rybí svaloviny, Základní pracovní schéma: - Rozpuštění vzorku v acetonitrilu (na 1 g vzorku 1 ml acetonitrilu) - Vysolení přídavek nadbytku solí a pufrů k extraktu, je docíleno přechodu analytů do acetonitrilu - Centrifugace odebrána acetonitrilová vrstva, která obsahuje analyty - Čištění odstranění vody je prováděno disperzivní SPE,d-SPE krokem, kdy se smíchá acetonitrilový extrakt s bezvodým MgSO 4 a speciálním sorbentem - Centrifugace, filtrace pro chromatografické stanovení s MS detekcí 8.Čištění extraktů, clean up Použití výše uvedených technik: - SPE - Semipermeabilní membrány - Extrakce kapalina/kapalina Zvláštní místo: Gelová permeační chromatografie GPC - Látky jsou na porézních gelových částicích děleny podle velikosti molekul - Nejprve jsou eluovány molekuly, které nemohou proniknout do pórů gelového nosiče - Nejdéle jsou zadržovány molekuly nejmenší - GPC primárně používána v analýze polymerů - Při čištění extraktů z potravinové matrice slouží k izolaci tukové složky a rušivých barevných koextrahovaných látek a umožňují finální analýzu dalších analytů, vyskytujících se ve stopových koncentracích.