Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Optimalizace chromatografických podmínek pro HPLC stanovení vybraných karotenoidů (diplomová práce) Vedoucí diplomové práce: RNDr. Dalibor Šatínský, PhD. Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Hradec Králové 2009 Petra Dvořáková

Ráda bych poděkovala RNDr. Daliboru Šatínskému, PhD. za vedení diplomové práce, za jeho trpělivost, cenné rady a připomínky k danému tématu. Dále bych chtěla poděkovat také celému kolektivu pracovníků katedry analytické chemie. Prohlašuji, že tuto diplomovou práci jsem vypracovala samostatně a že všechny uvedené zdroje jsou citované. 2

Abstrakt 3

Tato diplomová práce se zabývá hledáním optimálních podmínek pro stanovení karotenoidů luteinu, betakarotenu a zeaxanthinu. Pro stanovení byla využívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). V průběhu hledání optimálních podmínek bylo testováno velké množství kolon a různých mobilních fází. Vycházelo se přitom z poznatků publikovaných v odborné literatuře. Testována byla jak chromatografie na reverzních fázích, tak i chromatografie na normálních fázích. Nejčastěji testované byly C18 kolony od různých výrobců. Největším problémem pro HPLC stanovení a separaci těchto tří látek bylo to, že lutein a zeaxanthin jsou polohové izomery. Separace takovýchto látek je poměrně náročná a nepodařilo se ji zcela vyřešit. Přesto byla vyvinuta metoda, kterou je možno tyto tři látky separovat a stanovovat. Tato metoda využívá kolonu Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm), UV detekci při 450 nm, mobilní fázi methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95), dávkovaný objem vzorku 1 μl, rychlost průtoku mobilní fáze 1 ml/min při teplotě 30 C, isokratický režim. 4

This thesis deals with searching for optimal conditions for determination of carotenoids lutein, betacarotene and zeaxanthin. High performance liquid chromatography HPLC was used for determination. During searching for optimal conditions many various columns and mobile phases were tested. Primary information about carotenoids separation was obtained from scientific literature. There were tested both types of chromatography normal phases chromatography and reversed phases chromatography. The most frequently tested columns were C18 columns from different producers. The biggest problem for HPLC determination and separation of these three substance were position isomers of lutein and zeaxanthin. Separation of these substances is relatively difficult and it wasn t completely solved in this thesis. In spite of it new metod for determination and separation of three carotenoids was developed. This method used isocratic elution at column Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm), UV detection at 450 nm, mobile phase of methylene chloride:hexan:acetonitrile (2,5:2,5:95), injected volume 1 μl and flow rate at 1 ml/min. 5

Použité zkratky ACN BHT ČL HPLC LOD LOQ MTBE Ph Eur SLP SST SVP THF USP UV acetonitril butyl-hydroxy-toluen Český lékopis vysokoúčinná kapalinová chromatografie limit of detection (limit detekce) limit of quantitation (limit kvantifikace) methyl-tercbutyl-ether evropský lékopis správná laboratorní praxe system suitability test (test vhodnosti systému) správná výrobní praxe tetrahydrofuran United States Pharmacopoeia ultrafialová oblast spektra záření 6

Obsah 7

1 Úvod... 10 2 Cíl práce... 12 3 Teoretická část... 14 3.1 Karotenoidy... 15 3.1.1 Lutein... 16 3.1.2 Zeaxanthin... 16 3.1.3 Betakaroten... 17 3.1.4 Věkem podmíněná makulární degenerace... 17 3.2 Metody stanovení karotenoidů... 19 3.3 Chromatografie... 22 3.3.1 Základní princip a rozdělení chromatografických metod... 22 3.3.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)... 22 3.4 Validace analytických metod... 26 3.4.1 Správnost... 27 3.4.2 Přesnost... 27 3.4.3 Selektivita, specificita... 27 3.4.4 Detekční limit... 27 3.4.5 Kvantitativní limit... 28 3.4.6 Linearita... 28 3.4.7 Rozsah... 28 3.4.8 Robustnost... 28 3.4.9 Test způsobilosti systému... 28 4 Experimentální část... 30 4.1 Materiál a pomůcky... 31 4.2 Příprava roztoků standardů... 32 4.2.1 Příprava zásobních roztoků:... 33 4.2.2 Příprava pracovních roztoků:... 33 4.3 Optimalizace chromatografických podmínek... 33 4.3.1 Volba vlnové délky detektoru... 34 4.3.2 Optimalizace složení mobilní fáze a výběr nejvhodnější kolony... 34 4.3.3 Volba dávkovaného objemu vzorku a rychlosti průtoku mobilní fáze a teploty analýzy... 35 4.4 Přehled výsledků na jednotlivých kolonách... 35 8

4.4.1 Thermo ODS Hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm)... 35 4.4.2 SUPELCO Discovery HS F5 (10 cm x 4 mm, 3 μm)... 37 4.4.3 SUPELCO Discovery C18 (12,5 cm x 4 mm, 5 μm)... 38 4.4.4 Zirchrom-carb (150 x 4,6 mm, 5 μm)... 38 4.4.5 SUPELCO Discovery ZR-Carbon C18 (7,5 cm x 4,6 mm, 3 μm)... 39 4.4.6 SUPELCO Discovery ZR-PBD (15 cm x 4,6 mm, 5 μm)... 39 4.4.7 Zorbax SB-phenyl (75 x 4,6 mm, 5 μm)... 40 4.4.8 Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm, 5 μm)... 40 4.4.9 Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm, 5 μm)... 42 4.4.10 SUPELCO Discovery Cyano (10 cm x 4 mm, 5μm)... 43 4.4.11 Zorbax TMS (250 x 4,6 mm, 5 μm)... 43 4.4.12 Kromasil Si (125 x 4 mm, 5 μm)... 46 4.4.13 SUPELCO Discovery RP Amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm)... 47 4.4.14 Synergi 4 μ FUSION-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm)... 50 4.4.15 Synergi 4 μ HYDRO-RP 80A (75 x 3,00 mm, 4 μm)... 53 4.4.16 Zorbax ECLIPSE XDB C18 (75 x 4,6 mm, 4 μm)... 57 4.4.17 Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm)... 57 4.4.18 Synergi 4 μ POLAR-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm)... 64 4.4.19 Pathfinder AS Silica 100 (150 x 4,6 mm, 5 μm)... 64 4.4.20 Atlantis T3 (150 x 3 mm, 5 μm)... 66 4.5 Souhrn optimálních podmínek... 67 4.6 Základní validace metody... 67 4.6.1 Test vhodnosti chromatografického systému (System suitability test SST). 67 5 Závěr... 72 6 Seznam literatury... 74 9

1 Úvod 10

Karotenoidy jsou skupinou přírodních barviv, která jsou rozpustná v tucích. Tyto přírodní látky obsahují ve své molekule řetězce konjugovaných dvojných vazeb, což zapříčiňuje jejich barevnost. Tato barviva jsou obsažena v četných rostlinných i živočišných tkáních a stále častěji jsou využívána ve formě doplňků výživy k prevenci různých onemocnění, přičemž významnou roli na jejich účinku hraje jejich antioxidační aktivita. Tyto látky lze stanovovat metodami spektrofotometrickými, protože díky velkému počtu dvojných vazeb absorbují světelné záření odpovídající vlnové délce viditelného světla. Spektrofotometrické metody mají však řadu nevýhod, zejména jimi nelze stanovovat látky ve směsích. Proto v této práci byla využívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), která patří mezi separační metody a k jejím hlavním výhodám patří, že lze jednou analýzou získat údaje o kvalitě, kvantitě a čistotě látek. 11

2 Cíl práce 12

Cílem této práce bylo vyvinout a optimalizovat metodiku pro kvantitativní a kvalitativní analýzu karotenoidů luteinu, betakarotenu a zeaxanthinu. Tyto látky jsou součástí řady komerčně vyráběných přípravků a doplňků výživy a jsou používány k prevenci některých typů rakoviny, kardiovaskulárních onemocnění a onemocnění zrakového aparátu. Snahou při vývoji metodiky bylo získat analýzu časově a finančně nenáročnou, reprodukovatelnou a robustní a v neposlední řadě také šetrnou k životnímu prostředí. Základní metodou používanou při analýze byla HPLC s UV detekcí. Při hledání optimálních podmínek jsem vycházela z článků publikovaných v odborné literatuře. 13

3 Teoretická část 14

3.1 Karotenoidy 1 Karotenoidy jsou rostlinná barviva, která patří do skupiny tetraterpenů. To jsou látky, které obsahují v molekule 40 atomů uhlíku a velký počet konjugovaných dvojných vazeb, které mají většinou all-trans konfiguraci. Velký počet konjugovaných dvojných vazeb způsobuje absorpci viditelného světla, a proto jsou tyto sloučeniny barevné. Tvoří skupinu žlutých, oranžových, červených a fialových barviv, která doprovázejí v rostlinách chlorofyl, ale vyskytují se i v mikroorganismech a živočišných orgánech a jako zásobní látky jsou ukládány do tukové tkáně (např. vaječný žloutek, játra, pigment sítnice oka). Dělí se do dvou skupin: Karoteny: jedná se o uhlovodíky (α-karoten, β-karoten, γ-karoten), které mají v molekule jeden nebo dva cyklohexenové kruhy spojené konjugovaným uhlovodíkovým řetězcem. Xantofyly: jedná se o kyslíkaté sloučeniny (zeaxanthin, lutein, cryptoxanthin, a další) odvozené od karotenů, které v molekule obsahují hydroxylové skupiny a jedná se o alkoholy nebo dioly. V rostlinných tkáních jsou přítomny buď volné, nebo vázané ve formě esterů s vyššími mastnými kyselinami, nebo ve formě glykosidů. Karotenoidy jsou látky rozpustné v tucích a některých organických rozpouštědlech (chloroform, hexan, petrolether). Nerozpouští se ve vodě, omezeně v ethanolu. Řada látek z této skupiny má charakter provitaminu A, který je nezbytný pro správnou funkci kůže, sliznic a sítnice. Důležitý je pro růst a nitroděložní vývoj. Jeho nedostatek se projevuje suchou kůží, šeroslepostí apod. Kromě role provitaminu A se karotenoidy účastní dalších procesů v organismu jako antioxidanty, regulátory buněčné proliferace a diferenciace, modulátory imunitních reakcí a metabolismu karcinogenů, stimulátory komunikace mezi buňkami a jako filtry UV záření. Příjem karotenoidů snižuje riziko kardiovaskulárních onemocnění (ischemická choroba srdeční, městnavé srdeční selhání, ateroskleróza, diabetická kardiomyopatie, ), některých nádorových onemocnění (rakovina tlustého střeva) V této práci jsem se zabývala třemi látkami betakarotenem, luteinem a zeaxanthinem, které jsou využívány především v potravních doplňcích určených k předcházení rozvoje věkem podmíněné makulární degenerace. 1 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 3, 7, 8, 6 15

3.1.1 Lutein 2 Struktura: Obr. 1: Strukturní vzorec luteinu Sumární vzorec: C 40 H 56 O 2 Mr: 568,88 Teplota tání: 190 C CAS: 127-40-2 Tento karotenoid patří do skupiny xantofylů. Má žlutou barvu a nemá aktivitu provitaminu A. Největší obsah luteinu je v ovoci, zelenině, obilí a vejcích. Vysoký obsah je také v řasách. Z vyšších rostlin je lutein zastoupen v květech měsíčku lékařského, v řepce olejce, pomerančích, meruňkách, špenátu atd, z řas lze jmenovat Chlorellu. V živočišných organismech je transportován HDL lipoproteiny a to díky své relativně vysoké polaritě. Skladován je v játrech a krvi a v těle působí jako antioxidant. 3.1.2 Zeaxanthin 3 Struktura: Obr. 2: Strukturní vzorec zeaxanthinu Sumární vzorec: C 40 H 56 O 2 Mr: 568,88 Teplota tání: 215,5 C CAS: 144-68-4 2 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 7, 16, 17 3 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 7, 6, 16

Stejně jako lutein patří do skupiny xantofylů a je v podstatě jeho polohovým izomerem. Má výrazně žlutou barvu a vyskytuje se v ovoci a zelenině, většinou spolu s luteinem. Vysoký obsah je v zrnech kukuřice. Zeaxanthin má s luteinem podobnou nejen strukturu a zdroje, ale také vlastnosti. Během přípravy roztoků standardů těchto látek byla však zjištěna rozdílná rozpustnost luteinu a zeaxanthinu v chloroformu. Zeaxanthin se v chloroformu lépe rozpouštěl a tyto roztoky poskytovaly píky lepších tvarů (symetričtější) a se silnější odezvou. Lutein se naproti tomu dobře rozpouštěl i v ethanolu. 3.1.3 Betakaroten 4 Struktura: Obr. 3: Strukturní vzorec betakarotenu Sumární vzorec: C 40 H 56 Mr: 536,88 Teplota tání: 183 C CAS: 7235-40-7 Betakaroten patří do podskupiny karotenů. Jedná se o rostlinné barvivo oranžové barvy a s aktivitou provitaminu A. Vyskytuje se v ovoci a zelenině, vysoké množství je v meruňkách, mrkvi, paprikách, apod. Ve své molekule neobsahuje žádnou hydroxylovou skupinu, je to tedy lipofilní látka rozpustná v lipofilních rozpouštědlech (např. chloroform), prakticky nerozpustná ve vodě a ethanolu. 3.1.4 Věkem podmíněná makulární degenerace 5 Věkem podmíněná makulární degenerace je degenerativní onemocnění sítnice oka, které je častou příčinou oslepnutí v populaci vyspělých zemí s věkem nad 55 let. Toto onemocnění má omezené možnosti léčby, v časných stádiích probíhá asymptomaticky a rozvijí se pomalu po řadu let. 4 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 7, 22 5 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 12, 13, 14, 15 17

V počátečních stádiích je onemocnění charakterizováno ukládáním bělavo-žlutých drůz pod pigmentepitelem sítnice. Tyto drůzy jsou složeny z řady látek, ke kterým patří například glykokonjugáty a různé složky aterosklerotických plátů jako jsou apolipoprotein B a E, tukové částice a další molekuly. Dochází tak ke zhoršování ostrosti vidění a onemocnění se dále rozvíjí. Později dochází k atrofii sítnice (ložiska o průměru 175 μm s ostrými hranicemi), která vede k další ztrátě pigmentepitelu sítnice. Může docházet také k neovaskulární degeneraci, která se projevuje rozvojem subretinální fibrózy, ta může vést k prosakování tekutiny nebo krve. Možným důsledkem krvácení je otok sítnice, či její odchlípení. Rizikové faktory makulární degenerace Věk nad 55 let Kouření Bílá rasa Genetická predispozice Nízký příjem antioxidantů v potravě Nízký příjem omega-3 polynenasycených mastných kyselin K dalším rizikovým faktorům patří například modrá barva duhovky, expozice slunečnímu záření, ženské pohlaví (studiemi nebyl tento rizikový faktor signifikantně prokázán), hypertenze, obezita, zvýšená hladina cholesterolu, atd. Léčba věkem podmíněné makulární degenerace je v současné době stále omezená a dokáže pouze zpomalit rozvoj onemocnění a nástup slepoty. K používaným postupům patří léčba laserem, laserová fotokoagulace, fotodynamická terapie a podávání inhibitorů vaskulárního endoteliálního růstového faktoru. Nejdůležitější tedy stále zůstává prevence, která zahrnuje ovlivnění ovlivnitelných rizikových faktorů (kouření, BMI, hypertenze, ) a zvýšený příjem vitamínů a karotenů s antioxidačním účinkem. Studií Age-related Eye Disease Study 2 byl stanoven jako optimální příjem 10 mg luteinu, 2 mg zeaxanthinu a 1 mg omega-3 polynenasycených mastných kyselin denně. Betakaroten není pigmentem sítnice a přesto, že má antioxidační aktivitu a je provitaminem A, tak nebyl jeho příjem touto studií doporučen, protože u kuřáků zvyšuje riziko rakoviny plic. 18

3.2 Metody stanovení karotenoidů 6 Ze stanovovaných látek je pouze betakaroten lékopisnou látkou. Čl 2005 předepisuje pro stanovení betakarotenu spektrofotometrické stanovení, při kterém se měří absorbance roztoku betakarotenu při 455 nm, za použití cyklohexanu jako kontrolní tekutiny. Spektrofotometrická stanovení jsou, přes všechny výhody, nepoužitelná u směsí látek. Proto bylo v této práci využito HPLC stanovení a vycházelo se z metod publikovaných ve světové literatuře. Metody shrnuté v následující tabulce se vždy netýkají přímo/pouze luteinu, zeaxanthinu a betakarotenu, ale vzhledem k podobným vlastnostem všech látek ze skupiny karotenoidů bylo možno z nich, v průběhu optimalizace podmínek, vycházet. 6 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 1, 2, 6, 23, 24, 25, 26, 27 19

Zdroj karotenoidů Meruňky Mango Stanovované látky Kolona Mobilní fáze Průtok Nástřik Detekce Typ eluce Literatura Poznámka Lutein, zeaxanthin, β- karoten, α-karoten, γ- karoten Lutein, zeaxanthin, β- karoten, all-trans α- karoten, violaxanthin, neoxanthin, neochrom, luteoxanthin, cisneoxanthin, cisviolaxanthin Pinacle II-C18 (250 x 4,6 mm, ID 5 µm) + předkolona Pinacle II- C18 (10 x 4,6 mm) C-30 ACN:methanol:1,2- dichlormethan (60/35/5) + 0,1% BHT A: methanol:isopropanol (99/1), B: 100%methylenchlorid 1 ml/min 1 ml/min 20 µl 20 µl UV 450 nm UV 450 nm Isokratická 1 Gradientová: 100%A, po 15 min. snížení na 70% A do 45. min., udrženo 15 min., zvýšeno na 100% A do 65. min. 2 Řasy spirulina a chlorella Lutein, zeaxanthin, β- karoten, α-chlorofyl, β- chlorofyl Bischoff C-30 A: methanol:mtbe:octanový pufr (1,5-3 %) - různé poměry B: methanol:mtbe:octanový pufr 1% (8/90/2) 0,4 ml/min 20 µl UV 445 nm Gradientová: 3 min 100% A, 15 min lineární gradient na 80% A, 17 min lineární gradient na 55% B, 15 min lineární gradient na 95% B a 2 min gradient zpět na 100% A 6 Mrkev β-karoten, α-karoten Lichrospher Merck RP18 (25cm x 4mm, 5 μm Methanol:ACN:ethylacetát (80/10/10) 2 ml/min neuveden UV 449 nm Isokratická 23 Standardy Zeaxanthin, all-trans β- karoten, 13-cis β-karoten C-18 kolony od růzvých výrobců Methanol:carbon dioxid (15/85) 3 ml/min neuveden UV 440 nm Isokratická 24 Test kolon Sojové boby Lutein, β-karoten, chlorofyl A, chlorofyl B Inertsil ODS-3 (4,6 x 250 mm) A: ACN B: ethanol 0,8 ml/min 20 µl UV 447 nm Gradientová: 5 min. 25 % B, od 5. do 15. min. zvýšení na 75 % B, od 15. do 20. min. snížení zpět na 25 % B a udržení 5 min. 26

Řasa Chlorella Auroxanthin, violaxanthin, neochrom, neoxanthin, lutein, β-karoten, α- karoten, β-apo-8'- karotenal, β-cryptoxanthin, (a jejich různé izomery, celkem 32 látek) C-30 A: methanol:acn:voda (84/14/2) B: methylenchlorid 1 ml/min 20 µl UV 450 nm Gradientová: 100%A, od 14. do 25. min. pokles na 95%, do 30. min. pokles na 75%, do 35. min. pokles na 74%, do 50. min. pokles na 45%, pak zpět na 100% A do 55. min. 27 Tabulka 1: Metody stanovení karotenoidů 21

3.3 Chromatografie 7 Chromatografické metody patří k široce používaným a významným analytickým metodám. Jedná se o metody separační, při kterých lze oddělit jednotlivé látky ze směsi a zároveň určit jejich kvalitativní i kvantitativní charakteristiky. 3.3.1 Základní princip a rozdělení chromatografických metod Základní uspořádání chromatografických metod je tvořeno mobilní a stacionární fází, které jsou vzájemně nemísitelné, a mezi kterými dochází k mnohonásobnému ustavování rovnováhy a tak k separaci složek směsi na základě afinity látek k jednotlivým fázím. K rozdělení látek dochází díky mobilní fázi, která unáší částice stanovovaných látek, které jsou různou silou sorbovány na fázi stacionární. Mobilní fází může být kapalina nebo plyn, stacionární fází pak tuhý sorbent (silikagel, zirkoniové sorbenty) nebo kapalina navázaná na inertním nosiči. Podle vlastností těchto dvou fází se chromatografické metody rozdělují. Rozdělení je možné podle: Skupenství mobilní fáze (plynová, kapalinová) Uspořádání stacionární fáze (kolonová, plošná, tenkovrstvá) Typu separačního procesu (rozdělovací, afinitní, iontovýměnná, adsorpční) V této práci jsem používala vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii ( High performance liquid chromatography HPLC). 3.3.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) HPLC je analytická separační metoda, která je široce používána v mnoha odvětvích. Například v monitorování životního prostředí, monitorování lékových hladin, včetně dopingových testů, v analýze potravin, v diagnostice nemocí, apod. Ve farmacii je HPLC široce používána při výzkumu, ale hlavně v kontrole léčiv. Jako metoda určení totožnosti a zkoušek na čistotu je HPLC předepsána v monografiích Českého lékopisu. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je separační metoda, která podává informace o kvalitě i o kvantitě analytů. Velkou předností je její rychlost a citlivost 7 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 9, 18

(záleží na typu detektoru), dále možnost automatizace díky moderním přístrojům vybaveným autosamplery a možnost dávkování malých objemů vzorků (1 μl) a tedy nízká spotřeba vzorků a rozpouštědel (a tedy i šetrnost k životnímu prostředí). HPLC se používá jako analytická i jako preparativní metoda. K rozdělení látek dochází na koloně působením mobilní fáze, která eluuje analyty sorbované na fázi stacionární. HPLC lze rozdělit podle polarity stacionární a mobilní fáze na chromatografii na normálních fázích a na chromatografii na reverzních fázích, která je v současné době používanější. Chromatografie na normálních fázích používá jako stacionární fázi silikagel, který je polární a jako mobilní fáze jsou využívána nepolární rozpouštědla (methylenchlorid, hexan, heptan, apod.). Práce s nepolárními rozpouštědly je obtížnější, díky jejich negativnímu působení na lidské zdraví a životní prostředí a hořlavosti. Tato rozpouštědla v čistotě nutné pro chromatografické použití jsou též poměrně finančně náročná. Proto je v posledních letech upřednostňována chromatografie na reverzních fázích. Chromatografie na reverzních fázích využívá stacionární fáze, které jsou chemicky modifikované. Na inertní nosič (kterým může být silikagel, oxid zirkoničitý nebo různé polymerní materiály) jsou chemickou vazbou navázány různé radikály. Podle typu radikálu se jedná buď o nepolární fáze (radikál obsahuje uhlíkové řetězce nejčastěji C8 až C18) nebo středně polární fáze (radikál obsahuje tříuhlíkaté řetězce zakončené různými skupinami, které ovlivňují polaritu. Například NH 2, -CN, apod. 23

3.3.2.1 Schéma kapalinového chromatografu 8 Obr. 4: Schema kapalinového chromatografu Základní součásti kapalinového chromatografu jsou zásobníky mobilní fáze (Z), čerpadlo (Č), programovací jednotka (PG), dávkovací zařízení (DZ), kolona (K), detektor (D) a vyhodnocovací zařízení (PC) Zásobníky mobilní fáze jsou nádoby ze skla, kovu nebo plastu. Může být jeden nebo více. Mobilní fáze musí být odplyněna buď použitím vakua nebo probubláváním inertního plynu (např. helia). Nové sestavy mají zabudované degassery. Čerpadlo důležitá součást chromatografické sestavy. Důležité je, aby zajišťovalo konstantní průtok mobilní fáze kolonou. V HPLC se používají dva typy čerpadel. Jedná se buď o tzv. vysokotlaká čerpadla, u kterých se složky mobilní fáze mísí až za čerpadlem, nebo o nízkotlaká čerpadla, která pumpují již smísenou mobilní fázi. Oba typy čerpadel ovšem pracují za vysokého tlaku až 40 Mpa. Programovací jednotka nastavuje požadované složení mobilní fáze. Dávkovací zařízení u starších přístrojů se využívá manuální způsob dávkování pomocí Hamiltonovy stříkačky. Nové HPLC sestavy mají zabudované automatické dávkovače autosamplery, které automaticky a velmi přesně dávkují i malá množství vzorku. 8 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 9, 18, 19 24

Kolona součást sestavy, kde dochází k vlastnímu rozdělení složek směsi. U nových přístrojů je kolona umístěna v termostatovaném prostoru, což zajišťuje stálou a regulovatelnou teplotu analýzy. Detektor registruje průtok mobilní fáze a složek směsi a tento průtok převádí na vhodný signál do počítače, kde je vhodným softwarem dále zpracováván. Na typu detektoru závisí citlivost a také selektivita analýzy. 3.3.2.2 Kolony v HPLC 9 Chromatografická kolona je 2 30 cm dlouhá tyčinka (ze skla nebo kovu) vyplněná sorbentem a tvoří stacionární fázi systému. Na délce kolony, jejím vnitřním průměru a velikosti částic sorbentu závisí rozlišení, šířka píku, doba analýzy a tlakový spád. Nejčastěji používané kolony jsou dlouhé od 75 mm do 300 mm s průměrem 2 mm až 5 mm a velikostí částic od 1,7 do 5 µm. Přičemž v současné době převládá tendence zmenšování částic a používání kratších kolon na kterých je analýza kratší a nižší je i spotřeba rozpouštědel. S kratší kolonou se ale sníží rozlišení a její účinnost. Delší kolony (nad 200 mm) se používají jako kolony preparativní, pro dělení složek ze směsi. Kratší kolony jsou vhodné pro analytické účely, kdy množství analytu ve směsi je menší. Pro ochranu kolony před mechanickými nečistotami jsou používány předklonky. Ty jsou nejčastěji umístěny těsně před kolonou a využívají se zejména při analýze biologického materiálu. 3.3.2.3 Detektory v HPLC Na použitém detektoru závisí citlivost celého chromatografického systému. Existuje řada detektorů, avšak u všech jsou požadovány stejné vlastnosti: Vysoká citlivost Stabilita a reprodukovatelnost odezvy Linearita odezvy Minimální objem detekční cely HPLC detektory lze rozdělit na univerzální a selektivní. Selektivní detektor je schopen zaregistrovat jen látku, jejíž odezva nás zajímá a ostatní látky ze směsi se na chromatogramu neprojeví. 9 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 9, 18, 19 25

Univerzální detektory jsou naproti tomu schopné zaregistrovat všechny typy látek. Jednotlivé typy detektorů lze mezi sebou vzájemně kombinovat. Mezi nejpoužívanější typy detektorů patří: Spektrofotometrické detektory tyto detektory měří absorbanci záření určité vlnové délky jednotlivými složkami směsi. Nejčastěji se používá UV oblast spektra. Mezi spektrofotometrické detektory patří i DAD detektor (diode array detektor), který snímá celé absorpční spektrum, porovnává poměry absorbancí a hodnotí látku při více vlnových délkách. Detektory této skupiny jsou univerzální a jejich citlivost dosahuje 10-9 až 10-10 g/ml. Fluorimetrické detektory lze je využít u látek, které vykazují fluorescenci. Ve srovnání se spektrofotometrickými detektory jsou selektivnější, nelze je použít u všech analýz, ale dosahují vyšší citlivosti (10-9 10-12 g/ml) Elektrochemické detektory měří elektrochemickou veličinu na rozhraní elektroda/eluent. Do této skupiny patří voltametrický, amperometrický a polarografický detektor, které všechny dosahují citlivostí 10-9 10-12 g/ml. Nevýhodou je, že je nelze využít univerzálně u všech látek. Refraktometrický detektor využívá rozdílného indexu lomu dvou prostředí. Je to jediný naprosto univerzální detektor. Velkou nevýhodou však je nutnost jeho termostatování a nízká citlivost (10-6 g/ml). Hmotnostní detektor v poslední době se začíná hmotnostní detekce často využívat, ale hlavní nevýhodou je jeho finanční náročnost. 3.4 Validace analytických metod 10 Validace nám potvrzuje, že daná metoda je vhodná pro dané stanovení a že poskytuje stále stejné výsledky i za provedení jiným pracovníkem nebo v jiné laboratoři. Validace se provádí vždy při vývoji nové metody, při její změně nebo při přenosu do jiné laboratoře a řídí se platnými předpisy (Čl, Ph Eur, USP, normami, které podléhají SLP a SVP). Při validaci jsou sledovány tyto parametry: Správnost (accuracy) Přesnost (precision) Selektivita, specificita (specificity) 10 Kapitola byla vypracována ze zdrojů 9, 20, 21, 22 26

Detekční limit (limit of detection, LOD) Kvantitativní limit (limit of quantitation, LOQ) Linearita (linearity) Rozsah (range) Robustnost (robustness) Test způsobilosti systému (system suitability test) 3.4.1 Správnost Je míra shody mezi získanou a správnou hodnotou. Zjišťuje se analýzou nejméně šesti vzorků a vyjadřuje se jako rozdíl správné a naměřené hodnoty nebo jako výtěžnost (recovery). Výtěžnost = 100 * nalezená hodnota / správná hodnota 3.4.2 Přesnost Vyjadřuje shodu mezi výsledky získanými opakovaným proměřováním jednoho vzorku. Jeden vzorek se obvykle šestkrát analyzuje stejným postupem. Přesnost se vyjadřuje jako relativní směrodatná odchylka RSD % 100 y n 1 y y Podle podmínek analýzy existují tři úrovně přesnosti: Opakovatelnost opakování jedním pracovníkem na stejném přístroji Mezilehlá přesnost analýza se provádí různými pracovníky na různých přístrojích, v různé dny, ale se stejným vzorkem Reprodukovatelnost provedení je stejné jako u mezilehlé přesnosti, ale probíhá v různých laboratořích 3.4.3 Selektivita, specificita Je schopnost metody změřit danou látku správně a specificky i v přítomnosti jiných možných látek, jako jsou nečistoty, rozkladné produkty apod. 3.4.4 Detekční limit Je nejnižší koncentrace látky, kterou lze detekovat, ale nestanovuje se kvantitativně. U instrumentálních metod bývá LOD koncentrace látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 3. i 2 27

3.4.5 Kvantitativní limit Je nejnižší koncentrace látky, kterou lze metodou kvantifikovat. Většinou to bývá trojnásobek detekčního limitu. Často je vyjadřován jako koncentrace látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 10. 3.4.6 Linearita Je schopnost metody poskytovat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky. Ověření linearity se provádí na pěti různých koncentracích látky, vhodné je pracovat s roztoky standardů. Po proměření se sestaví kalibrační křivka a určí se její směrnice. 3.4.7 Rozsah Určuje se z linearity metody a je to rozmezí koncentrací, v němž může být metoda používána a získané výsledky jsou správné a přesné. Dolní hranicí může být například kvantitativní limit a horní maximální odezva přístroje. 3.4.8 Robustnost Vyjadřuje, jak moc ovlivňují změny podmínek výsledky analýzy. Účelem zjišťování robustnosti je zjistit, které podmínky mají vliv na výsledky analýzy. U HPLC se zjišťuje vliv složení mobilní fáze, teplota na koloně, rychlost průtoku, rozdíly mezi kolonami od různých výrobců apod. 3.4.9 Test způsobilosti systému Tímto testem se prokazuje, že daná metoda je vhodná k použití a není potřebná nová validace (např. při novém použití metody) Test způsobilosti zahrnuje zjištění parametrů uvedených v následující tabulce. SST parametr Doporučený limit Počet teoretických pater N > 2000 Asymetrie píků / faktor symetrie T = 0,8-1,5 Rozlišení píků R ij > 1,5 Kapacitní faktor k > 2 RSD < 1% (min. 5 Opakovatelnost - retenční čas nástřiků) RSD < 1% (min. 5 Opakovatelnost - ploch píku nástřiků) Tabulka 2: Parametry zjišťované při SST 28

Počet teoretických pater tento parametr vyjadřuje účinnost kolony. Vzorec pro jeho výpočet je: t R N 5,54 wh Asymetrie píků Tento parametr vyjadřuje tendenci látky zadržovat se na koloně a je důležitý pro výpočet plochy píků. Vzorec pro výpočet je: w A S 2d Rozlišení píků je vzdálenost mezi píky dvou složek analyzované směsi. Doporučený limit rozlišení ( > 1,5 odpovídá rozdělení píků až na základní linii). Vzorec pro výpočet je: 0,05 t R2 tr 1 Rs 2 w1 w2 Kapacitní faktor vyjadřuje kapacitu kolony a je mírou sorpce analytu na koloně. Vzorec pro výpočet je: Vysvětlivky: t R retenční čas W šířka píku v polovině jeho výšky W 0,05 šířka píku ve dvacetině jeho výšky t M mrtvý čas d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky D m tr t t M M 2 29

4 Experimentální část

4.1 Materiál a pomůcky Standardy karotenoidů: Lutein, Applichem Zeaxanthin, Applichem Betakaroten, Fluka Chemikálie: Methanol chromasolv, Sigma Aldrich Acetonitril chromasolv, Sigma Aldrich Tetrahydrofuram chromasolv, Sigma Aldrich Ethanol chromasolv, Sigma Aldrich Hexan chromasolv, Sigma Aldrich Methylenchlorid, Sigma Aldrich Dichlorethan, Sigma Aldrich Heptan, Sigma Aldrich Chloroform, Sigma Aldrich Isopropanol, Sigma Aldrich 1,2-dichlorpropan, Sigma Aldrich Destilovaná voda Přístroje a pomůcky: Chromatografická sestava Shimadzu Pumpy LC-10 AD VP Degasser DGU-14 A Autosampler SIL-HTA Termostat kolony CTO-10 AC VP DAD detektor SPD-M10A VP Fluorescenční detektor RF-10A XL Ultrazvuková lázeň Analytické váhy Kolony: Synergi 4 μ HYDRO-RP 80 Å (75 x 3,00 mm) Zorbax TMS (250 x 4,6 mm, 5 μm) Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm) SUPELCO Discovery Cyano (10 cm x 4 mm, 5 μm) 31

Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm 5 μm) SUPELCO Discovery RP Amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm) Synergi 2 μ FUSION-RP 80 Å (20 x 2,0 mm, 2 μm) Synergi 4 μ FUSION-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Synergi 4 μ POLAR-RP 80 Å (75 x 3,00 mm 4, μm) Thermo ODS Hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm) SUPELCO Discovery ZR-Carbon C18 (7,5 cm x 4,6 mm, 3 μm) SUPELCO Discovery HS F5 (10 cm x 4 mm, 3 μm) SUPELCO Discovery ZR-PBD (15 cm x 4,6 mm, 5 μm) Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm) Zorbax ECLIPSE XDB C18 (75 x 4,6 mm, 5 μm) SUPELCO Discovery C18 (12,5 cm x 4 mm, 5 μm) Zirchrom-carb (150 x 4,6 mm, 5 μm) Zorbax SB-phenyl (75 x 4,6 mm, 5 μm) Kromasil Si (125 x 4 mm, 5 μm) Pathfinder AS Silica 100 (150 x 4,6 mm, 5 μm) Atlantis T3 (150 x 3 mm, 5 μm) 4.2 Příprava roztoků standardů 11 Jako rozpouštědlo pro přípravu standardních roztoků byl, na základě odborné literatury, zvolen ethanol. Později bylo zjištěno, že karotenoidy se lépe rozpouští v chloroformu. Při použití chloroformu jako rozpouštědla vykazují látky na chromatografickém záznamu symetričtějsí píky se silnější odezvou. Zásobní roztoky byly připraveny rozpuštěním standardů v ethanolu. Pracovní roztoky byly připravovány ze zásobních roztoků ředěním ethanolem, později chloroformem. Ethanol byl před přípravou roztoků odvzdušněn 5 minut pomocí hélia a roztoky standardů byly ultrazvukovány po dobu 5 minut. 11 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 6 32

4.2.1 Příprava zásobních roztoků: Navážka (mg) Koncentrace (mg/l) Betakaroten 1,5 1500 Lutein 0,458 572,5 Zeaxanthin 0,44 550 Tabulka3: Koncentrace zásobních roztoků karotenoidů 4.2.2 Příprava pracovních roztoků: Betakaroten Lutein Zeaxanthin Zásobní roztok (μl) 250 200 200 Ethanol (μl) 750 600 600 Chloroform (μl) 0 0 0 Koncentrace (mg/l) 375 143 137,5 Zásobní roztok (μl) 200 160 160 Ethanol (μl) 0 0 0 Chloroform (μl) 800 640 640 Koncentrace (mg/l) 300 114,5 110 Tabulka 4: Koncentrace pracovních roztoků karotenoidů Pro optimalizaci chromatografických podmínek byla připravena také směs všech tří látek. Tento roztok byl připraven smísením 200 μl pracovních roztoků připravených ředěním chloroformem. Koncentrace látek v této směsi byla: Betakaroten 100 mg/l Lutein 38,17 mg/l Zeaxanthin 37 mg/l Zásobní i porovnávací roztoky byly připraveny do vialek z tmavého skla a uchovávány v mrazničce, aby se předešlo oxidačním změnám. 4.3 Optimalizace chromatografických podmínek Optimalizace chromatografických podmínek je výběr takových podmínek chromatografické analýzy, při kterých dojde k co nejlepší separaci složek směsi v co nejkratším čase. Zahrnuje volbu vlnové délky detektoru, kolony, složení mobilní fáze, objemu dávkované směsi a rychlosti průtoku mobilní fáze kolonou. 33

4.3.1 Volba vlnové délky detektoru 12 Pro analýzu karotenoidů byl jako detektor zvolen DAD detektor. Karotenoidy jsou látky s velkým počtem konjugovaných dvojných vazeb v molekule, proto absorbují záření ve viditelné oblasti (400 760 nm) λ max (nm) Betakaroten 452 Lutein 445 Zeaxanthin 452 Tabulka 5: Vlnové délky v maximu absorpce záření pro jednotlivé karotenoidy Pro detekci byla zvolena vlnová délka 450 nm. Při této vlnové délce absorbují všechny tři látky a výhodou je, že nedochází k interferenci s rozpouštědly a případnými nečistotami, které při této vlnové délce neabsorbují a neprojevují se na záznamu. 4.3.2 Optimalizace složení mobilní fáze a výběr nejvhodnější kolony 13 Při výběru nejvhodnější mobilní fáze se vycházelo z postupů publikovaných v odborné literatuře. Byla testována řada mobilních fází a chromatografických kolon. Při vývoji této metody se zkoušel jak systém reverzních fází, tak systém normálních fází. Protože lutein a zeaxanthin jsou látky strukturně podobné (polohové izomery) bylo hlavním problémem při optimalizaci jejich dostatečné oddělení. Dalším problémem byla rozdílná lipofilita látek. Zatímco betakaroten je lipofilní, lutein a zeaxanthin obsahují ve své molekule hydroxylové skupiny, které tyto látky hydrofilizují. Proto zvolená mobilní a stacionární fáze musely být vybírány tak, aby se složky směsi dostatečně separovaly a separace probíhala v optimálním čase. Z výsledků jednotlivých analýz byla nakonec pro tuto metodu vybrána kolona Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, velikost částic 2 μm) a mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril o poměru 2,5:2,5:95. 12 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 1, 2, 5 13 Kapitola byla vypracována ze zdrojů:7, 8, 34

4.3.3 Volba dávkovaného objemu vzorku a rychlosti průtoku mobilní fáze a teploty analýzy 14 Při volbě dávkovaného objemu se vycházelo z odborné literatury a dále z absorbční kapacity kolony. Zpočátku testování byl dávkován objem 10 μl, ten byl později snížen na objem 5 μl, protože roztoky standardů byly dostatečně koncentrované a píky byly při velkém nastřikovaném objemu široké a rozmyté. Při použití výsledné zvolené kolony byl nastřikován objem 1 μl, protože při větším objemu docházelo k přetížení kolony. Jako nejvhodnější rychlost průtoku mobilní fáze byla vybrána rychlost 1 ml/min. V průběhu testování byly zkoušeny i jiné rychlosti a to za účelem zkrácení doby analýzy při příliš silné sorbci látek na koloně nebo pro lepší rozdělení píků luteinu a zeaxanthinu. V průběhu testování nejvhodnějších chromatografických podmínek byly testovány i různé teploty. Nejvhodnější pro analýzu se ukázala teplota 30 C. Vyšší teploty byly zkoušeny pro zrychlení eluce látek z kolony. 4.4 Přehled výsledků na jednotlivých kolonách 4.4.1 Thermo ODS Hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm) Jedná se o klasickou C18 kolonu, která je jednou z nejpoužívanějších při HPLC analýze. Řada publikovaných prací, zabývajících se analýzou karotenoidů, využívala právě kolony obsahující sorbent s C18 skupinami. Na této koloně byla vyzkoušena řada mobilních fází, ale žádná kombinace neposkytovala požadované výsledky. Nejlepšího rozlišení bylo dosaženo při použití mobilní fáze o složení methylenchlorid:acn 15:85. Thermo ODS Hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Methanol 100 5,39 5,44 22,79 ACN 100 16,97 18,6 28,59 ACN + THF 70 / 30 3,63 3,73 6,64 85 / 15 5,46 5,78 13,89 Hexan + THF 90 / 10 3,57 3,69 2,64 85 / 15 2,84 3,08 2,64 Heptan + THF 90 / 10 3,71 3,82 2,66 14 Kapitola byla vypracována ze zdrojů: 9, 35

Lutein 2,84 Betakaroten 2,64 Zeaxanthin 3,08 ACN + Dichlorethan 80 / 20 7,46 8,63 10,04 90 / 10 11,04 12,73 16,34 Methanol + ACN + Dichlorethan 35 / 60 / 5 5,25 5,49 17,12 55 / 30 / 15 4,18 4,3 Methanol + ACN + Methylenchlorid 35 / 60 / 5 5,28 5,51 18,21 33 / 57 / 10 4,61 4,76 Tabulka 6: Mobilní fáze testované na koloně Thermo ODS Hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. mau 450nm,4nm (1.00) 350 300 250 200 150 100 50 0-50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 min Obr. 5: Chromatogram získaný použitím kolony Thermo ODS hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm), mobilní fáze hexan:tetrahydrofuran (85:15), průtok 1 ml/min, 30 C 36

Lutein 6,87 Zeaxanthin 7,63 Betakarotén 9,43 20.0 mau 450nm,4nm (1.00) 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0-2.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 6: Chromatogram získaný použitím kolony Thermo ODS hypersil (250 x 4,6 mm, 5 μm), mobilní fáze hexan: methylenchlorid:acetonitril (20:80), průtok 1ml/min, 30 C 4.4.2 SUPELCO Discovery HS F5 (10 cm x 4 mm, 3 μm) Obr. 7: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony SUPELCO Discovery HS F5 Tato kolona poskytuje oproti klasické C18 lepší tvar píků. Byla používána s cílem zlepšení tvaru píků a lepšího rozlišení. Jejím použitím však nebylo dosaženo požadovaných výsledků. Tato kolona obsahuje navázané pentafluorofenylpropylové skupiny (viz. obr. 7). Vykazuje odlišnou separaci ve srovnání s C18 oproti které je více polární. Protože v řadě odborných článků byla jako stacionární fáze používána C30, která však nebyla pro optimalizaci této metody k dispozici, byla testována tato kolona. Složené mobilní fáze s vodou byly používány na základě lipo-hydrofilních vlastností látek, podle kterých by měla voda eluci z kolony zpomalovat. To se sice potvrdilo, ale k oddělení píků luteinu a zeaxanthinu nedošlo. 37

SUPELCO Discovery HS F5 (10 cm x 4 mm, 3 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 0,99 1,12 1,26 Methanol 100 1,12 1,12 1,62 Methanol + Voda 95 / 5 1,61 1,61 3,93 90 / 10 3,55 3,47 16,26 93 / 7 2,13 2,09 6,68 Ethanol + Voda 95 / 5 1,05 1,05 1,74 93 / 7 1,1 1,08 2,24 90 / 10 1,43 1,37 3,61 80 / 20 4,12 3,8 Methanol + ACN + methylenchlorid 33 / 57 / 10 0,97 0,97 1,19 Tabulka 7: Mobilní fáze testované na koloně SUPELCO Discovery HS F5 (10 cm x 4 mm, 3 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.3 SUPELCO Discovery C18 (12,5 cm x 4 mm, 5 μm) Obr. 8: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony SUPELCO Discovery C18 Klasická a nejpoužívanější kolona v HPLC analýze. C18 kolona byla používána v řadě publikovaných prací. Při použití této kolony nebylo však dosaženo optimálních výsledků díky krátkým retenčním časům luteinu a zeaxanthinu a extrémně dlouhému retenčnímu času betakarotenu. SUPELCO Discovery C18 (12,5 cm x 4 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Methanol 100 2,39 2,31 18,74 Tabulka 8: Mobilní fáze testované na koloně SUPELCO Discovery C18 (12,5 cm x 4 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.4 Zirchrom-carb (150 x 4,6 mm, 5 μm) Tato kolona obsahuje stacionární fázi na bázi oxidu zirkoničitého. Tyto stacionární fáze jsou stabilní v širokém rozmezí ph a při teplotách do 200 C. Kolona 38

Zirchrom-carb je vhodná pro separaci diastereomerů a geometrických izomerů. Protože lutein a zeaxanthin jsou polohové izomery, které je na běžných kolonách obtížné oddělit, tak byly zkoušeny různé zirkoniové kolony. Jako první z řady byla zkoušena právě Zirchrom-carb kolona. Všechny zirkoniové kolony se však ukázaly pro použití v analýze karotenoidů jako naprosto nevhodné, protože látky na nich byly silně sorbovány a k eluci nedocházelo ani do 30 minut. Jako mobilní fáze byl zkoušen methanol a dále kombinace methanolu a tetrahydrofuranu ( 70:30, 50:50, 10:90). Tetrahydrofuran byl použit s cílem urychlit eluci látek z kolony. Pro zvýšení eluce byla postupně zvyšována teplota až na 80 C. 4.4.5 SUPELCO Discovery ZR-Carbon C18 (7,5 cm x 4,6 mm, 3 μm) Další zirkoniová kolona používaná pro univerzální separaci látek, která má ale odlišnou selektivitu ve srovnání s C18. Tato kolona byla také pro analýzu nepoužitelná, protože rovněž docházelo k velmi silné sorbci. Jako mobilní fáze byl zkoušen methanol a směs methanolu a tetrahydrofuranu 10:90. V průběhu analýzy byla teplota zvýšena až na 80 C, ale k eluci nedošlo ani do 25 minut. Jako další mobilní fáze byl zkoušen čistý hexan, který měl urychlit eluci karotenoidů jako lipofilních látek. Toho ale nebylo dosaženo. 4.4.6 SUPELCO Discovery ZR-PBD (15 cm x 4,6 mm, 5 μm) Další zirkoniová kolona, která obsahuje navázané polybutadienové skupiny. Lze jí používat v módu reverzních fází a iontovýměnné chromatografie s širokým spektrem mobilních fází a ph. V průběhu optimalizace byla na této koloně zkoušena mobilní fáze složená z methanolu a tetrahydrofuranu (10:90 a 90:10), dále čistý methanol a čistý acetonitril. Látky se na této koloně při použití těchto mobilních fází chovaly obdobně jako na klasické C18. Tedy methanol a THF urychlovaly eluci a ACN eluci zpomaloval. K oddělení luteinu a zeaxanthinu za nastavených podmínek nedošlo. Testování této kolony bylo zahájeno při 80 C a v průběhu byla teplota snížena na 30 C. 39

Supelco Discovery ZR-PBD (15 cm x 4,6 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten THF + Methanol 90 / 10 1,46 Methanol + THF 90 / 10 1,68 1,69 3,37 Methanol 100 1,97 2,01 12,7 ACN 100 3,34 3,76 Tabulka 9: Mobilní fáze testované na koloně Supelco Discovery ZR-PBD (15 cm x 4,6 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.7 Zorbax SB-phenyl (75 x 4,6 mm, 5 μm) Tato kolona obsahuje nepolární stacionární fázi. Jako mobilní fáze zde proto byly používány směsi methanolu a ethanolu s vodou, která eluci zpomalovala. Vyzkoušen byl i acetonitril, který oproti C18 stacionární fázi eluci látek urychloval. K oddělení látek na této koloně nedošlo. Zorbax SB-phenyl (75 x 4,6 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Methanol + Voda 90 / 10 5,52 5,72 21,6 93 / 7 2,94 3,03 10,11 Ethanol + Voda 80 / 20 5,76 5,58 Tabulka 10: Mobilní fáze testované na koloně Zorbax SB-phenyl (75 x 4,6 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.8 Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm, 5 μm) Nitrilovou kolonu lze používat jak v módu reverzních, tak i normálních fází. Při testování byly zkoušeny oba módy. Postupovalo se od mobilní fáze, kterou byl čistý methanol, přes jeho směsi s vodou, až po čistý methylenchlorid. Nejlepších výsledků pro separaci luteinu a zeaxanthinu bylo dosaženo s mobilní fází hexan:thf 90:10, betakaroten se však eluoval s mrtvým objemem (viz. Obr. 9) Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Methanol 100 2,04 2,09 2,47 Methanol + Voda 95 / 5 2,66 2,78 4,12 90 / 10 4,43 4,8 10,56 ACN 100 2,12 2,19 2,12 40

Zeaxanthin 6.25 Lutein 5.64 ACN + Voda 95 / 5 2,07 2,12 2,46 85 / 15 2,65 2,73 5,77 ACN + THF 85 / 15 2,96 2,96 Hexan + THF 90 / 10 5,64 6,25 1,71 Methylenchlorid + THF 90 / 10 1,8 1,84 1,54 Methylenchlorid 100 3,77 3,71 1,54 Methylenchlorid + Hexan + ACN 2,5 / 2,5 / 95 2,2 2,3 2,07 Tabulka 11: Mobilní fáze testované na koloně Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. mau 450nm,4nm (1.00) 70 60 50 40 30 20 10 0-10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min Obr.9: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB CN (150 x 4,6 mm, 5 μm); mobilnífáze hexan:tetrahydrofuran (90:10); průtok 1 ml/min, 30 C (jen směs luteinu a zeaxanthinu. Během analýzy kolísal tlak, proto pravděpodobně nedošlo k úplnému rozdělení) 41

Lutein 6.36 Betakaroten 1.71 Zeaxanthin 6.92 225 mau 450nm,4nm (1.00) 200 175 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min Obr. 10: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB-CN (150 x 4,6 mm, 5 μm), mobilní fáze hexan:thf (90:10)průtok 1 ml/min, 30 C 4.4.9 Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm) Jedná se o další nitrilovou kolonu od jiného výrobce, než předchozí. Zkoušení bylo zahájeno v módu normálních fází. Nejlepších výsledků bylo dosaženo použitím mobilní fáze hexan:thf 85:15. Analýza však trvala 20 minut, proto nebyla tato kolona pro analýzu zvolena jako optimální. Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 80 / 20 11,01 11,36 3,19 75 / 25 7,73 7,91 85 / 15 18,83 19,76 3,29 Tabulka 12: Mobilní fáze testované na koloně Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 42

Betakaroten 3.80 Lutein 18.83 Zeaxanthin 19.76 90 mau 450nm,4nm (1.00) 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Obr. 11: Chromatogram získaný použitím kolony Bischoff nucleosil 100-5-CN 5 μm (250 x 4,6 mm); mobilní fáze hexan:tetrahydrofuran (85:15); průtok 1 ml/min, 30 C 4.4.10 SUPELCO Discovery Cyano (10 cm x 4 mm, 5μm) Nitrilová kolona od firmy Sigma-Aldrich. Testována byla v módu normálních fází s mobilní fází ze směsi hexan a tetrahydrofuran (80:20, 85:15 a 90:10). K eluci betakarotenu docházelo v módu normálních fází výrazně dříve než k eluci luteinu a zeaxanthinu, což souvisí s jeho vyšší lipofilitou. SUPELCO Discovery Cyano (10 cm x 4 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 80 / 20 1,06 1,12 0,72 85 / 15 1,71 1,8 90 / 10 3,82 4 Tabulka 13: Mobilní fáze testované na koloně SUPELCO Discovery Cyano (10 cm x 4 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.11 Zorbax TMS (250 x 4,6 mm, 5 μm) Protože testování na nitrilových kolonách probíhalo od systému reverzních fází k systému normálních fází, byly dále zkoušeny kolony pro systém normálních fází. Jako mobilní fáze byly na této koloně testovány směsi hexan:thf (90:10, 80:20, 60:40, 55:45, 60:40), heptan:thf (60:40), hexan:methylenchlorid (75:25, 60:40), 43

ACN:methylenchlorid (85:15, 70:30, 40:60, 50:50, 60:40) a THF:methylenchlorid (10:90, 40:60, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70). Nejlepších výsledků bylo dosaženo použitím mobilní fáze o složení hexan:thf 60:40 a heptan:thf 60:40. Výsledky při použití těchto mobilních fází se prakticky nelišily. Při vysokých podílech organické složky v mobilní fázi nebo při čistě organické mobilní fázi byla sorpce látek na koloně velmi silná (k eluci nedocházelo ani do 20 minut). Zorbax TMS (250 x 4,5 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 90 / 10 80 / 20 60 / 40 8,13 9,09 2,77 55 / 45 6,42 7,1 Heptan + THF 60 / 40 8,15 9,18 2,78 Hexan + Methylenchlorid 75 / 25 60 / 40 ACN + Methylenchlorid 85 / 15 70 / 30 60 / 40 3,55 4,91 2,6 50 / 50 3,65 5,43 2,56 40 / 60 Methylenchlorid + THF 90 / 10 70 / 30 4,35 4,96 2,64 60 / 40 3,81 4,13 2,63 50 / 50 3,5 3,7 2,63 40 / 60 3,3 3,44 2,62 30 / 70 3,16 3,28 2,62 20 / 80 3,08 3,16 2,6 Tabulka 14: Mobilní fáze testované na koloně Zorbax TMS (250 x 4,5 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 44

Lutein 3,49 Zeaxanthin 3,7 Betakaroten 2,63 Lutein 8.13 Betakaroten 2.78 Zeaxanthin 9.11 mau 450nm,4nm (1.00) 35 30 25 20 15 10 5 0-5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 12: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax TMS (250 x 4,5 mm, 5 μm); mobilní fáze hexan:tetrahydrofuran (60:40); průtok 1 ml/min, 30 C 500 mau 450nm,4nm (1.00) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0-50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 min Obr. 13: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax TMS (250 x 4,5 mm, 5 μm); mobilní fáze methylenchlorid:tetrahydrofuran (50:50); průtok 1 ml/min, 30 C 45

Lutein 8,14 Zeaxanthin 9,12 Betakaroten 2,78 mau 450nm,4nm (1.00) 30 25 20 15 10 5 0-5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min Obr. 14: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax TMS (250 x 4,5 mm, 5 μm); mobilní fáze heptan:tetrahydrofuran (60:40); průtok 1 ml/min, 30 C 4.4.12 Kromasil Si (125 x 4 mm 5 μm) Tato kolona obsahuje pouze křemíkový sorbent, který je použitelný pouze pro systém normálních fází. Jedná se o kolonu naplněnou hydrofilním sorbentem a jako mobilní fáze se používají hydrofóbní organická rozpouštědla. V našem případě se jednalo o směsi hexan:thf (90:10, 95:5, 92:8), methylenchlorid:thf (90:10, 95:5, 98:2), heptan:thf (90:10, 85:15, 82:18). Použití těchto systémů bylo pro analýzu karotenoidů nevhodné, protože všechny tři látky se eluovaly ve stejných časech a na koloně byly zadržovány jen minimálně. Kromasil Si (125 x 4 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 95 / 5 92 / 8 2,69 3,11 1,16 90 / 10 2,14 2,27 1,15 Methylenchlorid + THF 98 / 2 1,05 1,07 1,02 Heptan + THF 90 / 10 1,57 95 / 5 1,03 1,04 1,01 90 / 10 1,01 1,01 1,02 85 / 15 1,62 1,69 1,12 46

82 / 18 1,39 1,46 1,1 Tabulka 15: Mobilní fáze testované na koloně Kromasil Si( 125 x 4 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.13 SUPELCO Discovery RP Amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm) Obr. 15: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony SUPELCO Discovery RP Amide C16 Předpokladem použití této kolony byla její vyšší hydrofilita ve srovnání s C18, která je způsobena přítomností amidové skupiny (viz. Obr. 15). Na této koloně je proto odlišná retence hydrofilních a hydrofóbních látek. Jako mobilní fáze byly testovány různé směsi, vždy se jednalo o systém reverzních fází methylenchlorid:acn (20:80, 15:85, 12:88, 10:90), methylenchlorid:methanol:acn (5:35:60, 10:33:57), hexan:thf (90:10, 95:5), dichlorethan:acn (20:80, 15:85, 10:90, 5:95), methylenchlorid:thf (90:10, 95:5), chloroform:acn (5:95), 1,2-dichlorpropan:ACN (5:95, 10:90). Nejoptimálnějších výsledků bylo dosaženo kombinací chlorovaných rozpouštědel a acetonitrilu methylenchorid:acn (10:90), dichlorethan:acn (5:95), chloroform:acn (5:95) a 1,2-dichlorpropan:ACN (5:95). Ani při nastavení těchto podmínek však rozdělení píků luteinu a zeaxanthinu nebylo dostačující. V závěru celé optimalizace byla na této koloně vyzkoušena i výsledná optimální mobilní fáze o složení methylenchlorid:hexan:acn v různých poměrech, která ale na této koloně nebyla pro rozdělení látek vhodná. SUPELCO Discovery RP Amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN + Methylenchlorid 80 / 20 2,7 2,84 3,17 85 / 15 3,11 3,29 3,8 88 / 12 3,41 3,62 4,28 90 / 10 3,62 3,9 4,7 Methylenchlorid + methanol + ACN 5 / 35 / 60 2,34 2,34 4,43 10 / 33 / 57 2,34 2,34 3,67 Hexan + THF 95 / 5 2,75 2,87 1,4 47

Lutein 4,41 Zeaxanthin 4,76 Betakaroten 6,49 90 / 10 1,76 1,8 1,38 ACN + Dichlorethan 80 / 20 2,87 3 3,54 85 / 15 3,21 3,38 4,08 90 / 10 3,69 3,92 4,91 95 / 5 4,4 4,72 6,12 Methylenchlorid + THF 90 / 10 1,38 1,39 1,36 95 / 5 1,4 1,42 1,36 ACN + Chloroform 95 / 5 4,39 4,75 6 ACN + 1,2-dichlorpropan 95 / 5 4,41 4,76 6,47 90 / 10 3,66 3,91 5,15 Methylenchlorid + Hexan + ACN 2,5 / 2,5 / 95 4,43 4,78 6,31 1,67 / 3,33 / 95 4,41 4,76 6,48 3,3 / 6,7 / 95 3,65 3,89 5,49 Tabulka 16: Mobilní fáze testované na koloně SUPELCO Discovery RP Amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 150 mau 450nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min Obr. 16: Chromatogram získaný použitím kolony Discovery RP amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm), mobilní fáze 1,2-dichlorpropan:acetonitril (5:95), průtok 1 ml/min, 30 C 48

Lutein 4,40 Zeaxanthin 4,72 Betakaroten 6,12 Lutein 3,65 Zeaxanthin 3,90 Betakaroten 4,68 mau 450nm,4nm (1.00) 175 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Obr. 17: Chromatogram získaný použitím kolony Discovery RP amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm); mobilní fáze methylenchlorid:acetonitril (10:90); průtok 1 ml/min, 30 C 125 mau 450nm,4nm (1.00) 100 75 50 25 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Obr. 18: Chromatogram získaný použitím kolony Discovery RP amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm); mobilní fáze dichlorethan:acetonitril (5:95); průtok 1 ml/min, 30 C 49

Lutein 4,41 Zeaxanthin 4,75 Betakaroten 5.96 110 mau 450nm,4nm (1.00) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 -20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Obr. 19: Chromatogram získaný použitím kolony Discovery RP amide C16 (25 cm x 3 mm, 5 μm); mobilní fáze chloroform:acetonitril (5:95); průtok 1 ml/min, 30 C 4.4.14 Synergi 4 μ FUSION-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Obr. 20: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony Synergi FUSION-RP Kolony od tohoto výrobce jsou konstruovány tak, aby poskytovaly co nejvyšší účinnost. Synergi fusion je kolona se zlepšenou selektivitou pro polární látky a zároveň s kratšími retenčními časy, což je zajištěno stacionární fází s navázanými C18 skupinami a současně i s navázanými hydrofilními skupinami (viz. Obr. 20) Byla testována kolona Synergi fusion 75 x 3,00 mm, 20 x 2,00 mm a jejich spojení. Jako mobilní fáze byly zkoušeny směsi různých organických rozpouštědel v různých poměrech viz tabulka 17. Překvapivě nejlepšího výsledku bylo dosaženo na koloně Synergi fusion 75 x 3,00 mm při použití čistého acetonitrilu jako mobilní fáze. 50

Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 90 / 10 1,5 1,67 0,46 Methylenchlorid + THF 60 / 40 0,45 88 / 12 1,29 1,32 0,45 70 / 30 0,46 90 / 10 0,54 Hexan + Methylenchlorid 90 / 10 75 / 25 ACN + Methylenchlorid 80 / 20 0,83 0,89 0,88 90 / 10 0,99 1,08 1,21 ACN 100 1,27 1,44 1,93 ACN + Voda 98 / 2 1,04 1,04 2,1 99 / 1 1,22 1,22 2,13 99,5 / 0,5 1,18 1,28 2,09 ACN + Methanol 98 / 2 1,21 1,34 1,72 Tabulka 17: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å ( 20 x 2,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 0,82 0,82 2,47 Tabulka 18: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å ( 20 x 2,00mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å ( 75 x 3,00 mm, 4 μm + 20 x 2,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 1,47 1,62 2,56 Tabulka 19: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å ( 75 x 3,00mm, 4 μm+ 20 x 2,00 mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 51

Lutein 1.43 Zeaxanthin 1.58 Betakaroten 2.53 Lutein 1.32 Zeaxanthin 1.47 Betakaroten 1.97 350 mau 450nm,4nm (1.00) 300 250 200 150 100 50 0-50 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 min Obr. 21: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze 100% acetonitril; průtok 1 ml/min, 30 C 225 mau 450nm,4nm (1.00) 200 175 150 125 100 75 50 25 0-25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 min Obr. 22: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å ( 75 x 3,00mm, 4 μm+ 20 x 2,00 mm, 4 μm);mobilní fáze 100% acetonitril; průtok 1ml/min, 30 C 52

4.4.15 Synergi 4 μ HYDRO-RP 80A (75 x 3,00 mm, 4 μm) Obr. 23: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony Synergi HYDRO-RP Výhodou této kolony je silnější retence hydrofóbních látek a její stabilita i ve 100% vodné mobilní fázi. Zkoušené mobilní fáze byly jedno, dvou i třísložkové. Jednalo se o acetonitril, jeho směsi s methylenchloridem v různých poměrech (98:2, 95:5) a o směsi ACN:methylenchlorid:hexan (90:5:5, 80:10:10, 95:2,5:2,5) a ACN:chloroform:hexan (95:2,5:2,5, 90:5:5). Dále bylo vyzkoušeno i spojení kolony Synergi Hydro a Synergi Fusion (75 x 3,00 mm) s mobilní fází složenou z acetonitrilu a dále jeho kombinací s methylenchloridem a hexanem (95:2,5:2,5). Lepší výsledky byly získány s čistým acetonitrilem. Synergi 4 μ HYDRO-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 2,59 2,98 10,56 ACN + Methylenchlorid 98 / 2 2,29 2,61 9,62 95 / 5 1,96 2,23 7,86 ACN + Methylenchlorid + Hexan 90 / 5 / 5 1,4 1,56 4,59 80 / 10 / 10 0,93 0,93 2,29 95 / 2,5 / 2,5 1,81 2,05 6,8 ACN + Chloroform + Hexan 95 / 2,5 / 2,5 1,58 1,78 6,52 90 / 5 / 5 1,07 1,18 4,27 Tabulka 20: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 53

Lutein 2.59 Zeaxanthin 2.98 Betakaroten 10.56 Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) + Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 3,89 4,45 12,69 Methylenchlorid + Hexan + ACN 2,5 / 2,5 / 95 2,6 2,9 7,82 Chloroform + Hexan + ACN 2,5 / 2,5 / 95 2,65 2,97 8,11 Tabulka21: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) + Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. mau 450nm,4nm (1.00) 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Obr. 24: Chromatogram získaný použitím kolony Kolona Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze 100% acetonitril; průtok 1 ml/min, 30 C 54

Lutein 1.81 Zeaxanthin 2.05 Betakaroten 6.80 Lutein 1.96 Zeaxanthin 2.23 Betakaroten 7.86 80 mau 450nm,4nm (1.00) 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 25: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze methylenchlorid:acetonitril (5:95); průtok 1ml/min, 30 C 90 mau 450nm,4nm (1.00) 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min Obr. 26: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze acetonitril:hexan:methylenchlorid (95:2,5:2,5); průtok 1 ml/min, 30 C 55

Lutein 3.89 Zeaxanthin 4.45 Betakaroten 12.69 Lutein 1.79 Zeaxanthin 2.02 Betakaroten 6.76 90 mau 450nm,4nm (1.00) 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min Obr. 27: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze acetonitril:hexan:chloroform (95:2,5:2,5), 30 C mau 450nm,4nm (1.00) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0-5 -10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0min Obr. 28: Chromatogram získaný použitím kolony Synergi 4 μ Hydro-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) + Synergi 4 μ Fusion-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm); mobilní fáze 100% acetonitril; průtok 1 ml/min, 30 C 56

4.4.16 Zorbax ECLIPSE XDB C18 (75 x 4,6 mm, 5 μm) Další C18 kolona na které byl jako mobilní fáze zkoušen acetonitril a jeho směs s methylenchloridem (90:10), dále směs hexan:thf (90:10, 98:2) a výsledná mobilní fáze o složení methylenchlorid:hexan:acn (2,5:2,5:90). Nebylo však dosaženo žádných optimálních výsledků. Zorbax ECLIPSE XDB C18 (4,6 x 75 mm, 5 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN 100 2,74 2,91 ACN + Methylenchlorid 90 / 10 1,43 1,5 12,71 Hexan + THF 90 / 10 0,73 0,73 0,71 98 / 2 0,78 0,98 0,72 Methylenchlorid + Hexan + ACN 2,5 / 2,5 / 95 2,19 2,19 21,31 Tabulka22: Mobilní fáze testované na koloně Zorbax ECLIPSE XDB C18 (4,6 x 75 mm, 5 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.17 Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm) Tato kolona poskytovala nejlepší výsledky, byla proto zvolena jako výsledná pro použití při analýze karotenoidů. Byla na ní testována řada mobilních fází, viz. tabulka 23. Po zjištění optimálních podmínek byly tyto dále měněny, aby byl zjištěn jejich vliv na separaci. Zjišťován byl vliv teploty, která byla ze 30 C zvyšována postupně až na 50 C. Zvýšení teploty sice urychlilo analýzu, která tak probíhala do šesti minut, ale píky luteinu a zeaxanthinu pak vykazovaly shodný retenční čas. Stejný efekt mělo i zvýšení průtoku mobilní fáze z 1 ml/min až na 5 ml/min. V tomto případě ale nedošlo k tak výraznému urychlení analýzy. Záměna hexanu za lipofilnější heptan měla na separaci jen minimální vliv. Došlo ke zhoršení separace luteinu a zeaxanthinu a k mírnému urychlení betakarotenu. Stejný vliv mělo i zvýšení poměru lipofilnějších složek mobilní fáze (hexanu a methylenchloridu). Nejlepšího rozlišení bylo na této koloně dosaženo pravděpodobně proto, že obsahuje sorbent s velikostí částic 2 μm, což zapříčiňuje vysokou účinnost kolony. 57

Lutein 1.48 Zeaxanthin 1.63 Betakaroten 6.39 Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten Hexan + THF 95 / 5 0,57 0,78 0,55 ACN + Methylenchlorid 90 / 10 1,48 1,63 6,39 85 / 15 1,23 1,33 4,48 ACN + Methylenchlorid + Hexan 95 / 2,5 / 2,5 1,89 2,12 9,56 90 / 5 / 5 1,49 1,65 6,41 1,67 / 3,33 / 95 1,69 1,88 9,74 3,3 / 6,7 / 90 1,71 1,88 10,01 ACN + Methylenchlorid + Heptan 95 / 2,5 / 2,5 1,69 1,87 9,4 Tabulka23: Mobilní fáze testované na koloně Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 150 mau 450nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Obr. 29: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:acetonitril (10:90); průtok 1 ml/min, 30 C 58

Lutein 1.89 Zeaxanthin 2.12 Betakaroten 9.56 Lutein 1.23 Zeaxanthin 1.33 Betakaroten4.48 mau 450nm,4nm (1.00) 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min Obr. 30: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:acetonitril (15:85); průtok 1 ml/min, 30 C mau 450nm,4nm (1.00) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 -20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 31: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 1 ml/min, 30 C 59

Lutein 1.69 Zeaxanthin 1.88 Betakaroten 9.74 Lutein 1.49 Zeaxanthin 1.65 Betakaroten6.41 mau 450nm,4nm (1.00) 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0min Obr. 32: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (5:5:90); průtok 1 ml/min, 30 C mau 450nm,4nm (1.00) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 33: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (1,67:3,33:95); průtok 1 ml/min, 30 C 60

Lutein 1.69 Zeaxanthin 1.87 Betakaroten 9.40 Lutein 1,15 Zeaxanthin 1,24 Betakaroten 10,1 175 mau 450nm,4nm (1.00) 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Obr. 34: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (3,3:6,7:90); průtok 1 ml/min, 30 C 125 mau 450nm,4nm (1.00) 100 75 50 25 0-25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min Obr. 35: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:heptan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 1 ml/min, 30 C 61

Lutein 1,38 Zeaxanthin 1,47 Betakaroten 7,05 Lutein 1,10 Zeaxanthin 1,22 Betakaroten 6,65 150 mau 450nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min Obr. 36: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 1,5 ml/min, 30 C 150 mau 450nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min Obr. 37: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 1 ml/min, 40 C 62

Společný pík luteinu a zeaxanthinu 2.27 Betakaroten 9.65 Společný pík luteinu a zeaxanthinu1.22 Betakaroten 5.10 200 mau 450nm,4nm (1.00) 175 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min Obr. 38: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 1 ml/min, 50 C 175 mau 450nm,4nm (1.00) 150 125 100 75 50 25 0-25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min Obr. 39: Chromatogram získaný použitím kolony Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm); mobilní fáze methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95); průtok 5 ml/min, 50 C 63

4.4.18 Synergi 4 μ POLAR-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Obr. 40: Skupiny navázané na stacionární fázi kolony Synergi POLAR-RP Tato kolona je vhodná zejména pro separaci polárních a aromatických látek. Jako mobilní fáze byly testovány dvou a třísložkové směsi o složení: methylenchlorid:hexan:acn (1,67:3,33:95), methanol:voda (95:5, 90:10, 85:15), ethanol:voda (80:20) a hexan:thf (90:10). Při použití všech typů mobilních fází docházelo k eluci luteinu a zeaxanthinu ve stejných časech. Synergi 4 μ Polar-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) Retenční čas (min) Mobilní fáze Poměr (%) Lutein Zeaxanthin Betakaroten ACN + Methylenchlorid + Hexan 1,67 / 3,33 / 95 0,58 0,58 0,66 Methanol + Voda 95 / 5 0,81 0,83 2,01 90 / 10 1,47 1,49 7,59 85 / 15 3,9 3,94 80 / 20 0,97 0,94 3,47 Hexan + THF 90 / 10 0,56 0,61 0,47 Tabulka 24: Mobilní fáze testované na koloně Synergi 4 μ Polar-RP 80 Å (75 x 3,00 mm, 4 μm) a přehled retenčních časů stanovovaných karotenoidů. 4.4.19 Pathfinder AS Silica 100 (150 x 4,6 mm, 5 μm) Kolony obsahující stacionární fáze Pathfinder mají oproti klasickým kolonám řadu výhod (chemická inertnost, vysoká účinnost, tlaková odolnost), které jsou způsobeny polymerní enkapsulací silikagelu. Pathfinder AS silica je C18 kolona. Jako mobilní fáze byla zkoušena výsledná třísložková směs methylenchlorid:hexan:acn (2,5:2,5:95), dále směs methylenchlorid:acn (10:90) a hexan:thf (85:15, 95:5). K rozdělení luteinu a zeaxanthinu ze směsi při nastavených podmínkách nedošlo. 64