MIKROSKOPIE POTRAVIN

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie vegetabilních potravin MIKROSKOPIE POTRAVIN MVDr. Matej Pospiech, Ph.D. doc. MVDr. Bohuslava Tremlová, Ph.D. Mgr. Zdeňka Javůrková, Ph.D MVDr. Zuzana Řezáčová Lukášková, Ph.D. Mgr. Michaela Petrášová BRNO 2014

Tato učebnice je spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost: Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

OBSAH OBSAH... 2 1 ÚVOD... 4 2 CÍLE MIKROSKOPICKÉHO VYŠETŘOVÁNÍ POTRAVIN... 5 3 MIKROSKOPICKÉ METODY A TECHNIKY PRO ANALÝZU POTRAVIN... 7 3.1 VÝBĚR VHODNÉ METODY A TECHNIKY... 7 3.2 SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE... 7 3.2.1 Zpracování vzorků pro světelnou mikroskopii... 8 3.2.2 Barvení mikroskopických preparátů... 9 3.2.2.1 Přehledná barvení... 11 3.2.2.2 Cílená barvení... 13 3.2.3 Imunohistochemické metody (IHC)... 18 3.3 MODIFIKACE SVĚTELNÉ MIKROSKOPIE... 20 3.3.1 Polarizační mikroskopie... 20 3.3.2 Fázový kontrast... 22 3.3.3 Interferenční mikroskopie... 22 3.3.4 Fluorescenční mikroskopie... 23 3.3.5 Aplikace jednotlivých metod světelné mikroskopie... 24 3.4 ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE... 25 3.4.1 Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)... 25 3.4.2 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)... 26 3.4.3 Použití elektronové mikroskopie v potravinářství... 29 3.5 DALŠÍ TYPY MIKROSKOPICKÝCH METOD... 30 3.5.1 Infračervená mikroskopie... 30 3.5.2 Konfokální mikroskopie... 31 3.5.3 Mikroskopické metody skenovací sondou... 32 3.5.4 Mikroskopie blízkého pole... 32 3.5.5 Skenovací tunelová mikroskopie (STM)... 33 3.5.6 Mikroskopie atomárních sil (AFM)... 33 3.5.7 Akustická mikroskopie... 34 3.6 KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ MIKROSKOPICKÁ ANALÝZA... 35 3.6.1 Kvalitativní mikroskopické vyšetření... 35 3.6.2 Semikvantitativní mikroskopické vyšetření... 36 3.6.3 Kvantitativní mikroskopické vyšetření... 36 4 SUROVINY ROSTLINNÉHO PŮVODU... 41 4.1 MOUKY A ŠKROBY... 41 4.1.1 Mouky... 41 4.1.2 Škroby... 43 4.2 NEŠKROBOVÉ POLYSACHARIDY... 49 4.3 KARAGENANY... 51 4.4 LUŠTĚNINY A SUROVINY Z NICH... 52 4.5 KOŘENÍ... 60 4.5.1 Technologie zpracování koření... 60 4.5.2 Použití koření ve výrobě potravin... 61 4.5.3 Oddenky... 61 4.5.3.1 Zázvor... 61 4.5.3.2 Kurkuma... 62 4.5.4 Kůry... 63 4.5.4.1 Skořice... 63 4.5.5 Listy a natě... 66 4.5.5.1 Bobkový list... 66 4.5.5.2 Majoránka... 66 2

4.5.6 Květy a součásti květů... 67 4.5.6.1 Hřebíček... 67 4.5.7 Plody a semena... 69 4.5.7.1 Pepř... 69 4.5.7.2 Nové koření... 71 4.5.7.3 Paprika... 74 4.5.7.4 Muškátový květ a muškátový oříšek... 76 4.5.7.5 Kmín... 77 4.5.8 Další druhy koření... 78 4.5.8.1 Cibule... 78 4.5.8.2 Česnek... 79 4.6 ROSTLINNÉ ALERGENY... 80 4.6.1 Sezam... 81 4.6.2 Podzemnice olejná... 82 4.6.3 Hořčice... 83 4.6.4 Celer... 84 4.6.5 Stromové ořechy... 85 4.6.5.1 Mandle... 85 4.6.5.2 Lískový ořech... 86 4.6.5.3 Vlašský ořech... 86 4.7 HOUBY... 87 4.8 KAKAOVÉ BOBY... 87 4.9 KÁVOVÉ BOBY... 90 5 SUROVINY ŽIVOČIŠNÉHO PŮVODU... 91 5.1 PRINCIPY DIAGNOSTIKY ŽIVOČIŠNÝCH PRODUKTŮ URČENÝCH K VÝROBĚ POTRAVIN... 92 5.1.1 Epitely... 92 5.1.2 Pojivová tkáň... 94 5.1.3 Svalová tkáň... 98 5.1.4 Mikroskopická struktura dalších poživatelných částí... 103 5.1.4.1 Využitelné části trávicí soustavy... 104 5.1.4.2 Využitelné části dýchací soustavy... 109 5.1.4.3 Využitelné části oběhové soustavy... 111 5.1.4.4 Využitelné části mízní soustavy... 112 5.1.4.5 Využitelné části nervové soustavy... 114 5.1.4.6 Využitelné části močové soustavy... 115 5.1.4.7 Využitelné části pohlavní soustavy... 116 5.1.4.8 Využitelné části kožní soustavy... 117 5.2 MLÉKO... 119 5.3 VEJCE... 122 6 MIKROSKOPIE HOTOVÝCH POTRAVIN... 124 6.1 MIKROSKOPIE MASNÝCH VÝROBKŮ... 124 6.1.1 Mikrostruktura mělněných masných výrobků... 125 6.1.2 Mikrostruktura celosvalových masných výrobků... 127 6.1.3 Mikrostruktura vařených a pečených masných výrobků... 128 6.1.4 Mikrostruktura trvanlivých výrobků... 130 6.1.5 Mikrostruktura roztíratelných fermentovaných masných výrobků... 132 6.1.6 Mikrostruktura výrobků z drůbežího masa... 132 6.2 MIKROSKOPIE MLÉČNÝCH VÝROBKŮ... 133 6.3 MIKROSKOPIE PEKÁRENSKÝCH VÝROBKŮ... 139 6.4 MIKROSKOPIE MEDU... 141 6.5 MIKROSKOPIE SPECIÁLNÍCH PRODUKTŮ... 145 7 LITERATURA... 146 8 REJSTŘÍK... 148 3

1 ÚVOD Kvalita potravin zahrnuje celou řadu vzájemně propojených nebo na sebe buď přímo či nepřímo navazujících aspektů - hygienických, nutričních, technologických, senzorických a informačních. Kvalita finálního výrobku je odvozena od kvality surovin a je ovlivňována v pozitivním i negativním smyslu v celém průběhu potravinového řetězce. Snížení kvality výrobků mohou tedy způsobit nekvalitní suroviny, technologické chyby až úmyslné porušení nebo falšování. Falšování potravin zůstává problémem i v současnosti, a proto je třeba neustále zdokonalovat analytické metody pro detekci jednotlivých součástí potravin. Ze skupiny optických metod pak zejména zobrazovací metody představují jedny z nejvhodnějších postupů pro hodnocení skladby a struktury potravin. Je pro to několik důvodů mikroskopická stavba základních surovin je známá, změny po základních technologických postupech jsou popsány, lze využít cílené diagnostické metody. Mikroskopické metody umožňují získat přehled o rozmístění a velikosti součástí ve výrobku a způsobu jejich zpracování. V případě potřeby je možné převést mikroskopický obraz na číselná data, která dovolují statistické zpracování. V České republice není tento způsob vyšetření potravinářských výrobků obvyklý. V řadě evropských zemí (Rakousko, Německo, Francie, Holandsko, Rusko) je však používáno jako cílené vyšetření a je také součástí potravinářské legislativy a souborů analytických metod pro vyšetřování potravin. Výsledek analýzy může být rozhodujícím faktorem pro posouzení dodržování technologického postupu a některých způsobů falšování potravin. Obvykle jde o kvalitativní vyšetření, tzn. o zjištění přítomnosti jednotlivých tkání a posouzení jejich přípustnosti nebo vhodnosti pro daný výrobek. Učebnice Mikroskopie potravin je určena pro všechny, kteří chtějí získat ucelené znalosti související s využitím mikroskopických metod a technik pro analýzu potravin. Zároveň by měla kniha sloužit jako učebnice pro studenty potravinářských oborů a také jako zdroj informací pro odborníky z potravinářské praxe a výzkumu. Učebnice je rozdělena na dvě samostatné knihy. První kniha je zaměřena na popis metod a technik vhodných ke studiu i praktickému mikroskopickému vyšetření, na popis mikroskopické stavby nejvýznamnějších potravinových surovin rostlinného a živočišného původu, dále hotových výrobků s využitím popisu změn surovin v souvislosti s technologickým opracováním a se zaměřením na hodnocení skladby a struktury potravinářských výrobků. Druhá kniha představuje mikroskopický atlas potravin a potravinových surovin s minimálním podílem textu. Odkazy na atlas jsou v učebnici mikroskopie potravin propojeny textem obr. ax-x. Učebnice bude jistě vhodnou učební pomůckou pro vysokoškolsky připraveného odborníka v oblasti kvality a složení potravin a rozhodování o jejich použitelnosti. Hlubší znalosti a praktické dovednosti v této oblasti mohou získat studiem specializovaných předmětů Struktura a skladba potravin a Mikroskopie potravin. Autory jednotlivých kapitol jsou pracovníci Ústavu hygieny a technologie vegetabilních potravin Fakulty veterinární hygieny a ekologie VFU Brno. Autorům i odborníkům, kteří se podíleli na recenzi textu, patří poděkování. 4

2 CÍLE MIKROSKOPICKÉHO VYŠETŘOVÁNÍ POTRAVIN Mikroskopické metody (mikroskopie světelná, elektronová, laserová, mikroskopie atomových sil aj.) a další zobrazovací techniky jsou jedny z nejvhodnějších postupů pro hodnocení složení a struktury potravin. Cíle mikroskopického vyšetření určují počet a způsob odebíraných vzorků a také jejich další zpracování a vyšetření. Složení potravin V současné době je dobře známá mikroskopická stavba surovin rostlinného a živočišného původu a jsou popsány změny po základních technologických postupech. Základní mikroskopickou technikou při hodnocení složení potravin je světelná mikroskopie a její modifikace, fluorescenční mikroskopie a v menší míře i ostatní techniky. Mikroskopické metody jsou schopné i s využitím řady cílených diagnostických postupů zprostředkovat informace nutné pro identifikaci složek potravin a posouzení vzhledem k jejich kvalitě, velikosti, rozmístění a množství a následně tyto informace využít také pro hodnocení případného falšování potravin. V případě potřeby je mikroskopický obraz možné převést na data, která dovolují statistické zpracování ať už digitálních nebo analogových snímků. Složení potravin je do určité míry regulováno předpisy národními a na úrovni Evropské unie. Konkrétní požadavky na jejich složení umožňují, aby se zachovala určitá kvalita potravin ve spojení s konkrétním druhem výrobku a použitím určitého názvu. Struktura potravin Struktura a uspořádání potravinového materiálu mají přímý vztah k dalším vlastnostem potravin, zejména organoleptickým, a proto jsou jedním z prvků určujících kvalitu potravin. Charakter a stupeň změn surovin v souvislosti s technologickým opracováním jsou podmíněny jejich strukturou a parametry technologického procesu. Základem mechanické struktury potravin je struktura rostlinných a živočišných tkání, jejichž původní vlastnosti jsou známé a souvisí s jejich funkcí v živém organizmu. Přirozené změny těchto struktur jsou způsobené enzymatickými procesy, např. při zrání produktů nebo jejich kažení. Strukturální vlastnosti se však podstatně mění také při technologických procesech, zahrnujících vlivy chemické, mechanické a termické. Kromě porušení původní struktury dochází v řadě případů k vytváření nových struktur, které v nativním materiálu přítomné nebyly. Některé takové příklady jsou známé už celá staletí např. struktura masných výrobků, gelové vlastnosti pudinků a pórovitost chlebové střídky. Existuje však řada jiných potravin, jejichž struktura ještě popsána nebyla. Je tedy stále příležitost přinést nové znalosti o struktuře potravin, případně doplnit již známé informace. V současné době se vyrábějí potraviny nových typů struktur (např. pěny, emulze, disperze, extruze a vlákna) a používají se nové funkční přísady do potravin. Vznik těchto nových struktur a působení různých přísad v potravinách lze vysvětlit pomocí strukturálních studií. Následně lze využít těchto znalostí k cílené produkci dalších nových struktur v potravinách eventuálně k vyvarování se nedostatků při výrobě. Při studiu struktury potravin se uplatňují i náročnější mikroskopické techniky elektronová mikroskopie, konfokální laserová mikroskopie, atomová mikroskopie a další. Vizualizace přesné a skutečné struktury potraviny je nesmírně obtížná. Každý krok přípravy vzorku pro mikroskopii jej do určité míry mění. Nešetrné nebo záměrné odstranění vody, tuku nebo jiných substancí během přípravy působí změny vztahů, které existují mezi jednotlivými komponentami. Takové změny musí tudíž být brány do úvahy při formulaci závěrů a zobecňování výsledků analýz. Nejlepší přístup pro správné získání informací o vzorku potraviny je použití několika zobrazovacích technik pro srovnání a potvrzení výsledků. 5

Pro kvantifikaci některých znaků potraviny je používána analýza obrazu, která umožňuje zpracování dat získaných přímo v digitální podobě z mikroskopu. Parametry, jako jsou rozměry a tvary sledovaného objektu k celkové ploše vzorku, lze prakticky využít např. pro programování automatických operací na výrobních linkách. 6

3 MIKROSKOPICKÉ METODY A TECHNIKY PRO ANALÝZU POTRAVIN Optické metody patří mezi biofyzikální metody, které využívají rychlé, přesné a neinvazivní techniky pro zjištění technologické a senzorické kvality potravin, navíc je možné je zapojit on-line do technologického procesu. Biofyzikální metody mohou buď přímo měřit vlastnosti, nebo komponenty potravin anebo je vypočítat nepřímo pomocí korelací mezi několika parametry z dat získaných těmito měřeními. Jednotlivé metody poskytují různé klíčové informace pro posouzení potravin. Současnost i budoucnost výzkumu potravin je v kombinování metod pro získání a zpracování výsledků zobrazovacích metod. Kombinace metod je základem pro získání objektivních výsledků, případně pro jejich lepší vizualizaci. 3.1 VÝBĚR VHODNÉ METODY A TECHNIKY Mikroskopické techniky a metody se odlišují v metodě získání obrazu, rozlišení a typu detekovaného signálu a dávají podrobný, speciální druh informace, která je zvláštní podle použité techniky. Obvykle se rozdělují podle druhu záření, které se používá na analýzu sledovaných složek: a) Mikroskopické metody využívající světelné záření klasická světelná mikroskopie polarizační mikroskopie b) Mikroskopické metody využívající proud elektronů transmisní elektronová mikroskopie skenovací elektronová mikroskopie c) Mikroskopické metody využívající jiné druhy záření d) Mikroskopické metody využívající rastrovací sondu V potravinářské praxi se nejčastěji jedná o použití mikroskopie světelné (klasické nebo jejích modifikací) a mikroskopie elektronové. Méně často, spíše v oblasti výzkumu, se setkáváme s ostatními mikroskopickými metodami. O výběru vhodné metody rozhoduje cíl vyšetření a vlastnosti vyšetřované matrice. Obecně je cílem každého vyšetření poskytnout přesnou informaci o struktuře a složení potravin, každá z metod však umožňuje různé stupně zvětšení a je vhodná pro různé složky vyšetřované matrice. 3.2 SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE Světelná mikroskopie je nejjednodušší technikou pro získání obrazu vzorku potravin. V potravinářském průmyslu je využívaná od vzniku prvních instrumentálních zařízení. Její primární použití bylo spojeno s odhalováním některých způsobů falšování potravin. V současné době je používána řada mikroskopických technik pro získání mikrostrukturálních informací o potravinách, o potravinových složkách a také o distribuci a uspořádání potravinových komponent. Pomocí světelné mikroskopie můžeme zjistit vzájemné interakce potravinových složek a zjistit také hodnotné informace, které umožňují pochopení vlastností finálních produktů, zpracování a technologických procesů a jejich dopad na strukturu jednotlivých složek. 7

Princip světelné mikroskopie Vizualizace detailů objektů umožňuje vytvoření zvětšeného obrazu světlem procházejícím přes soustavu skleněných čoček. Maximální zvětšení je násobkem objektivového a okulárového zvětšení. Světelná mikroskopie může dosáhnout zvětšení až 1200krát, avšak pro analýzu složek a struktury potravin je většinou postačující zvětšení 100 až 200krát. Zvětšení 400 až 600krát je potřebné pro práci s emulzemi, pro posouzení přítomnosti mikroorganizmů (žádoucích i nežádoucích), kvasinek či mycelií a spór nižších hub. Limitem pro světelnou mikroskopii je propustnost sledovaných struktur pro světelné záření. Vzorky je nutné zpracovat histologickou technikou nebo vytvořit tenký nátěr. Větší zvětšení potřebuje tenčí řez a silnější zdroj světla. Absorpci světla můžeme také cíleně ovlivnit použitím různých barvících technik, kdy barvivo reaguje se sledovanými strukturami, mění absorpci světla o určitých vlnových délkách a vznikají tak barevně odlišené struktury. Pro vyšetření vzorků bez úpravy je možné použít stereomikroskopické, které ale dosahují zvětšení maximálně 200krát a analyzují jenom povrch vzorku. Technika je používána ke sledování větších součástí v potravinách, např. koření, zjištění cizích částic nebo vyšetření práškových materiálů. Výhodou je, že se vzorek nemusí nijak předem zpracovávat, nevýhodou je nepříliš velké zvětšení. Pro lepší zobrazení 3D efektu, který tento typ mikroskopu umožňuje, je vhodné volit LED osvětlení, které umožňuje nasvícení z různých stran. 3.2.1 Zpracování vzorků pro světelnou mikroskopii Základem pro dosažení očekávaného výsledku je správný odběr, ošetření a zpracování vzorku. Odběr vzorků Vzorky pevných potravin jsou odebírány podle toho, jaký je cíl vyšetření. Objektivitu posouzení složení a struktury potraviny zajišťuje odběr dostatečného počtu vzorků, který zohlední velikost, konzistenci a homogenitu vyšetřované potraviny. U masného výrobku se vzorky odebírají z míst od sebe co nejvíce vzdálených, tak aby postihly střed výrobku a podobalovou vrstvu, příp. i obal, pokud je součástí výrobku. U výrobků nestejnorodé konzistence se vzorky odebírají zejména z rozmělněných částí. U homogenních vzorků není místo odběru vzorků omezeno. Vzorky tekutých, roztíratelných a sypkých potravin se odebírají rovněž z různých částí výrobku. Z výrobků jsou odebrány obvykle 3-4 vzorky, které se obvykle zpracovávají a vyhodnocují samostatně (obr. 1). Je možné však vytvořit průměrný vzorek a teprve ten rozdělit na 3 4 dílčí vzorky. V případě výskytu podezřelých míst a při podezření na falšování potraviny je vhodné odebrat větší počet vzorků. Vzorky se v tomto případě nespojují do průměrného vzorku a vyšetřují se vždy samostatně. Zpracování vzorků Vzorky z potravin, které podléhají zkáze, se před zpracováním fixují a to buď chemicky, nebo zmražením. U pevných vzorků je vhodné před fixací vzorek upravit na velikost asi 1 cm 3 (obr. 2). Vzorky výrobků s drobivou konzistencí se zabalí do gázy, příp. uzavřou do speciálních krabiček s otvory, aby se při zpracovávání nerozpadly (obr. 3). Do fixační tekutiny se vzorky ukládají minimálně na 24 h, nejčastěji se používá formaldehyd v koncentraci 5 10 %. K urychlení fixace, případně z důvodu vysokého obsahu tuku ve vzorku, lze využít i jiné fixační tekutiny (Carnoyova nebo Bodianova fixační směs). 8

Obr. 1 Odběr vzorku (autoři) Obr. 2 Úprava velikosti vzorku (autoři) Vzorky se po potřebné době fixace a odvodnění zalévají do vhodného média, v případě masných výrobků nejčastěji do parafínu (obr. 4). Z takto vyrobených bloků se připravují tenké řezy (obvykle kolem 4 m) pro mikroskopické vyšetření. Urychlení této fáze zpracování vzorků a rovněž některé další výhody (menší poškození) představuje zmrazení vzorku, ze zmrazených vzorků se mikroskopické řezy krájí přímo na kryotomu. Obr. 3 Umístění vzorku do histologické kazety (autoři) Obr. 4 Příprava parafínového bločku (autoři) Parafínové i zmrazené řezy se přenášejí na podložní skla a na nich se po usušení a odstranění parafinu z parafinových řezů barví (obr. 5). Z tekutých a lehce roztíratelných výrobků je možné vytvořit přímo tenký roztěr, který se dále barví stejným postupem. Podobně se přímo mohou zpracovat i sypké materiály. V některých případech lze sypké materiály zamíchat do parafínu a vytvořit parafínové bločky, které se dále zpracovávají výše uvedeným způsobem. Trvalé preparáty se montují do média, které je fixuje na podložním skle a zároveň umožní jejich vyšetření ve světelném mikroskopu (obr. 6). 3.2.2 Barvení mikroskopických preparátů Až na několik málo výjimek jsou vzorky bezbarvé, což velice znesnadňuje jejich pozorování světelným mikroskopem. Metody barvení byly vyvinuty nejen pro zviditelnění jednotlivých složek vzorku, ale také pro jejich snadné odlišení. Použití barviv bylo v minulosti a možná je i dnes často založeno na empirii, ale v řadě případů jsou přesně známé mechanismy vzniku 9

zbarvení. K barvení jsou používána převážně barviva rozpuštěná ve vodě, výjimečně v alkoholu. Převážně se jedná o směsi barviv nebo postupnou aplikaci různých barviv. Obr. 5 Barvení preparátů (autoři) Obr. 6 Montování preparátů (autoři) Mechanismus vzniku zbarvení závisí na barvivu a barvené součásti: fyzikální přijetí barviva prostřednictvím rozpustnosti ve struktuře, difuze barviva, prosáknutí (závisí na hustotě struktury, velikosti molekul a koncentraci barviva), chemický vznikají pravé chemické vazby (histochemické metody), zejména syntetická barviva, projevuje se afinita kyselých barviv k zásaditým složkám a naopak. Podle způsobu barvení: nepřímé (adjektivní) barvení dochází k tvorbě tzv. barevných laků, kontakt s barvivem je zprostředkován pomocí mořidla, které upraví povrch biologické struktury anebo přímo reaguje s barvivem, přímé (substantivní) barvení. Podle postupu barvení: progresívní barvení roztok barviva působí na řez do dosažení dostačujícího zbarvení, regresívní barvení a diferenciace řez se přebarví a přebytek barviva se odstraní diferenciační tekutinou, sukcedánní objekt barvíme postupně dvěma nebo více barvivy po sobě, každé barví jinou složku (hematoxylin-eozin), simultánní barvíme současně více barvivy v jednom roztoku. Podle výsledku barvení: ortochromatické součásti vzorku se barví v různých odstínech jedné barvy (kyselina pikrová), metachromatické barvení součásti vzorku se barví jiným odstínem než má barvivo (modrá barviva, např. toluidinová modř). V následující části je uveden přehled nejběžnějších barvících metod využívaných v mikroskopii potravin se stručným popisem cílených struktur. Nejedná se však o výčet úplný. U jednotlivých barvení jsou dále popsány mechanismy barvení a struktury, které jsou zvýrazněny. 10

3.2.2.1 Přehledná barvení Přehledná barvení se používají za účelem zobrazení všech struktur potravin a slouží zejména k posuzování uspořádaní a struktury výrobku. Správná diagnostika je založena na znalosti nevelkých barevných odlišností a na znalosti vzhledu složek potraviny. Hematoxylin-eozin Hematoxylin-eozin (dále také HE) je běžně používané přehledné histologické barvení, které našlo uplatnění také v mikroskopii potravin. Jedná se o nepřímé, sukcedánní, bazické barvivo. Vlastní barvící látkou je hematein (oxidační produkt hematoxylinu), důležité je spojení hemateinu s hliníkem z kamence draselného (tzv. mořidlo), tak vzniká potřebný barevný lak. Je to silně pozitivně nabité jaderné barvivo. Jádra jsou barvena modře, obarvení jader přitom nevyžaduje přítomnost DNA a je pravděpodobně dáno vazbou hemateino solného komplexu s bazickými nukleoproteiny bohatými na arginin. Podle druhu mořidla pak se pak označují různé druhy hematoxylinu (např. kamencový Mayerův, železitý Weigertův). Eozin je kyselé, xantenové, cytoplasmatické barvivo. Jedná se o skupinu barviv - nejčastěji se používá erytrosin a žlutý eozin. Eozinem se barví intracelulární a extracelulární proteiny. Barvení je vhodné zejména pro barvení potravin živočišného původu (obr. 7 a 8) a lze je tedy použít pro průkaz běžných struktur masných výrobků, např. pro určení druhu svaloviny, průkazu pojivových tkání včetně tkáně tukové a také pro určení použitých orgánů. Změny v barvitelnosti jader a kolagenního vaziva v důsledku tepelného ošetření výrobků lze použít na určení tepelného namáhání tkání a tím i na potvrzení nebo vyvrácení tepelného ošetření výrobků. U materiálu rostlinného původu je barvení méně výrazné, důvodem je složení buněčných stěn, které se tímto způsobem nebarví. Také další polysacharidové součásti rostlinných buněk a pletiv včetně škrobu jsou neobarveny nebo barveny jenom slabě, ale je možné prokázat buněčná jádra, buněčnou cytoplazmu a proteinové inkluze jako jsou například aleuronová zrna, která představují zásobní proteiny řady semen. Barvení lze tedy použít na průkaz celozrnných obilovin, papriky, kmínu a dalších součástí s vyšším obsahem proteinů ve formě aleuronových zrn. A B Obr. 7 Svalovina kosterní, HE (autoři) Obr. 8 Lymforetikulární tkáň mízní uzlina, HE A mízní uzlík, B kolagenní vazivo (autoři) Toluidinová modř Barvení toluidinovou modří je další přehledné barvení, vhodné zejména pro barvení kryostatových řezů. Jedná se o základní bazické barvivo vhodné pro identifikaci potravinových součástí, které obsahují aniontové skupiny. Schopnost různých složek 11

potraviny vázat barvivo je dána množstvím a zejména vzájemnou vzdáleností aniontových skupin, nazýváme ji metachromazií a barviva jsou označována jako metachromatická. Při vzdálenosti aniontových skupin nad 0,45 nm se naváže jenom jedna molekula toluidinové modři a výsledkem je modré zbarvení. Hovoříme o slabě pozitivní metachromazii, která je typická pro glykoproteiny. V případě vzdálenosti aniontových skupin menší než 0,45 nm dochází mezi molekulami barviva k polymerizaci a změně barvy na purpurovou (červenorudou), jedná o pozitivní metachromazii, která je typická zejména pro polysacharidy s vyšším počtem sulfátových skupin. Barvení lze použít jak pro živočišné tak také pro rostlinné suroviny. Výsledkem barvení potravin živočišného původu je světle modrá svalovina s červeno fialovými jádry, kolagen je zbarven bledě fialově, tepelně opracovaný kolagen bledě modře s modrofialovými jádry, elastické vazivo je tyrkysové (obr. 9 a 10). U rostlinných tkání jsou buněčné stěny barveny tmavě purpurově, sójový protein tmavě modře až purpurově, pšeničný protein světle modrozeleně, celulóza tmavě modře až modrozeleně (obr. 11 a 12). Tuky se nebarví, v případě mastných kyselin je zbarvení světle modré. Potravinové gumy jsou zbarveny růžově, purpurově anebo tmavě purpurově (obr. 13 a 14). Výhodou barvení toluidinovou modří je právě schopnost rozlišit rostlinné a živočišné proteiny na základě již zmíněné metachromazie. Určité omezení má při analýze potravin s vysokým obsahem organických kyselin (kečup, ocet) a tedy s nízkým ph, kde dochází k redukci zbarvení vlivem omezené vazby barviva na aniontové skupiny. A A B Obr. 9 Modelový vzorek, toluidinová modř A kolagen (bledě fialově), B pšeničný protein (světle modře) (Flint & Firth, 1988) B Obr. 10 Modelový vzorek, toluidinová modř A svalovina (světle modře), B stěny buněk (fuchsiově) (Flint & Firth, 1988) A B A B Obr. 11 Modelový vzorek, toluidinová modř A sójový protein (tmavě modře), B pšeničný protein (světle modře) (Flint & Firth, 1988) Obr. 12 Modelový vzorek, toluidinová modř A sójový protein (modře), B stěny buněk (fuchsiově) (Flint & Firth, 1988) 12

Obr. 13 Karagenan, toluidinová modř (Flint, 1990) Obr. 14 Pektin, toluidinová modř (Flint, 1990) 3.2.2.2 Cílená barvení Cílená barvení jsou určena pro zvýraznění struktur, které chceme prokázat. Další (často i hlavní) složky potraviny jsou méně viditelné. Většina cílených barviv působí na principu histochemických barvení. Znamená to, že dochází k chemické vazbě mezi barvivem a sledovanou strukturou např. určitého druhu proteinu, polysacharidu nebo fosforečnanu vápenatého. Pro usnadnění orientace jsou metody rozděleny do skupin podle cílové složky. Barvení kolagenu Massonovy trichromy existují tři základní druhy trichromů, jejichž název vychází z výsledné barvy kolagenního vaziva. Jedná se o trichrom žlutý, modrý a zelený. Žlutý trichrom má omezené použití, barvení je málo trvanlivé. Z tohoto důvodu se častěji setkáváme s použitím modrých nebo zelených trichromů, které poskytují standardní výsledek barvení a rovněž barevně odliší základní druhy tkání. Barvení modrým trichromem vyžaduje po obarvení jader použití mořidla (kyselina fosfowolframová), které zajistí vazbu dalších barviv na vzorek. Výsledkem barvení modrého trichromu (barvení azanem) jsou modře až hnědočerně zbarvená jádra, červeně zbarvená svalovina, oranžově zbarvené erytrocyty a modře zbarvené kolagenní vazivo (obr. 15). U zeleného trichromu jsou výsledky barvení stejné kromě zbarvení kolagenního vaziva, které je zelené (obr. 16). B A A C B Obr. 15 Játra, Massonův trichrom modrý A vazivo, B jaterní trámce (autoři) 13 Obr. 16 Svalovina, Massonův trichrom zelený A svalovina, B vazivo, C tukové buňky (autoři)

Calleja výhodou tohoto barvení je snadná kombinovatelnost s dalšími barvivy, jako je například Lugolův roztok nebo Periodic Acid-Schiff s reagent (dále také PAS). Výsledkem barvení je modře zbarvené kolagenní vazivo, zeleně zbarvená svalovina (obr. 17 až 19). Jádra buněk jsou zbarvena červeně. Picro-Sirius Red barvení určené průkaz kolagenu v různých druzích živočišných tkání (kosti, chrupavky, vazivo). Metodu lze použít pro průkaz kolagenu v masných výrobcích (obr. 20). A A B C B C Obr. 17 Párek, Calleja A kolagenní vazivo (modře), B kostní úlomek (tmavě modře), C spojka (autoři) B Obr. 18 Modelový vzorek s vlákninou, PAS-Calleja A kolagenní vazivo (modře), B svalovina (zeleně), C polysacharidy (růžově) (autoři) C A A Obr. 19 Masný výrobek, Lugol-Calleja A kolagenní vazivo (modře), B svalovina (zeleně), C škrob (černě) (autoři) Obr. 20 Tuková tkáň, Picro-Sirius Red A kolagenní vazivo (červeně) ( Slimani, 2012) Barvení elastinu a retikulinu K obarvení elastického vaziva lze použít zejména cílené barvení orceinem, aldehydovým fuchsinem a Weigertovým resorcinovým fuchsinem. Výsledkem barvení orceinem jsou červenohnědě zbarvená elastická vlákna (obr. 21) a modře zbarvená jádra buněk. Aldehydový fuchsin barví elastické vazivo jasně fialově. Stabilním, ale zdlouhavým postupem s Weigertovým resorcinovým fuchsinem získáme modročerně zbarvení elastických vláken a červené zbarvení buněčných jader. Barvení retikulárního vaziva nemá v potravinách významné praktické použití. Běžně používané barvení je založené na principu impregnace retikulárních vláken dusičnanem stříbrným barvení dle Gömöriho. Principem metody je oxidace řezů manganistanem 14

draselným a vybělení pyrosiřičitanem. Poté následuje moření železitým kamencem a impregnace retikulárních vláken amoniakálním roztokem stříbra. Pro docílení černého zbarvení se řezy vloží do chloridu zlatitého. Posledním krokem je ustálení vzniklého komplexu roztokem sirnatanu sodného. Výsledkem barvení jsou šedě až černě zbarvená retikulární vlákna (obr. 22). Další možností pro průkaz retikulárních vláken je barvení histochemickou reakcí PAS. A A Obr. 21 Stěna cévy, orcein A elastická vlákna (hnědočerveně) (autoři) Obr. 22 Plíce, Gömöri A retikulární vlákna (černě) (autoři) Barvení kostní tkáně Na průkaz kostní tkáně se nejčastěji využívají metody histochemické. S nejlepšími výsledky se setkáváme u barvení dle Kossy a barvením alizarinovou červení. Principem barvení dle Kossy je reakce nitrátů stříbra s vápennými solemi. Výsledkem barevní jsou černě zbarvené vápenaté soli a červená jádra buněk (obr. 23). U barvení alizarinovu červení dochází ke vzniku chelátových komplexů mezi barvivem Alizarin Red S a vápenatými ionty. Takto vzniklý komplex vykazuje také dvojlomné vlastnosti a lze ho tedy detekovat pomocí polarizačního vyšetření. Výsledkem barvení jsou červeně zbarvené vápenaté ionty (obr. 24). Podobné výsledky lze dosáhnou i s výše uvedeným barvivem Picro Sirius Red. Kromě histochemických metod lze na průkaz kostní tkáně použít také přehledné barvící postupy, jako je například hematoxylin-eosin nebo toluidinová modř, kde se identifikace opírá o charakteristickou strukturu kostní tkáně. A A Obr. 23 Masný výrobek, dle Kossy A kostní úlomek (černě) (autoři) Obr. 24 Masný výrobek, alizarinová červeň A kostní úlomek (černě) (autoři) 15

Barvení tuků Pod označením lipidy rozumíme skupinu látek značně heterogenních. Obecně lze říct, že se jedná o látky, které lze z tkání a pletiv extrahovat pomocí organických rozpouštědel (např. éter, chloroform, benzen) a ve vodě jsou nerozpustné. Pro naše účely je lze rozdělit na lipidy neutrální, vosky, fosfolipidy a glykolipidy. Kapénky nacházející se v tukových nebo olejových buňkách patří mezi neutrální lipidy. Vosky jsou součástí kutikuly rostlin. Fosfolipidy jsou součástí buněčných membrán a membránových komplexů buněk. Glykolipidy se vyskytují zejména v mozkové kůře a na povrchu buněk. Pokud chceme prokázat lipidy, musíme se při zpracování vzorků vyvarovat použití organických rozpouštědel. Po fixaci ve vodných fixativech (např. 10% formaldehyd) se vzorek krájí na zmrazovacím mikrotomu. Po nakrájení následuje vlastní barvení a obarvené vzorky je nutné uzavírat do vodou ředitelných médií. Nejčastěji se používá glycerin-želatina, levulázové sirupy nebo sirup s arabské gumy. Pro barvení lipidů se používají barviva rozpustná v tucích a nerozpustná ve vodě. Na barvení tuku v potravinách se nejčastěji používají barvení sudanovými barvivy a olejovou červení. Obr. 25 Tuková tkáň, sudanová čerň tukové kuličky (černě) (autoři) Obr. 26 Tuková tkáň, olejová červeň tukové kuličky (oranžově) (autoři) Barvení sudanovými barvivy Je to skupina barviv, patří sem Sudan I, II, III, IV a sudanová čerň. Tato barviva jsou cílená především na neutrální tuky. Přibarvují však i tuky jiné povahy, proto je tato metoda především základní orientační metodou. Výsledkem barvení sudanovou černí je modročerně až černě zbarvený tuk, ostatní struktury jsou barveny do modra, výhodou je to, že obarví i drobné kapénky tuku (obr. 25). Výsledkem barvení Sudanem I IV je červeně zbarvený tuk, oranžově zbarvené ostatní struktury a modře zbarvená jádra. Barvení olejovou červení je dalším barvením na neutrální tuky, olejová červeň podobně jako sudanová čerň obarvuje drobné kapénky tuků. Výsledkem barvení je červenoranžově zbarvený tuk, oranžově zbarvení ostatních struktur a modrá jádra (obr. 26). Barvení celkových polysacharidů Sacharidy jsou hojně zastoupenou látkou v rostlinných pletivech a živočišných tkáních. Histochemickou detekci však nelze stanovovat monosacharidy a oligosacharidy, které se nachází v rozpustné formě. Během zpracovaní vzorků totiž dochází k jejich difuzi do používaných roztoků. V živočišných tkáních se nacházejí převážně jednoduché sacharidy, jejichž detekce není mikroskopickými metodami možná. Ty, které lze detekovat, jsou většinou spojeny s proteiny glykoproteiny. Glykoproteiny mají bílkovinnou složku, která je v převaze a nese kovalentně navázané dvou až šesti článkové oligosacharidy. Jedná 16

se zejména o proteiny séra, krevních skupin, sekreční produkty endo a exokrinních žláz a amyloid. Další polysacharidy živočišných tkání jsou glykosaminoglykany (mukopolysacharidy). Jsou tvořeny lineárními řetězci uronových kyselin a aminocukrů. U rostlinných surovin jsou sacharidy zastoupeny ve větší míře. Pro mikroskopickou identifikaci rostlinných pletiv mají rovněž význam zejména polysacharidy škroby, celulóza, hemicelulóza, pektiny aj. Pro identifikaci polysacharidů lze použít tři základní techniky vazbu bazických barviv, oxidační metody nebo aplikaci lektinů. Každý z uvedených postupů může být doplněn buď chemickou blokádou funkčních skupin (acetylace hydroxylů) nebo enzymatickou extrakcí mukosubstance (amyláza, hyaluronidáza, neuraminidáza). Mezi používaná bazická barviva pro identifikaci polysacharidů patří výše zmíněná toluidinová modř, dále také metylénová a alciánová modř. Alciánová modř se používá zejména na průkaz kyselých glykosaminoglykanů, které jsou zbarveny modrozeleně. Aplikace lektinů je principiálně podobná metodám imunohistochemickým. Lektiny jsou látky rostlinného, živočišného, nebo bakteriálního původu, které se selektivně vážou na terminální mono- a oligo- sacharid buněčných glykoproteinů, glykopeptidů a glykosaminoglykanů. Pro samotnou vizualizaci musí být na lektin navázán chromogen. Nejčastěji se používají fluorochromy. Mezi oxidační metody patří metoda využívající PAS reakce (Periodic Acid-Schiff s reagent), která může být úspěšně kombinovaná s jinými barvicími postupy (obr. 27). C B A Obr. 27 Střevo, PAS (dobarveno HE) mukopolysacharidy (růžově) (autoři) Obr. 28 Šunka, PAS-Calleja A kosterní svalovina (zeleně), B kolagenní vazivo (modře), C jádra (červeně) (autoři) Barvení PAS-Calleja Pro diagnostiku jednotlivých surovin v potravinách se hodí nejvíce kombinace PAS-Calleja. Toto barvení využívá oxidační metodu PAS s dobarvením dalších struktur cíleným barvením dle Callejy na průkaz kolagenu. Principem PAS reakce je oxidace 1,2-hydroxylových skupin hexóz, 1-hydroxy-2-amino- 1-hydroxy-2-alkylamino, 1-hydroxy-2-ketoskupin kyselinou. Nejčastěji je používána 1% kyselina jodistá. Oxidací vznikají aldehydy, jejichž přítomnost je prokázána pomocí Schiffova činidla. Pozitivní PAS reakce dává růžově červené až purpurově červené zbarvení. Výsledkem barvení jsou tedy celkové polysacharidy (včetně škrobu) růžově červené až purpurově červené zbarvené. Kolagenní vazivo je barveno modře, jádra jsou červené a svalovina zelená až žlutě zelená (obr. 28). V případě průkazu škrobu nebo glykogenu je vhodné dělat kontrolní řez, který je po dobu 30 minut vystaven působení amylázy nebo diastázy. Působení těchto enzymů dochází k jejich rozštěpení. Kontrolní řez 17

má být PAS negativní. V případě jiných polysacharidů, které jsou vůči amyláze rezistentní, je kontrolní řez naopak PAS pozitivní. Barvení škrobů Jodové roztoky Toto barvení je klasickou metodou pro průkaz škrobů. Hlavním limitem použití jodu je jeho rozpustnost ve vodě. Nejčastěji se používá jod rozpuštěný v škrobovém mazu, ale je možné také použít jod v alkoholovém roztoku jodová tinktura (obr. 29). Další možností použití tohoto barvení je barvení v jodových párách, zejména pro potraviny obsahující tepelně opracovaný (želatinizovaný škrob), který má tendenci se rozpouštět ve vodných roztocích jodu. B A B A Obr. 29 Bramborový a kukuřičný škrob, Lugol A bramborový škrob (hnědě), B kukuřičný škrob (světle hnědě) (autoři) Obr. 30 Mouka, trypanová modř A poškozený škrob (modře), B nepoškozený se nebarví (Flint, 1994) Trypanová modř Ve srovnání s jodovými roztoky trypanová modř barví jenom poškozená škrobová zrna. Trypanová modř patří do skupiny azobarviv, které se váží s některými polysacharidy (celulosa, škrob) vodíkovými můstky, kterou usnadňuje podlouhlý tvar molekul barviva. Podstatou barvení je, že poškozená škrobová zrna včetně škrobů želatinizovaných umožní přestup molekul barviva do škrobového zrna a navázání na molekuly amylózy a amylopektinu. Využití barvící metody je tedy vhodné při sledování změn v procesech mletí obilí. Další využití tohoto barvení je také v barvení plísní ať už kulturních nebo patogenních, kde se využívá vazba s celulózou. Poškozený škrob se barví modře, slabě poškozený škrob světle modře a nepoškozený škrob se nebarví (obr. 30). U plísní a celulózy je výsledná barva světle modrá a u lignifikované celulózy tmavě modrá. 3.2.3 Imunohistochemické metody (IHC) Imunohistochemie se rozvíjela z histochemie, a to zaváděním postupně objevovaných zákonitostí specifické imunologické reakce a s rozvojem její dostupnosti pro běžné laboratoře. Původní histochemie vznikala přibližně od 30. let dvacátého století na hranici histologie a analytické chemie a biochemie. Jejím cílem je identifikovat a lokalizovat chemické látky v místě jejich výskytu v tkáních na úrovni histologické či cytologické. 18

Základem pro imunohistochemické techniky byla možnost kovalentní vazby molekul imunoglobulinů s jinými molekulami, což se stalo předmětem výzkumu již ve 30. letech dvacátého století. Do patologické diagnostiky se tyto techniky dostávaly od 50. let a postupně byla zlepšována specifita, senzitivita a dostupnost stále širšího spektra metod, k čemuž napomohl i rozvoj molekulárního, proteinového a genového inženýrství nezbytný pro produkci reagencií potřebné kvality a kvantity. V 70. letech dvacátého století byly připraveny protilátky proti jednotlivým epitopům (antigenní determinantě), tzv. monoklonální protilátky. Do imunohistochemických metod spadají všechny techniky využívající mono- či polyklonální značené protilátky, kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáňové antigeny. Imunohistochemické metody jsou využívány zejména v medicínských oborech. V potravinářství lze tyto metody použít na průkaz rostlinných alergenů, průkaz nervové tkáně, typizaci svaloviny nebo typizaci kolagenu. Podle intenzity vazby a jejích násobku rozdělujeme imunohistochemické metody na metody přímé a nepřímé. Přímé metody využívají protilátky značené vizualizačním činidlem. Specifická vazba protilátek na antigen se uskuteční i tehdy, jestliže je antigen zabudován nebo tvoří součást organizovaných supramolekulárních struktur, jakými jsou v histologických řezech buňky a jejich různé komponenty včetně buněčných povrchů. Rozmístění označené protilátky se pak hodnotí ve světelném, flurescenčním nebo elektronovém mikroskopu. Podmínkou je, aby antigen byl ve tkáních v dostatečném množství, které umožní jeho detekci. V případě, že je ve tkáních antigenu málo, je vhodnější použít metody nepřímé, které zahrnují znásobení síly signálu vložením dalších stupňů do imunologické reakce. Podle stupně násobení dělíme tyto metody na dvoustupňové a třístupňové. U dvoustupňové metody je v prvním kroku použita neoznačená protilátka specifická proti zvolenému antigenu. Nazýváme ji primární protilátkou. Ve druhém kroku je použita značená protilátka proti protilátce primární (sekundární protilátka) nejčastěji proti Fc fragmentu imunoglobulinů zvířete, které bylo producentem primární protilátky. Třístupňové a vícestupňové metody slouží k ještě většímu zesílení signálu a jsou použity v případě, že množství antigenu v potravině je malé nebo byla snížená jeho antigenicita například z důvodu tepelného opracování, mechanického namáhání nebo působením kyselin či konzervačních látek. U těchto metod je podobně v prvním kroku použita primární protilátka proti prokazovanému antigenu. Ve druhém kroku je použita také neznačená protilátka (sekundární) proti protilátce primární. Sekundární protilátku je nutno přidávat v nadbytku, aby nebyla vazebně vysycena obě její ramena (Fab fragmenty IgG molekuly), což by poskytlo falešně negativní výsledek. Ve třetím kroku použijeme značený komplex. Hlavní částí komplexu je enzym, který v dalších krocích reaguje s barvivem (chromogenem). Z enzymů se používá zejména křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Další součástí komplexu jsou spojovací látky. Může se jednat o protilátku s reaktivitou se sekundární protilátkou nebo je využita specifická aktivita jiných látek jako jsou například avidin a biotin. Právě metody využívající specifické vazby avidinu nebo streptavidinu (produkt bakterií) s biotinem představují v současnosti nejcitlivější imunohistochemické metody. Pro nepřímé imunohistochemické metody je výhodnější k identifikaci cílové součásti fluorescenční mikroskop, z důvodu snadnější kvantifikace výsledků a také vysoká míry detekce. Imunohistochemické metody se používají v potravinách pro lokalizaci látek s antigenními vlastnostmi (specifické proteiny) - součásti svaloviny jako jsou aktin, myosin nebo kolagen, suroviny z mléka (např. syrovátkové bílkoviny v masných výrobcích) nebo z vajec. Touto metodou lze dále identifikovat rostlinné bílkoviny (sójové, pšeničné aj.) na základě výraznějšího zvýraznění pomocí vazby značených specifických protilátek a DAB chromogenem oproti dobarvenému pozadí. Při kombinaci tohoto barevného systému s dalším, např. s BCIP/NBT chromogenem, pak lze metodou dvojího značení souběžně vyšetřovat přítomnost dvou bílkovin během jednoho vyšetření. Imunohistochemická metoda má však 19