Fluorescenční vyšetření rostlinných surovin 10. cvičení
Cíl cvičení práce s fluorescenčním mikroskopem detekce vybraných rostlinných surovin Princip nepřímé dvojstupňové IHC s použitím fluorochromu
Fluorescenční mikroskopie umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce - tedy světlem jiné barvy - fluorescence. je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením.
Princip fluorescenční mikroskopie Princip - vazba fluorochromu na určitou buněčnou složku (polysacharid, protein), která pak např. v modrém budícím světle září světlem žlutým. Aby modré světlo budící fluorescenci nevadilo při pozorování, musí být odstraněno bariérovým filtrem. Ten pohltí modré světlo vycházející z preparátu do objektivu a do okuláru propustí jen světlo žluté. Výsledkem je tedy obraz žlutě zářících struktur v temném poli.
Princip konstrukce fluorescenčního mikroskopu
Fluorescenční mikroskopie v odraženém světle (epifluorescence) Dichroické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem ke vzorku, propouští ostatní vlnové délky a také odráží osamocené paprsky excitačního světla zpět ve směru zdroje. Bariérový filtr zachytí zbytky excitačního světla, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu.
Pracovní postup fluorescenčního vyšetření zapněte fluorescenční mikroskop zapněte zdroj světla umístěte preparát na posuvný stolek na mikroskopu nastavte filtr na pozici 2 zvolte zvětšení zaostřete sledovanou strukturu sledovaná struktura fluoreskuje na černém pozadí
Preparáty ke studiu Majoránka Cibule Kmín Bramborový škrob Mouka hladká Mouka polohrubá Sójová bílkovina
Majoránka Mikroskopické znaky pokožka - na líci listu ploché buňky, na rubu průduchy a je tvořena laločnatými tabulovými buňkami trojí chlupy - kuželovité štíhlé chlupy dvoubuněčné až čtyřbuněčné, paličkovité chlupy s jednobuněčnou nebo dvoubuněčnou paličkou a žláznaté chlupy s jednobuněčnou stopkou a paličkou složenou z více sekrečních buněk, nad nimi je sekreční měchýřek se silicí. charakteristická je pokožka semeníku s tlustostěnnými buňkami se zvrásněným povrchem.
Majoránka- zvětšeno 100x
Cibule Mikroskopické znaky pokožka na šupinách ze silně protáhlých buněk pod pokožkou je hypoderm ze šestibokých buněk, v řadách a kolmo k protáhlým buňkám pokožky téměř každá buňka obsahuje na konci krystalek šťavelanu vápenatého v náhodném řezu se buňky parenchymu podobají tukové tkáni cévní svazky jsou v řadě a jsou obklopeny buňkami, které obsahují olej
Cibule- zvětšeno 100x
Kmín Mikroskopické znaky : pokožka parenchym s velkými cévními svazky endosperm - tenkostěnné buňky s obsahem tuku a aleuronových zrn
Kmín- zvětšeno 50x
Bramborový škrob Mikroskopické znaky největší zrna ze všech domácích škrobů (70-100 µm) vejčitá nebo eliptická s jádrem excentricky uloženým v užším konci a se zřejmým mimostředným vrstvením někdy se vyskytují zrna podvojná a potrojná
Bramborový škrob-zvětšeno 400x
Pšeničná mouka Pšeničný škrob- mikroskopické znaky zrna jsou dvojí - velká a malá zrna čočkovitého tvaru velká zrna mají velikost 12-41 µm, uprostředje slabě zřetelné jádro a téměř nepatrné centrické vrstvení malá zrna jsou velká 2-8 µm
Mouka hladká-zvětšeno 200x
Mouka polohrubá-zvětšeno 200x
Sójová bílkovina Mikroskopické znaky nemá strukturu, ale má formu tvar - houbovité, popř. srpovité až kruhovité částice
Sójová bílkovin-zvětšeno 200x
Další vzorky ke studiu: Karagenan Zázvor-škrob Skořice Vláknina Kukuřičný škrob
Další příklady využití fluorescenční mikroskopie
Fluorescence listů huseníčku Fluorescence poskytuje užitečné informace o stavu fotosyntetického aparátu uvnitř buněk. Biologové svítí na rostlinu přesně definovaným způsobem a měří fluorescenci. Ze získaných dat pak mohou posoudit, nakolik je rostlina poškozena stresem. Stresy podstatně snižují výnos zemědělských plodin. Proto jsou hledány způsoby, jak zlepšit odolnost rostlin vůči nim: například zvýšením obsahu přirozených ochranných látek (antioxidantů) nebo změnami hladin hormonů.
Fluorescence listů huseníčku Na fotografii vidíte listy huseníčku. Pokusné rostliny byly na pět dnů vystaveny teplotě 5 C. Potom byla kamerou snímána fluorescence listů. Barvy ukazují její intenzitu. Oblasti nejvíce poškozené chladem jsou modré, nejméně postižené jsou červené.
Princip IHC s použitím fluorochromu
Imunohistochemické metody Základním cílem imunohistochemických metod je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, t.j. na principu vazby antigenu a protilátky. Tuto vazbu si můžeme obrazně představit jako vztah specifického klíče (protilátky, která je zpravidla volná) k zámku (tkáňovému antigenu, který je zpravidla pevně fixován na určitou strukturu, např. na povrch buňky.
Nepřímá dvojstupňová IHC Nepřímé IHC metody jsou ve srovnání s přímými sice komplikovanější, ale výhodou je, že mohou být mnohem citlivější. Na tkáňové řezy se nejprve aplikuje neoznačená protilátka (imunoglobulin) nebo sérum, které jsou specifické proti prokazovanému antigenu a nazýváme je primární protilátkou. Ve druhé vrstvě nanášíme protilátku proti Fc-fragmentu imunoglobulinu zvířete, které bylo dárcem primární protilátky. Druhá (sekundární) protilátka je značená fluorochromem nebo enzymem a imunologickou vazbou se váže na protilátku primární.
Nepřímá dvojstupňová IHC Postup: rostlinný či živočišný materiál nakrájet napínání řezu fixace v acetonu blokace pozadí (nespecifické vazby) vazba primární protilátky vazba sekundární protilátky barvení preparátů-fluorochrom montování preparátů
Pšeničný protein v masném výrobku Zvětšeno 200x Barveno: Texas red
Děkuji za pozornost