HPLC systémy. Věra Schulzová

Podobné dokumenty
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) HPLC = high performance liquid chromatography high pressure liquid chromatography

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Principy chromatografie v analýze potravin

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

HPLC v analýze potravin a přírodních produktů. Věra Schulzová

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá

Selektrivní distribuce anlytu mezi rozpouštědlo a adsorpční povrch stacionární fáze. Konkurence na povrchu sorbentu: analyt versus solvent

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Gelová permeační chromatografie

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Separační metody v analytické chemii. Kapalinová chromatografie (LC) - princip

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC

ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC)

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková

mobilní fáze pohyblivá - obsahuje dělené látky, které mají různou afinitu ke stacionární fázi.

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková. záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN 2) GFP

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

HPLC v analýze potravin a přírodních produktů

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Struktura. Velikost ionexových perliček Katex. Iontová výměna. Ionex (ion exchanger) Iontoměnič Měnič iontů. Katex (cation exchanger) Měnič kationtů

Trendy v moderní HPLC

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Úvod do vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Kapalinová chromatografie - LC

HPLC v analýze potravin a přírodních produktů

Chromatografie. Petr Breinek

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ RIGORÓZNÍ PRÁCE

Opakování

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Úvod do vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Hydrofobní chromatografie

nejdůležitější a nejčastější analytická a preparační metoda v biochemickém výzkumu dělení látek mezi dvěma fázemi

isolace analytu oddělení analytu od matrice (přečištění) zakoncentrování analytu stanovení analytu (analytů) ve vícesložkové směsi

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, Vysoké Mýto

IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE. Jana Sobotníková

Skupenské stavy. Kapalina Částečně neuspořádané Volný pohyb částic nebo skupin částic Částice blíže u sebe

Co je proteomika? Proteom? Protein? Experimentální strategie proteomiky Vlastnosti AMK a proteinů

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech

Kapalinová chromatografie: KOLONY - Nové trendy

CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní).

Kapalinová chromatografie

Teorie chromatografie - I

II. Chromatografické separace

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

1. ročník Počet hodin

PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE

OPVK CZ.1.07/2.2.00/

EXTRAKČNÍ METODY. Studijní materiál. 1. Obecná charakteristika extrakce. 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE. 3. Alkalická hydrolýza

Kapalinová chromatografie - LC

Problematika separace uranu z pitné vody

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Repetitorium chemie IV (2014)

Ionexová chromatografie

Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice Listopadu, 2012

NÁPLŇOVÉ KOLONY PRO GC

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Pentachlorfenol (PCP)

Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie)

TYPY KOLON A STACIONÁRNÍCH FÁZÍ V PLYNOVÉ CHROMATOGRAFII

LEKCE 2b. NMR a chiralita, posunová činidla. Interpretace 13 C NMR spekter

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli)

Chirální separace v CE

Extrakce vzorku tuhou fází. Izolační a separační metody, 2018

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Principy řízených extrakcí nox z biologického materiálu pro různé typy toxikologických analýz. Význam správné přípravy vzorku pro konečný výsledek

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Chromatografie. Petr Breinek. Chromatografie_2011 1

Cvičení KATA Analytická chemie Chromatografie

Chromatografické metody

Mobilní fáze. HPLC mobilní fáze 1

Historie. Ruský botanik Michail S. Cvět (Tswett) objevitel chromatografie na přelomu 19. a 20. stol. Dělení rostlinných pigmentů na barevné pásy

Průvodka. CZ.1.07/1.5.00/ Zkvalitnění výuky prostřednictvím ICT. III/2 Inovace a zkvalitnění výuky prostřednictvím ICT

Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Ústav organické technologie. Václav Matoušek

EXTRAKČNÍ METODY používané pro stanovení lipofilních a hydrofilních látek. Mgr. Romana Kostrhounová, Ph. D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.

Při reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma fázemi První ucelená teorie respektující uvedenou skutečnost byla

VÝUKOVÝ MODUL MEMBRÁNOVÝCH PROCESŮ TÉMATA PŘEDNÁŠEK

Historie. Ruský botanik Michail S. Cvět (Tswett) objevitel chromatografie na přelomu 19. a 20. stol. Dělení rostlinných pigmentů na barevné pásy

Sekunda (2 hodiny týdně) Chemické látky a jejich vlastnosti Směsi a jejich dělení Voda, vzduch

Stereochemie 7. Přednáška 7

VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE. Jana Sobotníková

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a

V současné době stoupá význam analýz glykoproteinů (většina proteinů je glykosylována). Při jejich analýze se využívá hmotnostně spektrálních metod.

Mezimolekulové interakce

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Superkritická fluidní extrakce (SFE) Superkritická fluidní extrakce

Částicové složení látek atom,molekula, nuklid a izotop

[ A] 7. KAPITOLA CHROMATOGRAFIE K =

Transkript:

HPLC systémy Věra Schulzová

Systémy HPLC I. Systémy s normálními fázemi - polární stacionární fáze, lepší selektivita pro separaci polohových isomerů než systémy s obrácenými fázemi, méně vhodné k dělení látek, které se liší pouze velikostí alkylů, pro vzorky obsahující středně a málo polární látky x HILIC polární stacionární fáze (silika, modifikovaná silika, aminopropyl, CN), polární mobilní fáze (voda, acetonitril) analyty ionogenní i neionogenní, polární, ve vodě rozustné II. Systémy s obrácenými fázemi - nepolární či slabě polární fáze chemicky vázané na povrchu anorganického nosiče, nejčastěji oktadecylovaného či oktylovaného silikagelu, ale i chemicky vázané fenylové či nitrilové fáze, případně i organické polymerní sorbenty s hydrofobním povrchem. III. Iontovýměnná chromatografie - používají se měniče iontů s chemicky vázanými ionto výměnnými skupinami na povrchu silikagelu nebo ionexy s vhodně modifikovanou organickou polymerní matricí, nejčastěji na bázi styren-divinylbenzenového kopolymeru či hydrofilních gelů. IV. Gelová chromatografie - kolony plněné hydrofilními lipofilními gely s definovanou distribucí velikosti pórů, do nichž mohou molekuly pronikat různě hluboko podle velikosti. V. Afinitní chromatografie - využívá biospecifických interakcí mezi dvojicemi látek. 2

Molecular weight Chromatografické systémy Increasing polarity Selection of chromatographic configuration depends on physicochemical properties of the analyte: Analyte solubility Analyte polarity Analyte weight 10 2 10 3 Water-insoluble Non-polar Adsorption Normal phase LC (Reversed phase partition) Non-ionic polar Partition (Normal phase partition) Water-soluble HILIC Ionic Ion exchange Reversed phase LC Ion exchange 10 4 Only weak interactions with stationary phase are required (analytes have to go throught the column) 10 5 (Gel permeation) Exclusion (Gel filtration) 10 6 3

LC separace retenční mechanismy Hlavní typy interakcí v kapalinové chromatografii retence = kombinace mechanismů Hydrofobní interakce (van der Waalsovy síly) O P O H C H 3 C 3 OH C H 3 Polární interakce Interakce dipol - dipol N O H HO OH H 3 C Vodíková vazba C H 3 O Polární interakce O H O H π-π interakce Elektrostatické interakce (iontové) H 3 C N + CH H 3 3 C O - O S O 4

HPLC systém Stacionární fáze IONIC HYDROPHOBIC POLAR SCX strong cation exchange SAX strong anion exchange Silica bare silica phase CN cyanopropyl phase NH 2 amino phase F5 pentafluorophenyl phase Phenyl butyl-phenyl phase C 4 butyl phase C 8 octyl phase C 18 octadecyl phase 5

Adsorpční a rozdělovací kapalinová chromatografie Stacionární fáze tuhé stacionární fáze mohou být z hlediska velikosti a pórovitosti: klasické pórovité (velikost 25-80 m) pelikulární (film polymerní stacionární fáze je nanesen na povrchu kulové částice anorganického nosiče) povrchově pórovité (na neporézní jádro je nanesena pórovitá vrstva anorganického materiálu případně s chemicky vázanou stac. fází průměr 25-80 m) pórovité mikropartikulární (průměr 2-20 m): vysoký specifický povrch vysoká kapacita, retence a účinnost ale u velmi malých částic vysoký odpor vysoký pracovní tlak 6

Princip separace Adsorpční chromatografie Rozdíly v adsorční affinitě složek vzorku anorganické sorbenty Al 2 O 3, SiO 2 etc. normal phase chromatografie. Rozdělovací chromatografie Rozdíly v různé rozpustnosti složek mezi mobilní a stacionární fází normální i reverzní stacionární fáze 7

Více než 90% aplikací (HPLC separací) v analýze potravin na REVERZNÍ STACIONÁRNÍ FÁZI 8

Chromatografie : přímá x reverzní fáze Srovnání chromatografie v přímé a reverzyní fázi 9

Výběr chromatografického systému Normal phase Chromatography Reversed Phase Chromatography HILIC Chromatography Ion Exchange Chromatography Stationary phase Polar (silica, alumina, florisil, MgO) Non-polar modified silica (CN, C8, C18, phenyl) Polar (silica, modified silica (aminopropyl, CN)) Ionic (Resins with bonded ionic groups Mobile phase Non-polar (hexan, dichlormethan, tetrahydrofuran, ethylacetate) Polar (water, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran) Polar (water, acetonitrile) Ionic water (up to 50% organic) with buffers (NaHCO3, NaOH ) Analytes Non-polar and water insoluble Non-polar and polar Podobné se rozpouští v podobném Ionic and nonionic polar, water soluble analytes Ionic, organic and anorganic bases and acids Nepolární látky se lépe rozpouští v nepolárních rozpouštědlech a adsorbují na nepolárním povrchu Polární látky se lépe rozpouští v polárních rozpouštědlech a adsorbují na polárním povrchu 10

Chromatografie na polárních stacionárních fázích = chromatografie na normální fázi Adsorpční chromatografie, -OH na povrchu silikagelu jsou aktivní místa (nebo Al 3+ a O 2- pokud je použit oxid hlinitý). Typy interakcí: dipole-induced dipole, dipole-dipole, hydrogen bonding, π- complex bonding Vysokou afinitu k polární stacionární fázi mají polární analyty (největší retence). Adsorpční síla (k) roste v následujícím pořadí: saturated hydrocarbons < olefins < aromatic halogenated compounds < suphides < ethers < nitro compounds < esters aldehydes ketones < alcohols amines < suphones < suphoxides < amides < carboxylic acids Mobilní fáze je nepolární rozpouštědlo nebo směs několika nepolárních rozpouštědel. Eluční sílu mobilní fáze lze odhadnout podle postavení příslušného rozpouštědla v tzv. eluotropní řadě rozpouštědel viz. dále Retenci látek na polárním adsorbentu lze ovlivnit nejen druhem mobilní fáze, ale také aktivitou adsorbentu, která souvisí se zbytkovým obsahem vody adsorbentu. 11

signal Chromatografie na normální fázi Polární látky jsou eluovány později než nepolární (lypofilní) Lipophilicity 1 2 3 CH 3 1 2 3 2 3 1 OH 1 2 3 OH OH void 1 2 3 OH time H 3 C OH C H 3 OH H 3 C Polarity 12

Nepolární REVERZNÍ stacionární fáze Rozdělovací chromatografie nepolární sorbenty: uhlí, polyamidy, polystyreny nepolární chemicky vázané fáze, které vznikají chem. modifikací silikagelu (tj. kovalentní vazbou hydrofobních skupin na silanolové skupiny povrchu); nejčastěji požívané typy jsou: oktadecylovaný silikagel (SiC18) oktylovaný silikagel (SiC8) silikagel hydrofobizovaný vazbou fenylové skupiny (SiPhe) Hlavní interakce hydrofobní (van Der Waals interaction), retence je ale komplexem mechanismů Eluční pořadí: Strong Lewis acids (carboxylic acids) < Weak Lewis acids (alcohols, phenols) < Strong Lewis bases (amines) < Weak Lewis bases (ethers, aldehydes, ketones) < permanent dipoles (CHCl 3 ) < induced dipoles (CCl 4 ) < aliphatics Retence roste s počtem atomů uhlíku v molekule: Pentan < Hexan < Heptan 13

Chromatografie na nepolárních stacionárních fázích = chromatografie na obrácené (reverzní) fázi Na nepolární stacionární fázi (např. na oktadecylovaném silikagelu) je chování analytů opačné vzhledem k chování na silikagelu. Jako mobilní fáze se používá směs polárních rozpouštědel: voda-metanol, voda-acetonitril, voda-isopropylalkohol, vodná složka může obsahovat rozpuštěnou látku (sůl, kyselinu ) Chromatografie na obrácené fázi je dnes mnohem častěji aplikována, než chromatografie na normální fázi. Důvodem jsou menší problémy (vyšší teploty varu a menší hořlavost rozpouštědel). Optimálního rozlišení a přijatelné doby analýzy se dosahuje použitím gradientové eluce (v tomto případě dochází ke zvýšení eluční síly mobilní fáze zvýšením podílu méně polární složky a snížením obsahu vody v mobilní fázi) 14

signal Chromatografie v reverzní fázi Polární látky jsou eluovány dříve než nepolární Lipophilicity 3 2 1 CH 3 3 2 1 2 3 OH 3 2 1 OH 1 OH void H 3 C 3 2 1 OH C H 3 OH H 3 C OH time Polarity 15

Separace interakce, které ovlivňují relativní retenční čas jednotlivých složek vzorku 16

Iontově výměnná chromatografie Separace založena na rozdílech v ion-exchange afinitě složek vzorku. Negativně nabité sorbenty interagují s kationty (katex). Pozitivně nabité sorbenty tvoří vazby s anionty (anex). katexy (měniče kationtů) silně kyselé: funkční skupiny SO 3- H + (v H + cyklu) slabě kyselé: funkční skupiny COO - H + (v H + cyklu) anexy (měniče aniontů) silně bazické: funkční skupiny,nh 3+, CH2 N+R3 Cl- (v Cl- cyklu) slabě bazické: funkční skupiny např. NR 3 +,- NH+R2 Cl- (v Cl- cyklu) 17

18

Iontově výměnná chromatografie Typické aplikace - Organické látky Nabité biomolekuly (velké proteiny, malé nukleotidy), bílkoviny, peptidy stanovení aminokyselin (detekce pokolonovou derivatizací s ninhydrinem ) dělení peptidů a bílkovin (podle isoelektrického bodu) stanovení monosacharidů a oligosacharidů Stanovení velmi polárních pesticidů (glyphosate, ethephone, quarternary amines) Základní princip Iontové interakce vzorek a rozpouštědlo soutěží o aktivní místa Přitažlivé síly mezi molekulami nesoucími nabité skupiny opačného znaménka jsou v HPLC používány dvěma způsoby: Ion Pairing - malé molekuly, technika může být použita ve spojení s reverzní chromatografií Ion Exchange Chromatography nabité částice (matrice) se reversibilně naváží na molekuly vzorku (bílkoviny ). Desorpce je docíleno zvýšením koncentrace solí nebo alternativně pomocí ph mobilní fáze. Iontové měniče obsahující diethyl aminoethyl (DEAE) nebo karboxymethyl (CM) skupiny jsou nejčastěji používány v biochemii. 19

Iontově výměnná chromatografie Stacionární fáze: Měniče iontů (ionexy) jsou stacionární fáze na bázi organických polymerů (styren-divinylbenzenové, methakrylátové polymery) s kovalentně vázanými polárními funkčními skupinami (kyselými nebo bazickými), které mohou vlastní proti iont (counterion) vyměňovat s iontem v mobilní fázi Silikagel méně vhodný užívá se široké rozmezí ph Silné iontoměniče jsou nabité v celém rozsahu ph, není vliv ph mobilní fáze. Kapacita slabých intoměničů je závislá na ph. Disociovaná aktivní centra mohou interagovat s analyty. ph < pka ph > pka ph pka a) Undissociated cation exhcanger b) Dissociated cation exchanger c) Partly dissociated cation exchanger 20

Iontově výměnná chromatografie Mobilní fáze: Většinou se skládá většinou z vody (do 50% organického rozpouštědla) s counter-ion. Retence klesá s vyšší iontovou silou mobilní fáze (koncentrací conter ion). Nárůst ph redukuje retenční čas při výměně kationtů. Naopak snížení ph snižuje retenční dobu při výměně aniontů. Eluce je založena na rostoucí síle mobilní fáze (koncentrace the conter ion). Profil kapacity pro iontově výměnnou separaci 21

Pořadí eluce při iontoměničové chromatografii je určeno hustotou náboje (náboj/radius) hydratovaného iontu 22

V organických kyselinách a bázích je eluční pořadí určeno jejich pka nebo pkb (síla kyseliny nebo báze). 23

Reversed Phase Chromatography Separation of ionic compounds Ion-Pair Chromatography Method of choice, when neutral and ionic compounds have to be analysed togehter. Reversed-phase chromatography with counter ion in mobile phase (neutral compounds are not influenced). + & - + - Analyte Counter ion Ion-pair Ion-pairs are separated as neutral molecules. - & + - + Analyte Counter ion Ion-pair 24

Reversed Phase Chromatography Separation of ionic compounds Ion-Pair Chromatography Common ion-pair agents: Counter ion Quarternary amines (tetramethylammonium, tetrabutylammonium, palmityltrimethylammonium) Tertiary amines (trioctylamine) Alkyl- and arylsulphonates (methanesulphonate, heptanesuphonate) Perchloric acids Perfluoric acids Suitable for Strong and weak acids, sulphonated dyes, carboxylic acids Sulphonates Strong and weak bases, benzalkonium salts, catecholamines. Strong ion pairs with basic compounds Strong ion pairs with basic compounds Ion-Pair chromatography is not suitable for LC-MS applications, since stable ionpairs do not provide ions and sensitivity is significantly compromised. 25

Stanovení anorganických iontů iontovou chromatografií Detekce: vodivostní, vodivostní se supresorem, spektrofotometrická (pokolonová derivatizace) nepřímá spektrofotometrická Kationty: dělení na katexu Ni, Mn, Co, Cu, Fe, Zn lze dělit na anexu ve formě chlorkomplexů (postupná eluce roztoky HCl s klesající koncentrací) Anionty: dělení na anexu, eluce roztokem NaOH (gradient) nebo NaHCO 3 +Na 2 CO 3 Typy látek, které mohou být stanoveny metodou iontové chromatografie: Anorganické ionty jako Cl-, Br-, SO42- etc. Anorganické kationty Organické kyseliny Organické báze Ionogenní organo-kovové sloučeniny 26

Chirální stacionární fáze Výměna ligandů p-donor p-akceptor Chiral Host-guest (cyclodextrin) Imobilizované bílkoviny Imobilizované polysacharidy Stereoizomery - jedinečná konfigurace - enantiomery a diastereomery Chirální molekula - má zrcadlový obraz, který se s ní nekryje - enantiomer. Enenatiomery = optické izomery (antipody) Separace enantiomerů - chirální chromatografie: Separace derivátu, který se získá reakcí chirální molekuly s chirálním derivatizačním činidlem chirální derivatizace Separace diastereomerů pomocí konvenční HPLC - nepřímá metoda chirální separace Přímé metody chirální separace - tvorba přechodných diastereomerních komplexů mezi chirálním selektorem a chirálním solutem (na stacionární nebo mobilní fázi) 27

Afinitní chromatografie Vysoce specifická chromatografie molekuly jsou rozpoznávány činidlem vázaným na stacionární fázi a vytěsňovány rozpouštědlem. Princip klíč zámek podobný jako u reaktivity enzymů 28

Vylučovací chromatografie Separace podle hydrodynamického objemu molekul porézní neadsorbující materiál s póry přibližně stejné velikosti jako rozměry molekul, které mají být odděleny vylučovací limit. Separace molekul na základě jejich molekulové velikost molekulové síto. Větší molekuly (větší molekulová hmotnost) se eluují dříve 29

Gelová chromatografie Systém je kalibrován použitím standardů o známé molekulové hmotnosti. Neznámé molekuly - určení jejich velikostní distribuce z kalibrační křivky. Retenční čas je úměrný logaritmu molekulové hmotnosti 30