Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 9 Kolony a stacionární fáze Kolony pro HPLC Většina HPLC kolon je zhotovena z nerezové oceli 316, jedná se o chrom-niklmolybdenovou ocel, odolnou k běžným tlakům v HPLC a relativně inertní i vzhledem ke korozi (chloridové a lithné ionty jsou výjimkou). Vnitřní povrch kolon by měl být hladký, takže ocel musí být pečlivě vrtána, leštěna, nebo elektro-leštěna po běžné výrobě. Skleněné trubice mohou být také použity jako chromatografické kolony. Jsou chemicky inertní a nekorodují. PEEK, je tlakově odolný plast použitelný nejen pro výrobu kapilár, ale i HPLC kolon. Flexibilní polyethylenové trubice představují speciální typ kolonových systémů (Waters). Stěny kolony mají snahu se přizpůsobit stacionární fázi a zamezit tak vzniku kanálků u stěn kolony. Kolony s vnitřním průměrem 2 5 mm jsou obecně používané pro analytické aplikace. Kolony s větším vnitřním průměrem mezi 10 mm a jedním palcem (25,4 mm) mohou být použity pro preparativní účely. Některé firmy nabízejí i kolony o větších průměrech i 30 cm a více. Mikro a kapilární kolony mají vnitřní průměr do 1 mm. Kolony délek 5, 10, 15 nebo 25 cm jsou nejběžnější pokud jsou plněny tzv. mikropartikulárními stacionárními fázemi s velikostí částic 10 a méně mikrometrů. Pokud je nutné dosáhnout většího počtu pater, je vhodnější aplikovat menší částice sorbentu než delší

2 kolonu. Delší kolona prodlužuje retenční čas, koncentrace analytu v eluovaném píku je nižší a zhorší se limit detekce. Nicméně pro preparativní separace je běžná délka kolon do 1 m. Obrázek níže znázorňuje různé konce kolon. První komerční kolony měly koncovky se zakončením dle schématu A. Tato konfigurace je schopna vydržet léta, pokud není závit příliš dotažen. Typ B je novější uspořádání než typ A. Verze C je kartridžový design. Kolona jako taková nemá žádné koncovky, je proto levnější, dá se snadno vyměnit bez užití nástrojů a je možno jich spojit několik za sebou (s použitím adaptéru) bez vzniku mimokolonových prostor. Kolona je uzavřena nerezovými fritami menších rozměrů/pórů než je velikost částic sorbentu. Standardní rozměr pórů frity je 2.0 µm, ale pro částice 3,5 µm a menší, je třeba frity s póry rozměru 0.5 µm. Pokud je frita ucpána je nejlepší ji vyměnit; pokud to nejde provést, je vhodné zkusit čištění ultrazvukem. Výhody kolon s malým průměrem Kolony s malým vnitřním průměrem nabízí dvě hlavní výhody vzhledem ke kolonám s větším průměrem: (a) Menší spotřeba rozpouštědel (méně odpadů). Retenční objem V R je úměrný čtverci vnitřního průměru kolony, d c : V R ~ d 2 c (protože V R 2 εdc πlc = ( k + 1). 4

3 Pokud je potřeba 10 ml mobilní fáze k eluci analytu na koloně o vnitřním průměru 4.6 mm, odpovídá to: 4.8 ml na kolně 3.2 mm i.d., 1.9 ml na koloně 2.0 mm i.d., 0.5 ml na koloně 1.0 mm i.d., (20x méně rozpouštědla!). (b) Lepší poměr výšky signálu k hmotnosti analytu. Koncentrace látky v maximu píku c max je úměrná obrácené hodnotě čtverce vnitřního průměru kolony, d c : c max = 1/d c 2 (protože c max civi N =, a V R ~ d 2 c ) V 2π R Když např. 1 µg analytu poskytne signál o výšce 0.1 mv na koloně o i.d. 4.6 mm, pak to odpovídá: 0.21 mv na 3.2 mm i.d. koloně 0.53 mv na 2.0 mm i.d. koloně 2.1 mv na 1.0 mm i.d. koloně (signál 20x větší!). Předkolony Jak je znázorněno na obrázku dole rozlišují se dva typy předkolon. Předkolony umístěné před nástřikovým ventilem jsou užívány kondicionaci mobilní fáze. Jejich náplně jsou částečně rozpouštěny, takže tento typ je označován jako scavenger

4 column. Každý solvent mírně rozpouští silikagel a tento efekt se zvětšuje se zvýšením jeho polarity a zvýšením iontové síly a ph mobilní fáze. Scavenger column naplněná hrubými částicemi silikagelu se využívá k ochraně separační kolony před rozpouštěním její stacionární silikagelové náplně. Tím je dosaženo nasycení mobilní fáze rozpuštěnými produkty z předklony a prodloužena životnost separační kolony. Na druhou stranu, krátké guard ochranné kolony se používají k ochraně mezi injektorem a hlavní kolonou. Tyto předklony jsou většinou plněny stejným nebo velmi podobným sorbentem, jaký je v hlavní koloně a jejich smyslem je zabránit vstupu nečistot a silně zadržovaných látek ze vzorku přímo na analytickou kolonu. To je zvlášť důležité pokud jsou analyzovány biologické vzorky. Pokud je ochranná kolona dobře vybrána a instalována, neovlivňuje separační schopnosti hlavní kolny. Ochranné předkolony jsou měněny pravidelně po určité době nebo po jistém počtu nástřiků, a tím je opět prodlužována životnost separační kolny. Obecné vlastnosti stacionárních fází Vysoké počty pater jsou dosahovány jen když je zajištěna krátká difuzní dráha v pórech stacionární fáze; proto jsou v HPLC preferovány mikročástice. Molekuly vzorku nemohou penetrovat více než 2.5 µm v částici o velikosti 5 µm. Dva chromatogramy na obrázku níže ukazují, jak se zvýší výkonnost systému použitím malých částic sorbetu. kolona plněná částicemi s rozměrem 10 µm musí být 20 cm dlouhá (dole), aby poskytla účinnost 7000 teoretických pater, na druhou stranu kolona se sorbentem 3 µm poskytuje stejnou účinnost při délce jen 6 cm. Analýza na delší koloně přitom trvá 15 min a na kratší jen desetinu uvedené doby. Tento efekt velké úspory času je dán jednak kratší kolonou, ale i tím, že minimum van Deemterovy závislosti leží při vyšších lineárních průtocích pro částice malých rozměrů ve srovnání se sorbenty s větší velikostí částic. Avšak, je třeba také zmínit, že tlak na koloně plněné sorbentem menšího zrna bude 10 x vyšší než na hrubším materiálu. Velikostní distribuce sorbentu by měl být co nejužší (s poměrem velikosti nejmenší k největší velikosti částic 1:1.5 nebo 1:20), protože nejmenší částice určují permeabilitu kolony a největší možnou účinnost kolony. Malé částice způsobují velký odpor proti proudění kapaliny a velké jsou důvodem velkého rozmytí píků. Z těchto důvodů je u řady komerčních sorbentů uvedena i velikostní distribuce částic.

5 Velikostní distribuje ale většinou neříká nic o rozměrech částic s extrémními velikostmi. V současnosti se v HPLC používají nejrůznější typy stacionárních fází: porézní částice, neporézní částice malých rozměrů, částice mající porézní vrstvu a monolitické materiály. Porézní částice Jedná se o obvyklý typ HPLC stacionárních fází. Tyto materiály jsou velikosti 1,8; 3,0; 3,5; 5,0 nebo 10 µm. Platí, že účinnost vztažená na jednotku délky kolony vždy vzroste přibližně 2 x při poklesu velikosti částic z 10 na 5 a z 5 na 3 µm, tlak přitom vzroste pokaždé přibližně 4 x. Vnitřní struktura částic je plně porézní. Uvnitř pórů mobilní fáze skoro neproudí a analyt se pohybuje především difúzí. Neporézní částice, částice malých rozměrů Pokud je stacionární fáze neporézní, složka odporu proti přenosu hmoty ve stacionární fází přispívající k rozmývání píků, tj. složka C van Deemterovy závislosti, úplně zmizí nebo je malá, protože analyt nedifunduje do vnitřního prostoru částic. Důsledkem je velmi plochá van Deemterova závislost v pravé části s minimem posunutým k velkým lineárním rychlostem, rychlá chromatografie se tak dá provozovat bez ztráty separační účinnosti. Kapacita sorbentu je ale zhruba 50 x menší než u konvenčního plně porézního sorbentu a tlak na koloně je vysoký. Retenční objem píků je nízký, protože póry v sorbentu neexistují; frakce kapaliny v koloně (potozita kolony ε) je jen asi 0.4 ve srovnání s kolonou naplněnou klasickým porézním materiálem, tam je kolonová porozita kolem 0.8. Proto musí být mimokolonové objemy a časová konstanta velmi malé. Chromatografie biopolymerů bývá na tomto typu

6 sorbentů poměrně výhodná vzhledem ke zmenšení potíží s denaturací biolátek a jejich výtěžností. Částice s porézní vrstvou Tyto částice jsou tvořeny neprostupným tedy neporézním jádrem a na jeho povrchu je porézní vrstva aktivní stacionární fáze. Tento typ částic dnes prožívá velkou renesanci. Perfuzní částice Podobně jako neporézní částice i částice perfuzní byly navrženy pro rychlé separace biopolymerů. Jsou tvořeny vysoce zesílenými částicemi styren-divinyl benzenu a obsahují dva typy pórů: velmi velké throughpores s velikostí nm a malé diffusion pores s velikostí nm. Aktivní stacionární fáze (např. reverzní, iontově výměnná nebo afinitní) pokrývá celý vnitřní i vnější povrch částic. Velké póry umožňují protékání mobilní fáze skrz částice a malé póry zajišťují dostatečně velký povrch částic pro interakce s analytem. Separovaná látka je rychle transportována dovnitř a ven z částic a krátké difuzní dráhy vedou k příznivému průběhu van Deemterovy závislosti a umožňují dosahování separace makromolekul bez ztáty účinnosti i při vysokých průtocích mobilní fáze (obrázek dole). Není potřeba, a ani to není možné, připravovat velmi malé částice tohoto sorbentu, běžná velikost je 20 µm. Tlakový spád na kolonách je velmi malý. Monolitické stacionární fáze Je možné syntetizovat stacionární fáze ve formě jednolitých porézních monolitů organických polymerů nebo silikagelu (viz obrázek níže). Při tomto konceptu není stacionární fáze tvořena částicemi sorbentu, ale blokem porézního materiálu zaplňujícím kolonu. V případě

7 silikagelových monolitů velikost velkých pórů (kterými protéká mobilní fáze) je např. 2 µm a tzv. mesopórů např. 12 nm. Tyto materiály mají porozitu více než 0.8, jejich separační účinnost je podobná jako 3 µm porézního silikagelu, a van Deemterova křivka má velmi výhodný tvar. Monolity navíc nepotřebují frity v kolonách na stabilizaci stacionární fáze. Každá kolona je originální šarže. Často je možné na monolity nadávkovat poměrně znečištěné vzorky (sérum, extrakt z potravin) bez ztráty separačních vlastností nebo zkrácení životnosti kolony.

8 Silikagel Silikagel je sorbent s vynikajícími vlastnostmi. Může být použit také pro vylučovací chromatografii a tvoří základní matrici pro mnoho tzv. chemicky vázaných stacionárních fází. Je tvořen 3D sítí tvořenou atomy křemíku spojenými s atomy kyslíku. Níže uvedený obrázek znázorňuje povrch silikagelu, je vidět že je pokryt OH skupinami, tzv. silanolovými skupinami. Materiál je amorfní a má heterogenní povrch, není snadné jej tedy připravovat definovaným způsobem. Ačkoli všechny funkční skupiny na povrchu mají adsorpční vlastnosti, různé typy mají odlišné vlastnosti: (a) volné silanoly jsou slabě kyselé, proto se na nich snadno adsorbují bazické látky. To často vede k chvostování píků. (b) geminální silanoly nejsou kyselé. (c) asociované, vicinální, silanoly nejsou kyselé. Látky mající OH skupiny mají tendenci se na nich adsorbovat. (d) silanoly poblíž kationtů kovů jsou silně kyselé. Zvyšují heterogenitu povrchu sorbentu a mohou značně nepříznivě ovlivnit dělení bazických látek. (e) siloxany vznikají kondenzací asociovaných silanolů. Tepelné zpracování silikagelu zvyšuje množství siloxanů a snižuje koncentraci siloxanů. Silikagel může být připraven mnoha různými způsoby jako např. kompletní hydrolýzou sodných silikátů nebo polykondenzací emulzifikovanáho polyethoxysilanu následovanou dehydratací. Vzniklé gely poskytují částice nepravidelného i pravidelného tvaru v závislosti na postupu přípravy; navíc vlastnosti konečného produktu jsou závislé na reakčních podmínkách (ph, koncentraci, aditivech, rychlosti míchání velikosti nádoby). Jedním z nejdůležitějších parametrů výchozích látek je obsah kovů, protože ty jsou odpovědné za koncentraci výsledných kyselých silanolů. Běžné silikagely jsou kontaminovány až 250 ppm

9 sodíku a 150 ppm hliníku vedle dalších kationtů. Jejich povrchové reakce mohou být i bazické podle typu a koncentrace inkorporovaných iontů. Moderní špičkové silikagely obsahují méně než 1 ppm sodíku, vápníku, hořčíku a hliníku, a jen mírně vyšší množství železa. Jenom takovéto silikagely jsou dobře použitelné pro dělení bazických látek jak v normálním modu (nemodifikovaný silikagel), tak reverzním mechanizmem (ve formě vázaných fází). Vedle tvaru částic se silikagely různých výrobců mohou lišit i dalšími vlastnostmi: (a) Velikost pórů: měla by být větší než 5 nm (50 Å). Makromolekuly musí být děleny na makroporézním silikagelu (30nm = 300 Å nebo větším). (b) Specifický povrch: je inverzně úměrný šířce pórů a uvádí se v m 2 g -1 : asi 100 m 2 g -1 pro 30 nm silikagel, 300 m 2 g -1 pro 10 nm silikagel a 500 m 2 g -1 pro 6 nm materiál. Čím menší je specifický povrch, tím menší je retence analytu při stejných chromatografických podmínkách. (c) Distribuce šířky pórů: úzká distribuce šířky pórů je důležitá pro dosažení symetrických píků. (d) Hustota: hustota silikagelu je asi 2.2 g cm -3 ; hustota naplnění v koloně (packing density) je podle jednotlivých produktů v rozmezí od 0.3 do 0.6 g cm -3. Silikagel je stabilní v rozsahu ph asi od 1 do 8. Silikagely s šířkou pórů do 400 nm (a velikostí částic 10 µm) jsou užívány pro vylučovací chromatografii. Musí mít dobře definovanou šířku pórů a minimální adsorpční vlastnosti. Chemicky modifikované silikagely Silikagely mají OH skupiny (silanolové skupiny) na svém povrchu s ty mohou být chemicky modifikovány, a tak poskytovat stacionární fáze se specifickými vlastnostmi. Obrázek dále ukazuje některé možné reakce. I. Silanolové skupiny mohou být esterifikovány alkoholy, ROH, kde R může být alkyl nebo jiná funkční skupina. Ze sterických důvodů dochází k reakci především na povrchu silikagelu a ne uvnitř struktury, takže navázané řetězce jsou orientovány ven ze sorbentu.

10

11 Esterifikovaný silikagel je náchylný k hydrolýze a nemůže být použit s mobilními fázemi obsahujícími vodu nebo alkohol, produkty s Si-O-Si-C vazbami jsou mnohem důležitější. II. reakce s thionyl chloridem SOCl 2 poskytují chloridy reagující s aminy za vzniku vazby Si- N. R může být různé. Výsledný produkt má lepší hydrolytickou stabilitu. III. Silikagely s funkční skupinou vázanou vazbou Si-O-Si-C (reakcí s mono- nebo dichlorsilanem) jsou nejběžnější. Oktadecyl silan ODS, ve kterém R = -(CH 2 ) 17 CH 3, je nejčastěji používanou chemicky vázanou fází. Je nepolární a je používán jako reverzní fáze.

12 Příklad přípravy chemicky vázané fáze: 100 ml suchého toluenu + 4 g suchého silikagelu ml suchého pyridinu jsou smíchány se čtyřnásobným přebytkem silanu RSi(CH 3 )Cl (počítáno pro silikagel s pokrytím povrchu 2.4 skupiny na mm -2. ). Teplota u držena 10 C pod bodem varu nejtěkavější složky po dobu 40až 150 h (podle skupiny R). Směs je čas od času opatrně protřepána. Nakonec je produkt filtrován, promyt a vysušen. Následné opracování trimethylchlorsilanem může snížit počet silanolových skupin, které zůstaly ze sterických důvodů nezreagovány, to se označuje jako end-capping. Možné funkční skupiny jsou uvedeny v tabulce. Silikagel může být funkcionalizován vhodnými skupinami pro iontově výměnnou chromatografii, afinitní chromatografii nebo dělení enantiomerů. Chemická stabilita vázaných fází Vysoké ph vede k rozpouštění silikagelové matrice stacionární fáze. Nízká hodnota ph vede k hydrolýze siloxanové vazby: SiO-Si-R -> Si-OH + HO-Si-R. Malé funkční skupiny užívané

13 pro end capping jsou k hydrolýze zvláště málo odolné. Proto end-cappované fáze mění svoje vlastnosti, pokud jsou provozovány v mobilních fázích s ph<3. Fáze modifikované delšími alkylovými řetězci (např. oktadecyl) jsou stabilnější než fáze s řetězci kratšími (např. dimethyl). Chemická stabilita je vyšší pro materiály připravené z vysoce čistého silikagelu s malým obsahem kovů, které jsou hustě pokryté end-cappovanou vázanou fází, pro jejíž přípravu bylo použito derivatizační činidlo vedoucí k sterickému chránění vazby k silikagelu. Životnost sorbentu klesá při vyšších teplotách, při vysoké koncentraci pufrů a při použití měně vhodných pufrů: anorganické pufry jako je fosforečnan nebo uhličitan jsou agresivnější než organické pufry jako je např. glycin. Styren-divinylbenzen Zesítěný styren je všestranná stacionární fáze připravená kopolymerací styrenu a divinylbenzenu (Figure 7.11). Množství divinylbenzenu použité při reakci určuje stupeň zesítění, a tím strukturu pórů. Polymery s menším obsahem divinylbenzenu než 6% nejsou tlakově stabilní a nejsou použitelné jako HPLC sorbenty. Semi-rigidní polystyreny s 8% divinylbenzenu jsou stabilní do 60 bar. Mění svůj objem v koloně v závislosti na rozpouštědle a iontové síle (např. botnají při nízké a sráží se při vysoké iontové síle); takže pokud je solvent a jeho iontová síla zvolena, není vhodné již mobilní fázi následně měnit. Rigidní polystyreny jsou plnohodnotné vysokoúčinné sorbenty. Jsou vysoce zesítěné, a proto vůbec nebotnají a jsou stabilní asi do 350 bar.

14 Styren-divinyl benzenové fáze mohou být mikroporézní nebo mohou obsahovat mikro i makrospory. Přítomnost makropórů s velikostí několik desítek nanometrů usnadňuje přístup objemných analytů k aktivním centrům. Na rozdíl od silikagelu jsou styren-divinylbenzenové fáze stabilní v rozmezí ph Styren-divinylbenzenové fáze jsou aplikovatelné pro chromatografii na obrácených fázích při použití vodných mobilních fází a mají výbornou odolnost v extrémním ph, to rozšiřuje jejich aplikovatelnost sorbentů ve srovnání s modifikovanými silikagely. Za užití méně polárních rozpouštědel je možno pracovat v normálním/adsorpčním módu. Měniče iontů jsou získány zavedením vhodných skupin do matrice sorbentu, jak je znázorněno na obrázku. Podobnou cestou lze imobilizovat C 18 H 37 skupiny; tento typ oktadecylové fáze neobsahuje žádné zbytkové (nezreagované) OH skupiny nerozdíl od fází na silikagelu. Po zesítění vedoucí ke vzniku dobře definovaných pórů, představují styrendivinylbenzenové fáze důležitý typ sorbentů určených pro vylučovací chromatografii. Alumina Alumina je zásaditá, nicméně vhodným zpracování lze připravit aluminu neutrální a kyselou s tím, že neutrální forma je nejužívanější v adsorpční chromatografii. Bazická alumina je slabý měnič kationtů, a kyselá slabý měnič aniontů. Alumina je zvlášť efektivní při děleních polyaromatických uhlovodíků a strukturních izomerů. Na rozdíl od silikagelu je stabilní v rozmezí ph Je náchylnější k chemisorpci ve srovnání se silikagelem, především pro kyselé komponenty, které mohou vykazovat chvostování. Alumina by neměla být zahřívána nad 150 C. Kolony plněné aluminou poskytují menší účinnosti než kolony na bázi silikagelu. Chemická derivatizace je možná, ale bývá nekovalentní.

15 Křemičitan hořečnatý Musí být používána obezřetně, protože aromáty, aminy, estery a mnohé další látky mohou být chemisorbovány. Porézní sklo Je připravováno kontrolovaným odskelněním složek borosilikátového skla. Malé kapičky B 2 O 3 jsou segregovány a odstraňovány z matrice SiO 2 parou. Tento materiál je znám jako porézní sklo, sklo s kontrolovanou porozitou (CPG), a je tlakově stálé a má vynikající chemickou stabilitu (s výjimkou k silným alkáliím), lze sterilizovat. Povrchové OH skupiny je možno chemicky modifikovat podobně jako silikagel, a tak získat sorbenty pro adsorpční, rozdělovací, iontově výměnnou, vylučovací a afinitní chromatografii. Methakrylátové gely Velký počet OH skupin v methakrylátových gelech dává těmto sorbentům vysokou polaritu a tyto fáze mohou být přímo užity ke gelové filtraci nebo po derivatizaci pro afinitní chromatografii. Hydroxylalkylové funkční skupiny bývají odvozeny od glykolu a glycerinu. Hydroxylapatit

16 Jedná se hexagonálně krystalizovaný fosforečnan vápenatý, Ca(PO 4 ) 6 (OH) 2. Je připravován v tlakově stabilní formě (do 150 bar) a je použitelný pro dělení bílkovin a jiných biopolymerů. Porézní grafitický uhlík Porézní grafitický uhlík (PGC) je plně porézní sférická stacionární fáze vykazující jedinečné reverzně fázové vlastnosti, ale může být použit i v normálním modu. PGC má krystalický grafitický povrch. Je chemicky stabilní v rozmezí od 10 M kyseliny po 10 M zásady a snáší vysokou teplotu. Selektivita (tj. eluční pořadí) je odlišná než na reverzních fázích na bázi silikagelu. PGC je doporučován pro dělení vysoce polárních a ionizovaných látek a stereoizomerů. Je vhodný pro separaci velkých poměrně rigidních molekul s mnoha polárními skupinami, např. pro mnohé přírodní látky a léčiva. Obrázek ukazuje dělení dvou izomerů proléčiva se sumarním složením C 50 H 80 N 8 O 20 PK.

17 Oxid titaničitý Oxid titaničitý je krystalická forma TiO 2 se zásaditými OH skupinami na povrchu (opak oproti silikagelu), takže je stabilní za vysokých hodnot ph. Může být aplikován v normálním i obráceném modu. Oxid zirkoničitý Oxid zirkoničitý má podobné vlastnosti jak oxid titaničitý, ale může interagovat s analyty také ligandovou výměnou, neboť je Lewisovou kyselinou. Jeho chemická derivatizace je možná. Pokrytí polybutadienem nebo polystyrenem poskytuje fázi stabilní v rozmezí ph přinejmenším 1-13 a tepelnou stabilitou nejméně do 200 C. Fáze s omezeným přístupem Tento speciální typ fází byl vyvinut pro analýzu léčiv a jejich metabolitů v séru (a dalších tělních tekutinách). Pokud je správně zvoleno ph a iontová síla mobilní faze, nezachycuje proteiny, ale selektivně malé středně polární analyty. Proto je možné na takovou kolonu nastříknout přímo sérum, aniž by došlo k denaturaci proteinu a znehodnocení stacionární fáze nevratnou sorpcí bílkovin. Jedna z možností syntézy uvedené stacionární fáze je představena na obrázku. Šířka pórů je tak malá, že proteiny nemohou do pórů proniknout (podobný princip jako vylučovací chromatografie). Navíc nemá vnější povrch absorpční ani denaturující povahu. Stacionární fáze odpovědná za separační selektivitu je jen uvnitř pórů.

18 Péče o kolony a jejich regenerace Pokud kolona není používána, měla by být přechovávána v rozpouštědle, vzduchotěsně uzavřená a neměla by být vystavena vibracím. Voda není příliš vhodným konzervačním solventem, protože v ní poměrně snadno mohou začít růst bakterie. Pufry mohou krystalizovat a ucpat kolonu. Kolon musí být vždy řádně označena štítkem s označením solventu uvnitř. Po dlouhé době používání kolony nebo při nedostačující opatrnosti během aplikace kolony může dojít k nahromadění adsorbovaných látek především na jejím začátku, a tím ke snížení dělící schopnosti kolony. Před tím, než je kolona vyřazena z provozu, je možné se pokusit o regeneraci (ovšem bez záruky). Ochranná kolona musí být před zahájením experimentů vyřazena ze systému. Bývá dobré zapojit kolonu v obráceném směru. Silikagelové kolony Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 1-3 ml min ml tetrahydrofuran;

19 75 ml methanol; 75 ml 1-5% vodná kyselina octová, pokud jsou přítomny zásadité nečistoty; 75 ml 1-5% vodný pyridin, pokud jsou přítomny kyselé nečistoty; 75 ml tetrahydrofuran; 75 ml terc-butylmethyl ether; 75 ml hexan (pokud je hexan použit jako následující mobilní fáze, jinak zastavte na etheru) Pokud je dělící schopnost snížena příliš velkým množstvím adsorbované vody, je možné jí odstranit chemicky s aplikací činidel připravených v laboratoři nebo komerčních činidel (Alltech Associates, Deerfield, Illinois, USA). Oktadecyl, oktyl, fenyl a nitrilové kolony Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min ml voda + 4 x nástřik 100 µl dimethyl sulfoxidu; 75 ml metanol; 75 ml chloroform; 75 ml metanol. Voda -> 0.1 M kyselina sírová -> voda je další možnost. Pokud sorbent ztratil vázanou fázi, může být provedena příslušná silanizace sorbentu ve snaze obnovit stacionární fázi. Anexy Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min ml voda; 75 ml metanol; 75 ml chloroform; Metanol -> voda. Katexy Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min ml voda + 4 x nástřik 100 µl dimethyl sulfoxidu; 75 ml tetrahydrofuran; voda. Následující sekvence je vhodná pro anexy a katexy:

20 75 ml voda; 75 ml M roztoku pufru používaného dříve (ke zvýšení iontové síly); 75 ml voda; 75 ml 0.1 M kyselina sírová; 75 ml voda; 75 ml aceton; 75 ml voda; 75 ml 0.1 M EDTA sodná sůl; 75 ml voda. Pro styren-divinylbenzenové katexy: 0.2 M hydroxid sodný je čerpán přes noc za teploty 70 C(k odstranění bakterií, které mohou být na povrchu částic). Styren-divinylbenzenové kolony Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0,5-2,0 ml min ml toluen nebo tetrahydrofuran (s obsahem peroxidů do 50 ppm); 200 ml 1% merkaptooctové kyseliny v tetrahydrofuranu nebo toluenu, pokud je kolona ucpána styren-butadienovou gumou nebo přírodní nebo syntetickou gumou. Speciální regenerační procedury jsou doporučeny pro kolny používané pro dělení biopolymerů. Plnění kolon Kolony mohou být otevřeny pro kontrolu chromatografického lože. Pokud sorbent v koloně zkolaboval, pak je kolona opravena podle následující procedury: (b) nadbytek sorbentu je odstraněn špachtlí a zarovnán; (c) prázdný objem je doplněn skleněnými 35 µm kuličkami nebo vhodným povrchově porézním sorbentem a kolona je uzavřena. Stará frita je nahrazena novou fritou. Kolony s 3 µm částicemi jsou často vybaveny odlišnými fritami, na vstupu 2 µm a výstupu z kolony např. 0.5 µm. Pochopitelně, pokud je o kolonu dobře postaráno (potlačení pulzů, správná příprava mobilní fáze, zamezení srážení v koloně, apod.), není třeba kolonu regenerovat. Na uvedené téma publikoval řadu výborných prací Rabel, Nugent a Dolan. Prázdný prostor v koloně s kolabovanou stacionární fází vybavenou tzv. axiální kompresí je snadno eliminován posunutím pístu kolony.

21 Vyprazdňování kolon Obsah kolon by neměl být vyprazdňován špachtlí, drátkem apod., neboť může dojít k poškrábání vnitřního povrchu kolon. Nejvhodnější je odejmout jednu koncovku a tlakem stacionární fázi z kolony vysunout. Směr toku Nejlepší je používat kolonu stále ve stejném směru nebo vědět, z jakého důvodu byl směr změněn. Řada kolon má na svém povrchu vyznačen směr toku a tehdy není zřejmé, jestli je možné otočit kolonu. Pokud mají frity na obou koncích kolony stejnou velikost otvorů, je možné kolonu otočit, pokud tomu tak není, platí, že frita s většími otvory by měla být na vstupu solventu do kolony. Když kolona směr průtoku označen nemá, je vhodné na ní směr vyznačit. Kolona by pak měla být používána v tomto směru, prach a sorbující se látky jsou zadrženy na začátku kolony. Kolona by měl být zapojena v opačném směru jen při regeneraci.