INGS s.r.o AUTMATICKÝ ANALYZÁTR AMINKYSELIN AAA 400 Návod k obsluze chemická èást PRAHA 11. dubna 2006
Výrobce : INGS s.r.o divize laboratorních přístrojů Vývoj a konstrukce : PiKRN s.r.o Chemický systém : V. Havlíček - ZMBD chemik Dodavatel a servis : INGS s.r.o Tel: +420 296 781 683 K Nouzovu 2090 +420 296 781 692 14316 PRAHA 4 Fax: +420 244 403 051 e-mail:pristroje@ingos.cz (c) INGS 2006
ÚVD CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA PØÍPRAVA VZRKÙ BIGENNÍ AMINY VZRVÉ ANALÝZY BSAH 1 2 3 4 5 6
1. ÚVD 1.1 Úèel publikace Tato příručka je určena pracovníkům, kteří se zabývají obsluhou automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400. Byla vypracována jako pomůcka začínajícím obsluhám a začátečníkům v oboru ionexové chromatografie. Usnadňuje pochopit princip přístroje jako celku i jeho jednotlivých částí. Pochopení a osvojení všech činností, spojených s provozem přístroje,je základním předpokladem jeho správného využití a jeho bezporuchového chodu. Úvodní kapitoly poslouží jako pomůcka. 1.2 Základní chemická problematika aminokyselin. 1 1.2.1 Aminokyseliny Aminokyseliny jsou organické sloučeniny obsahující jak aminovou skupinu, tak i skupinu karboxylovou. Většina aminokyselin má obecnou strukturu, ve které primární aminy a skupina karboxylové kyseliny jsou připojeny k jednomu atomu uhlíku. Další vazba tohoto uhlíku váže atom vodíku a čtvrtá vazba s připojenou skupinou určuje vlastnosti každé aminokyseliny. Tento postraní řetězec také přispívá ke specifickému rozdělení nábojů jednotlivých aminokyselin. Struktury vedlejších řetězců a běžné názvosloví nejdůležitějších aminokyselin a ninhydrin pozitivních látek jsou uvedeny v následující tabulce. název zkr. MW strukturní vzorec ( )2,6-amino Dpm 190.20 pimelová kyselina H H alanin Ala 89,09 2-amino propionová kyselina H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 4
Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec alfa amino adipová Aad 161,16 kyselina H H 1 alfa amino-n-máselná Abu 103,12 kyselina H gama amino-n-máselná gabu 103,12 kyselina H 2 N H beta amino iso- BAIBA 103,12 máselná kyselina H 2 N H asparagová kyselina Asp 133,10 2-amino jantarová kyselina H H asparagin Asn 132,12 2- amino 3-karbamylpropionová kyselina H 2 N H arginin Arg 174,20 2-amino 5-guanidinovalerová kyselina H 2 N NH N H H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 5
Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec alfa amino-beta gua- AGPA 146,15 nidino propionová kyselina NH H 2 N N H H 1 citrullin Cit 175,19 2-amino -5-ureidovalerová kyselina H 2 N N H H cystathionin Cysta 208,24 3 thio di 2 amino propionová kyselina H H 2 N S H cystein Cys 121,16 2-amino -3-merkapto propionová kyselina HS H cysteová kyselina Cya 169,16 2-amino-3-sulfopropionová kyselina S H H cystin 240,30 2-amino-3-merkaptopropionová kyselina N H 2 H S S H ethanolamin EA 61,08 2-amino ethanol N H 2 H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 6
Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec fenylalanin Phe 165,19 2-amino-3-fenylpropionová kyselina H 1 glutamová kyselina Glu 147,13 2-aminoglutarová kyselina H H glutamin Gln 146,15 2-amino-4-karbamoylmáselná kyselina H 2 N H glycin Gly 75.07 glykol,aminooctová kyselina N H 2 H histidin His 155,16 2-amino-3-(4-imidazolyl)propionová kyselina HN N H homoserin Hse 119,12 2-amino-4-hydroxy máselná kyselina H H homocystein Hcy 135,19 2amino-4 mercapto máselná kyselina HS H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 7
Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec hydroxy prolin 4Hyp 131,13 4-hydroxypyrolidin- 2-karboxylová kys. isoleucin Ile 131,18 2-amino 3-methylvalerová kyselina H N H H H 1 leucin Leu 131,18 2-amino-5-methylvalerová kyselina H lysin Lys 146,19 (2,6-diaminokapronová kyselina) H 2 N H methionin Met 149,21 2-amino-4-methylthio máselná kys. S H 1 methyl histidin 1mHis 169,18 2-amino 3-(imidazol)- 1-methyl di azol octová kyselina N N H 3 methyl histidin 3mHis 169,18 2-amino 3-(imidazol)- 3-methyl di azol octová kyselina N N H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 8
Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec norleucin Ahx 131,18 2-amino kapronová kyselina H 1 norvalin Ape 117,15 2 amino valerová kyselina H ornithin rn 132,16 2,5 diaminovalerová kyselina H 2 N H prolin Pro 115,13 pyrolidin -alfa karbonová kyselina N H H serin Ser 105,09 2-amino-3-hydroxypropionová kyselina H H taurin Tau 125,14 2-aminoethansulfonová kyselina H 2 N S H threonin Thr 119,12 2-amino-3-hydroxymáselná kyselina H H Tab.1 Přehled aminokyselin INGS s.r.o. Strana 9
AAA400 Kapitola 1: ÚVD název zkr. MW strukturní vzorec tryptofan Trp 204,23 2-amino-3-(3-indolyl) propionová kyselina tyrosin Tyr 181,19 2-amino-3-(4hydroxyfenyl propionová kyselina H N H H H 1 valin Val 117,15 (2-aminoisovalerová kyselina) H Tab.1 Přehled aminokyselin 1.2.2 Výskyt aminokyselin Aminokyseliny se vyskytují v přírodě bud ve volném stavu nebo jako polymerované řetězce nazývané peptidy nebo proteiny, které mohou být spojeny s nejrůznějšími substráty jako např. uhlohydráty, lipidy a.p. Všechny tyto aminokyseliny, po vhodné úpravě vzorku, je možno analyzovat chromatografickými metodami. Peptidy jsou polymerické řetězce aminokyselin.peptidické vazby se vytvářejí kondenzací alfa aminoskupiny jedné aminokyseliny a alfa karboxylové skupiny druhé aminokyseliny.!" Vazba dvou aminokyselin tvoří dipeptidy, tří aminokyselin tripeptidy a více aminokyselin polypeptidy. Protein je dlouhý polypeptid, obsahující přibližně 20 zbytků aminokyselin, má obvykle specifickou biologickou funkci (na př. enzym). Analýza složení aminokyselin v peptidu nebo proteinu se provádí po hydrolýze peptidických vazeb. Spojením aminokyselin s jinými substráty je možno vytvořit mnoho derivátů. Tyto dvě skupiny, t.j. aminokyseliny a substráty, se často analyzují odděleně po hydrolýze konjugátu. INGS s.r.o. Strana 10
AAA400 Kapitola 1: ÚVD 1.2.3 Historie analýzy aminokyselin Stanford Moore a William Stein věnovali mnoho času separaci aminokyselin. Když v roce 1958 publikovali, společně se Spackmanem, popis prvého automatického analyzátoru pro kvantitativní i kvalitativní stanovení ninhydrin pozitivních látek, uzavřeli tím jednu dlouhou etapu v biochemické analýze.v roce 1972 obdrželi Nobelovu cenu. d roku 1958 se mnoho autorů zabývalo zdokonalením analýzy aminokyselin, byla provedena řada zlepšení, avšak žádné z nich nebylo zásadní. Náš přístroj pracuje na tradičním principu Moora a Steina s ninhydrinovou detekcí. V poslední době je ve značné oblibě HPLC. U těch pracovníků, kteří nejsou dobře obeznámeni s posledními trendy vývoje stanovení aminokyselin mohou, proto některé nově používané metody vyvolat zmatek. Stanovení aminokyselin pomocí HPLC přináší řadu problémů a nedostatků proti dnes již klasickému stanovení podle Moora a Steina. Tím je možno vysvětlit pomalé pronikání HPLC do běžných provozních aplikací. Pro HPLC se vyžadují většinou naprosto čisté vzorky bez zákalů a p.,jinak se zničí drahá náplň analytické kolony, problémová bývá i derivatizace aminokyselin, odstraňování přebytečného činidla, nutnost používat velice čistých elučních roztoků atd. Nesnadné bývá i rozdělení složitých směsí. Tyto problémy u klasické ionexové chromatografie s ninhydrinovou detekcí odpadají. Vzhledem k tomu, že celý proces stanovení aminokyselin je zcela automatizován, předčí svými parametry HPLC co do spolehlivosti i přesnosti stanovení. 1 1.2.4 Reakce ninhydrinu s aminokyselinami Reakci ninhydrinu (indantrionového hydrátu) s aminokyselinami a iminokyselinami lze znázornit takto: Reakce NHD s primárními aminokyselinami!#" $ % & '%( Reakce NHD se sekundárními aminokyselinami (iminokyselinami)! Ninhydrin je silné oxidační činidlo, které reaguje s alfa aminoskupinami, uvolňuje amoniak, oxid uhličitý, aldehyd a redukovanou formu ninhydrinu hydrindantin. Uvolněný amoniak pak reaguje s hydrindantinem a další molekulou ninhydrinu a dává purpurovou INGS s.r.o. Strana 11
AAA400 Kapitola 1: ÚVD substanci (Ruhemanova červeň). Hydrindantin přítomný v detekčním činidle zabraňuje vedlejší reakci, která by redukovala vznikající Ruhemanovu červeň. Sekundární aminokyseliny vytvářejí různé chromofory. 1 1.2.5 Detekce Ruhemanova červeň má absorbční maximum při 570 nm.tato absorbance je lineární funkcí množství přítomných alfa aminoskupin. Reakce je vhodným základem pro stanovení všech organických sloučenin obsahujících aminokyseliny. Reakce nihydrinu se sekundárními aminokyselinami má absorbční maximum při 440 nm. Měření při vlnových délkách pod 440 nm dává příliš velkou doplňkovou absorbanci z nezreagovaného ninhydrinu. 1.3 Iontomìnièová chromatograe aminokyselin 1.3.1 Struèná teorie iontomìnièové chromatograe. Aminokyseliny je možno oddělovat chromatografií založenou na výměně iontů. Chromatografická kolona je naplněna pryskyřicí s negativním nábojem a aminokyseliny jsou na kolonu zaváděny při nízkém ph. Tím jsou všechny kladně nabity. Za těchto podmínek nenastane chromatografické dělení. Aminokyseliny čekají na počátku kolony na změnu podmínek. Při zvýšeném ph, zvýšené teplotě nebo vyšší iontové síle elučního roztoku dojde k dosažení izoelektrického bodu aminokyseliny. Tehdy ztrácí přitažlivost svých iontů k pryskyřici a aminokyselina je eluována z kolony. Izoelektrický bod molekuly je definován jako ph, při kterém molekuly v roztoku nenesou žádný náboj. Izoelektrický bod aminokyselin je funkcí pk hodnot ionizovatelných skupin v molekule. Podmínky jsou upraveny tak, že izoelektrické body, pro všechny aminokyseliny, se dosahují v různých časech. To umožňuje provést chromatografické dělení. Jako příklad uvedeme kyselinu asparagovou. Podíváme-li se na výše uvedenou rovnici kyseliny asparagové, vidíme, že při ph 1 mají v zásadě všechny molekuly jeden kladný náboj. Při vzrůstajícím ph, bude mít stále větší počet molekul na alfa karboxylové skupině negativní náboj, až při ph 2,8 jej budou mít všechny. To je izoelektrický bod. Karboxylová skupina v postranním řetězci je méně kyselá než alfa karboxylová skupina a koncentrace iontů vodíku je stále dostatečná, aby se zabránilo její ionizaci. Když ph stoupne na 6,6, budou mít všechny molekuly ionizovány karboxylové skupiny postranního řetězce a budou mít dva záporné a jeden kladný náboj. Při ph 11 mají všechny molekuly pouze dva záporné náboje. Podíváme-li se nyní, na př. na molekulu lysinu, který má aminoskupinu i na postranním řetězci, zjistíme, že jeho izoelektrický bod je při ph 9,7, a je to právě aminokyselina INGS s.r.o. Strana 12
AAA400 Kapitola 1: ÚVD na postranním řetězci, která je při izoelektrickém bodu nabita. Má tedy větší váhu, než alfa aminoskupina. 1! #" %$ Proces výměny iontů je možno znázornit jednoduše takto: Separace je ovlivňována změnou ph,teploty nebo koncentrace opačně nabitých iontů. Tím se posunuje rovnováha jedním nebo druhým směrem. 1.4 Iontomìnièe Iontoměničové náplně dnešních klasických analyzátorů aminokyselin mají sférický kulový tvar. Jejich syntéza se provádí kopolymerací styrenu a divinylbenzenu. Divinylbenzenu bývá při syntéze použito přibližně 8%. Procenta divinylbenzenu jsou velice důležitá nejen proto, že tvoří v řetězcích styrenu příčné vazby, čímž vzniká kulovitý tvar, ale ionex podle množství příčných vazeb má řadu vlastností příznivých i méně příznivých, na př. rigiditu, botnavost, pórovitost a.p. Množství příčných vazeb se u ionexů označuje písmenem X (crosslinking). Strukturu pryskyřice je možné znázornit na následujícím obrázku. Příčně svázaná pryskyřičná struktura se nazývá pryskyřičná matrice. Je-li tato matrice nasulfonována, potom získáme silně kyselý katex. Také písmena v označení českých ionexů ve znaku KS značí silně kyselý. Úseky uvnitř skeletu se nazývají póry a pro nabité ionty S3- se užívá termínu vázané ionty. pačně nabité ionty jsou vyměnitelné ionty, které jsou přiřazeny k matrici heteropolárními vazbami (kladně nabité skupiny v pufrech nebo aminokyselinách). Při iontové výměně pronikají opačně nabité ionty v pufru do pórů matrice a vyměňují si místa s opačně nabitými ionty, které jsou tam vázané. INGS s.r.o. Strana 13
Kapitola 1: ÚVD U pryskyřic (ionexů) používaných pro analýzu aminokyselin, jsou proměnnými parametry rozměry částic, stupeň sulfonace a stupeň zesítění /crosslinking). Chromatografickou činnost analyzátorů aminokselin ovlivňují ještě jiné parametry, jako rozměry kolony, rychlost toku eluentu, teplota a přítomnost organických rozpouštědel a.p. těchto parametrech bude pojednáno v dalších kapitolách - příprava elučních roztoků. 1 INGS s.r.o. Strana 14
2. CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA 2.1 Ionexy Pro analyzátory aminokyselin se používají tři druhy ionexů. Všechny jsou od firmy Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí nad Labem. Jsou prodávány pod ochrannou značkou STIN. značení LG znamená určení ionexu pro analytické účely. Prvé dvojčíslí značí stupeň zesítění, druhé dvojčíslí velikost zrna. Toto je běžné u analytických ionexů u nás toto značení používáme pouze pro ionex předkolony. Ionexy určené pro analytické kolony našich analyzátorů aminokyselin mají poněkud odlišné značení. Pro náplň analytické kolony určené pro stanovení hydrolyzátů bílkovin se používá stion LG ANB, dodávaný v Na cyklu. Pro analýzu volných aminokyselin se dodává stion LG FA, dodávaný v Li cyklu. Ionexy mají odlišné značení od běžných analytických ionexů proto, že jsou testovány podle jiných kriterií, než běžné ionexy. 2.1.1 Ionex pro pøedkolonu. Ionex pro předkolonu je dodáván pod označením stion LG KS 0804, v Na cyklu. Pro použití v Li provoze je nutné jej přecyklovat podle kapitoly 2.1.5. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu. 2.1.2 stion LG ANB pro stanovení hydrolyzátù. stion LG ANB je silně kyselý katex s průměrnou velikostí zrna asi 12 um. Je dodáván zásadně v Na formě v balení po 20 ml. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu. 2.1.3 stion LG FA pro stanovení volných aminokyselin. Speciálně vyvinutý ionex pro náš přístroj. Dodává se zásadně v Li formě. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.pro stanovení volných aminokyselin lze také použít stion LG ANB. Je však nutné jej převést do Li cyklu. 2.1.4 Práce s ionexy. Před plněním kolony, nebo po delší době stání ionexu (několik měsíců) jej doporučujeme přecyklovat, protože se během skladování uvolňují zbytky látek po syntéze, které zhoršují dělící schopnosti ionexu a kvalitu nulové linie. Během provozu jsou na ionex vázány nečistoty ze vzorků a většinou se neúnosně zvětší tlaky, nebo podstatně zhorší dělení obtížně dělitelných dvojic. Takto znečištěný ionex nic neztrácí na své kvalitě, je však nutné jej vyčistit. Toto provedeme opakovaným převedením do H cyklu a zpět do Na nebo Li cyklu. Při práci s analytickými ionexy musíme zachovávat určitá pravidla, na která upozorňujeme. 1.Ionex nesmíme nikdy nechat vyschnout. Když už se tak stane, je nutné jej přecyklovat, silně naředit - 20 ml ionexu smíchat v odměrném válci přibližně s 250 ml destilované vody. Počkat asi 20 až 30 min, až se ionex usadí a vrchní zakalenou část H2 odsát (dekantovat).toto lze zopakovat podle potřeby 2 až 3 krát. Touto manipulací se zbavíme drtě, která vznikla uschnutím ionexu. Zmenší se nám sice množství, avšak vzroste kvalita a sníží se tlaky v systému. 2 INGS s.r.o. Strana 15
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA 2.Ionex uchováváme vždy vlhký, to znamená, že po přecyklováni nebo jiné manipulaci (plnění kolony a.p.) jej kvantitativně spláchneme do skladovací nádobky destilovanou vodou. Po usazení dekantujeme. Nad ionexem ponecháme stát malé množství vody (l až 2 mm). 3. Skladováni provádíme pokud možno v chladničce, abychom zabránili případné kontaminaci (bakterie,plísně). 4. Při manipulaci s ionexem musíme míchat skleněnou tyčinkou, nepřípustné je míchání protřepáváním. Při protřepávání se naváže na jednotlivá zrnka ionexu vzduch, což má za následek vysoké tlaky a zhoršené dělení čerstvé kolony. 5.Při cyklování nesmí dojít nikdy k prosátí vzduchu přes vrstvu ionexu na fritě. Staneli se, že se nám přes všechnu opatrnost navázal do ionexu vzduch je nutné opakovat minimálně jednou cyklování. 2 2.1.5 Cyklování ionexu - èi¹tìní. Když je ionex znečištěný balastními látkami a zhorší se jeho vlastnosti, je nutné jej přecyklovat.nyní bude popsán praktický postup cyklování ionexů. Před započetím je nutné přečíst kapitolu 2.1.4. 1.Převedení do H formy. Jeden objemový díl ionexu smícháme s 5 až 6 objemovými díly 15 % HCl (1:1). Za občasného míchání zahříváme na teplotu 80C po dobu 6 min.potom promyjeme na fritě S4 (nebo takové, která nemá větší velikost pórů než 4 um) destilovanou vodou do neutrální reakce. Takto zpracovaný ionex je v H formě. 2. Převedení do Na formy. Ionex v H formě smícháme s 16 % NaH v poměru 1 objemový díl ionexu + 5 až 6 objemových dílů NaH. Ponecháme asi 30 min stát při pokojové teplotě. bčas zamícháme celý obsah skleněnou tyčinkou. Potom opět sfiltrujeme přes fritu S 4, promyjeme destilovanou vodou do neutrální reakce. 3. Převedení do Li formy. Ionex v H formě smícháme s pětinásobným množstvím nasyceného roztoku LiH. Za občasného míchání skleněnou tyčinkou ponecháme stát asi 1 hod. Potom sfiltrujeme přes fritu S 4 a promyjeme destilovanou vodou do neutrální reakce. Pro plnění analytické kolony nebo předkolony ředíme prvním analytickým pufrem 0,18 N Li ph 2,9. Pro uskladnění převedeme do PE lahvičky a skladujeme ve vlhkém stavu v chladničce. 4. Skladování ionexu. Po převedení ionexu do Na nebo Li formy tento promyjeme na fritě prvním pufrem a v tomto stavu jej uchováváme v PE lahvičce v lednici. Nikdy neskladujeme ionex po převedení do Na nebo Li formy po promytí louhem. Louh se z pórů ionexu uvolňuje a ionex je potom skladován prakticky v louhu, což způsobuje jeho naboptnání a ztrátu tvrdosti. Skladuje se proto v kyselém prostředí prvního pufru. K udržení vlkosti postačí doplňovat H2. 2.1.6 Plnìní analytických kolon pro hydrolyzáty Na cyklus. Kolona se plní ionexem STIN ANB. Kolonu nejprve chemicky vymyjeme,přišroubujeme k ní spodní uzávěr, jehož kapiláru odpojíme od směšovače a vložíme do malé kádinky. Kolonu zasadíme do držáku kolony v analyzátoru a necháme povytaženou z lůžka topení ven. Připravíme si asi 5ml injekční stříkačku opatřenou PE hadičkou s vnitřním INGS s.r.o. Strana 16
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA průměrem asi 1 mm a délce 500 mm. Do této stříkačky nasajeme destilovanou vodu a vpravíme ji na dno do výše 10-20 mm. Potom do této stříkačky nasajeme ionex, který jsme předtím zředili prvním pufrem v poměru 1 díl ionexu a 2-3 díly pufru. Při rozmíchávání ionexu používáme vždy skleněnou tyčinku, míchání provádíme pomalu. Nikdy nerozmícháváme ionex protřepáváním! Zasuneme PE hadičku na dno kolony, pomalu vytlačujeme ionex ze stříkačky do kolony a současně vytahujeme hadičku tak,aby byla stále 5-10 mm pod hladinou suspenze, až naplníme kolonu po okraj. Potom na kolonu našroubujeme plnící uzávěr (shodný s uzávěrem předkolony) a běžným průtokem plníme. Když je suspenze ionexu nad sedimentem ionexu asi 20mm, vypneme čerpadlo. Počkáme na pokles tlaku, odšroubujeme horní plnící uzávěr,odsajeme čirou kapalinu až k suspenzi a opět naplníme suspenzí ionexu. Takto pokračujeme až docílíme požadovanou výšku ionexu v koloně. Výška ionexu v koloně má být pro stanovení hydrolyzátů 350-370mm, což odpovídá počtu asi 23-25 000 teoretických pater. Počáteční plnění kolony necháváme na 370mm, protože během prvních analýz ionex asi o 20mm klesne. Přeplníme-li kolonu, postačí přebytečné množství odsát. Po naplnění kolony neodsáváme přebytečný pufr nad ionexem, ale vložíme do kolony analytický uzávěr, který dotáhneme těsně na ionex. Během prvních analýz kontrolujene dotažení horního uzávěru na ionex a v případě potřeby jej opět dotáhneme, nelze-li uzávěr již dotáhnout na ionex pomocí šroubu, vložíme na uzávěr další distanční trubičku. Upozornění: V případě, že při plnění dojde ke spojení suspenze se sedimentem, neodsajeme všechen přebytečný pufr, ale ponecháme nad sedimentem asi 10-20mm pufru a hadičkou krouživým pohybem rozhrábneme horní vrstvu ionexu a dále plníme běžným způsobem. Neprovedeme-li toto rozhrábnutí je vážné nebezpečí, že kolona nebude dobře dělit. 2 2.1.7 Plnìní analytických kolon pro volné aminokyseliny Li cyklus. Kolona se plní ionexem STIN LG FA, ředění ionexu opět provedeme prvním pufrem ve stejném poměru jako při plnění hydrolyzátové kolony. Plnění provádíme postupem v kapitole 2.1.6. Kolona se plní do výše 200-220mm. 2.1.8 Plnìní pøedkolony. Předkolona se plní ionexem STIN 0804 stejným způsobem jako analytická kolona. Pro plnění kolony do Li cyklu (stanovení volných aminokyselin) se má teoreticky ionex přecyklovat do Li cyklu. Z praxe však víme, že to není nutné, protože během plnění se ionex přecykluje sám. Je ale nutné alespoň 2x vystřídat po 10 min. průchod kolonou LiH a první pufr, na hořejší části se objeví malá prohlubeň. Postačí otevřít horní uzávěr a kolonu doplnit čerstvým ionexem, nejlépe je slít z uskladněného ionexu pufr a hustým sedimentem pomocí špachtle (kopistě, navažovací lžičky) doplnit ionex (dokytovat).projeví-li se nám časem zhoršené doběhnutí arg na základní linii a kolona je řádně naplněna, bývá většinou horní vrstva ionexu znečištěná. Poznáse to po sejmutí horního uzávěru. Na povrchu je ionex tmavé barvy. Tento ionex odstraníme až na čistý ionex a doplníme čerstvý ionex. Při zavírání předkolony musí být její okraj vždy řádně očištěn, jinak by mohla kolona špatně těsnit, což je hrubá závada. INGS s.r.o. Strana 17
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA 2.1.9 Vyprazdòování kolon Z kolony odšroubujeme spodní uzávěr, podsuneme pod ní kádinku a spustíme pufrové čerpadlo. Počkáme, až mám všechen ionex vyteče z kolony. Tento ionex uskladňujeme samostatně a až je ho větší množství, tak jej přecyklujeme a vrátíme k původnímu ionexu. 2.2 Ninhydrinové èinidlo. 2.2.1 Chemikálie potøebné pro pøípravu ninhydrinového èinidla: 2 2.2.2 Ninhydrin Ninhydrin - 1,2,3 - triketohydrinden monohydrát C9H64, MW 178,14. Kvalitní ninhydrin (dále jen NHD) tvoří světle žluté krystalky. Červenofialové krystalky v NHD jsou známkou jeho znehodnocení. NHD uskladňujeme při normální teplotě v tmavých láhvích za nepřístupu světla. 2.2.3 2-methoxyethanol 2-methoxyethanol (ethylenglykolmonomethylether, methylcellosolv) MW 76,10 C3H82 CH3--(CH2)2-H Methylcellosolv (dále jen MCV) musí být prostý peroxydů. V případě, že je obsahuje projeví se to na rychlém zhoršování ploch píků a jejich výšek.(pokud není jiný důvod k jejich snižování). V takovém případě je nutné MCV předestilovat a to pouze potřebné množství pro přípravu NHD činidla. Destilace se provádí s přídavkem 10 ml roztoku FeS4 na 1000 ml MCV. Roztok síranu železnatého připravíme rozpuštěním 6 g FeS4 ve 100 ml destilované vody okyselené 6 ml koncentrované H2S4. 2.2.4 4 M acetátový tlumiè. se připraví takto: V 600 ml horké destilované vody rozpustíme 544 g octanu sodného (CH3CNa.3H2). Po zchladnutí přidáme 100 ml ledové kyseliny octové a doplníme na 1000ml destilovanou vodou. Tento acetátový tlumič bývá výrobcem většinou dodáván hotový. 2.2.5 Hydrindantin dihydrát MW 358,31. Bílá jemně krystalická látka. Skladuje se v tmavé láhvi pokud možno za nepřístupnosti světla (ve skříni) při pokojové teplotě. Navažuje se s přesností 0,02 g. 2.2.6 Pøíprava ninhydrinového èinidla. Chemikálie rozpouštíme v uvedeném pořadí za stálého probublávání dusíkem přímo v reagenční láhvi.množství, pořadí a nezbytná doba pro probublávání dusíkem jsou uvedeny v následující tabulce. poř.čís. název množství dusík min. promývání l. ninhydrin (NHD) 40 g 2. methoxyethanol (MCV) 1 500 ml do rozp.nhd 3. 4 M Na acetátový pufr 500 ml 5 min 4. hydrindantin dihydrát 2,00 g do rozpušt. INGS s.r.o. Strana 18
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA Tab.2 Příprava ninhydrinu Hydrindantin se ve směsi acetátový pufr methoxyethanol velmi špatně rozpouští, proto při přípravě činidla odlijeme asi 200ml MCV do kádinky, jinak postup zachováme stejný. Když máme přidat hydrindantin, rozpustíme ho v připravované MCV. Ihned po vložení hydrindantinu do MCV intenzivně mícháme, aby se rozpustil v co nejkratší době (do 1 min.). Rozpuštění poznáme tak, že se roztok zcela vyjasní. Potom ihned nalijeme do láhve s připraveným činidlem NHD, kádinku nevyplachujeme a krátce probubláme dusíkem (1-2 min.). Poznámka: 1. Všechny použité chemikálie musí být čistoty pro analýzy, nebo pro analyzátory aminokyselin. 2. Methoxyethanol je možné nahradit dimethylsulfoxidem, je však nutné použít 4 N Li acetátový pufr ph 5,2. 3. Místo hydrindantinu je možné použít jiné redukční činidlo na př SnCl2 (,8 g pro 4 g NHD) nebo 7,5 ml 15% roztoku TiCl3. 4. Dusík který používáme jako inertní plyn musí být zcela prostý kyslíku (žárovkový). Lze použít i argon. Nedoporučujeme použití helia (má malou molekulu). 2 2.2.7 Bezpeènostní pøedpisy pøi práci s NHD èinidlem Při přípravě činidla vždy používáme gumové rukavice. Dojde-li k potřísnění pokožky omyjeme zasažené místo vodou a posypeme pyrosiřičitanem sodným (dvojsiřičitan sodný). Při zjištění modrých skvrn na pokožce tyto též posypeme pyrosiřičitanem sodným a omyjeme vlažnou vodou. Při požití vyvoláme zvracení a ihned lékařskou pomoc. 2.3 Pøíprava sodno citrátových eluèních roztokù. Sodno citrátové pufry jsou používány převážně pro stanovení aminokyselin v hydrolyzátech bílkovin. 2.3.1 Seznam potøebných chemikálií: 1. Kyselina citrónová p.a. 2. Citronan sodný p.a. 3. Chlorid sodný p.a. 4. Hydroxid sodný p.a. - pecičky a roztok obsahující v 1 ml 0,5 g NaH 5. Kyselina boritá p.a. 6. Thiodiglycol pro analyzátory aminokyselin 7. Azid sodný Poznámka: 1.Používáme chemikálie pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin, případně chromatograficky čisté. 2. Roztok NaH připravujeme v minimálním množství 500 ml a uchováváme v PE láhvi. Pipetujeme vždy ze středu láhve pod vrstvou uhličitanů. Výsledná koncentrace NaH má být 0,5 g v 1 ml. Př. 500 g NaH rozpustíme za stálého míchání a chlazení asi ve 300 ml destilované vody. Po zchladnutí doplníme na 1000 ml destilovanou vodou. 3. Azid sodný můžeme nahradit fenolem, pentachlorfenolem, nebo kyselinou kaprylovou v množství 0,1 g na 1000 ml elučního roztoku. INGS s.r.o. Strana 19
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA Tabulka výpočtu množství jednotlivých chemikálií pro zhotovení sodno citrátových elučních roztoků. Na pufry 1 2 3 4 M Na 0.2 0.2 0.4 1.12 M citr. 0.066 0.066 0.066 0.066 ph 2.6 3.0 4.25 - H 30 30 32 - Z 19.6 19.6 19.6 viz dole F 11.7 11.7 23.4 viz dole přísady TDG ml/l 2.5 2.5 2.5 NaH roz. - - - 0.5-3ml H3B3 - - - 2.05 g N3Na 0.1 0.1 0.1 0.1 Výpočet: Tab.3 Na Pufry MW kyselina citrónová [g/l] = H : ph =A 210.14 citronan sodný [g/l] = Z - (A x 1.4) =B 294.11 chlorid sodný [g/l] = F - (B x 0.596) 58.44 2 Pufr 4 se připraví navážením 19.6 g citronanu sodného a 52.6g chloridu sodného + přísady podle tabulky.navážky jsou konstantní není třeba je vypočítávat, proměnné je pouze množství NaH. 2.3.2 Postup pøi pøípravì eluèních roztokù (dále jen pufrù) Postupně rozpouštíme za stálého míchání jednotlivé složky pufru v teplé destilované vodě (40 až 60 C). Po rozpuštění doplníme na žádaný objem. Takto připravené pufry nezrají, je možno je okamžitě používat. Několik praktických poznatků při přípravě pufrů. Při zavádění nového systému, na př. při výměně ionexu nejprve připravíme 1000 ml pufru, nevyhovuje-li tento pufr, (je rychlý, nebo pomalý), nezdržujeme se jeho opravou, ale připravíme nový pufr se změněnými parametry podle nového výpočtu.změnu u prvního pufru neprovádíme zpravidla větší než o 0,1 ph. Známe-li parametry vyhovujícího pufru, není nutné jej podruhé vypočítávat, postačí si zapsat jeho ph a navážky, které se potom v praxi opakují. Doporučujeme připravovat z vyhovujících pufrů koncentráty v množství asi 5000 ml, pětinásobný koncentrát. Potom celá příprava pufru spočívá v odměření 200 ml koncentrátu a doplnění na 1000 ml destilovanou vodou. INGS s.r.o. Strana 20
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA Příklad přípravy koncentrátu: Koncentrát vyrobíme tak, že v přibližně 2500 ml destilované vody rozpustíme postupně 25ti násobek jednotlivých složek pufru. Po rozpuštění doplníme destilovanou vodou na 5000 ml. 2.3.3 Vlastnosti Na pufrù Systém pufrů INGS má celou řadu výhod, je velice jednoduchý, pufry nevyžadují použití pomocných zařízení (ph metry). Jsou vyrobeny z pevných chemikálií a pouhým navážením na technických váhách se dociluje maximální reprodukovatelnosti.celý systém výpočtu jednotlivých složek pufrů byl zjednodušen avšak variabilita ph byla zachována. Všechny zde popsané pufry budou prokazovat uvedené parametry při konstantním průtoku pufru 0,3 ml/min, dále při rozměrech kolony 0.37 x 45 cm, při náplni STIN LG ANB (výrobce Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí n/labem.) a výšce sloupce ionexu l = 35 až 37 cm. Pufr 1 0.2 M Na, ph 2.7 Při použití tohoto pufru je poředí aminokyselin toto: Kyselina cysteová, kyselina asparagová, methionin sulfon, threonin, serin. Při správném nastavení času stabilizace kolony je rozdělení všech píku na 100%. Problém může činit jedině mets, který je při dlouhé stabilizaci kolony blíže k asp a naopak. Postačí proto upravit délku stabilizace tímto pufrem na konci analýzy. Upozorňujeme také na nebezpečí přidavku thiodiglykolum, který musí být přesný a je potřeba ho odměřovet, ovlivňuje též ruclost eluce mets. Pufr 2 0.2 M Na, ph 3.0 Tento pufr slouži k dokončení eluce kyselých aminokyselin, protože použitím pufru ph 2.8 by bylo zbytečně dlouhé. Eluují se jím tyto aminokyseliny: Kyselina glutámová, prolin, glycin, alanin, cystin a valin. Při správném přepnutí ihned na začátku analýzy nejsou žádné problémy a všechny píky jsou dodělěny na 100%. Přepnutí z pufru ph 2.7 na tento pufr provádíme zpravidla již v 1 min. Pufr 3-0,4 M Na, ph 4,25 Tímto pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: met, ile, leu. Tento pufr není problematický,všechny dvojice jsou velice dobře rozděleny. Čím je pufr kyselejší, tím je pomalejší eluce a naopak. Totéž platí o teplotě. Čím vyšší teplota kolony, tím rychlejší eluce a naopak. Pufr 4-1.12 M Na, ph 7,9 Moderní pufr, který na počátku stlačí během prvních tří analýz ionexový sloupec v koloně o max. 1 cm a zvýší tlak na koloně přibližně o 0,2 až 0,5 MPa. Toto se v průběhu dalších analýz však vůbec nemění. Jeho veliká přednost spočívá v tom, že své analytické vlastnosti po celou dobu své životnosti nemění. Retenční doby se prakticky vůbec nemění a reprodukovatelnost je také výborná.toto vše nám plně vynahradí malé sesednutí kolony a nepatrné zvýšení tlaků. Jeho příprava je velice jednoduchá a naprosto nenáročná. Eluční vlastnosti se určují pouze množstvím přidaného NaH. 2 2.3.4 Pøíprava øedícího roztoku pufru.2 M Na, ph 2.2 Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné měřit ph. Postačí jej připravit podle následující receptury. kyselina citronová 14.0 g/l INGS s.r.o. Strana 21
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA chlorid sodný thiodiglycol azid sodný 11.5 g/l 5.0 ml/l 0.1 g/l 2.3.5 Pøíprava regeneraèního roztoku NaH 0,2 M Na Tento roztok připravíme rozpuštěním 8.0g NaH (MW 40,01) v 1000 ml destilované vody. 2.3.6 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Na pufry. Vzhledem k tomu že se jedná o sloučeniny kyseliny citrónové a chloridu sodného, což jsou suroviny běžně obsažené v potravě, není nutné dbát zvláštních bezpečnostních předpisů. 2.4 Pøíprava lithno citrátových eluèních roztokù. Lithno citrátové eluční roztoky (dále jen pufry) jsou používány převážně pro stanovení volných aminokyselin ve fyziologických roztocích. 2.4.1 Seznam potøebných chemikálií 1. kyselina citronová 2. citronan lithný 3. chlorid lithný 4. hydroxid lithný 5. thiodiglykol pro analyzátory aminokyselin 6. azid sodný Poznámka: 1.Používáme chemikálií pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin, případně chromatograficky čisté. 2. Chlorid litný je značně hydroskopický. Starší může obsahovat značné množství vody. Lépe něž jej sušit je rozpustit ho v destilované vodě, stanovit jednoduchým způsobem chloridy (např. titračně-argentometricky) a potom vypočítat množství LiCl v 1ml rozroku a odměřit potřebný počet g. 3.Azid sodný můžeme nahradit kyselinou kaprylovou, fenolem nebo pentachlorfenolem v množství 0,1 g na 1000 ml pufru. Při větším přidaném množství azidu sodného do Li pufrů může dojít ke koincidenci (splynutí) píku kyseliny asparagové a hydroxyprolinu. V sodných pufrech jsou jejich polohy opačné. 4.Pro přípravu pufrů používáme zásadně kvalitní čerstvou destilovanou vodu, která není kontaminována amoniakem. Navážky jednotlivých komponent pro 1000 ml provádíme s přesností 0,05 g. 5. Při rozpouštění je přípustné zahřát roztok na teplotu přibližně 60 C a mícháním napomáhat rychlejšímu rozpouštění. 2.4.2 Pøíprava øedícího pufru 0,1 M Li, ph 2,2 Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné měřit ph. Postačí jej připravit podle následující receptury. 2 INGS s.r.o. Strana 22
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA 9.5g citronan lithný 8.5 g kyselina chlorovodíková p.a. (33-35 %) 5,0 ml thiodiglykolu 0,1 g azid sodný destilovaná voda - doplníme na konečný objem 1000 ml. 2.4.3 Pøíprava regeneraèního roztoku LiH 0,3 M Li Tento roztok připravíme rozpuštěním 12.59 g LiH (MW 41,96) v 1000 ml destilované vody. Máme-li LiH s jinou MW, musíme provést přepočet. 2.4.4 Pøíprava eluèních roztokù a jejich výpoèet podle tabulky. Li pufry 1 2 3 4 5 M Li 0,18 0,20 0,35 0,33 1,20 M citr. 0,053 0,06 0,07 0,10 0,22 ph 2,90 3,10 3,35 4,5 4,65 H 27,26 3,7 35,17 38,48 41,65 Z 14,92 16,92 19,74 28,20 62,04 F 7,62 8,47 14,83 13,98 50,87 přísady TDG 2,5 2,5 2,5 - - N3Na 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Výpočet: Tab.4 Li pufry MW kyselina citrónová [g/l] = H : ph =A 210.14 citronan lithný [g/l] = Z - (A x 1.342) =B 281.93 chlorid lithný [g/l] = F - (B x 0.4509) 42.43 2 2.4.5 Vlastnosti Li pufrù Při hledání vhodného ph a ostatních partametrů pufrů je vždy nejdůležitější si uvědomit, které aminokyseliny (skupinu aminokyselin) nám bude pufr eluovat. ph pufrů neměříme. Posoudíme dělící vlastností pufru, jsou-li nevyhovující, připravíme nový pufr. Navážky vyhovujících pufrů si zapíšeme. Bývají neměnné, pokud neměníme analytické podmínky. Toto je veliká přednost systému pufrů INGS. V popise jsou uvedeny aminokyseliny a NHD pozitivní látky v pořadí ve kterém jsou eluovány z kolony. Pufr 1-0.18 M Li, ph 2,80 První Li pufr eluuje tyto aminokyseliny (NHD pozitivní látky): kyselinu cysteovou, taurin, fosfoethanolamin, močovinu, asparagovou kyselinu, hydroxyprolin, threonin, serin, asparagin, glutamovou kyselinu, glutamin. Eluce se provádí při základní teplotě 37 až 40C. Nejcitlivější na ph a teplotu je trojice asn, glu, gln. Z těchto tří je nejcitlivější a nejpohyblivější, při změnách ph a teploty, kyselina glutamová. INGS s.r.o. Strana 23
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA Tím je určena taktika přípravy purfu. ph a teplotu musíme upravit tak, aby kyselina glutamová byla přesně uprostřed mezi asn a gln. Zvýšením teploty a zvětšením ph se eluční čas kyseliny glutamové zkrátí a tato se přiblíží k asn a naopak.u tohoto pufru můžeme také provést posun kyseliny glutamové zkrácením doby stabilizace.čím kratší je doba stabilizace, tím je alkaličtější (rychlejší) první pufr a opačně. Jedná se o zkrácení o několik minut, max 15. Pufr 2-0,20 M Li, ph 3,05 Druhý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: kyselinu alfa amino adipovou, prolin, glycin, alanin, citrullin, kyselinu alfa amino máselnou a valin. Problém při dělení je pouze s citrullinem, který je velice citlivý na teplotu a ph. Jeho polohu je možné nastavit pomocí ph pufru (nový pufr). Většinou postačí upravit dobu přepnutí druhého pufru. Je-li citrullin eluován blízko alaninu, je druhý pufr méně kyselý (rychlejší), postačí posunout dobu jeho přepnutí o 2 až 3 min. Příklad: druhý pufr přepínáme v 16 min. provedeme tedy změnu přepnutí na 19 min. Totéž platí opačně, dělí-li se citrullin špatně od kyseliny alfa amino máselné. Někdy bývají drobné problémy s dělením prolinu. Zde musíme provést úpravu prvního pufru, aby ještě uspokojivě dělil trojici asn, glu, gln a současně se dělil dobře i pro ve druhém pufru. Pufr 3-0,36 M Li, ph 3,35 Třetí Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: cystin, methionin, cystathionin, isoleucin, leucin. Tento pufr není náročný na ph. Z eluovaných aminokyselin je problematický jen cystathionin, který je citlivý na ph i na teplotu. Volíme proto přepnutí na vyšší teplotu 60 C tak, aby byl cystathionin uprostřed mezi methioninem a isoleucinem. V případě pozdějšího přepnutí teploty je cystathionin eluován později a je nedostatečně oddělen od isoleucinu, v opačném případě je eluován v methioninu. Zpravidla nebývá rozdíl od základního času větší než o 5 min. Také je důležité, aby změna pufru proběhla za valinem a aby cystin byl eluován již v tomto pufru. Toto poznáme na grafu standardu tak, že cystin je štíhlejší a vyšší pík než valin. Pufr 4-0,33 M Li, ph 4,05 Čtvrtý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: tyrosin, fenylalanin, beta alanin a beta aminomáselnou kyselinu. U tohoto pufru nejsou žádné problémy, je-li pufrová změna provedena na správném místě. Změnu pufru poznáme snadno, za leucinem se objeví při analýze standardu typické zvlnění pufrové změny. V případě, že je provedena brzy je eluován leucin již ve 4 pufru je užší vyšší než ile. (leu je ve standardu ze čtveřice met,cystathionin,ile,leu nejnižší). Když je eluován pouze částečně 4 pufrem, projeví se to jeho nesymetričností. V tomto případě také neuvidíme typické zvlnění nulové linie zaviněné změnou pufru. Pozdní změna pufru se projeví velkou mezerou mezi leucinem a tyrosinem. Toho se využívá při použití vnitřního standardu norleucinu (nle), který je právě eluován za leucinem v tomto místě. Pufr 5-1.20 M Li, ph 4.65 Pátým pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: gama amino máselná kyselina, ethanolamin, amoniak, ornithin, lysin, histidin, 1-methyl histidin, 3-methyl histidin a arginin.tento pufr je bezproblémový. Pufrovou změnu musíme provést za kyselinou beta aminomáselnou, aby tato byla eluována ve 4 pufru. (má pík řádově stejně vysoký jako beta alanin.) V případě, že byl pufr přepnut brzy, je beta aminomáselná kyselina podstatně vyšší než beta alanin. Také zde je dobře patrná pufrová změna. 2 INGS s.r.o. Strana 24
Kapitola 2: CHEMICK-TECHNLGICKÁ KAPITLA Další pozornost musíme věnovat zařazení regenerace. Předčasné zařazení regenerace vede k deformaci píku argininu, nebo k jeho splynutí s regenerací. Pozdější zařazení regenerace se projeví podstatně pomalejším nárůstem nulové linie a v okamžiku, kdy přichází regenerace tento nárůst prudce stoupá. 2.4.6 Poznámky k Li provozu z praxe 1. Li pufry jsou mnohem agresivnější než Na, proto je vhodné přibližně jedenkrát měsíčně propláchnout, při maximálním průtoku, čerpadla teplou destilovanou vodou. Tuto nepouštíme do hydraulického systému. 2. Pro korekce časových změn přepínání pufrů použijeme kurzor, kterým odečteme časové hodnoty vzdáleností jednotlivých píků z grafu (ve výpočtové obrazovce). 3. Je nutné mít na paměti, že posuny časů přepnutí nižších pufrů se musí provést i u pufrů s vyššími čísly. Na př. pufr č 3 posuneme o 5 min, musíme tím samým směrem posunout přepnutí 4 a 5 pufru a regenerace též o 5 min. 4. V případě nouze lze provést analýzu volných aminokyselin též na ionexu STIN LG ANB, který převedeme do Li cyklu. 5. V případě značné kontaminace pufrů amoniakem nebo v případě práce se značně znečištěnými vzorky, se může stát, že nulová linie se obtížně ustaluje. Projeví se to pomalým sestupem na základní čáru. Start analýzy proběhne a nulová linie není ještě ustálena. V tomto případě nepostačí pouhá jednoduchá regenerace. Je nutné provést dvě regenerace. Dosáhneme tím dokonalou reprodukovatelnost. Doporučujeme tento postup: a. regenerace 0,3 M LiH po dobu 10 min, při teplotě 60 o C. b. stabilizace pufrem č. 1 po dobu 20 min, teplota 60 o C. c. regenerace 0,3 M LiH po dobu 15 mi při teplotě 60 o C. d. Stabilizace pufrem č.1 po dobu 50 min při teplotě 38 o C. e. Pro zlepšení reprodukovatelnosti doporučujeme nepřetržitý provoz. 6. Všechny úpravy a ladění pufrů se provádí pouze na počátku při zavádění programu, nebo při změně analytických podmínek. Podrobně jsou zde popsány proto, aby obsluhu nezdržovaly. V praxi se již úpravy pufrů neprovádí, pouze se navažují, nebo se vyrábí koncentráty, tak jak to bylo popsáno v kapitole přípravy Na pufrů. 2 2.4.7 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Li pufry Tyto předpisy jsou shodné s Na pufry, pouze jsou agresivnější vůči všem kovům, není vhodné je nechávat delší dobu ve styku s povrchy laků a kovů. 2.5 Pøíprava eluèních roztokù pufrù Celá tato problematika je součástí programu počítače, který obsluhuje analyzátor. Tento program nám po zadání ph vypočítá optimální složení pufru. V instrukci jsou potom vlastnosti jednotlivých pufrů i jejich úprava. Celá problematika elučních roztoků je též popsána ve stati 2.3. a 2.4.. INGS s.r.o. Strana 25
3. PØÍPRAVA VZRKÙ 3.1 Úvod Správně zvolený způsob přípravy vzorku je prvotním předpokladem správných a reprodukovatelných výsledků v automatické analýze aminokyselin. Chybný způsob přípravy vzorku může nejen vést k omylům v kvalitativní analýze a chybám při kvantitativním stanovení, ale může ohrozit i chod analyzátoru. Pro úspěšnou přípravu vzorku je žádoucí se nejprve seznámit s dostupnými literárními údaji o jeho spektru aminokyselin a jiných látek, jež mohou hrát roli při zpracování vzorků a interpretaci chromatogramu. Předběžná znalost přibližného obsahu aminokyselin je výhodná pro zvolení optimální navážky. K dávkování do automatického analyzátoru používáme zásadně pouze čiré roztoky, zbavené pevné fáze a koloidních příměsí. Přípravu vzorků lze rozdělit na uvolňování aminokyselin vázaných v bílkovinách, peptidech apod. hydrolýzou a na přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny (biologické tekutiny, tkáňové extrakty), z nichž odstraňujeme bílkoviny a jiné rušivé látky. V komplexních biologických materiálech často stanovujeme vázané i volné aminokyseliny. Vzhledem k neobyčejné rozmanitosti přírodního materiálu a k rozsáhlému použití automatické analýzy aminokyselin v řadě oborů, lze v této stati podat pouze orientační údaje o přípravě vzorků, jež doporučujeme konfrontovat se speciální literaturou v daném oboru. Při výběru metod přípravy vzorků byla v této stati dána přednost jednoduchým, v praxi prověřeným postupům, jež nejsou náročné na přístrojové vybavení. Máme-li však možnost, provádíme zejména přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny za nízkých teplot (používáme chlazených odstředivek, vakuové odpařování nahrazujeme lyofilizací apod.). 3.2 Bílkoviny a peptidy 3.2.1 Charakteristika materiálu dolnost peptidických vazeb vůči hydrolýze se liší v závislosti na druhu aminokyseliny a struktuře bílkoviny. Aminokyseliny uvolněné z peptidické vazby mohou podléhat různým rozkladným změnám účinkem hydrolyzačního činidla nebo jiných složek reakční směsi. Není proto možné získat absolutní údaje o obsazích aminokyselin při jediných podmínkách hydrolýzy. 3.2.2 Hydrolýza kyselinou chlorovodíkovou [1] Pro tuto nejběžnější metodu hydrolýzy 6N HCl, kterou získáme buď zředěním koncentrované kyseliny v poměru 1:1 destilovanou vodou, nebo destilací azeotropní směsi HCl s vodou (1:1) ve skleněné aparatuře s přídavkem malého množství SnCl2. Hydrolýzu provádíme ve zkumavce ze Sialu nebo Pyrexu, postupně vypláchnuté chromsírovou směsí (40g Cr3 do 600ml H2,po rozpuštění + 400ml H2S4),destilovanou vodou a 1N HCl. Zbytky HCl se odstraní v sušárně při 100 o C. Zkumavky pak uchováme v polyetylenových sáčcích, aby na nich nevznikly nálety NH4Cl. 3 INGS s.r.o. Strana 26
Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZRKŮ Vzorek diferenčně navážíme na dno zkumavky tak, aby materiál neulpěl na stěnách. Potom připipetujeme 6N HCl ve dvěstěnásobném přebytku. Ke kapalným vzorkům přidáme 12N HCl v objemu vzorku. Při stanovení navážek vycházíme z orientačního údaje, že 1mg bílkoviny obsahuje 0,3-1 mol jednotlivých aminokyselin. Na kyslíkovém plameni zúžíme vrch zkumavky na vnitřní průměr asi 2mm tak, aby nedošlo k zeslabení stěn. Roztok pak zmrazíme v mrazící lázni (aceton a suchý led) nebo v podchlazeném alkoholu. Pak vzorek evakuujeme přes kohout, uzavřeme a zkumavku v krčku zatavíme. Zkumavku vložíme do hydrolyzačního bloku nebo do vzdušného termostatu a ponecháme po dobu 20 hodin při teplotě 110 1 o C. Další stejně připravený podíl vzorku hydrolyzujeme 70 hodin. Po hydrolýze zkumavky ochladíme, nařízneme a odpukneme přiložením na konci rozžhavené tyčinky. Kyselinu odpaříme ve vakuovém rotačním odpařováku. Vzorky, jež nemohou být ihned po hydrolýze analyzovány neotvíráme a uskladníme je v lednici nebo mraznici. Pokud je ve vzorku přítomen cystein, je nutno odparek rozpustit v destilované vodě a po úpravě fosforečnanovým pufrem na ph 6,5 jej ponecháme 4 hodiny při laboratorní teplotě. Po této oxidaci cysteinu na cystin se vzorek okyselí 1N HCl a doplní na potřebný objem pufrem o ph 2,2. Neprovádíme-li oxidaci cysteinu, rozpouštíme odparek přímo v tomto pufru. 3 3.2.3 Zdroje chyb Přítomnost těžkých kovů v hydrolyzačním médiu, kam mohou být vneseny např. s HCl, zvyšuje ztráty threoninu, serinu, sirných aminokyselin a tyrosinu. Ke ztrátám sirných aminokyselin a chloraci tyrosinu přispívá rovněž nedokonalá evakuace vzorku a zejména přítomnost oxidačních činidel (např. methionin - sulfoxidu, dimetylsulfoxidu, iontu N3 - apod.). V přítomnosti nitroargininu se chloruje i fenylalanin. Ke ztrátám threoninu a serinu esterifikací přispívá přítomnost síranového iontu a starší způsob odstraňování HCl odpařením v exikátoru nad louhem, jež se projeví výskytem malých vrcholů v různých částech chromatogramu. Kyselina glutamová se za těchto podmínek částečně cyklizuje. Neúplné výtěžky některých aminokyselin jsou dány použitou metodou hydrolýzy HCl a nejsou prakticky odstranitelné. Cystin při hydrolýze recemizuje a poskytuje na chromatogramu plochý, asimetrický, obtížně integrovatelný pík. Přesnějších výsledků při stanovení sirných aminokyselin i s ohledem na možnou oxidaci při hydrolýze HCl lze dosáhnout oxidací vzorku před hydrolýzou (viz odst. 3.2.4 str. 28). Pro stanovení přesných obsahů isoleucinu a valinu, jež jsou obtížně uvolňovány z peptidických vazeb, používáme 70 hod. hydrolýzy. U threoninu a serinu dochází podle různých autorů při 20-24 hodinách hydrolýzy ke ztrátám ve výši 3-15%, přičemž je serin podle většiny údajů labilnější než threonin. Ztráty tyrosinu uváděné v literatuře pro tytéž časy hydrolýzy se pohybují v rozmezí 1-14%. Tryptofan je během kyselé hydrolýzy HCl ničen téměř úplně, píky jeho oxidačních produktů se však mohou objevit na chromatogramu před pozicí tryptofanu. statní aminokyseliny jsou podle většiny literárních údajů při 20-24 hodinové hydrolýze považovány za stabilní, resp. jejich ztráty lze s ohledem na přesnost stanovení zanedbat. INGS s.r.o. Strana 27
Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZRKŮ Pro získání údajů o skutečném obsahu labilních aminokyselin v intaktním vzorku z výsledků rozborů hydrolyzátů byla navržena řada metod, jejichž přehled podává Robel [3]. Nejjednodušší postup předpokládá reakční kinetiku I.řádu, provedení dvou hydrolýz při čase t 1 =20 hod. a t 2 =70 hod. a výpočet původního obsahu A 0 podle vzorce: loga 0 = t 2 loga t 1 t 2 t 1 loga 1 t 2 t 2 1 kde A 1,A 2 jsou zjištěné obsahy aminokyseliny A v časech t 1, t 2. Korekce na základě grafické interpolace [2], nebo obecně použitelná řešení metodou nelineárních nejmenších čtverců [3] vyžadují 4-5 dob hydrolýzy. 3.2.4 Pøíprava vzorku pro stanovení sirných aminokyselin [4] Nespecifickým redox reakcím sirných aminokyselin během hydrolýzy HCl zabráníme převedením cystinu a methioninu pomocí kyseliny permravenčí na stabilní oxidované deriváty - kyselinu cysteovou a methioninsulfon. Příprava oxidační směsi: 1 díl 30% H22 smísíme s 9 díly 88% kyseliny mravenčí, ponecháme stát 30 minut při laboratorní teplotě a vychladíme na 0 o C. Směs pak přidáme ke vzorku v poměru 1ml na 0,04 až 0,08mg cystinu (tj. asi 2mg bílkoviny) a ponecháme stát při 0 o C 4 hodiny. Vzorky, jež se v té době nerozpustí, ponecháme při této teplotě přes noc. xidační směs odpaříme na rotačním vakuovém odpařováku při 40 o C do sirupovité konsistence - úplné odpaření vzorku způsobuje ztráty cystinu. Po přidání 200násobného přebytku HCl pak vzorek podrobíme normální kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). xidovaný hydrolyzát zpravidla nepoužíváme ke stanovení ostatních aminokyselin, i když jsou kromě tyrosinu a tryptofanu vůči oxidaci stabilní. Výtěžek kyseliny cysteové lze poněkud zvýšit redukcí zbytků oxidační směsi před vakuovým odpařením pomocí HBr - podrobnosti viz [5]. 3.2.5 Urychlené odpaøování vzorkù po hydrolýze oxidaèní i bì¾né Po hydrolýze vzorek sfiltrujeme přes černou pásku do odměrné baňky 200 nebo 250 ml. Filtr promyjeme teplou vodou a doplníme po vychladnutí. K odpařování požíváme alikvot (20 nebo 25 ml), který spláchneme do 10 ml odměrné baňky a doplníme ředícím, pufrem ph 2.2. Tímto postupem si značně zrychlíme odpařování vzorku, jelikož odpařování objemu cca 150ml vzorku je značně zdlouhavé. dpaření 20ml trvá několik minut. 3.2.6 Pøíprava vzorkù pro stanovení aminocukrù Aminocukry vázané v glykoproteinech lze jako látky reagující s ninhydrinem dobře stanovit analyzátorem aminokyselin. Při běžných způsobech hydrolýzy jsou však větší části ničeny a tvoří součást tzv. huminů, jež se z hydrolyzátů odstraňují odstřeďováním či filtrací. Pro stanovení aminocukrů se používá hydrolýzy 4N HCl po dobu 1-4 hod. nebo 2N HCl po dobu 12 hod. při 100 o C. Postupuje se podle metody v části 3.2.2 str. 26, vyloučení kyslíku a těžkých kovů je zcela nezbytné. 3.2.7 Pøíprava hydrolyzátù pro stanovení tryptofanu Příprava vzorku pro stanovení tryptofanu vázaného v bílkovině je obtížná vzhledem k nízké stabilitě této aminokyseliny v obvyklých hydrolyzačních médiích, zvláště v přítom- 3 INGS s.r.o. Strana 28
Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZRKŮ nosti nebílkovinných složek. U čistých bílkovin neobsahujících cukry lze částečně zabránit rozkladu tryptofanu (dále jen trp) při kyselé hydrolýze přídavkem merkaptosloučenin k HCl nebo použitím aryl- a alkylsulfonových kyselin k hydrolýze. Pro vzorky obsahující cukry se užívá bazické hydrolýzy, při níž se výsledek tryptofanu snižuje oxidací vzdušným kyslíkem, uvolňováním křemičitanů ze stěn skleněných hydrolyzačních nádob (zvláště při použití NaH) a absorbcí tryptofanu na případných sraženinách a nerozpustných podílech reakční směsi. Podle většiny prací poskytuje nejvyšší výtěžky trp hydrolýza hydroxidem barnatým, odstraňování Ba(H)2 před ionexovou chromatografií je však pracné a může být zdrojem dalších ztrát. Dále jsou uvedeny dva příklady seriózně ověřených metod hydrolýzy pro stanovení tryptofanu. 3.2.8 Kyselá hydrolýza [6] K HCl přidáme 4% kyseliny thioglykolové p.a. a postupujeme jako při standardní kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). Výtěžěk tryptofanu činí 90%, vzorek však nesmí obsahovat cukry. Cystein vznikající při tomto způsobu hydrolýzy interferuje se stanovením prolinu. Kyselina thioglykolová poskytuje dva píky na chromatogramu, jeden v oblasti mezi píky kyseliny cysteové a asparagové, druhý na místě karboxymetylcysteinu. 3.2.9 Bazická hydrolýza [7] Tryptofan je uvolňován působením 4,2N NaH na vzorek umístěný v evakuované propylenové kyvetě za přídavku částečně hydrolyzovaného škrobu. Příprava částečně hydrolyzovaného škrobu: 50g bramborového škrobu se přidá ke směsi 99ml acetonu a 1ml koncentrované HCl. Směs se zahřívá 2 hodiny na 50 o C. Po přidání 25ml 1M octanu sodného se směs převede na fritu a promyje postupně 2l destilované vody a 2l acetonu. Produkt se vysuší v exikátoru. Lze použít i obchodního preparátu škrobu pro gelovou elektroforézu. Pro hydrolýzy nejprve připravíme roztok bílkoviny v 0,005N HCl nebo NaH, obsahující 0,1-0,5 mol trp na 1ml, 0,1ml tohoto roztoku se pipetuje do polypropylenové odstředivkové kyvety (11 x 50mm), přidá se 25mg částečně hydrolyzovaného škrobu a 0,5ml 5n NaH, čerstvě připraveného z 50% NaH. Kyveta se pak umístí do tenkostěnné zkumavky (16 x 150mm) a přidá se 5µl 1% roztoku oktanolu v toluenu pro zamezení pěnění. Zkumavka se přibližně v polovině vytáhne nad kyslíkovým plamenem do průměru asi 2mm. U tenkostěnné zkumavky to lze provést bez poškození plastické vložky. Pak se spodek zkumavky vychladí ve směsi acetonu a suchého ledu po 90s tak, aby nezmrzl obsah. Poté se evakuuje olejovou vývěvou, přičemž se spojením se zdrojem vakua několikrát přeruší a v případě, že vzorek příliš pění, se zkumavka opět ponoří do chladící lázně. Po dosažení evakuace po 50 m Hg se zkumavka zataví. Zatavená zkumavka se hydrolyzuje při 110 1 o C. Po dokonalém ochlazení se pak zkumavka otevře naříznutím a přiložením horké skleněné tyčinky. Ke vzorku se přidá 0,5ml sodnocitrátového pufru o ph 4,25 (nemá obsahovat BRIJ - 35) a směs se promíchá. Pak se roztok kvantitativně převede tímto pufrem do 5ml 3 INGS s.r.o. Strana 29