Mykologická laboratoř dermatovenerologické kliniky. VFN a 1.LF FVL

Mykologická laboratoř dermatovenerologické kliniky VFN a 1.LF FVL Přednosta: Prof.MUDr.Jiří Štork,CSc Primář: MUDr.Ivana Krajsová, MBA Vedoucí lékař: As.MUDr.Magdalena Skořepová, CSc Lékař: As.MUDr.Ivana Kuklová, CSc. Akreditované laborantky: Jiřina Stará Kateřina Sedláková Adresa: Mykologická laboratoř dermatovenerologické kliniky Fakultní poliklinika VFN Karlovo nám. 32 128 00 Praha 2 Telefon: 22496 6733, 34, 35 e-mail mykologie@vfn.cz mykologie.vfn@seznam.cz Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 1

1 EN ISO 15189 1.1 Zásady bezpečnosti práce pro osoby provádějící odběr vzorku biologického materiálu Při odběru vzorku od pacienta dodržuje odebírající osoba zásady stanovené vyhláškou MZČR. 207/1992 Sb. O hygienických požadavcích na provoz zdravotnických zařízení. Důsledně dbá na osobní hygienu a na řádnou dezinfekci vlastní pokožky (odběry nutno provádět v rukavicích). Veškerý odebraný materiál je nutno považovat za infekční. Na to je nutno pamatovat i při dalších manipulacích s ním. Při konzultacích s pacientem a při odběru vzorku pacientovi je nutno zajistit přiměřené soukromí. 1.2 Bezpečnostní aspekty při odběru a zacházení se vzorky Obecné zásady strategie bezpečnosti práce s biologickým materiálem jsou obsaženy ve Vyhlášce MZ ČR. 195/2005 Sb., kterou se upravují podmínky předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnění a hygienické požadavky na provoz zdravotnických zařízení a ústavů sociální péče. Shrnutí hlavních zásad: Při samotném odběru a při manipulaci se vzorky je nutno dodržovat následující podmínky: 1. Zabránit nevhodné manipulaci se vzorky. Každý vzorek je nutno považovat za infekční. Především je nutno zabránit: - poškození odběrové nádobky nebo materiálu - kontaminaci pokožky, oka a sliznic osoby, která přijde se vzorky do styku - poranění odběrovým nástrojem - požití části vzorku - vzniku infekčního aerosolu (v případě odběru z krku) 2. Zajistit dostupnost lékaře pro případ komplikací při odběru. V případě nevolnosti pacienta zajistit jeho pohodlí a soukromí (oddělená místnost) 3. Provádět s maximální opatrností manipulace s odběrovými nástroji. 4. Zajistit, aby průvodka ani vnější strana odběrové nádobky nebyla kontaminovaná odebraným materiálem. 1.3 Postup při nesprávné identifikaci na průvodce Při odběru je vždy kontrolována kartička pojišťovny! Při nedostatečné identifikaci pacienta na průvodce je neprodleně kontaktován odesílající subjekt a je s ním sjednána adekvátní náprava (tj. chybějící údaje jsou doplněny, nečitelné nebo špatné údaje jsou opraveny, je vyžádána nová průvodka apod). Není-li k dispozici údaj o odesílajícím oddělení, materiál se uskladní do dalšího projednání s odesílatelem (pokud nebyl zastižen při příjmu materiálu). Pokud by hrozilo nebezpečí nenahraditelné ztráty, materiál se zpracuje. Pokud v těchto případech nedojde k domluvě s odesílajícím lékařem, popř. není tento odesílající subjekt zjištěn, materiál se likviduje. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 2

1.4 Důvody k odmítnutí zpracování biologického materiálu Laboratoř může odmítnout zpracování materiálu v následujících případech: - na žádance nebo na biologickém materiálu nejsou uvedeny nebo nejsou čitelné údaje důležité pro identifikaci vzorku a pro styk se zdravotní pojišťovnou (číslo pojištěnce, jméno a příjmení, identifikace zdravotní pojišťovny, IČZ odesílajícího lékaře, základní diagnóza) a není možno tyto údaje doplnit či upřesnit na základy komunikace s ordinací ošetřujícího lékaře. - ke vzorku biologického materiálu není přiložena příslušná průvodka - odběrová nádobka není dostatečně označena nebo jsou údaje na ní nečitelné - nesouhlasí-li údaje uvedené na průvodce a na odběrové nádobce a není-li možno kontaktem s ošetřujícím lékařem tuto neshodu vyřešit - takový stav materiálu, u něhož zjevně došlo k porušení zásad při odběru, uložení či transportu a znehodnocen natolik, že jej nelze vyšetřit - došlo-li k silné kontaminaci průvodky, či vnější strany odběrové nádobky - jsou-li požadovaná vyšetření, která laboratoř neprovádí O odmítnutí zpracování biologického materiálu je žadatel neprodleně informován a je s ním sjednána náprava. Pokud jsou chybné, či chybějící údaje opraveny a doplněny, je vzorek předán ke zpracování. V ostatních případech je vzorek vyřazen. Ke zpracování vzorku lze přistoupit pouze v případě, jedná-li se o nenahraditelný nebo kritický vzorek. Pracovník, který takový vzorek přijal, ihned informuje žadatele a dohodne s ním další postup. Vzorek může být zpracován pouze na výslovnou žádost lékaře, který vyšetření vyžaduje. Veškeré skutečnosti související s takto zpracovaným vzorkem jsou uvedeny v komentáři k výsledkům. 1.5 Náležitosti laboratorních výsledků Výsledek je vydáván v papírové podobě jako laboratorní zpráva vytvořená z NIS. Jedná se o protokol s následujícími údaji: - identifikace laboratoře, která výsledek vydala - jednoznačná identifikace pacienta (celé jméno, rodné číslo) - identifikace zdravotní pojišťovny pacienta, popř. další informace (samoplátce, cizinec) - identifikace žadatele (jméno lékaře, jeho adresa, specializace, spojení) - datum přijetí vzorku laboratoří - datum tisku výsledku - jednoznačné označení vyšetření (o jaký materiál se jedná) - výsledek vyšetření a textová interpretace výsledku - jiné poznámky (skutečnosti, které mohly nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek) - adresa a telefon odesílající laboratoře - identifikace osoby, která autorizovala uvolnění nálezu a její podpis Výsledky jsou zálohovány v elektronické podobě. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 3

1.6 Formy vydávání výsledků Písemné zprávy Výsledky jsou vydávány v podobě písemných zpráv vytvořených v NIS. Výsledky jsou vždy před vydáním konfirmovány vysokoškolským pracovníkem laboratoře. Lékař výsledky podepisuje. Výsledky jsou distribuovány žadatelům prostřednictvím pošty. Telefonické hlášení výsledků Telefonicky lze výsledky sdělit pouze lékaři nebo sestře (žadateli o vyšetření). V žádném případě nesmí vzniknout jakákoliv pochybnost o identifikaci volajícího, tzn. vždy je vyžadováno jméno a funkce osoby, které je výsledek sdělován. Telefonicky sdělený výsledek je vždy následován písemnou zprávou. Vydávání výsledků pacientům Pacientům jsou výsledky vydávány pouze po osobní domluvě, po předložení kartičky pojišťovny. 1.7 Hlášení výsledků z vitálních indikací Výsledek vyšetření, který může být spojen s ohrožením základních životních funkcí pacienta nebo s nutností okamžitého lékařského zásahu (tj. vitální indikace), musí být sdělen požadujícímu lékaři nebo odpovědnému zdravotnímu personálu v co nejkratším časovém intervalu od zjištění. Proto neprodleně po nálezu hlásíme výsledek telefonicky ošetřujícímu lékaři. 1.8 Změny výsledků a nálezů Jedná se o změnu výsledků po jeho propuštění k tisku, resp. k žadateli (např. dodatečný průkaz pomaleji rostoucího patogena). Opravu může provést pouze lékař a schvaluje ji vedoucí laboratoře. Vedoucí laboratoře v tomto případě informuje telefonicky zasílajícího lékaře o chybném výsledku a sdělí mu způsob opravy. Jestliže nebyl protokol dosud odeslán, ale původní chybný výsledek byl již telefonicky nahlášen, musí být neprodleně telefonicky nahlášena změna výsledku. U všech změn nálezů nebo výsledků musí být vyznačeno datum, čas (je-li to vhodné) a jméno osoby, která změny provedla, případně důvod opravy. O opraveném výsledku musí být vedena v patřičném sešitě poznámka s jasným označením, že byl revidován. Opravený výsledek musí být znovu vytištěn s poznámkou, že se jedná o opravu výsledku a odeslán ordinujícímu lékaři. 1.9 Opakovaný výsledek Na žádost ordinujících lékařů je nutno často vytisknout opakovaný výsledek. Tato situace nastává při ztrátě výsledku u žadatele, případně při záměně lékařů a vložení chybných dat do NIS (v tomto případě je nutno kontaktovat oba lékaře odesílajícího i chybně obeslaného). Na vytištěný opakovaný výsledek je nutno napsat, že se jedná o opis. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 4

1.10 Intervaly od odebrání vzorku k vydání výsledku Kultivace dermatofytů trvá 21 dní. Po 1.a 2. týdnu jsou kultivace kontrolovány, v případě rychlejšího růstu a možnosti určení dermatofytu dříve je odeslán výsledek. Kvasinky jsou přeočkovány na rýžový agar a po dvou až třech dnech určeny, pokud je třeba, zpracovány Auxacolorem a je odeslán výsledek Interní kontrola kvality Půdy jsou sterilně připravovány ve varně půd Ústavu imunologie a mikrobiologie v KDDL z námi dodaných chemikálií. U každé dávky je prováděna kontrola růstových vlastností kultivačních půd, která je zapsána do protokolu odesílaného zpět. 1.11 Kontrola půd Sabouraudův glukózový agar s chloramfenikolem: Pozitivní kontrola: Candida albicans, 48 hod. při 37 C výsledek + Negativní kontrola: Escherichia coli, 48 hod. při 37 C výsledek Sabouraudův glukózový agar s chloramfenikolem a cykloheximidem: Pozitivní kontrola: Trichophyton mentagrophytes, 5 dní při 25 C výsledek: + Negativní kontrola:aspergillus niger, 5 dní při 25 C výsledek 1.12 Kontrola přístrojů Lednice: Denně je kontrolována a zapisována teplota v lednicích Termostaty: Denně je kontrolována a zapisována teplota v termostatech 1x ročně odborné vyčištění mikroskopů a vah 1.13 Konzultační činnost Individuální konzultace jsou umožněny kontaktem s odbornými pracovníky VŠ As.MUDr.Skořepovou na telefonním čísle 22496 6734 As.MUDr.Kuklovou na tel. Čísle 22496 6733 Prosté sdělování nálezů bez konzultační činnosti zajišťují laborantky na čísle 224966733,224966734. Upozornění a komentáře k výsledkům, které jsou lékařsky významné a mají vliv na posuzování výsledku, jsou uvedeny v textové části výsledkové zprávy. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 5

2 Poučení pacienta před mykologickým odběrem. K odběrům vzorků na mykologické vyšetření se není třeba objednávat, je však třeba písemná žádanka od lékaře "Poukaz na vyšetření/ošetření typ K. K žádance bývá přiložen lístek s adresou, telefony a časy odběrů ( prosíme dodržovat). S touto žádankou nemusíte procházet kartotékou, jdete přímo k odběrové ordinaci, dveře č. 5 a vyčkáte pokynů laborantky. Před odběrem se můžete normálně mýt i mýdlem, ale přehnaně nedrhnout. Pro odběry z nehtů a kůže platí: Nehty by měly být asi 14 dní narostlé, ne čerstvě ostříhané, a nenalakované, odlakované alespoň před 14 dny. Je nutné, aby pacient NEBYL léčen protiplísňovými prostředky kůže by neměla být před odběrem léčena antimykotiky alespoň 1 týden, vlasy 14 dní, NEHTY 6 TÝDNŮ! Jinak je výsledek falešně negativní. Centrum pro dermatomykózy, Karlovo nám.32, budova B, 3 patro, Telefon: 224 966 733,4,5 Bez objednání Bez poplatku Odběry: dveře č. 5 Pondělí 8 10 hod. Úterý 8 12 hod. Středa 13 15 hod. Čtvrtek 8 10 hod Toto poučení je posíláno lékařům, kteří je mají přidávat k žádance o mykologické vyšetření. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 6

3 Pracovní postupy 3.1 Odběry pro mykologické vyšetření Pomůcky: Sterilní tupé, nejlépe zubaté nástroje / skalpely, lancety nebo jiné vhodné / Sterilní pinzeta Nůžky Buničinové čtverečky Jednorázová podložka 70% alkohol Petriho misky, podložní a krycí skla 20% roztok KOH Gumové, pro případ alergického pacienta i vinylové rukavice Správná technika odběru je velmi důležitá, protože významně ovlivňuje výsledek mikroskopického i kultivačního vyšetření. Pacient přichází se žádankou od svého lékaře a s kartičkou pojišťovny. Před odběrem si přečte, vyplní a podepíše informovaný souhlas. V kabince si odloží a předá žádanku a kartičku laborantce, která informovaný souhlas podepíše a opatří datem a číslem vyšetření, stejně jako žádanku, kterou zkontroluje, očísluje a doplní kódy pro pojišťovnu. Obojí pak uloží do desek nebo krabice, pro další zápis. Kartičku vrátí pacientovi. Tyto materiály už s odebraným vzorkem nepřijdou do styku. Laborantka si připraví a očísluje Petriho misky, zkumavky, případně podložní skla, čísla musí souhlasit s čísly na žádance. Ložisko se očistí 70% alkoholem, který odstraní povrchové kontaminace. Výjimka je pouze u odběru na vyšetření pityriasis versicolor, kde by otření mohlo ovlivnit výsledek a u odběru ze sliznic. Nehty: Vhodným tupým nástrojem se odškrábne /odbrousí, odpiluje/ první podnehtová vrstva materiálu přímo do Petriho misky nebo na sklíčko, další vrstva /protože života schopné dermatofyty jsou uloženy hlouběji/ se naočkuje přímo do zkumavek se sterilním agarem, které se okamžitě uzavřou a uloží do stojánku. Ložiska na kůži: Odebírá se z okrajů ložiska, další postup je stejný. Kštice: Postup je stejný, navíc se z okraje ložiska sterilní pinzetou vytrhne několik vlasů i s kořínkem /to je velmi důležité/, vlasy se okamžitě uloží do kapky louhu na podložním skle a přikryjí krycím sklem. Sliznice: Výtěr sterilním tamponem, okamžité naočkování na agar. Glans penis: Otisk inkriminovaného místa přímo na sterilní agar v Petriho misce. Odběr je prováděn v místnosti k tomuto výkonu určené, je zaručeno soukromí. Medici nebo stážisté mohou být přítomni pouze se souhlasem pacienta. Po odchodu pacienta se povrchy, prostor odběru i klika v kabince desinfikují některým z používaných desinfekčních prostředků, které se po 14 dnech obměňují. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 7

Použité nástroje jsou uloženy do uzavřené nádoby s 2% roztokem Korzolexu, po skončení odběrů + ½ hodiny jsou opláchnuty tekoucí vodou, osušeny a připraveny pro sterilizaci. Použité jednorázové pomůcky jsou průběžně odkládány do uzavřeného koše, označeného nálepkou Infekční odpad, odkud jsou po skončení práce likvidovány. Rukavice jsou po umytí odloženy tamtéž. Laborantka si po odložení rukavic řádně umyje a vydesinfikuje ruce, osuší jednorázovým ručníkem. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 8

3.2 Mikroskopické vyšetření mykologické Šupiny z kůže, podnehtová drť, epilované vlasy. Varianta A: Materiál se odebírá přímo na podložní sklo nebo je dodán z ambulancí ve zkumavkách. Pomůcky a chemikálie: Bakteriologická klička, kahan, podložní sklo, krycí sklo, skleněná tyčinka ohnutá do tvaru V, skleněná Petriho miska o průměru 9 cm, mikroskop, 20% roztok KOH s inkoustem Parker, destilovaná voda. Materiál se umístí na podložní sklo a překryje 2-3 kapkami 20% KOH. Přikryje se krycím sklem, preparát se umístí do Petriho misky na podložku ze skleněné tyčinky tvaru V a podlije destilovanou vodou. Nechá se macerovat 30 minut až 1 hodinu. Prohlíží se pod zvětšením 100 200x. Subvarianta STATIM (u dětí při podezření na tinea capitis; u akutních, silně zánětlivých lézí): Materiál se umístí na podložní sklo a překryje 2-3 kapkami 20% KOH. Přikryje se krycím sklem, lehce se zahřeje nad plamenem a ponechá se macerovat jen 10 minut. Zároveň se z další části materiálu zhotoví standardní preparát. Použité sklo se odkládá do pytlů označených Infekční odpad ostrý a likviduje jako infekční odpad. Varianta B: Materiál se odebírá do sterilní plastové misky o průměru 5 cm, nejprve se naočkují kultivační půdy a ze zbytku materiálu v misce se zhotoví preparát. Pomůcky a chemikálie: Krycí sklo, mikroskop, 20% roztok KOH s inkoustem Parker. Šupiny se hranou krycího skla shrnou doprostřed misky, přikápnou se 2-3 kapky 20% roztoku KOH. Přikryjí se krycím sklem a miska se uzavře víčkem. Preparát se nechá macerovat 30 minut až 1 hodinu. Prohlíží se přímo v misce pod zvětšením 160-200x, detaily pod zvětšením 400x. Odečtené preparáty se ukládají do označeného pytle s infekčním odpadem a likvidují ve spalovně. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 9

Varianta C Fluorescenční vyšetření s blankoforem Vyšetření se dělá buď na sklíčku jako ve variantě A, nebo v misce jako ve variantě B. Pomůcky a chemikálie: Krycí sklo, event. podložní sklo, fluorescenční mikroskop, 20% roztok KOH s 2 % Ryluxu B. Postup při zhotovení preparátu je stejný jako u varianty A nebo B. Preparáty se prohlížejí fluorescenčním mikroskopem při zvětšení 160x 450x. Odečtené preparáty na sklíčkách se ukládají do pytlů s označením Infekční odpad ostrý. Plastové misky s odečteným preparátem se ukládají do označeného pytle s infekčním odpadem a likvidují ve spalovně. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 10

3.3 Kultivační vyšetření mykologické Šupiny z kůže, podnehtová drť, epilované vlasy Pomůcky a chemikálie: Plastové 15 ml zkumavky se šikmým agarem bez aktidionu (Sabouraudův agar s chloramfenikolem), plastové 15 ml zkumavky se šikmým agarem s aktidionem (Sabouraudův agar s chloramfenikolem a cykloheximidem), jednorázová očkovací klička nebo očkovací lanceta sterilizovaná vypálením. Sterilní kovové nasouvací zátky. Každý vzorek se očkuje do 2 zkumavek bez aktidionu a 1 zkumavky s aktidionem. Očkuje se 3 5 vpichy. Zkumavky se uzavřou kovovými zátkami a inkubují v termostatu při 26 C po dobu 3 týdnů u běžných vzorků, 6 týdnů při klinickém podezření na infekci Trichophyton verrucosum. Zkumavky se 1x týdně prohlížejí. Po 3 týdnech se roztřídí na: a) dermatofyty orientačně, b) kvasinky orientačně, c) oportunní hyfomycety a kontaminující saprofyty, e) negativní kultivace. Skupina a) dermatofyty - určují se dále pomocí mikrokultur, případně specielních testů (test perforace vlasu, ureázový test, kultivace na rýžových zrnech). Nálezy méně obvyklých dermatofytů se konzultují s MUDr. Karlem Menclem, mykologická laboratoř Nemocnice Pardubice. Skupina b) kvasinky stanoví se semikvantitativně jejich četnost (počet koloniíí 1 10, četně, masivně ), určují se dále pomocí mikrokultivace na agaru s rýžovým extraktem a testů Auxacolor. Při podezření na Candida dublinensis navíc kultivací při 45 C. Skupina c) saprofyty ojedinělé kolonie se považují za náhodnou kontaminaci a uzavírají jako negativní výsledek. Četný až masivní růst jednoho druhu v čisté kultuře při pozitivním mikroskopickém preparátu se považuje za podezřelý a hyfomycet se dále určuje pomocí mikrokultury, případně se posílá na katedru botaniky PřI FUK k dourčení. Pokud pacient nebyl ještě zaléčen, je pozván na opakovaný odběr z téhož místa pro potvrzení etiologie. Četný až masivní růst směsi různých druhů se považuje za kontaminaci a uzavírá jako saprofytická flóra. Odečtené zkumavky se odkládají do označených pytlů na infekční odpad a likvidují se ve spalovně. Použité jednorázové kličky se ukládají do označených pytlů na infekční odpad a likvidují ve spalovně. Použité kovové zátky se odkládají na ½ hodiny do nádoby s desinfekční prostředkem, po opláchnutí jsou sterilizovány pro další použití. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 11

Stěry ze sliznice dutiny ústní Pomůcky a chemikálie: Plastové Petriho misky o průměru 9 cm se Sabouraudovým agarem bez aktidionu bouraudův agar s chloramfenikolem). Materiál zachycený na odběrovém tamponu se rovnoměrně rozetře po povrchu agaru ve 2 navzájem kolmých směrech. Naočkované půdy se inkubují v termostatu 1 týden při 37 C. Po 3 dnech se prohlížejí, po týdnu se roztřídí na negativní a pozitivní (růst kvasinkových kolonií). U vyrostlých kvasinek stanoví se semikvantitativně jejich četnost (počet kolonií 1 10, četně, masivně ), určují se dále pomocí mikrokultivace na agaru s rýžovým extraktem a testů Auxacolor. Při podezření na Candida dublinensis navíc kultivací při 45 C. Použité odběrové tampony i jejich obaly se ukládají do označených pytlů na infekční odpad a likvidují ve spalovně. Petriho misky s kulturami se ukládají do označených pytlů na infekční odpad a likvidují ve spalovně. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 12

3.4 Určování kvasinek Kvasinky se určují na základě makromorfologie (tvar kolonie, tvorba pigmentu), mikromorfologie na agaru s rýžovým extraktem (tvorba pseudomycelia, pravého mycelia, chlamydospor, hlenového pouzdra) a utilizace substrátů v testu Auxacolor2. Mikromorfologie na agaru s rýžovým extraktem Potřeby a chemikálie: Plastová Petriho miska o průměru 9 cm s tence nalitou živnou půdou, sterilní krycí skla, jednorázová plastová klička, pinzeta sterilizovaná vypálením. Agar s rýžovým extraktem a 1% Tweenu 80 dle Taschdjianové. Světelný mikroskop. Zkoumaná kultura se řídce naočkuje vlnovkou na povrch agaru, přikryje sterilním krycím sklem a inkubuje 24 48 hodin v termostatu při teplotě 26 C. Poté se kultura prohlíží pod mikroskopem přímo v otevřené misce. Plastové misky s odečtenými kulturami a jednorázové plastové kličky se ukládají do označených pytlů s infekčním odpadem a likvidují ve spalovně. Test Auxacolor Potřeby a chemikálie: Souprava Auxacolor2, jednorázová plastová klička, plastová Pasteurova pipeta. Postup práce a odečítání výsledků jsou popsány v návodu k soupravě Auxacolor2. Odečtené plastové mikrotitrační destičky, nádobky se zbytkem suspenze kultury, jednorázové plastové kličky a pipety se ukládají do označených pytlů s infekčním odpadem a likvidují ve spalovně. Testy citlivosti na antimykotika Testy citlivosti na antimykotika provádí mikrobiologická laboratoř v areálu DAK, kam se narostlé kultury v případě potřeby posílají. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 13

3.5 Určování vláknitých hub Určování dermatofytů a oportunních hyfomycetů na základě morfologických charakteristik v mikrokultuře. Dermatofyty se určují vždy, oportunní hyfomycety jen tehdy, jestliže splňují kritéria dle Englishe: Mikroskopický preparát z materiálu musí být pozitivní. Hyfomycet roste masivně aspoň ve 2 ze 3 zkumavek. Hyfomycet roste v čisté kultuře, zejména nesmí být přítomen dermatofyt. Určují se především hyfomycety z rodů, které jsou známy jako možné kožní patogeny: Aspergillus, Scopulariopsis, Fusarium, Alternaria. Méně obvyklé izoláty se posílají k dourčení na katedru botaniky PřFUK. Testování citlivosti na antimykotika provádí mikrobiologická laboratoř v areálu DAK, kam se kultury v případě potřeby posílají. Nález ojedinělé kolonie oportunní houby se hodnotí jako náhodná kontaminace a uzavírá jako negativní. Nález masivního růstu směsi různých druhů se hodnotí jako kontaminace a uzavírá jako saprofytická flóra. Mikrokultura Potřeby a chemikálie: Petriho miska s tence nalitým Sabouraudovým agarem, sterilní skalpel, sterilní pinzeta (obojí sterilizováno vypálením), sterilní plastová Petriho miska o průměru 5 cm, očkovací háček sterilizovaný vypálením, sterilní krycí sklo, sterilní voda. Světelný mikroskop, podložní a krycí sklo, barvivo laktofenolová modř. Z agaru se vykrojí čtvereček 1x1 cm a přilepí na spodní stranu víčka malé Petriho misky. Na všechny 4 rohy se naočkuje částka mycelia ze zkoumané kultury. Agarový čtvereček se přikryje sterilním krycím sklem. Na dno malé Petriho misky se naleje tenká vrstva sterilní vody (k udržení vlhkosti) a víčko se přiklopí. Inkubuje se v termostatu při 26 C po dobu 1 2 týdnů. Ke zhotovení preparátu z mikrokultury se připraví podložní sklo s kapkou laktofenolové modři. Krycí sklo s ulpělým myceliem se sejme z agarového čtverečku a položí do kapky barviva na podložním skle. Fakultativně je možno zhotovit druhý preparát tak, že se na mycelium ulpělé na víčku plastové Petriho misky kápne roztok laktofenolové modři a přikryje krycím sklíčkem. Preparáty se prohlížejí pod světelným mikroskopem při zvětšení 200x 400x - 1000x a určují podle morfologických klíčů (Atlas of Clinical Fungi). Plastové Petriho misky se ukládají do označených pytlů s infekčním odpadem a likvidují ve spalovně. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 14

Ureázový test K rozlišení Trichophyton rubrum a T. interdigitale Potřeby a chemikálie: Jednorázová plastová zkumavka s Christensenovým agarem, očkovací háček sterilizovaný vypálením. Háčkem se nabere částečka mycelia ze zkoumané kultury a naočkuje vpichem do Christensenova agaru. Inkubuje se při pokojové teplotě v termostatu 5 dní k rozlišení T. rubrum a T. interdigitale, 10 dní k rozlišení T. rubrum a T. raubitschekii. Kritéria: T. rubrum ureázový test negativní T. interdigitale ureázový test pozitivní po 5 dnech T.raubitschekii ureázový test pozitivní po 10 dnech. Jednorázové plastové zkumavky i s obsahem se odkládají do označeného pytle na infekční odpad a likvidují ve spalovně. Kultivace na rýžových zrnech Ke stimulaci tvorby makrokonidií u rodu Microsporum. Potřeby a chemikálie: Petriho miska o průměru 5 nebo 9 cm s vrstvou vařených sterilizovaných rýžových zrn. Očkovací háček sterilizovaný vypálením. Podložní sklo, krycí sklo, světelný mikroskop. Barvivo laktofenolová modř. Háčkem se odebere částka mycelia z primokultury a naočkuje vpichem do středu misky. Inkubuje se v termostatu při 26 C po dobu 2 týdnů. Poté se háčkem sebere narostlé mycelium a vloží do kapky laktofenolové modři na podložním skle. Preparát se přikryje krycím sklem a prohlíží pod mikroskopem při zvětšení 160x až 450x. U makrokonidií se hodnotí jejich tvar, velikost, počet sept, tloušťka stěn a zrnitost povrchu. Plastová Petriho miska se ukládá do označeného pytle na infekční odpad a likviduje ve spalovně. Sklo se ukládá do pytlů s označením Infekční odpad ostrý. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 15

Test perforace vlasu K rozlišení Trichophyton rubrum a T. interdigitale. Potřeby a chemikálie: Sterilní plastová Petriho miska o průměru 9 cm, očkovací háček sterilizovaný vypálením, sterilní destilovaná voda, vysterilizované lidské vlasy, sterilní pinzeta, podložní sklo, krycí sklo, mikroskop. Na dno Petriho misky se naleje sterilní voda, do ní se vloží několik sterilizovaných vlasů a na ně se naočkuje částečka mycelia ze zkoumané kultury. Inkubuje se 3 dni při pokojové teplotě v termostatu. Poté se vlasy vyjmou, zhotoví se z nich nativní preparát a pozorují se pod mikroskopem. Trichophyton interdigitale vytváří perforační orgány, T. rubrum nikoli. Plastová Petriho miska i s obsahem se ukládá do označeného pytle na infekční odpad a likviduje ve spalovně. Postup při technické závadě ( rozsypání materiálu) Postříkat vhodným dekontaminačním čidlem, zakrýt buničinou, setřít, odložit do koše označeného Infekční odpad, vydesinfikovat plochu. Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 16

4 Labochemikálie 4.1 Rýžový agar Tvrdá rýže, která se nerozváří Vodovodní voda Agar Noble Tween 80 Destilovaná voda Vata 75 ml vodovodní vody 2 g rýže vařit 15 minut přefiltrovat několikrát přes vatu namočenou v dest. vodě / a vyždímanou/ K filtrátu přidat 2,5 g agaru Noble 1 ml Tween 80 Doplnit do 100 ml dest. vodou, autoklávovat obvyklým způsobem, rozlít do Petriho misek ve vrstvě 2 3 mm. Raději méně misek, a oblepit leukoplastí, případně zabalit do kuchyňské folie. / rychle vysychají./ 4.2 Tvrdý agar Sabouraudův agar Thiamin Agar Noble Chloramphenicol 0,6 g Sabouraudova agaru 2,5 mg thiaminu 20 mg chloramphenicolu 4 g agaru Noble dest. voda ad 100 ml autoklávovat, nalít do zkumavek šikmý agar 4.3 Agar na malassezie (Bond) Sabouraudův agar uvařený 2% olivového oleje 0,2% Tween 80 Nalít šikmo do sterilních zkumavek nebo do malých Petriho misek, Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 17

4.4 Christensenův agar Christensenův agar ad 1000 ml H2O 22g 4.5 Tabákový agar 50-80 g tabáku vařit v 1 l H2O, přidat 20 g agaru Noble, dobře zamíchat sterilizovat při 120 C 15 min. 4.6 Rýže pro Microsporum Rýže hustě na dně10 cm Petriho misky, po okraj zalít dest. vodou, autoklávovat 20 min. při 180 C. 4.7 Laktofenolová modř Krystalický fenol Kyselina mléčná Glycerin H2O 20 g po rozpuštění přidat Bavlníková modř 20 g 20 g 40 g 10 mg 4.8 Parkerův inkoust 20% KOH 89,5ml Parker superchrome Blue Black 51 10.5ml Glycerin 0,5ml Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 18

1 EN ISO 15189... 2 1.1 Zásady bezpečnosti práce pro osoby provádějící odběr vzorku biologického materiálu... 2 1.2 Bezpečnostní aspekty při odběru a zacházení se vzorky... 2 1.3 Postup při nesprávné identifikaci na průvodce... 2 1.4 Důvody k odmítnutí zpracování biologického materiálu... 3 1.5 Náležitosti laboratorních výsledků... 3 1.6 Formy vydávání výsledků... 4 1.6.1 Písemné zprávy... 4 1.6.2 Telefonické hlášení výsledků... 4 1.6.3 Vydávání výsledků pacientům... 4 1.7 Hlášení výsledků z vitálních indikací... 4 1.8 Změny výsledků a nálezů... 4 1.9 Opakovaný výsledek... 4 1.10 Intervaly od odebrání vzorku k vydání výsledku... 5 1.11 Kontrola půd... 5 1.12 Kontrola přístrojů... 5 1.13 Konzultační činnost... 5 2 Poučení pacienta před mykologickým odběrem.... 6 3 Pracovní postupy... 7 3.1 Odběry pro mykologické vyšetření... 7 3.2 Mikroskopické vyšetření mykologické... 9 3.3 Kultivační vyšetření mykologické... 11 3.3.1 Šupiny z kůže, podnehtová drť, epilované vlasy... 11 3.3.2 Stěry ze sliznice dutiny ústní... 12 3.4 Určování kvasinek... 13 3.4.1 Mikromorfologie na agaru s rýžovým extraktem... 13 3.4.2 Test Auxacolor... 13 3.4.3 Testy citlivosti na antimykotika... 13 3.5 Určování vláknitých hub... 14 3.5.1 Mikrokultura... 14 3.5.2 Ureázový test... 15 3.5.3 Kultivace na rýžových zrnech... 15 3.5.4 Test perforace vlasu... 16 3.5.5 Postup při technické závadě ( rozsypání materiálu)... 16 4 Labochemikálie... 17 4.1 Rýžový agar... 17 4.2 Tvrdý agar... 17 4.3 Agar na malassezie (Bond)... 17 4.4 Christensenův agar... 18 4.5 Tabákový agar... 18 4.6 Laktofenolová modř... 18 4.7 Parkerův inkoust... 18 Vytvořil As.MUDr.M.Skořepová,CSc,J.Stará, akr. laborantka 19