Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké Tel: +1 (203) 328-9500 nebo volání bez poplatku ve Spojených státech amerických, Kanadě a Portoriku (888) 329-0255, Fax: +1 (203) 328-9599 WWW.IMMUCOR.COM Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na: www.immucor.com P Ř Í L O H A K P R O D U K T U Typizační sada LIFECODES SSO HLA-Nulová alela Test pro diagnostiku in vitro OBSAH Definice symbolů.... 1 Návod k použití..... 4 Sady/činidla podle katalogového č.... 2 A. Purifikace genomové DNA.. 4 Úrčené použití.... 2 B. Amplifikace DNA (PCR).... 4 Shrnutí a vysvětlení..... 2 C. Hybridizace 5 Postup....... 2 D. Analýza vzorku pomocí nástroje Luminex... 5 Činidla.... 3 Výsledky. 6 A. Identifikace....... 3 Kontrola kvality.... 6 B. Varování a upozornění... 3 Omezení postupu..... 6 C. Pokyny pro uskladnění 3 Řešení problémů.. 7 D. Purifikace a aplikace..... 3 Očekávané hodnoty. 7 E. Indikace nestability.. 3 Specifické funkční charakteristiky.. 7 Požadavky na nástroje.. 3 Literatura... 7 Odběr a příprava vzorků... 3 Omezené licence.. 7 Postup....... 3 Použité obchodní značky..... 8 A. Dodávané materiály. 3 Příloha A..... 8 B. Požadované, ale nedodávané materiály, činidla a vybavení... 3 C. Doplňující materiály, které dodá uživatel... 3 DEFINICE SYMBOLŮ (Označení výrobku a doplňující dokumentace) Gelová elektroforéza..... 8 Interpretace gelu.... 8 Číslo šarže Katalogové číslo Teplotní omezení Horní teplotní hranice Použitelné do Chraňte před světlem Množství pro X testů Nezmrazovat Varování - viz návod k použití Viz návod k použití Výrobce Zplnomocněný zástupce Nebezpečí Strana 1 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA. LCT -N Typizační sada LIFECODES SSO HLA-Nulová alela, katalogové č. 628939 LC-N Typizační sada LIFECODES HLA-Nulová alela kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č. 629100-50 Činidlo Číslo výrobku Plnicí objem Uskladnění 50 MX-N1 MX-N2 BM-N LIFECODES Nulová alela třídy 1 Master Mix 629001 870 µl 2 až 8 C LIFECODES Nulová alela třídy 2 629002 870 µl 2 až 8 C Master Mix LIFECODES Probe Mix Nulová alela 629003 810 µl x 2 2 až 8 C Chraňte před světlem DS Ředící roztok 628515 19,7 ml 18 až 30 ºC Množství pro 50 testů TAQ Taq polymeráza LIFECODES 628075 25 µl x 2-10 až -30 ºC Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepoužívejte po překročení data exspirace. VAROVÁNÍ: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů, včetně Taq polymerázy LIFECODES, nebyly schváleny. URČENÉ POUŽITÍ Typizace DNA u alel I. a II. třídy pomocí typizačních sad LIFECODES HLA SSO. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Typizace HLA na základě amplifikace DNA pomocí metody PCR je běžný laboratorní postup. Metoda amplifikace (množení) DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je používána k rozšíření zvolené oblasti DNA. V rámci typizace HLA je proveden následný rozbor, jehož cílem je stanovit vlast nosti zmnožené DNA. Pro účely typizace HLA je možné použít několik typů technologií, jako je SSP (1), SSOP (2), RFLP (3) a reverse dot blot (4). Stejně jako metody SSOP a reverse dot blot využívají typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO k identifikaci alel HLA přítomných ve vzorku po amplifikaci PCR sekvenčně specifické oligonukleotidové sondy (SSO). Schopnost rozlišení různých alel přítomných v amplifikovaném vzorku PCR je dána sadou použitých SSO, nikoli uplatněnou metodou. Zatímco metody reverse dot blot a SSOP používají enzymy a kolorimetrické substráty vyžadující vytváření subsekvencí, metoda LIFECODES představuje homogenní systém umožňující mnohonásobný rozbor. To znamená, že všechny SSO jsou analyzovány zároveň a celý test probíhá v jediné reakční nádobě pomocí jediného reakčního činidla. POSTUP Proces typizace LIFECODES HLA-SSO je založen na hybridizaci jednovláknového specifického PCR produktu se sondou SSO. Amplifikace DNA pomocí PCR využívá ekvimolární dávky obou primerů (forward a reverse primer) k vytvoření dvouvláknové DNA. Pokud však dávka jednoho z primerů převýší druhý, bude výsledkem reakce kromě dvouvláknových produktů také několik jednovláknových DNA. Během prvních cyklů amplifikace LIFECODES je vytvořena dvouvláknová DNA. Jakmile dojde k vyčerpání limitujícího primeru, použije druhý primer dvouvláknový produkt jako templát pro vytvoření jednovláknové DNA. Touto metodou dojde k vytvoření dvou i jednovláknových produktů, které se po denaturaci budou společně podílet na hybridizační reakci. Každá ze sond může být homologická s amplifikovanou DNA, která je jedinečná pro alelu nebo skupinu alel. Jinými slovy jsou tyto sondy vytvořeny tak, aby každá z nich hybridizovala s upřednostňovanou komplementární oblastí, která může a nemusí být přítomna v amplifikované DNA. K tomu navíc amplifikovaná DNA hybridizuje s jednou nebo více sondami odpovídajícími sekvencím přítomným ve všech alelách lokusu. Typizace SSO může být ovlivněna typem biologického materiálu, metodou purifikace a množstvím a integritou genomové DNA. Z toho důvodu může signál získaný pomocí sondy sloužit jako ukazatel úspěšnosti procesu amplifikace a hybridizace. Signál získaný pomocí konvenční sondy může být také použit k normalizaci signálu alelových sond a k úpravě odchylek v množství amplifikovaného produktu v rámci hybridizační reakce. Rozbor výsledků získaných typizací SSO lze použít k určení přítomnosti či nepřítomnosti konkrétních sekvencí DNA v amplifikované DNA a k identifikaci možných alel ve vzorku. V případě typizace LIFECODES HLA-SSO jsou sondy vázány na mikrokuličky Luminex určené k použití s nástrojem Luminex. Je možné smíchat a pomocí nástroje Luminex provést rozbor až 100 různých populací mikrokuliček, neboť jednotlivé populace mikrokuliček se od sebe liší pro každou populaci jedinečným fluorescenčním znakem nebo barvou. Na různé barvy mikrokuliček lze navázat různé sondy SSO. Jednotlivé promíchané sondy lze t edy od sebe odlišit na základě jejich spojení s konkrétní barvou mikrokuliček. Nástroj Luminex je také schopen určit množství produktů PCR hybridizujících s mikrokuličkami Luminex. Z toho důvodu je možné použít signál získaný pomocí sond SSO během rozboru LIFECODES, stejně jako s jinými metodami SSOP, k označení sond s kladnou nebo zápornou reaktivitou se vzorkem amplifikované DNA (viz Oddíl Výsledky). Budou tak získány informace potřebné k určení HLA-fenotypu vzorku. Test Nula 1 slouží jako doplňující test určený k lepšímu rozlišení mezi analýzami LIFECODES HLA-A, HLA-B a HLA-C, a vyřešení alelické dvojznačnosti mezi A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N a C*04:01/04:09N. Nula 2 slouží jako doplňující test určený k lepšímu odlišení analýzy LIFECODES HLA-DRB3,4,5, a vyřešení alelické dvojznačnosti mezi DRB4* 01:03/DRB4* 01:03:01:02N a DRB5*01:02/DRB5*01:02/DRB5*01:08N Sloučení informací získaných z analýz Nula 1 nebo Nula 2 s výsledky získanými pomocí odpovídajících lokus-specifických typizačních sad LIFECODES SSO s cílem vytvořit doporučenou typizaci vzorku, je možné provést prostřednictvím ruční nebo softwarové analýzy. V případě ruční analýzy označuje informace získaná z testu Nula 1 nebo Nula 2 přítomnost či nepřítomnost specifických nulových alel. Výsledek testu provedeného pomocí odpovídajících lokusspecifických typizačních sad LIFECODES SSO může být nejednoznačný z důvodu těchto nulových alel (např. A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/DRB4* 01:03:01:02N či DRB5*01:02/DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Pokud je nulová alela přítomna ve výsledku Nula, všechny kombinace alel, které nezahrnují nulovou alelu, mohou být z výsledků získaných pomocí příslušné lokus-specifické typizační sady LIFECODES SSO vyřazeny. V případě, že je alela ve výsledku Nula nepřítomna, všechny kombinace alel, které zahrnují nulovou alelu, mohou být z výsledků získaných pomocí příslušné lokus-specifické typizační sady LIFECODES SSO vyřazeny. V příbalovém letáku produktu a v softwaru je tento proces kombinování výsledků dvou produktů označen jako slučování výsledků. Strana 2 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
ČINIDLA A. Identifikace Úplný seznam katalogových čísel viz tabulky v části Činidla podle katalogového čísla. B. Varování a upozornění 1. Test pro diagnostiku in vitro. 2. K manipulacím před PCR a po PCR použijte různé pipety. 3. Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními. 4. Ředící roztok, Probe mix, Taq polymeráza a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin obsahují zdraví nebezpečné složky. Zabraňte kontaktu s kůží a s očima, likvidaci všech materiálů po použití provádějte v souladu s místními nařízeními a předpisy. Více informací naleznete v Bezpečnostním listu (BL). C. Pokyny pro uskladnění 1. Vhodné skladovací teploty naleznete na štítcích umístěných na balení jednotlivých komponent. 2. Probe mix a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin jsou citlivé na světlo, CHRAŇTE JE PŘED SVĚTLEM a NEZMRAZUJTE. 3. Komponenty nepoužívejte po překročení data exspirace. D. Purifikace a aplikace Viz Odběr a příprava vzorků E. Indikace nestability 1. Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysrážely soli, před použitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového pohybu při pokojové teplotě (18 až 30 C). 2. Nepoužívejte R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin, který během přepravy nebo uskladnění prošel bodem mrazu. POŽADAVKY NA NÁSTROJE 1. Nástroj Luminex a platforma XY (Výrobky č. 888300 a 888310) 2. Schváleny byly následující termocyklery: 96-jamkový PCR systém 9700 GeneAmp nastavený na režim MAX (základní katalogové č. N8050200, Gold Block kat. č. 4314878), 96-jamkový termocykler Veriti nastavený na režim MAX 9700 (kat. č. 4375786). Maximální povolené rychlosti naleznete v tabulce 2. Upozornění: ostatní termocyklery a rychlosti nebyly schváleny. ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ A. Lidskou DNA lze purifikovat z plné krve, z buffy coat a z ústní sliznice pomocí schválených metod splňujících níže uvedená kr itéria. DNA získaná z krve uchované v EDTA a ACD (kyselina citrónová-citrát-dextróza) byla testována a prokázala vhodnost pro daný rozbor. B. DNA získaná z krve a uchovaná v heparinu nemůže být pro tento rozbor použita. Další konzervační látky nebyly testovány. C. Izolovaná DNA by měla být v 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mm D. Přítomnost alkoholu, čistidel a solí může nepříznivě ovlivnit amplifikaci DNA. E. Konečná koncentrace DNA by měla být 10 až 200 ng/µl. F. Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 až 2,0. G. Vzorky DNA se mohou použít ihned po jejich izolaci nebo uskladnit až na 1 rok při teplotě 20 ºC. Vyhněte se opakovanému zmrazování/rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA. POSTUP Upozornění: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů nebyly schváleny. A. Dodávané materiály (Více informací viz tabulky v části Sady/Činidla podle katalogového čísla). Příslušná směs Master Mix (MX) Příslušná směs/směsi Probe Mix (BM) Ředící roztok (ŘR) B. Požadované materiály, ale nedodávané materiály K potvrzení soupravy byly použity následující materiály: Luminex Sheath Fluid (1x, číslo v katalogu Lifecodes: 628005) Voda bez nukleázy, č. v katalogu Lifecodes: 757003, 20 ml) PCR zkumavky a víčka zkumavkové pásky Corning Thermowell (č. v katalogu Costar : 6542, č. v katalogu LIFECODES: 888640) nebo 96-jamkové PCR destičky Corning Thermowell (katalogové č. CLS6551) nebo 96-jamková PCR destička Themoscientific AB Gene Superplate (kat. č. AB-2100) Destička Costar (č. v katalogu Costar : 6509, č. v katalogu LIFECODES: 888630) C. Doplňující materiály, které dodá uživatel Míchačka (Vortex) Silikonová těsnící poduška Axygen Scientific, č. CM-FLAT nebo podobný výrobek Sonikační lázeň Špičky s filtrem Microcentrifuge Barrier Pipetovací nástavce, vícekanáloví pipety a špičky (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl) Software umožňující analýzu souboru Topný blok 70% isopropanol nebo 20% bělidlo Držák zásobníku Applied Biosystems, č. 403081 (použití pouze s termocyklerem 9700) Tabulka prahových hodnot, tabulka(y) výsledků detekce sondy Taq polymeráza LIFECODES* (č. v katalogu LIFECODES: 628075) x 2 Polyethylenová páska Thermowell Clear (č. v katalogu Costar : 6524, č. v katalogu LIFECODES: 888635 ) R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin (SA-PE), 1mg/ml (č. v katalogu LIFECODES: 628511) Kalibrační sady Luminex (kalibrační sada Luminex 100/200, souprava pro kontrolu výkonu Luminex 100/200, čísla v katalogu LIFECODES 628018 a 628019 v daném pořadí) Strana 3 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
NÁVOD K POUŽITÍ POZNÁMKY: Probe mix a SA-PE jsou citlivé na světlo: chraňte před světlem a nezmrazujte. Zahřívejte kuličky při 55 ºC až 60 ºC po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily. Při procesu rozpipetování dbejte zvýšené opatrnosti a používejte cejchované pipety. V opačném případě může dojít ke ztrátám reakční směsi a zmaření vzorku. Všechny teploty musí být přesně dodrženy a zachovány. I nízké výkyvy o např. +/- 0,5 C mohou ovlivnit výsledek. Ve stádiu hybridizace by neměly vzorky zůstávat v rozpuštěném stavu při 56 C déle než 5 minut (viz oddíl Výsledky). Doporučujeme provést rozbor amplifikovaných vzorků co nejrychleji. Pokud není možné zpracovat vzorky pomocí nástroje Luminex v tentýž den, je možné uchovat amplifikovaný produkt před použitím po dobu až 3 dnů při teplotě 2-8 ºC. V případě dlouhodobějšího uskladnění uchovávejte do okamžiku použití při teplotě 20 ºC po dobu až jednoho týdne. Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování způsobí poškození amplifikovaných vzorků a v případě následného rozboru povede ke špatným výsledkům. A. Purifikace genomové DNA pomocí zvolené metody; konečná koncentrace by měla být 10 až 200 ng/µl. V případě potřeby doplňte vodou bez nukleázy. U všech vzorků udržujte stejnou koncentraci. B. Amplifikace DNA (PCR) 1. Nechte Master Mix ohřát na pokojovou teplotu (18 C až 30 C). 2. Jemně míchejte spirálovým pohybem po dobu cca 10 vteřin. Bude tak zajištěna přítomnost solí v roztoku. Umístěte na krátkou dobu (5 až 10 vteřin) na mikrocentrifugu, aby se obsah dostal na dno zkumavky. 3. Podle Tabulky 1 níže připravte komponenty k amplifikaci pro n+1 reakcí pomocí hodnot určených pro jednotlivé komponenty v rámci reakce (kromě DNA). Pomocí vody bez nukleázy připravte konečný objem 20 µl na reakci. Jemně promíchejte. 4. Pomocí pipety umístěte odpovídající množství genomové DNA (40 až 120 ng) do zkumavek PCR. 5. Pomocí pipety umístěte amplifikační směs do PCR zkumavek obsahujících genomovou DNA. (Celkový objem amplifikační směsi a genomové DNA by měl být 20 µl na každou jednotlivou reakci.) 6. Zkumavky pevně uzavřete, aby nedošlo k úniku během PCR. 7. Umístěte vzorky do termocykleru a spusťte program, viz Tabulka 2 a Tabulka 3. Tabulka 1. Reakční komponenty pro amplifikaci Složka Množství na reakci PCR LIFECODES Master Mix 6µl Genomová DNA 10-200 ng/µl Celkem ~80 ng Taq polymeráza LIFECODES 0,2 µl (1 U) Voda bez nukleázy Až 20µl konečného objemu Tabulka 2. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Termocykler GeneAmp PCR System 9700 Režim (přechodová rychlost) Režim MAX (3,9 C/s) Termocykler Veriti 96-jamkový Režim MAX 9700 (3,9 C/s) Table 3. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Krok Teplota a inkubační doba Počet cyklů 1 95ºC po dobu 3 min 1 2 95ºC po dobu 15 s 60ºC po dobu 30 s 72ºC po dobu 30 s 12 3 95ºC po dobu 10 s 63ºC po dobu 30 s 72ºC po dobu 30 s 28 4 72ºC po dobu 2 min 1 5 4ºC stále 1 Poznámka: Informace o amplifikaci vzorku naleznete v sekci Gelová elektroforéza produktu (Příloha A). Strana 4 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
C. Hybridizace Ujistěte se, že jsou složky hybridizačního pufru v LIFECODES probe mixu rozpuštěny a kuličky důkladně rozptýleny. Zapněte nástroj Luminex a platformu XY a nechte je spuštěné po dobu 30 minut na zahřátí. 1. Zahřívejte probe mix při 55 ºC až 60 ºC na termálním bloku po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. 2. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozptýlily. 3. Smíchejte 15 µl příslušné směsi s 5 µl PCR pro konkrétní lokus a rozpipetujte do každé jamky 96-jamkové destičky termocykleru (Costar č. 6509). Pokud rozpipetováváte směs do více než 10 jamek, jemně směs promíchejte spirálovým pohybem po každých deseti jamkách. Destičku přelepte polyethylenovou páskou (Costar č. 6524). 4. Před provedením hybridizace umístěte na destičku silikonovou těsnící podušku. 5. Proveďte hybridizaci vzorků za následujících inkubačních podmínek: Tabulka 4. Podmínky termocykleru pro hybridizaci 97 ºC po dobu 2 min. 47 ºC po dobu 10 min. 56 ºC po dobu 8 min. 56 ºC HOLD Zajistěte, aby byl detekční laser na nástroji Luminex spuštěn alespoň 30 minut před ukončením hybridizace. 6. Zatímco probíhá hybridizace vzorků, připravte směs SA-PE/ředícího roztoku v poměru 1:200. Smíchejte 170 µl ředícího roztoku (ŘR) a 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE na vzorek. Doporučujeme připravit dostatečné množství směsi ředícího roztoku pro n+1 vzorků pro případ ztráty při pipetování. (Viz Tabulka 5) 7. Směs ředícího roztoku/sa-pe uchovávejte ve tmě při pokojové teplotě, SA-PE je citlivý na světlo! Ředící roztok je možné zahřívat na teplotu 45 ºC po dobu 5 minut a promíchat spirálovým pohybem, aby byla zajištěna přítomnost všech komponent v roztoku. Před vytvořením směsi musí mít ředící roztok pokojovou teplotu (18 až 30 C). Připravte vše před použitím a zbývající dávku dejte stranou. Tabulka 4. Objemy pro přípravu ředícího roztoku Počet vzorků Ředící roztok (ŘR) SA-PE 1 170 µl 0,85 µl 5 850 µl 4,25 µl 10 1 700 µl 8,5 µl 20 3 400 µl 17 µl 50 8 500 µl 42,5 µl Poznámka: NEPŘERUŠUJTE PROGRAM HYBRIDIZACE PŘED SEJMUTÍM DESTIČKY Z TERMOCYKLERU! 8. Při kroku 56 ºC HOLD, zatímco je destička na termocykleru, zřeďte každý vzorek pomocí 170 µl předem připravené směsi ředícího roztoku/sa-pe. Všechny vzorky je třeba naředit během 5 minut (po 8 minut trvajícím kroku HOLD při 56 C). 9. Sejměte destičku z termocykleru a umístěte ji do nástroje Luminex. D. Analýza pomocí nástroje Luminex* Aby byly získané výsledky co nejlepší, rozbor vzorků pomocí nástroje Luminex proveďte ihned. 1. Nástroj Luminex zapněte 30 minut až 4 hodiny před zahájením rozboru vzorků. 2. Před rozborem vzorků pomocí nástroje Luminex nastavte dávkovací běh (Batch Run) určený k rozboru vzorků. a) Zvolte Create a New Batch (Vytvořit novou dávku) z nabídky File (Soubor). Např. pokud provádíte rozbor Nula třídy I, přidejte dávku pro Nula třídy I. Šablona dávky je k dispozici na webu a v tomto případě má název Nula1 xxxxxx (č. sady). Podrobný postup vytváření dávek se objeví na obrazovce vytváření dávek. Při vytváření názvu dávky nepoužívejte čárky, neboť informace následující po čárce zmizí při exportu dat. Více informací o vytváření dávek a multi-dávek naleznete v uživatelské příručce Luminex b) Klikněte na ikonu vysunutí, držák destičky se vysune. Umístěte 96-jamkovou destičku se vzorky určenou pro termocykler do termálního bloku XYP umístěného na držáku destičky. c) Klikněte na ikonu Zasunout. Vzorky jsou připraveny k rozboru. Před spuštěním cyklu je třeba provést napuštění. d) Po vyjmutí vzorků z nástroje je třeba provést čištění nástroje pomocí 70% isopropanolu nebo 20% bělidla (čistícího přípravku pro domácnost) s následným dvojím omytím. Pokud již nástroj nebudete toho dne používat, můžete jej nyní vypnout. 3. Po dokončení běhu budou data exportována v podobě hodnot oddělených čárkami (csv). Získané soubory mají název OUTPUT.CSV a budou uloženy ve složce s názvem dávky. Data jsou poté k dispozici k provedení typizace, jak je popsáno níže. *Informace o používání nástroje Luminex naleznete v uživatelské příručce Luminex, která obsahuje pokyny ke spuštění, kalibraci, údržbě a vypnutí. Strana 5 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
VÝSLEDKY Typizaci vzorků lze provést následujícím způsobem: Otevřete vytvořené soubory CSV a získaná data zpracujte pomocí běžných tabulkových procesorů, jako jsou Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro apod. Rozbor probíhá v následujících krocích: 1) Zkontrolujte, zda je počet případů pro každý SSO v každém vzorku alespoň 60. Tuto informaci naleznete v DataType: oddíl Výpočet v souboru CSV. 2) Určete, že hodnoty pro konvenční sondy pro jednotlivé vzorky se nacházejí nad minimální hodnotou jejich mediánu intenzity fluorescence (MFI). Minimální prahové hodnoty se liší dle konkrétních sad a je možné je zjistit z tabulky prahových hodnot. Upozornění: Abyste získali spolehlivé výsledky, potřebujete zajistit dostatečné množství dat získaných pomocí nástroje Luminex. Pro každý SSO získejte alespoň 60 případů. 3) Odečtěte kontrolní hodnotu pozadí pro jednotlivé sondy od hodnot vzorku a získejte tak soubor dat upravený na základě kontrolních hodnot. Kontrolní hodnoty pozadí naleznete v tabulce prahových hodnot po jednotlivé sady. Hodnoty pozadí jsou průměrné hodnoty MFI (mediánu intenzity fluorescence) pro jednotlivé kuličky, určené ke kompenzaci šumu pozadí způsobeného proměnlivostí kuliček. 4) Pro každý vzorek vydělte data upravená na základě pozadí pro jednotlivé sondy hodnotou upravenou na základě pozadí pro odpovídající konvenční sondu a získejte normalizovanou sadu dat. MFI (sonda) MFI (kontrola pro sondu) MFI (konvenční) MFI (kontrola pro konvenční hodnotu) 5) Získané hodnoty pro jednotlivé sondy zaneste do pracovního listu v tabulce prahových hodnot. 6) Jakmile budou zaneseny všechny hodnoty, je možné porovnat vzorec výsledků detekce sondy (tj. kombinace všech kladných a záporných zadání pro daný vzorek) s tabulkou (LC1024) obsahující detekované výsledky, která je k dispozici na webové stránce. Upozornění: Pro každý lokus existuje zvláštní tabulka prahových hodnot. Tabulky prahových hodnot jsou určeny pro konkrétní sady, ujistěte se, že číslo sady uvedené v tabulce prahových hodnot je shodné s číslem typizační soupravy. Pokud se stane, že normalizovaná hodnota pro konkrétní sondu stoupne nad maximální prahovou hodnotu v případě záporného zadání a pod minimální hodnotu v případě kladného zadání, bude vzorek pro tuto sondu považován za neurčitý. Vzorky musejí být typizovány tak, že se nejprve přijme záporná hodnota a poté kladná. Více informací o prahových hodnotách naleznete v oddíle OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY. KONTROLA KVALITY Doporučujeme provést jednu zápornou a jednu kladnou kontrolu v rámci každého testu, jako je test pomocí vody a poté pomocí př edem typizovaného vzorku. Konvenční sondy SSO uvedené v tabulce prahových hodnot hybridizují s alelami příslušných lokusů. Hodnoty získané s konvenčními SSO z pozitivních kontrol by měly mít vyšší než prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Směsi Probe mix LIFECODES obsahují jednu nebo více konvenčních sond SSO identifikovaných v pracovních listech typizačních souprav. Tyto konvenční sondy hybridizují se všemi alelami a chovají se jako interní kontroly sloužící k ověření amplifikace a potvrzení provedení hybridizací. Jestliže pro tyto SSO není dosaženo minimální hodnoty, vzorek nemůže zajistit správnou typizaci a testování vzorku musí být provedeno znovu. Rozbor je třeba provést podle doporučení uvedených v příbalovém letáku a dále pomocí jiných kontrolních postupů, které jsou v souladu s místními, státními a federálními předpisy a/nebo předpisy institutu pro akreditaci. OMEZENÍ POSTUPU Podmínky PCR a popsané podmínky rozboru vyžadují přesné dodržení stanovených podmínek. Nedodržení těchto parametrů může mít za následek chybný vzorek. Všechny nástroje musejí být kalibrovány v souladu s doporučeními výrobce a předepsanými parametry. 1) Před použitím je třeba kuličky předehřát a důkladně rozpustit. Tím je zajištěna přítomnost složek hybridizačního pufru v roztoku. 2) Inkubace při 47 ºC a 56 ºC vyžaduje vysoký stupeň přesnosti (+/- 0,5 ºC). Je třeba použít termocykler. Teplotu v 96 jamkách destičky termocykleru je třeba kontrolovat pomocí termočlánku (např. Bio-Rad, Model VPT-0300 apod.). Rozdíl teplot v jamkách a mezi jednotlivými jamkami by neměl překročit +/- 0,5 ºC. 3) Celková doba při 56 ºC nesmí překročit 15 minut. To zahrnuje 13-minutovou inkubaci a k tomu max. 8 minut určených k naředění všech vzorků pomocí směsi ředícího roztoku/sa-pe. 4) Po rozpuštění je nutné provést rozbor vzorku během jedné hodiny (mimo dosah světla). 5) Nemíchejte komponenty z jiných souprav a sad. Z důvodu složité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál. Strana 6 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PROBLÉM MOŽNÁ PŘÍČINA ŘEŠENÍ Nízký počet kuliček Směs Probe Mix nebyla důkladně rozpuštěna Probe mix předehřejte, sonikujte a spirálovým Chyba prahových hodnot CON Množství špatných SSO nebo vzorek nesplňuje výsledek typizace HLA Nástroj nefunguje správně Amplifikace vzorku neproběhla, nebo jen slabě* Chybná kalibrace Cesta toku vzorku je zablokována. Nízký obsah DNA Soli ve směsi Master Mix se nerozpustily Slabá Taq polymeráza Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry Nízká hodnota střední intenzity fluorescence (MFI) Amplifikace konkrétní alely Vzorek DNA byl kontaminován DNA je částečně poškozena Odpařování během hybridizace Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry *Amplifikaci PCR je možné ověřit pomocí gelové elektroforézy (viz Příloha A). pohybem promíchejte a zkoušku opakujte. Proveďte kalibraci nástroje. (Viz uživatelská příručka Luminex IS.) Odstraňte a sonikujte jehlu. Proveďte zpětný proplach. Pokud problém přetrvává, zavolejte Immucor Transplant Diagnostics, Inc. na číslo: (888) 329-0255 Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA. Zahřívejte Master Mix při teplotě 37 ºC po dobu 5 minut, jemně promíchejte spirálovým pohybem a nechte krátce ustát. Použijte schválenou Taq polymerázu LIFECODES, katalogové č. 628075 Spusťte tepelný profil na termocykleru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Před použitím zahřívejte ředící roztok při 45 ºC po dobu 5 minut a promíchejte spirálovým pohybem. Skladujte při pokojové teplotě. Vyměňte R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin. Spusťte tepelný profil na termocykléru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Znovu izolujte DNA z krevního vzorku. Pokud nevyužíváte celou destičku, nechte jednu řadu po každé straně vzorků prázdnou, aby bylo možné destičku důkladně utěsnit. OČEKÁVANÉ HODNOTY Na každém lokusu je jedna sonda CON a dvě sondy SSO. Pokud vzorek obsahuje jeden z testovaných lokusů, sonda CON a alespoň jedna z obou SSO sond pro daný lokus musejí být kladné. Hodnoty sond je možné označit za buďto kladné, nebo záporné. Ve vzácných případech se může hodnota nacházet mezi hranicí pro kladný a záporný výsledek, a je pak považována za neurčitou. V případě, že vzorek obsahuje neurčité hodnoty pro konkrétní sondu SSO, je třeba vzorek typizovat sondou jako záporný a poté jako kladný. Pokud jsou obě SSO sondy pro daný lokus neurčité, vzorek není možné typizovat a test musí být proveden znovu. Jak je uvedeno v oddíle Omezení postupu, je nezbytné přesně dodržovat protokol. Případné odchylky mohou mít za následek špatnou typizaci. SPECIFICKÉ FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Pokud jsou typizační soupravy LIFECODES HLA SSO Nulová alela použity v souladu s postupem popsaným v příbalovém letáku, je možné stanovit typ HLA třídy I a II ve vzorcích DNA. Výsledek testu HLA Nulové alely třídy I (Nula1) vykazuje 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus A, 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus B a 100% shodu (97,4% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus C na 139 vyhodnocených vzorků ve srovnání s výsledky získanými obousměrným sekvenováním. Výsledek testu HLA-Nulové alely třídy II (Nula2) vykazuje 97,1% shodu (92,7% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus DRB 4 a shodu 98,5% (94,8% nižší hranice z 95% intervalu spolehlivosti) pro lokus DRB 5 na 137 vyhodnocených vzorků ve srovnání s výsledky získanými obousměrným sekvenováním. LITERATURA 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 OMEZENÉ LICENCE Taq polymerázu vyrobila pro Immucor Transplant Diagnostics společnost Promega Corp. Maitelem licence na tento produkt je společnost Promega a produkt je chráněn v USA patenty 5,338,671 a 5,587,287, a v ostatních zemích odpovídajícími místními patenty. Zakoupením tohoto výrobku získáte omezenou nepřenosnou licenci zapsanou v USA pod patentovým číslem 5,981,180, nebo její zahraniční obdobu, která je majetkem Luminex Corporation, a která vám umožní provádět vícenásobné rozbory klinických vzorků za účelem typizace HLA. Výrobce: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké Tel.: +1 (203) 328-9500, 888-329-0255 Fax: +1 (203) 328-9599 Autorizovaný zástupce: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322, Germany Phone: (+49) 6074-84 20-0, Fax: (+49) 6074-84 20-99 Technický servis pro Evropu: Tel.: +32/3 385 4791 Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 3, 2015-05-15 Strana 7 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)
POUŽITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. PŘÍLOHA A Gelová elektroforéza PCR reakce provedené prostřednictvím typizačních sad LIFECODES HLA-SSO jsou určeny k vytváření jak dvouvláknových, tak i jednovláknových produktů, které představují dominantní produkty hybridizující s SSO. Za účelem zajištění dobré kvality či odstranění problémů může být nezbytné provést gelovou elektroforézu s cílem ověření PCR reakce a přítomnosti amplifikované DNA. Požadované materiály (viz seznam nebo odpovídající výrobky) Agaróza pro elektroforézu (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose č. 50170) Elektroforézní přístroj/zdroj energie Gelový pufr - 1X (40xTAE, Promega č. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535) UV transiluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36) Fotografický systém Relativní migrace jednovláknových produktů závisí na koncentraci gelu a použitém pufru. Přibližné migrace pro jednotlivé amplifikace jsou uvedeny níže pro vzorky v 2% agarovém gelu a pufru 1X TAE. Podmínky elektroforézy 1. Vyjměte GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535) z mrazáku a nechte rozmrznout. Uchovávejte ve tmě. 2. Gel použitý pro tento postup musí být 2%, tj. na 200 ml gelu použijte 4 gramy agarózy a 200 ml 1X TAE (naředit z 40X TAE). Přidejte 10µl GelStar Nucleic Acid Stain, čímž agaróza získá tekutou podobu. Při rozlévání gelu je třeba nechat dostatek prostoru pro DNA (2,5 až 5 cm). UPOZORNĚNÍ: GelStar je potenciální karcinogen. POZNÁMKA: Místo GelStar Nucleic Acid Stain je možné použít gely s 20 µl ethidium bromidu 10mg/ml. V gelech s ethidium bromidem bude výsledný produkt zastoupen méně výrazně než v gelech s GelStar. UPOZORNĚNÍ: Ethidium bromid je známý karcinogen. 3. Gely uložte na tmavé místo a nechte je ztuhnout. 4. Použijte směs 2,5 µl každého PCR produktu a 2,5 ll 2X pufru se zřejmým zbarvením na vzorek a na amplifikaci. Umístěte gel na tmavé místo při cca 160 voltech na 45 minut, nebo dokud nebude ve vzorku možné pozorovat oddělené pásky jedno a dvouvláknového produktu (modrý bromofenol nebo jiný marker migruje 2,5 až 5 cm od jamek). 5. Vyfotografujte pomocí UV transiluminátoru za použití žlutého fotografického filtru GelStar (Lonza Group, Ltd. č. 50536). UPOZORNĚNÍ: Při práci s GelStar Nucleic Acid Stain nebo ethidium bromidem a při fotografování gelu pomocí UV transiluminátoru používejte ochranné pomůcky. 6. Rozbor gelu Nula třída 1 Nula třída 2 Dvě vlákna (bp) ~210, ~280 ~180, ~280 Jedno vlákno (bp) ~150,~180 ~140,~180 Interpretace gelu Jamka Amplifikace proběhla Amplifikace neproběhla Dvouvláknová DNA Jednovláknová DNA ------- (jasný výsledek) -------- ( méně jasný výsledek) Pásmo primeru Strana 8 z 8 LC1437CECS.3 (05/15)