Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na:

Transkript

1 Immucor GTI Diagnostics, Inc Crossroads Circle, Waukesha, WI Spojené státy americké Tel: +1 (855) Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na: TYPIZAČNÍ SOUPRAVY LIFECODES HLA-SSO Test pro diagnostiku in vitro OBSAH Definice symbolů Návod k použití Sady/činidla podle katalogového č A. Purifikace genomové DNA.. 6 Úrčené použití B. Amplifikace DNA (PCR) Shrnutí a vysvětlení C. Hybridizace 7 Postup D. Analýza pomocí nástroje Luminex... 7 Činidla... 5 Výsledky. 8 A. Identifikace Kontrola kvality B. Varování a upozornění... 5 Omezení postupu C. Pokyny pro uskladnění 5 Řešení problémů.. 9 D. Purifikace a aplikace Očekávané hodnoty. 9 E. Indikace nestability.. 5 Specifické funkční charakteristiky.. 9 Požadavky na nástroje.. 5 Literatura Odběr a příprava... 5 Omezené licence.. 10 Postup Informace o výrobci A. Dodávané materiály. 5 Použité obchodní značky B. Požadované, ale nedodávané materiály, činidla a vybavení... 5 C. Doplňující materiály, které dodá uživatel... 5 DEFINICE SYMBOLŮ (Označení výrobku a doplňující dokumentace) Příloha A Gelová elektroforéza Interpretace gelu Číslo šarže Katalogové číslo Teplotní omezení Horní teplotní hranice Použít podle datum Chraňte před světlem Množství pro X testů Nezmrazovat Varování - viz návod k použití Konzultovat návod k použití Výrobce Zplnomocněný zástupce v zemi EU Nebezpečí Strana 1 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

2 SADY/ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA LCT-A Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-A, katalogové č Typizační sada LM-A LIFECODES HLA-A kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-A LIFECODES HLA-A Master Mix µl BM-A LIFECODES HLA-A Probe Mix µl DS Ředící roztok ,9 ml 18 až 30 ºC LCT-AE Testovací sada LIFECODES eres pro SSO typizaci alel HLA-A, katalogové č Typizační sada LC-AE LIFECODES HLA-A eres kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-A LIFECODES HLA-A Master Mix µl BM-A LIFECODES HLA-A Probe Mix µl BM-AeRES LIFECODES HLA-A eres Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7 ml 18 až 30 ºC LCT-B Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-B, katalogové č Typizační sada LM-B LIFECODES HLA-B kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-B LIFECODES HLA-B Master Mix µl BM-B LIFECODES HLA-B Probe Mix µl DS Ředící roztok ,9 ml 18 až 30 ºC LCT-BE Testovací sada LIFECODES eres pro SSO typizaci alel HLA-B, katalogové č Typizační sada LC-BE LIFECODES HLA-B eres kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-B LIFECODES HLA-B Master Mix µl BM-B LIFECODES HLA-B Probe Mix µl BM-BeRES LIFECODES HLA-B eres Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7ml 18 až 30 ºC Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepoužívejte po překročení data exspirace. VAROVÁNÍ: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů, včetně Taq polymerázy LIFECODES, nebyly schváleny. Strana 2 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

3 SADY/ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA (pokračoval) LCT-CE Testovací sada LIFECODES eres pro SSO typizaci alel HLA-C, katalogové č Typizační sada LC-CE LIFECODES HLA-C eres kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-C LIFECODES HLA-C Master Mix µl BM-CeRES LIFECODES HLA-C eres Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7 ml 18 až 30 ºC LCT-DR1 Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DRB1, katalogové č Typizační sada LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Master Mix µl BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Probe Mix µl Chraňte před světlem DS Ředící roztok ,9ml 18 až 30 ºC LCT-DR1E Testovací sada LIFECODES eres pro SSO typizaci alel HLA-DRB1, katalogové č Typizační sada LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eres kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Master Mix µl BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Probe Mix µl BM-DR1eRES LIFECODES HLA-DRB1 eres Probe Mix µ Chraňte před světlem Chraňte před světlem DS Ředící roztok ,7ml 18 až 30 ºC LCT-DRB3,4,5 Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DRB3,4,5, katalogové č Typizační sada LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Master Mix µl BM-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7 ml 18 až 30 ºC Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepoužívejte po překročení data exspirace. VAROVÁNÍ: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů, včetně Taq polymerázy LIFECODES, nebyly schváleny. Strana 3 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

4 SADY/ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA (pokračování) LCT-DQAB Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DQA1/B1, katalogové č Typizační sada LM-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-DQB BM-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 Master Mix µl LIFECODES HLA-DQA1/B1 Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7 ml 18 až 30 ºC LCT-DPAB Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DPA1/B1, katalogové č Typizační sada LM-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 kompatibilní s technologií Luminex Výrobek č MX-DQB BM-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 Master Mix µl LIFECODES HLA-DPA1/B1 Probe Mix µl DS Ředící roztok ,7 ml 18 až 30 ºC Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepoužívejte po překročení data exspirace. VAROVÁNÍ: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů, včetně Taq polymerázy LIFECODES, nebyly schváleny. URČENÉ POUŽITÍ Použití:Typizace DNA u alel HLA I. a II. třídy - na pomoc při transfuzi a transplantaci od dárce a výběr vhodného příjemce. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Typizace HLA na základě amplifikace DNA pomocí metody PCR je běžný laboratorní postup. Metoda amplifikace (množení) DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je používána k rozšíření zvolené oblasti DNA. V rámci typizace HLA je proveden následný rozbor, jehož cílem je stanovit vlastnosti zmnožené DNA. Pro účely typizace HLA je možné použít několik typů technologií, jako je SSP (1), SSOP (2), RFLP (3) a reverse dot blot (4). Stejně jako metody SSOP a reverse dot blot využívají typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO k identifikaci alel HLA přítomných ve vzorku po amplifikaci PCR sekvenčně specifické oligonukleotidové sondy (SSO). Schopnost rozlišení různých alel přítomných v amplifikovaném vzorku PCR je dána sadou použitých SSO, nikoli uplatněnou metodou. Zatímco metody reverse dot blot a SSOP používají enzymy a kolorimetrické substráty vyžadující vytváření subsekvencí, metoda LIFECODES představuje homogenní systém umožňující mnohonásobný rozbor. To znamená, že všechny SSO jsou analyzovány zároveň a celý test probíhá v jediné reakční nádobě pomocí jediného reakčního činidla. POSTUP Proces typizace LIFECODES HLA-SSO je založen na hybridizaci jednovláknového specifického PCR produktu se sondou SSO. Amplifikace DNA pomocí PCR využívá ekvimolární dávky obou primerů (forward a reverse primer) k vytvoření dvouvláknové DNA. Pokud však dávka jednoho z primerů převýší druhý, bude výsledkem reakce kromě dvouvláknových produktů také několik jednovláknových DNA. Během prvních cyklů amplifikace LIFECODES je vytvořena dvouvláknová DNA. Jakmile dojde k vyčerpání limitujícího primeru, použije druhý primer dvouvláknový produkt jako templát pro vytvoření jednovláknové DNA. Touto metodou dojde k vytvoření dvou i jednovláknových produktů, které se po denaturaci budou společně podílet na hybridizační reakci. Každá ze sond může být homologická s amplifikovanou DNA, která je jedinečná pro alelu nebo skupinu alel. Jinými slovy jsou tyto sondy vytvořeny tak, aby každá z nich hybridizovala s upřednostňovanou komplementární oblastí, která může a nemusí být přítomna v amplifikované DNA. K tomu navíc amplifikovaná DNA hybridizuje s jednou nebo více sondami odpovídajícími sekvencím přítomným ve všech alelách lokusu. Typizace SSO může být ovlivněna typem biologického materiálu, metodou purifikace a množstvím a integritou genomové DNA. Z toho důvodu může signál získaný pomocí sondy sloužit jako ukazatel úspěšnosti procesu amplifikace a hybridizace. Signál získaný pomocí konvenční sondy může být také použit k normalizaci signálu alelových sond a k úpravě odchylek v množství amplifikovaného produktu v rámci hybridizační reakce. Rozbor výsledků získaných typizací SSO lze použít k určení přítomnosti či nepřítomnosti konkrétních sekvencí DNA v amplifikované DNA a k identifikaci možných alel ve vzorku. V případě typizace LIFECODES HLA-SSO jsou sondy vázány na mikrokuličky Luminex určené k použití s nástrojem Luminex 100 nebo 200. Je možné smíchat a pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200 provést rozbor až 100 různých populací mikrokuliček, neboť jednotlivé populace mikrokuliček se od sebe liší pro každou populaci jedinečným fluorescenčním znakem nebo barvou. Na různé barvy mikrokuliček lze navázat různé sondy SSO. Jednotlivé promíchané sondy lze tedy od sebe odlišit na základě jejich spojení s konkrétní barvou mikrokuliček. Nástroj Luminex 100 nebo 200 je také schopen určit množství produktů PCR hybridizujících s mikrokuličkami Luminex. Z toho důvodu je možné použít signál získaný pomocí sond SSO během rozboru LIFECODES, stejně jako s jinými metodami SSOP, k označení sond s kladnou nebo zápornou reaktivitou se vzorkem amplifikované DNA (viz Oddíl Výsledky). Budou tak získány informace potřebné k určení HLA-fenotypu vzorku. Strana 4 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

5 ČINIDLA A. Identifikace Úplný seznam výrobků a katalogových čísel viz tabulky v části Sady/Činidla podle katalogového čísla. B. Varování a upozornění 1. Test pro diagnostiku in vitro. 2. K manipulacím před PCR a po PCR použijte různé pipety. 3. Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními. 4. Ředící roztok, Probe mix, Taq polymeráza a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin obsahují zdraví nebezpečné složky. Zabraňte kontaktu s kůží a s očima, likvidaci všech materiálů po použití provádějte v souladu s místními nařízeními a předpisy. Více informací naleznete v Bezpečnostním listu (BL). 5. Výsledky získané pomocí těchto souprav nelze použít jako jediný základ pro učinění klinických závěrů o stavu pacienta. C. Pokyny pro uskladnění 1. Vhodné skladovací teploty naleznete na štítcích umístěných na balení jednotlivých komponent. 2. Probe mix a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin jsou citlivé na světlo, CHRAŇTE JE PŘED SVĚTLEM a NEZMRAZUJTE. 3. Komponenty nepoužívejte po překročení data exspirace. D. Purifikace a aplikace Viz Odběr a příprava E. Indikace nestability 1. Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysrážely soli, před použitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového pohybu při pokojové teplotě (18 až 30 C). 2. Nepoužívejte R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin, který během přepravy nebo uskladnění prošel bodem mrazu. 3. Sady jsou stabilní nejméně 6 měsíců po otevření, pokud se skladují v souladu s doporučeními. POŽADAVKY NA NÁSTROJE 1. Nástroj Luminex 100 nebo 200 a platforma XY (Výrobky č , ) 2. Schváleny byly následující termocyklery: 96-jamkový PCR systém 9700 GeneAmp nastavený na režim MAX (základní katalogové č. N , Gold Block kat. č ), 96-jamkový termocykler Veriti nastavený na režim MAX 9700 (kat. č ). Maximální povolené rychlosti naleznete v tabulce 2. Upozornění: ostatní termocyklery a rychlosti nebyly schváleny. ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ a. Lidskou DNA lze purifikovat z plné krve, z buffy coat a z ústní sliznice pomocí schválených metod splňujících níže uvedená kritéria. b. DNA získaná z krve uchované v EDTA a ACD (kyselina citrónová-citrát-dextróza) byla testována a prokázala vlastnosti potřebné pro daný rozbor. DNA získaná z krve a uchovaná v heparinu nemůže být pro tento rozbor použita. Další konzervační látky nebyly testovány. c. Izolovaná DNA by měla být v 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mm. d. Přítomnost alkoholu, čistidel a solí může nepříznivě ovlivnit amplifikaci DNA. e. Konečná koncentrace DNA by měla být 10 až 200 ng/µl. f. Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 až 2,0. g. Vzorky DNA se mohou použít ihned po jejich izolaci nebo uskladnit až na 1 rok při teplotě 20 ºC. Vyhněte se opakovanému zmrazování/rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA. POSTUP Upozornění: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů nebyly schváleny. A. Dodávané materiály (Více informací viz tabulky v části Sady/Činidla podle katalogového čísla). Příslušná směs Master Mix (MX) Příslušná směs/směsi Probe Mix (BM) Ředící roztok (ŘR) B. Požadované materiály, ale nedodávané materiály K potvrzení soupravy byly použity následující materiály: Tabulka prahových hodnot, tabulka(y) výsledků detekce sondy Taq polymeráza LIFECODES* (č. v katalogu LIFECODES: ) Luminex Sheath Fluid (1x, číslo v katalogu Lifecodes: ) Voda bez nukleázy, č. v katalogu Lifecodes: , 20 ml) PCR zkumavky a víčka zkumavkové pásky Corning Thermowell (č. v katalogu Costar : 6542, č. v katalogu LIFECODES: ) nebo Axygen 8-Strip PCR zkumavky (č. v katalogu Axygen PCR0208CPC) nebo Applied Biosystems MicroAmp 8- zkumavky Strip a MicroAmp 8-Cap Strip (č. v katalogu ABI N a N ) nebo 96-jamkové PCR destičky Corning Thermowell (katalogové č. CLS6551) nebo 96-jamková PCR destička Thermo Scientific AB Gene SuperPlate (kat. č. AB-2100) Destička Costar (č. v katalogu Costar : 6509, č. v katalogu LIFECODES: ) Polyethylenová páska Thermowell Clear (č. v katalogu Costar : 6524, č. v katalogu LIFECODES: ) R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin (SA-PE), 1mg/ml (č. v katalogu LIFECODES: ) Kalibrační sady Luminex (kalibrační sada Luminex 100/200, souprava pro kontrolu výkonu Luminex 100/200, čísla v katalogu LIFECODES a v daném pořadí) C. Doplňující materiály, které dodá uživatel Míchačka (Vortex) Silikonová těsnící poduška Axygen Scientific, č. CM-FLAT nebo podobný výrobek Sonikační lázeň Špičky s filtrem Microcentrifuge Barrier Pipetovací nástavce, vícekanáloví pipety a špičky (1-20 µl, µl, 1000 µl) Software umožňující analýzu souboru Topný blok 70% isopropanol nebo 20% bělidlo Držák zásobníku Applied Biosystems, č (použití pouze s termocyklerem 9700) Strana 5 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

6 NÁVOD K POUŽITÍ POZNÁMKY: Probe mix a SA-PE jsou citlivé na světlo: chraňte před světlem a nezmrazujte. Zahřívejte kuličky při 55 ºC až 60 ºC po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily. Při procesu rozpipetování dbejte zvýšené opatrnosti a používejte cejchované pipety. V opačném případě může dojít ke ztrátám reakční směsi a zmaření vzorku. Všechny teploty musí být přesně dodrženy a zachovány. I nízké výkyvy o např. +/- 0,5 C mohou ovlivnit výsledek. Ve stádiu hybridizace by neměly vzorky zůstávat v rozpuštěném stavu při 56 C déle než 5 minut (viz oddíl Výsledky). Doporučujeme provést rozbor amplifikovaných co nejrychleji. Pokud není možné zpracovat vzorky pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200 v tentýž den, je možné uchovat amplifikovaný produkt před použitím po dobu až 3 dnů při teplotě 2-8 ºC. V případě dlouhodobějšího uskladnění uchovávejte do okamžiku použití při teplotě 20 ºC po dobu až jednoho týdne. Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování způsobí poškození amplifikovaných a v případě následného rozboru povede ke špatným výsledkům. A. Purifikace genomové DNA pomocí zvolené metody; konečná koncentrace by měla být 10 až 200 ng/µl. V případě potřeby doplňte vodou bez nukleázy. U všech udržujte stejnou koncentraci. B. Amplifikace DNA (PCR) 1. Nechte Master Mix ohřát na pokojovou teplotu (18 C až 30 C). 2. Jemně míchejte spirálovým pohybem po dobu cca 10 vteřin. Bude tak zajištěna přítomnost solí v roztoku. Umístěte na krátkou dobu (5 až 10 vteřin) na mikrocentrifugu, aby se obsah dostal na dno zkumavky. 3. Podle Tabulky 1 níže připravte komponenty k amplifikaci pro n+1 reakcí pomocí hodnot určených pro jednotlivé komponenty v rámci reakce (kromě DNA). Pomocí vody bez nukleázy připravte konečný objem 20 µl na reakci. Jemně promíchejte. 4. Pomocí pipety umístěte odpovídající množství genomové DNA (40 až 120 ng) do zkumavek PCR. 5. Pomocí pipety umístěte amplifikační směs do PCR zkumavek obsahujících genomovou DNA. (Celkový objem amplifikační směsi a genomové DNA by měl být 20 µl na každou jednotlivou reakci.) 6. Zkumavky pevně uzavřete, aby nedošlo k úniku během PCR. 7. Umístěte vzorky do termocykleru a spusťte program, viz Tabulka 2 a Tabulka 3. Tabulka 1. Reakční komponenty pro amplifikaci Složka Množství na reakci PCR LIFECODES Master Mix 6µl Genomová DNA ng/µl Celkem ~80 ng Taq polymeráza LIFECODES 0.2 µl (1 U) Voda bez nukleázy Až 20µl konečného objemu Tabulka 2. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Termocykler GeneAmp PCR System 9700 Termocykler Veriti 96-jamkový Režim (přechodová rychlost) Režim MAX (3,9 C/s) Režim MAX 9700 (3,9 C/s) Table 3. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Krok Teplota a inkubační doba Počet cyklů 1 95ºC po dobu 3 min 1 95ºC po dobu 15 s 2 60ºC po dobu 30 s 72ºC po dobu 30 s 12 95ºC po dobu 10 s 3 63ºC po dobu 30 s 72ºC po dobu 30 s ºC po dobu 2 min 1 5 4ºC stále 1 Strana 6 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

7 Poznámka: Informace o amplifikaci vzorku naleznete v sekci Gelová elektroforéza produktu (Příloha A). C. Hybridizace Ujistěte se, že jsou složky hybridizačního pufru v LIFECODES probe mixu rozpuštěny a kuličky důkladně rozptýleny. Zapněte nástroj Luminex 100 nebo 200 a platformu XY a nechte je spuštěné po dobu 30 minut na zahřátí. 1. Zahřívejte probe mix při 55 ºC až 60 ºC na termálním bloku po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. 2. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozptýlily. 3. Smíchejte 15 µl příslušné směsi s 5 µl PCR pro konkrétní lokus a rozpipetujte do každé jamky 96-jamkové destičky termocykleru (Costar č. 6509). Upozornění: soupravy A eres, B eres a DRB1 eres vyžadují dvě jamky na každý vzorek, jednu pro směs eres a druhou pro standardní směs. Směs eres a standardní směs (probe mix) nemusejí být zpracovány současně. Obě směsi těchto souprav musejí vykazovat výsledek eres. Sady C eres obsahují jen jednu standardní směs (probe mix). Pokud rozpipetováváte směs do více než 10 jamek, jemně směs promíchejte spirálovým pohybem po každých deseti jamkách. Destičku přelepte polyethylenovou páskou (Costar č. 6524). 4. Před provedením hybridizace umístěte na destičku silikonovou těsnící podušku. 5. Proveďte hybridizaci za následujících inkubačních podmínek: Tabulka 4. Podmínky termocykleru pro hybridizaci 97 ºC po dobu 2 min. 47 ºC po dobu 10 min. 56 ºC po dobu 8 min. 56 ºC HOLD Zajistěte, aby byl detekční laser na nástroji Luminex 100 nebo 200 spuštěn alespoň 30 minut před ukončením hybridizace. 6. Zatímco probíhá hybridizace, připravte směs 200:1 ředící roztok/sa-pe. Smíchejte 170 µl ředícího roztoku (ŘR) a 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE na vzorek. Doporučujeme připravit dostatečné množství směsi ředícího roztoku pro n+1 pro případ ztráty při pipetování. (Viz Tabulka 5) 7. Směs ředícího roztoku/sa-pe uchovávejte ve tmě při pokojové teplotě, SA-PE je citlivý na světlo! Ředící roztok je možné zahřívat na teplotu 45 ºC po dobu 5 minut a promíchat spirálovým pohybem, aby byla zajištěna přítomnost všech komponent v roztoku. Před vytvořením směsi musí mít ředící roztok pokojovou teplotu (18 až 30 C). Připravte vše před použitím a zbývající dávku dejte stranou. Počet Ředící roztok (ŘR) SA-PE Tabulka 4. Objemy pro přípravu µl 0,85 µl ředícího roztoku µl 4,25 µl µl 8,5 µl µl 17 µl µl 42,5 µl Poznámka: NEPŘERUŠUJTE PROGRAM HYBRIDIZACE PŘED SEJMUTÍM DESTIČKY Z TERMOCYKLERU! 8. Při kroku 56 ºC HOLD, zatímco je destička na termocykleru, zřeďte každý vzorek pomocí 170 µl předem připravené směsi ředícího roztoku/sa-pe. Všechny vzorky je třeba naředit během 5 minut (po 8 minut trvajícím kroku HOLD při 56 C). 9. Sejměte destičku z termocykleru a umístěte ji do nástroje Luminex 100 nebo 200. D. Analýza pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200* Aby byly získané výsledky co nejlepší, rozbor pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200 proveďte ihned. Rozbor je možné provést až 30 minut po naředění. Jestliže nehodláte provést interpretaci ihned, chraňte je před světlem. 1. Nástroj Luminex 100 nebo 200 zapněte 30 minut až 4 hodiny před zahájením rozboru. 2. Před rozborem pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200 nastavte dávkovací běh (Batch Run) určený k rozboru. a) Zvolte Create a New Batch (Vytvořit novou dávku) z nabídky File (Soubor). Např. pokud provádíte rozbor HLA-DRB1, přidejte dávku pro HLA-DRB1. Bude vytvořena a pojmenována šablona dávky, v tomto případě HLA-DRB1. Upozornění: verze šablon jsou vytvořeny pro konkrétní čísla sad a odpovídají číslům sad v soupravě. Podrobný postup vytváření dávek se objeví na obrazovce vytváření dávek. Při vytváření názvu dávky nepoužívejte čárky, neboť informace následující po čárce zmizí při exportu dat. Více informací o vytváření dávek a multi-dávek naleznete v uživatelské příručce Luminex b) Klikněte na ikonu vysunutí, držák destičky se vysune. Umístěte 96-jamkovou destičku se vzorky určenou pro termocykler do termálního bloku XYP umístěného na držáku destičky. c) Klikněte na ikonu Zasunout. Vzorky jsou připraveny k rozboru. Před spuštěním cyklu je třeba provést napuštění. d) Po vyjmutí z nástroje je třeba provést čištění nástroje pomocí 70% isopropanolu nebo 20% bělidla (čistícího přípravku pro domácnost) s následným dvojím omytím. Pokud již nástroj nebudete toho dne používat, můžete jej nyní vypnout. 3. Po dokončení běhu budou data exportována v podobě hodnot oddělených čárkami (csv). Získané soubory mají název OUTPUT.CSV a budou uloženy ve složce s názvem dávky. Data jsou poté k dispozici k provedení typizace, jak je popsáno níže. *Informace o používání nástroje Luminex naleznete v uživatelské příručce Luminex, která obsahuje pokyny ke spuštění, kalibraci, údržbě a vypnutí. Strana 7 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

8 VÝSLEDKY DNA software MATCH IT! je určený na pomoc s analýzou typizačních sad LIFECODES SSO Typizaci lze provést následujícím způsobem: Otevřete vytvořené soubory CSV a získaná data zpracujte pomocí běžných tabulkových procesorů, jako jsou Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro apod. Rozbor probíhá v následujících krocích: 1) Zkontrolujte, zda je splněn minimální počet případů pro každý SSO v každém vzorku. Tuto informaci naleznete v DataType: oddíl Výpočet v souboru CSV. 2) Určete, že hodnoty pro konvenční sondy pro jednotlivé vzorky se nacházejí nad minimální hodnotou jejich mediánu intenzity fluorescence (MFI). Minimální prahové hodnoty se liší dle konkrétních sad a je možné je zjistit z tabulky prahových hodnot. Upozornění: Abyste získali spolehlivé výsledky, potřebujete zajistit dostatečné množství dat získaných pomocí nástroje Luminex 100 nebo 200. Shromážděte nejméně 40 případů pro HLA-DQA1/B1 (číslo ) a HLA-DPA1/B1 (číslo ). Shromážděte minimálně 60 případů pro zbylé sady uvedeny v oddíle SADY/ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA nebo minimální počet případů uvedených ve specifických dokumentech šarží. 3) Odečtěte kontrolní hodnotu pozadí pro jednotlivé sondy od hodnot vzorku a získejte tak soubor dat upravený na základě kontrolních hodnot. Kontrolní hodnoty pozadí naleznete v tabulce prahových hodnot po jednotlivé sady. Hodnoty pozadí jsou průměrné hodnoty MFI (mediánu intenzity fluorescence) pro jednotlivé kuličky, určené ke kompenzaci šumu pozadí způsobeného proměnlivostí kuliček. 4) Pro každý vzorek vydělte data upravená na základě pozadí pro jednotlivé sondy hodnotou upravenou na základě pozadí pro odpovídající konvenční sondu a získejte normalizovanou sadu dat. MFI (sonda) MFI (kontrola pro sondu) MFI (konvenční) MFI (kontrola pro konvenční hodnotu) 5) Získané hodnoty pro jednotlivé sondy zaneste do pracovního listu v tabulce prahových hodnot. 6) Jakmile budou zaneseny všechny hodnoty, je možné porovnat vzorec výsledků detekce sondy (tj. kombinace všech kladných a záporných zadání pro daný vzorek) s poskytnutou tabulkou (tabulkami) obsahující detekované výsledky Upozornění: Pro každý lokus a každou směs probe mix existuje zvláštní tabulka prahových hodnot. Tabulky prahových hodnot jsou určeny pro konkrétní sady, ujistěte se, že číslo sady uvedené v tabulce prahových hodnot je shodné s číslem typizační soupravy. Pokud se stane, že normalizovaná hodnota pro konkrétní sondu stoupne nad maximální prahovou hodnotu v případě záporného zadání a pod minimální hodnotu v případě kladného zadání, bude vzorek pro tuto sondu považován za neurčitý. Vzorky musejí být typizovány tak, že se nejprve přijme záporná hodnota a poté kladná. Více informací o prahových hodnotách naleznete v oddíle OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY. KONTROLA KVALITY Doporučujeme provést jednu zápornou a jednu kladnou kontrolu v rámci každého testu, jako je test pomocí vody a poté pomocí předem typizovaného vzorku. Konvenční sondy SSO uvedené v tabulce prahových hodnot hybridizují s alelami příslušných lokusů. Hodnoty získané s konvenčními SSO z pozitivních kontrol by měly mít vyšší než prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Hodnoty získané s konvenčními SSO z kontrol používajících vodu by měly být nižší než prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Směsi Probe mix LIFECODES obsahují jednu nebo více konvenčních sond SSO identifikovaných v pracovních listech typizačních souprav. Tyto konvenční sondy hybridizují se všemi alelami a chovají se jako interní kontroly sloužící k ověření amplifikace a potvrzení provedení hybridizací. Jestliže pro tyto SSO není dosaženo minimální hodnoty, vzorek nemůže zajistit správnou typizaci a testování vzorku musí být provedeno znovu. Rozbor je třeba provést podle doporučení uvedených v příbalovém letáku a dále pomocí jiných kontrolních postupů, které jsou v souladu s místními, státními a federálními předpisy a/nebo předpisy institutu pro akreditaci. OMEZENÍ POSTUPU Podmínky PCR a popsané podmínky rozboru vyžadují přesné dodržení stanovených podmínek. Nedodržení těchto parametrů může mít za následek chybný vzorek. Všechny nástroje musejí být kalibrovány v souladu s doporučeními výrobce a předepsanými parametry. 1) Před použitím je třeba kuličky předehřát a důkladně rozpustit. Tím je zajištěna přítomnost složek hybridizačního pufru v roztoku. 2) Inkubace při 47 ºC a 56 ºC vyžaduje vysoký stupeň přesnosti (+/- 0,5 ºC). Je třeba použít termocykler. Teplotu v 96 jamkách destičky termocykleru je třeba kontrolovat pomocí termočlánku (např. Bio-Rad, Model VPT-0300 apod.). Rozdíl teplot v jamkách a mezi jednotlivými jamkami by neměl překročit +/- 0,5 ºC. 3) Celková doba při 56 ºC nesmí překročit 13 minut. To zahrnuje 10-minutovou inkubaci a k tomu max. 8 minut určených k naředění všech pomocí směsi ředícího roztoku/sa-pe. 4) Po naředění jsou vzorky stabilní při pokojové teplotě (18 až 30 C) po dobu až 2 hodin (je třeba je chránit před světlem). Vzhledem k tomu, že zpracování plné destičky s 96 jamkami nástrojem Luminex 100 nebo 200 může trvat až 1,5 hodiny, je třeba zahájit analýzu ne později než 30 minut od naředění, aby bylo zajištěno, že poslední vzorek bude analyzován v rámci dvouhodinového limitu. 5) Nemíchejte komponenty z jiných souprav a sad. Z důvodu složité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál. Strana 8 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

9 ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PROBLÉM MOŽNÁ PŘÍČINA ŘEŠENÍ Nízký počet kuliček Směs Probe Mix nebyla důkladně rozpuštěna Probe mix předehřejte, sonikujte a spirálovým Chyba prahových hodnot CON Množství špatných SSO nebo vzorek nesplňuje výsledek typizace HLA Nástroj nefunguje správně Amplifikace vzorku neproběhla, nebo jen slabě* Chybná kalibrace Cesta toku vzorku je zablokována. Nízký obsah DNA Soli ve směsi Master Mix se nerozpustily Slabá Taq polymeráza Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry Nízká hodnota střední intenzity fluorescence (MFI) Amplifikace konkrétní alely Vzorek DNA byl kontaminován DNA je částečně poškozena Odpařování během hybridizace Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry *Amplifikaci PCR je možné ověřit pomocí gelové elektroforézy (viz Příloha A). pohybem promíchejte a zkoušku opakujte. Proveďte kalibraci nástroje. (Viz uživatelská příručka Luminex IS.) Odstraňte a sonikujte jehlu. Proveďte zpětný proplach. Pokud problém přetrvává, zavolejte Immucor GTI Diagnostics, Inc. na číslo: +1 (855) Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA. Zahřívejte Master Mix při teplotě 37 ºC po dobu 5 minut, jemně promíchejte spirálovým pohybem a nechte krátce ustát. Používejte schválenou Taq polymerázu LIFECODES, katalogové č Spusťte tepelný profil na termocykleru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Před použitím zahřívejte ředící roztok při 45 ºC po dobu 5 minut a promíchejte spirálovým pohybem. Skladujte při pokojové teplotě. Vyměňte R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin. Spusťte tepelný profil na termocykléru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Znovu izolujte DNA z krevního vzorku. Pokud nevyužíváte celou destičku, nechte jednu řadu po každé straně prázdnou, aby bylo možné destičku důkladně utěsnit. OČEKÁVANÉ HODNOTY Hodnoty je možné hodnotit jako kladné a záporné. Ve vzácných případech může být hodnota neurčitá. Neurčitá hodnota představuje rozsah, v jehož rámci nebyly sledovány ani kladné, ani záporné hodnoty. V případě, že vzorek obsahuje neurčité hodnoty pro konkrétní sondu SSO, je třeba vzorek typizovat sondou jako záporný a poté jako kladný. Mohou nastat tři situace: 1. Jedna z možností (např. kladná nebo záporná) poskytnou shodu. 2. Obě možnosti poskytnou shodu. Vzorky mohou být znovu analyzovány, nebo alely získané z obou typizací mohou být zaznamenány. 3. Žádná z možností neposkytne shodu. V takovém případě pravděpodobně existují jiné sondy, které byly chybně přiřazeny. Takový vzorek musí být znovu analyzován a zřejmě i znovu amplifikován. Pokud vykazují více než dvě sondy neurčitý výsledek, vzorek musí být znovu analyzován. Pokud vzorec výsledků sondy neposkytne typ HLA, musí být vzorek znovu amplifikován a analyzován. Může být také nezbytné znovu izolovat DNA ze vzorku a provést novou amplifikaci a analýzu. Jak je uvedeno v oddíle Omezení postupu, je nezbytné přesně dodržovat protokol. Případné odchylky mohou mít za následek špatnou typizaci. SPECIFICKÉ FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Pokud jsou typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO použity v souladu s postupem popsaným v příbalovém letáku, je možné stanovit typ HLA třídy I a II ve vzorcích DNA. Sady HLA-A eres vykazují 98,46 % shodu (95,24 % nižší hranice 95 % intervalu spolehlivosti), sady HLA-B eres, DRB1 eres a DRB 3, 4, 5 vykazují 100 % shodu (97,72 % nižší hranice 95 % intervalu spolehlivosti), a sady HLA-C eres vykazují 99,23 % (95,75 % nižší hranice 95 % intervalu spolehlivosti) na 130 vyhodnocených při srovnání výsledků získaných obousměrným sekvenováním. Sady HLA-A a sady B vykazují 100% shodu (92,9 % nižší hranice 95 % intervalu spolehlivosti) na 50 vyhodnocených při srovnání výsledků získaných prostřednictvím metody Pel-Freez SSP UniTray. Sady HLA-DRB1 vykazují 98 % shodu (91,1 % nižší hranice 95 % intervalu spolehlivosti) na 60 vyhodnocených při srovnání výsledků získaných pomocí sady LIFECODES HLA-DRB. Sada HLA-DQA1/B1 (kat. č ) vykazuje 99,2% shodu pro alely DQA (nižší hranice je 96,2% za použití jednostranné přesné metody při intervalu spolehlivosti 95%) a 98,4% shodu pro alely DQB (nižší hranice je 95,2% za použití jednostranné přesné metody při intervalu spolehlivosti 95%) při porovnávání výsledků typizace HLA ve 2 polích v 123 a 130 dobře charakterizovaných vzorcích. Sada HLA-DPA1/B1 (kat. č ) vykazuje 100% shodu pro alely DPA ((nižší hranice je 97,7% za použití jednostranné přesné metody při intervalu spolehlivosti 95%) a 98,5% shodu pro alely DPB ((nižší hranice je 95,4% za použití jednostranné přesné metody při intervalu spolehlivosti 95%) při porovnávání výsledků typizace HLA ve 2 polích v 133 a 135 dobře charakterizovaných vzorcích. Tyto látky prokázaly v laboratorních vyšetřeních určitou inhibici při vyhodnocování za použití typizačních sad LIFECODES HLA-DQA1/B1 a LIFECODES HLA- DPA1/B1 SSO. Nejvyšší koncentrace rušivé látky bez přítomnosti inhibici byla u dodecylsulfátu sodného (0,005% (hmotnost/objem)), etanolu (500 mm), fenolu (0,125% (objem/objem)), sacharózy (0,1 M), EDTA (500 um), ACD (0,1% (objem/objem)), cholesterolu (3µg/mL), bilirubinu (16,4 um), hemoglobinu (0,0156 mg/ml) a hemolyzované krve (0,1% (objem/objem)). Strana 9 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

10 LITERATURA 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39: Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 OMEZENÉ LICENCE Taq polymerázu vyrobila pro Immucor GTI Diagnostics společnost Promega Corp. Maitelem licence na tento produkt je společnost Promega a produkt je chráněn v USA patenty 5,338,671 a 5,587,287, a v ostatních zemích odpovídajícími místními patenty. Zakoupením tohoto výrobku získáte omezenou nepřenosnou licenci zapsanou v USA pod patentovým číslem 5,981,180, nebo její zahraniční obdobu, která je majetkem Luminex Corporation, a která vám umožní provádět vícenásobné rozbory klinických za účelem typizace HLA. AUTORIZOVANÝ ZÁSTUPCE Autorizovaný zástupce: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32, Dreieich, Německo Technický servis pro Evropu: Tel.: +32/ Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: POUŽITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. Strana 10 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J

11 PŘÍLOHA A Gelová elektroforéza PCR reakce provedené prostřednictvím typizačních sad LIFECODES HLA-SSO jsou určeny k vytváření jak dvouvláknových, tak i jednovláknových produktů, které představují dominantní produkty hybridizující s SSO. Za účelem zajištění dobré kvality či odstranění problémů může být nezbytné provést gelovou elektroforézu s cílem ověření PCR reakce a přítomnosti amplifikované DNA. Požadované materiály (viz seznam nebo odpovídající výrobky) Agaróza pro elektroforézu (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose č ) Elektroforézní přístroj/zdroj energie Gelový pufr - 1X (40xTAE, Promega č. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. č ) UV transiluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36) Fotografický systém Relativní migrace jednovláknových produktů závisí na koncentraci gelu a použitém pufru. Přibližné migrace pro jednotlivé amplifikace jsou uvedeny níže pro vzorky v 2% agarovém gelu a pufru 1X TAE. Podmínky elektroforézy Poznámka: nevztahuje se na HLA-DQA1/B1 (č ), HLA-DRB 3,4,5 (č ) a HLA-DPA1/B1 (č ), protože jednotlivé proužky nemohou být rozlišeny ve vícenásobní kombinaci. 1. Vyjměte GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. č ) z mrazáku a nechte rozmrznout. Uchovávejte ve tmě. 2. Gel použitý pro tento postup musí být 2%, tj. na 200 ml gelu použijte 4 gramy agarózy a 200 ml 1X TAE (naředit z 40X TAE). Přidejte 10µl GelStar Nucleic Acid Stain, čímž agaróza získá tekutou podobu. Při rozlévání gelu je třeba nechat dostatek prostoru pro DNA (2,5 až 5 cm). UPOZORNĚNÍ: GelStar je potenciální karcinogen. POZNÁMKA: Místo GelStar Nucleic Acid Stain je možné použít gely s 20 µl ethidium bromidu 10mg/ml. V gelech s ethidium bromidem bude výsledný produkt zastoupen méně výrazně než v gelech s GelStar. UPOZORNĚNÍ: Ethidium bromid je známý karcinogen. 3. Gely uložte na tmavé místo a nechte je ztuhnout. 4. Použijte směs 2,5 µl každého PCR produktu a 2,5 ll 2X pufru se zřejmým zbarvením na vzorek a na amplifikaci. Umístěte gel na tmavé místo při cca 160 voltech na 45 minut, nebo dokud nebude ve vzorku možné pozorovat oddělené pásky jedno a dvouvláknového produktu (modrý bromofenol nebo jiný marker migruje 2,5 až 5 cm od jamek). 5. Vyfotografujte pomocí UV transiluminátoru za použití žlutého fotografického filtru GelStar (Lonza Group, Ltd. č ). UPOZORNĚNÍ: Při práci s GelStar Nucleic Acid Stain nebo ethidium bromidem a při fotografování gelu pomocí UV transiluminátoru používejte ochranné pomůcky. 6. Rozbor gelu HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1 Dvě vlákna (bp) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280 Jedno vlákno (bp) ~240 ~200 ~250, ~200 ~180 Interpretace gelu Jamka Amplifikace proběhla Amplifikace neproběhla Dvouvláknová DNA Jednovláknová DNA Pásmo primeru ---- (jasný výsledek) ( méně jasný výsledek) Strana 11 z 11 LC1436IVDCZ Rev. J