Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Samostatný projekt RP-HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi Brno 2007 Hana Fuksová Petra Kristová
Osnova: Teoretická část 1. Úvod...3 2. Kofein......3 2.1. Výskyt a použití.. 3 2.2. Účinky kofeinu v lidském těle 4 2.2.1. Žádoucí účinky...4 2.2.2. Nežádoucí účinky...4 2.3. Smrtelná dávka...5 3. Chromatografické metody kapalinová chromatografie..5 3.1. Historie chromatografie..5 3.2. Teorie chromatografie... 5 3.3. Termodynamické aspekty separace...6 3.3.1. Základní veličiny 6 3.3.2. Retenční veličiny...7 3.3.3. Redukované retenční veličiny 7 3.3.4. Retenční faktor (kapacitní poměr)....7 3.4. Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení..8 3.4.1. Tvary píků...8 3.5. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC, High Performance LiquidChromatography)...9 3.6. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP- HPLC, Reversed- Phase - High Performance Liquid Chromatography)....9 Experimentální část 4. Výsledky..10 4.1. Přístrojové vybavení......10 4.2. Chemikálie..10 4.3. Podmínky měření... 10 4.4. Optimalizace systému....11 4.4.1. Ukázka výpočtu.12 4.5. Kalibrační závislost....13 4.5.1. Výpočet LOD a LOQ....14 5. Závěr.....15 6. Literatura....16 2
1. Úvod Samostatný projekt byl zaměřený na seznámení se s metodou HPLC a ověření si pravidel uplatňujících se v této separační metodě. Použitým analytem byl standard methylxantin, kofein. 2. Kofein [1] Kofein (podle rostliny Coffea arabica, česky kávovník) je alkaloid, který příznivě stimuluje centrální nervovou soustavu. Kofein je pravděpodobně nejrozšířenější stimulant na světě, který se užíváním ve větším množství stává drogou. Obr 1: Vzorec kofeinu [1] Tab 1: Vlastnosti kofeinu [1] Chemický název 1,3,7-trimethylxanthine Sumární vzorec C 8 H 10 N 4 O 2 Molární hmotnost 194.19 g/mol Teplota tání 234 236,50 C Teplota varu 178 C (sublimuje) Kyselost 10,4 Hustota 1,2O g/cm 3 2.1 Výskyt a použití [1] Čistý kofein je bílý hebký prášek nebo lesklé jehličky, hořké chuti. Purinový derivát kofein se vyskytuje v listech, semenech a plodech alespoň 63 rostlin. Nejznámější jsou kávová zrna (Coffea arabica), kakaové boby (Theobroma cocao), cola, 3
ořechy (Cola acuminata), čajové lístky (Camellia thea), lístky maté (Ilex paragueyensis) a guarana (Paullinia cupana). Čaj obsahuje ještě dva další alkaloidy theofylin a theobromin. Kofein se přidává do nealkoholických nápojů jako Tonik, Coca-Cola, Kofola a další. Podle výskytu se označuje též jako tein či guaranin. 1 2% koncentrace kofeinu je pro plže smrtelným nervovým jedem. Lze jej tedy použít jako moluskocid na hubení škodlivých plžů. Kofein je mitotický jed (postihující buněčné jádro). 2.2 Účinky kofeinu v lidském těle [1] Kofein se do lidského těla dostává převážně orálně (čaj, káva, cola, v podobě léků proti únavě atd.) nebo intravenózně. Vstřebává se z žaludku a tenkého střeva z kávy se vstřebává po několika minutách po požití. U čaje je to až po 40 minutách, protože obsahuje jiné alkaloidy, které vstřebávání kofeinu oddalují. Proto je čaj zdravější. Kofein je v těle nejprve demethylován v dimetylxantin, pak v monometylxantin, ty se dále štěpí na močovinu a tak se vylučují. Opouští tělo asi 5 až 6 hodin po požití. Při pravidelné aplikaci kofeinu se stane tělo na kofein rezistentní a může na něm vzniknout závislost. Kofein nepomáhá rychleji vystřízlivět. Nemění osobnost a charakter člověka. Citlivost dětí na kofein se neliší od citlivosti dospělých. Kofein snižuje účinek některých léků proti epilepsii. Kofein prochází do mateřského mléka. V době kojení se doporučuje maximálně 300 mg kofeinu denně (2 3 šálky kávy). Kofein prochází i placentou. 2.2.1 Žádoucí účinky [1] Kofein příznivě stimuluje centrální nervový systém tím oddaluje únavu (zvláště duševní), zbystřuje myšlení, zlepšuje koncentraci, působí jistou euforii, zrychluje tep, uvolňuje hladké svalstvo, rozšiřuje tepny a stimuluje oběhový a respirační systém (srdce a dýchání). Proto pomáhá lidem postižených astmatem. Tím, že kofein stresuje tělo působením na jeho nervový systém, dochází k odbourávání tuků i v klidovém stavu. Zvyšuje obsah mastných kyselin v oběhovém systému, byl proto léta používán sportovci. Tyto účinky mohou trvat od několika hodin až do dvanácti hodin, ale již po čtyřech letech pravidelného užívání se tělo stane rezistentním. 2.2.2 Nežádoucí účinky [1] Negativní projevy jsou bolest žaludku (překyselení), proto se nedoporučuje lidem se sklonem k zrychlené srdeční činnosti, s pálením žáhy, žaludečními a dvanáctníkovými vředy. Dalšími negativními projevy může být infarkt a problémy s ledvinami, protože se 4
jedná o diuretikum. Navíc velké množství kofeinu může mít útlumový efekt. Ve velkých dávkách vede k pocitu podráždění, neklidu, nespavosti, ztrátě energie, popřípadě i křečím. Kofein zvyšuje odbourávání vápníku z těla, proto by každý, kdo pije alespoň dvě kávy denně, měl také vypít sklenici mléka nebo sníst jogurt pro doplnění vápníku. Vzrůstá riziko výskytu onemocnění srdce u osob, jejichž průměrná denní spotřeba přesahuje pět šálků kávy. V současné době neexistují důkazy o tom, že kofein způsobuje rakovinu, žaludeční vředy, vysoký krevní tlak nebo vážnou srdeční arytmii. 2.3 Smrtelná dávka [1] Smrtelná dávka je při orálním užití 150 mg.kg -1 pro 100 kg osobu to je 15 g kofeinu nebo 25 l kávy. Nitrožilně se jedná o množství 3,20 g. Doporučená denní dávka je 300 mg kofeinu ( tj. tři šálky kávy). 3. Chromatografické metody kapalinová chromatografie 3.1 Historie chromatografie [2] Za objevitele chromatografie je celosvětovou odbornou veřejností uznáván Michail Semjonovič Cvět a její zrod je datován 21. březnem 1903. M. S. Cvět se věnoval morfologickému studiu barviv chloroplastů a hledal účinnou a šetrnou metodu jejich separace. Jeho cílem byla izolace chlorofylu, který by si zachoval vlastnosti barviva v přírodním stavu. Cvět zjistil, že ostrost dělení v koloně se zvyšuje s jemnějším zrněním. Zvýšený odpor kolony překonával zvýšením tlaku na vstupu nebo odsáváním na konci kolony. Lze tedy říci, že postupoval způsobem, který byl mnohem později realizován ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Koncem 30. let se chromatografie stává uznávanou metodou a je dále rozvíjena. První, kdo v r. 1948 obdržel Nobelovu cenu za rozvoj metody, byl A. Tiselius, a to za výzkum elektroforézy a adsorpční chromatografie. Jsou mu také připisovány pracovní techniky frontální, eluční a vytěsnovací analýzy. Významný zlom v historii chromatografie však představuje objev rozdělovací chromatografie Martinem a Syngem.V práci z r. 1941 již uvádějí, že mobilní fází nemusí být kapalina, ale lze užít permanentní plyn. Význam a dosah jejich objevu byl v r. 1950 oceněn Nobelovou cenou a další desetiletí minulého století představují nebývalý rozvoj chromatografie, která našla uplatnění v nejrůznějších průmyslových odvětvích, především petrochemii, farmaceutickém, potravinářském a kosmetickém. 3.2 Teorie chromatografie [3, 4] Chromatografie je analytická fyzikálně-chemická separační metoda. Využívá distribuce látek mezi 2 fáze: mobilní fázi (pohyblivou) a stacionární fázi (nepohyblivou). Chromatografii lze dělit z různých hledisek: 1) povaha mobilní fáze : plynová, kapalinová 2) způsob provedení : kolonová (sloupcová), plošná (planární) 5
3) princip separace : rozdělovací, adsorpční, iontově výměnná, gelová, afinitní 4) pracovní způsob : eluční (analytická ch.), frontální, vytěsňovací 5) účel : analytická, preparativní (preparační) Princip chromatografické separace lze popsat následujícím způsobem: Separace probíhá v separační koloně, která obsahuje stacionární fázi (sorbent) a mobilní fázi (eluent). Vzorek je unášen mobilní fází kolonou a složky vzorku se separují podle své afinity ke stacionární fázi. Doba, kterou separovaný vzorek setrvává v koloně, závisí na velikosti interakcí a určuje pořadí, v němž se složky vzorku eluují. Čím větší je interakce se stacionární fází, tím větší má složka retenční čas neboť tím později vychází z kolony. Analyty vycházející z kolony jsou detekovány a výsledkem chromatografické separace je eluční křivka (pík). Eluční křivka vyjadřuje závislost odezvy detektoru na čase nebo objemu proteklé mobilní fáze. Obr. 2: Princip chromatografické separace [3] 3.3 Termodynamické aspekty separace [4] 3.3.1 Základní veličiny objem stacionární fáze V S [ml] objem mobilní fáze V M [ml] objemový průtok mobilní fáze F M [ml/min] lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min] délka kolony L [cm] distribuční konstanta K D,i - popisuje rovnováhu mezi koncentracemi analytu v obou fázích K D, i ( ci ) S ( ni ) S VM = = (6) ( c ) ( n ) V i M i M S 6
3.3.2 Retenční veličiny retenční objem V R,i [ml] - objem mobilní fáze prošlý kolonou po němž je A (analyt) na konci separační kolony retenční čas t R,i [min] - celkový čas A strávený v separační koloně mrtvý objem kolony Vm [ml] - objem eluentu prošlý kolonou za doby eluce nezadržovaného (inertního) A k detektoru mrtvý čas kolony t m [min] - retenční čas inertního A, pohybuje se s čelem MF objemový průtok mobilní fáze F M [ml/min] objem mobilní fáze proteklý kolonou za jednotku času Pro dané veličiny platí následující vztahy: V = F t (1) R, i m R, i 3.3.3 Redukované retenční veličiny Vm = Fm tm = VM (2) Jestliže odečteme od retenčního parametru odpovídající mrtvý parametr, získáme tzv. redukovaný retenční parametr, který je označován čárkou. Tyto veličiny jsou potřebné pro výpočet kapacitního poměru. redukovaný retenční čas t' R,i [min]- charakterizuje dobu, po kterou se analyt zdrží interakcemi se stacionární fází t = t t (3) ' R, i R, i m redukovaný retenční objem V' R,i [ml]- skutečný eluční objem V = V V (4) ' R, i R, i m V ' = F t ' (5) R, i m R, i 3.3.4. Retenční faktor (kapacitní poměr) Retenční charakterizace slouží k porovnávání chromatogramů při změně experimentálních podmínek (změna mobilní fáze, aj.) k i V V V R, i m R, i = = (7) V m V m ( n ) V k = i K ( n ) = (8) i S S D, i i M VM 7
k i t t t R, i m R, i = = (9) t m t m 3.4 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení [5] Nositelem kvalitativní informace jsou eluční parametry t R a V R. Eluční čas nebo objem neznámého analytu se statisticky porovnává s elučním časem nebo objemem standardu za stejných podmínek. Kvantitativní analýza vychází z toho, že plocha vymezená píkem nad základní linií je úměrná koncentraci látky. Chromatografický záznam- chromatogram: kde I [mau] = signál,t [min] = čas, t m = mrtvý čas, t R = retenční čas 3.4.1 Tvary píků [3] Gaussovský pík je symetrický pík má ideální tvar, jeho distribuční koeficient je roven 1. Frontující pík je pík rozmytý vpředu - vzniká, pokud eluční síla solventu vzorku je příliš silná oproti eluční síle mobilní fáze. Hodnota distribučního koeficientu je větší než 1. Chvostující pík je pík rozmytý vzadu- příliš dlouhá cesta mezi kolonou a detektorem. Zvyšuje se mrtvý objem systému, je nutné použít kratší kapiláru nebo kapiláru o menším vnitřním průměru. Hodnota distribučního koeficientu je menší než 1. 8
Obr.4: Tvary píků [3] 3.5. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) [5] Metody HPLC jsou založené na různém mechanismu separace, jejichž společným znakem je použití kapalné mobilní fáze, vysokotlaké techniky a účinných kolon. K dávkování vzorku se používá kohout s dávkovací smyčkou, která se naplňuje mikrostříkačkou. Kolony jsou zhotoveny z materiálů, který odolává vysokým tlakům (až 60 MPa) nejčastěji z borosilikátového tvrzeného skla nebo z antikorozní oceli. Kolony jsou plněny sorbenty s částicemi o velikosti 3 µm, délka kolon se pohybuje kolem 5 cm s vnitřním průměrem 2 mm. Poměrně velkých průtoků mobilní fáze se dosahuje použitím vysokotlakých čerpadel, která zajištují konstantní průtok mobilní fáze. 3.6. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP- HPLC, Reversed- Phase - High Performance Liquid Chromatography) [4] V RP-HPLC se používá polární mobilní fáze, které obsahují max. 5% H 2 O a 95% organické složky. Jako vhodné mobilní fáze je možné použít alkoholy (methanol), nitrily (acetonitril) a ethery (tetrahydrofuran, dioxan).většinou však tyto eluenty mají příliš velkou eluční sílu a proto se používají ve směsi s vodou. Mobilní fáze musí být před použitím odplyněna. Stacionární fáze je vysoce nepolární, je tvořena silikagelem s chemicky vázanou uhlovodíkovou s kupinou (fenyl, methyl, oktyl..). Pro detekci se nejčastěji používá spektrofotometrický (UV/ VIS) nebo fluorimetrický detektor. 9
4. Výsledky 4.1. Přístrojové vybavení - HPLC systém 10 AVP fy SCHIMADZU: a. odplyňovač GT-154, b. systémová řídící jednotka SCL-10AVP, c. pumpa LC-10AVP na dopravu mobilní fáze pod tlakem, d. pícka CTO-10ASVP s dávkovacím kohoutem Rheodyne 7120 a dávkovací smyčku 20 µl na injektování vzorku na kolonu, e. fotometrický detektor s diodovým polem detektor SPD-M10AVP, řídící software Class-VP 5.02, f. chromatografická kolona rozměrů 250 x 4 mm plněná sorbetem Silasorb C-18, zrnění 5µl (silikagel s chemicky vázanou oktadecylovou skupinou) g. injekční stříkačka se speciální upravenou jehlou pro dávkování vzorků, - ultrazvuková lázeň - odměrné baňky a další běžné laboratorní zařízení 4.2. Chemikálie - standard kofeinu - methanol - destilovaná voda - thiomočovina - testovací směs benzen, aceton, toluen 4.3. Podmínky měření Na začátku měření se kolona testovala testovací směsí, aby se ověřila její funkčnost a stav kolonky. Testovací směs obsahovala 44ml methanolu, 4 ml acetonu a 1 ml benzenu v mobilní fázi 70% MetOH. Jednotlivé složky se z kolony eluovaly v pořadí toluen > benzen > aceton, tedy dříve se eluovaly polárnější složky. Poté se zaznamenaly retenční časy, plochy, symetrie píků, tyto parametry by měly zůstat při každém měření stejné. Pokud některý parametr neodpovídá stejné hodnotě, jedná se o problém s funkčností kolony. Před použitím každé chemikálie jsme ji musely nechat odplynit na ultrazvuku. Pro stanovení mrtvého objemu V m jsme použily standard thiomočovinu, kterou jsme měřily při vlnové délce λ = 274 nm. Při stanovení analytu (kofeinu) jsme pracovaly s mobilní fází 50% MetOH, standard se měřil při vlnové délce λ = 524 nm a vzorek byl dávkován v objemu 20 µl. Pro optimalizaci jsme použily standard o koncentraci 100 µg.ml -1. Kalibrační křivka byla stanovena s koncentraci standardu kofeinu 12,5; 25; 50; 75 a 100 µg.ml -1. 10
4.4 Optimalizace systému Optimalizace systému byla prováděna s koncentrací standardu 100 µg.ml -1 při použití mobilní fáze 50% MetOH. Průtok mobilní fáze byl měřen při třech různých hodnotách 0,3; 0,5 a 0,7 ml.min -1. Vzorek byl dávkován v objemu 20 µl. Měřilo se při vlnové délce 524 nm pro kofein a 274 nm pro thiomočovinu. Tab.2.a: Thiomočovina, F = 0,3 ml.min -1, MF= 50% MetOH, λ = 274 nm, V=20 µl č.měření t m (min) V m (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 4,16 1,248 155206 4,16 0 0 0 0 2 4,16 1,248 149269 4,16 0 0 0 0 Ø 4,16 1,248 152237 Tab.2.b: Standard kofeinu, F = 0,3 ml.min -1, MF = 50% MetOH, λ = 524 nm, V=20 µl č.měření t r (min) V r (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 5,909 1,7727 14740376 5,902 0,003 0,056 0,015 0,008 2 5,899 1,7697 14081834 5,902 0,003 0,056 0,015 0,008 3 5,899 1,7697 15134065 5,902 0,003 0,056 0,015 0,008 Ø 5,902 1,771 14652092 t r = (x ± ½ IS) = (5,902 ± 0,008) min Tab.3.a: Thiomočovina, F = 0,5 ml.min -1, MF = 50% MetOH,, λ = 274 nm, V=20 µl č.měření t m (min) V m (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 2,496 1,2480 1430026 2,489 0,004 0,161 0,020 0,010 2 2,485 1,2425 1467741 2,489 0,004 0,161 0,020 0,010 3 2,485 1,2425 1581029 2,489 0,004 0,161 0,020 0,010 Ø 2,489 1,2443 1492932 t m = (x ± ½ IS) = (2,489 ± 0,010) min Tab.3.b: Standard kofeinu,, F = 0,5 ml.min -1, MF = 50% MetOH, λ = 524 nm, V=20 µl č.měření t r (min) V r (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 3,563 1,7815 8351092 3,552 0,011 0,310 0,055 0,027 2 3,541 1,7705 8381701 3,552 0,011 0,310 0,055 0,027 3 3,552 1,7760 8330160 3,552 0,011 0,310 0,055 0,027 Ø 3,552 1,7760 8354317 t r = (x ± ½ IS) = (3,552 ± 0,027) min Tab.4.a: Thiomočovina, F = 0,7 ml.min -1, MF = 50% MetOH,, λ = 274 nm, V=20 µl č.měření t m (min) V m (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 1,888 1,3216 82652 1,883 0,006 0,292 0,108 0,054 2 1,877 1,3139 75182 1,883 0,006 0,292 0,108 0,054 Ø 1,883 1,3178 78917 t m = (x ± ½ IS) = (1,883± 0,054) min 11
Tab.4.b: Standard kofeinu, F = 0,7 ml.min -1, MF = 50% MetOH, λ = 524 nm, V=20 µl č.měření t r (min) V r (ml) A(µm 2 ) s s r IS ½ IS 1 2,645 1,8515 5869877 2,635 0,006 0,232 0,030 0,015 2 2,635 1,8445 5472008 2,635 0,006 0,232 0,030 0,015 3 2,624 1,8368 5484259 2,635 0,006 0,232 0,030 0,015 Ø 2,635 1,8443 5608714 t r = (x ± ½ IS) = (2,635 ± 0,015) min Tab.5: Výpočet kapacitního poměru F (ml.min -1 ) k i 0,3 0,4188 0,5 0,4271 0,7 0,3996 4.4.1. Ukázka výpočtu Podmínky: F = 0,3 ml.min -1, MF = 50% MetOH, c (kofeinu) = 100 µg.ml -1, V= 20 µl, λ = 524 nm Výpočet V m a V r : ( 10) V m = 0,3 * 4,160 = 1,2480 ml (11) Výpočet aritmetického průměru: V r = 0,3 * 5,909 = 1,7727 ml (12) Výpočet směrodatné odchylky: = (5,909 + 5,899 +5,899) / 3 = 5,9023 min (13) s = ((( 5,909 5,9023) 2 + (5,899 5,9023) 2 + (5,899 5,9023) 2 ) / (3 1)) 1/2 = 0,003 12
Výpočet relativní směrodatné odchylky s r = s/.100 (14) s r = 0,0033/5,9023. 100= 0,0559 Výpočet intervalu spolehlivosti: IS = 2 S (t α,υ / n 1/2 ) (15) IS = 2 0,003 (4,303 / 3 1/2 ) = 0,015 kde, t α,υ = studentovo rozdělení, tabelovaná kritická hodnota: t 0,05, 2 = 4,303 a t 0,05, 1 = 12,706 n = počet měření α = 0,05 95% pravděpodobnost Výpočet kapacitního faktoru: (16) k i = (5,9023 4,160) / 4,160 = 0,4188 (17) 4.5 Kalibrační závislost Pro sestrojení kalibrační křivky jsme použily koncentrace kofeinu 12,5; 25; 50; 75 a 100 µg.ml -1, dávkovaly jsme 20 µl vzorku, mobilní fáze 50%MetOH a F = 0,5 ml.min -1. Standard byl měřen při vlnové délce 524 nm. Tabulka zahrnuje vždy průměr hodnot vypočítaný ze tří měření. Tab.6: Kalibrační závislost Thiomočovina t m (min) A (µm 2 ) F (ml.min -1 ) Ø 2,475 1512373 0,5 Standard kofeinu c (µg.ml -1) t m (min) A (µm 2 ) F (ml.min -1 ) 12,5 3,520 1369564 0,5 25 3,651 2219105 0,5 50 3,602 4537629 0,5 75 3,573 6840120 0,5 100 3,552 8354318 0,5 13
Kalibrační křivka A (m 2 ) 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 y = 82650x + 325027 R 2 = 0,9946 0 0 20 40 60 80 100 120 c kofeinu (g/ml) Obr.5: Kalibrační křivka standardu kofeinu 4.5.1. Výpočet LOD a LOQ LOD (limit of detection, mez detekce) je nejnižší relevantní detekovatelné množství. LOQ (limit of quantification, mez stanovitelnosti) je nejnižší relevantní stanovitelné množství. Hodnoty LOD a LOQ byly vypočítané z kalibrační křivky, z rovnice lineární regrese y= 82650x +325027. Koeficient a lze při výpočtech zanedbat, protože v horní a dolní mezi spolehlivosti je zahrnuta 0. Tab.7.: Hodnoty pro výpočet rovnice lineární regrese koncentrace kofeinu (µg.ml -1 ) plocha A (µm 2 ) 12,5 1369564 25 2219105 50 4537629 75 6840120 100 8354318 Tab.8.: Dopočítané hodnoty z rovnice kalibrač. křivky Koeficienty Chyba stř. hodnoty Dolní 95% Horní 95% a 325026,963 217199,4135-366199,1561 1016253,083 b 82649,9093 3532,164751 71408,97406 93890,84448 LOD = ( 3 s b ) / b (18) LOD = ( 3 217199,4) / 82649,91 = 7,9 µg.ml -1 LOQ = (10 s b )/ b (19) LOQ = (10 217199,4) / 82649,91 = 26,3 µg.ml -1 14
5. Závěr Cílem našeho samostatného projektu bylo seznámení se metodou HPLC, vyzkoušení práce s jednoduchým systémem a procvičení následného statistického vyhodnocení. Jako analyt jsme použily standard alkaloidu kofeinu o koncentracích 12,5, 25, 50, 75 a 100 µg.ml -1. Měřením jsme zjistily, že pro koncentraci kofeinu 100 µg.ml -1 je nejoptimálnější rychlost průtoku mobilní fáze 0,5 ml.min -1., protože kapacitní faktor se nejvíce blížil hodnotě 1. Z kalibrační křivky plyne, že s rostoucí koncentrací analytu roste i jeho plocha pod píkem. Mez detekce byla 7,9 µg.ml -1 a mez stanovitelnosti 26,3 µg.ml -1. 15
6. Seznam použité literatury: [1] Kofein [online]. [cit.2008-01-28]. Dostupný z WWW: <http://cs.wikipedia.org/wiki/kofein>. [2] Chem. Listy 97, 134-139 (2003) [3] Havliš J., Separační metody A [4] http://www.sweb.cz/hplc [5] Jančářová I., Jančář L., Analytická chemie 16