Univerzita Pardubice

Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie Semestrální práce 2000 2.2 - Kalibrace a limity její přesnosti Přednášející: Prof. RNDr. Milan Meloun, DrSc. Vypracoval: Ing. Vladimír Bartoš FNsP Ostrava Imunoanalytická laboratoř Kliniky nukleární medicíny a Referenční laboratoř MZ ČR pro metody RSA 1

Příklad 1: Lineární kalibrace U přímkové kalibrační závislosti vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. Kalibrační závislost, charakterizující naměřené četnosti radioaktivity (cpm) na koncentraci thymidinkinázy lze u radioreceptorové analýzy (RRA), v případě koncentrací do 100 U/l, považovat za lineární. Zjistěte koncentrace thymidinkinázy ve třech kontrolních vzorcích, jestliže u těchto vzorků byly změřeny hodnoty cpm: 749, 2458 a 4579. Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení, jestliže byly experimentálně zjištěny následující odezvy kalibrátorů A, B, C, D, E a F, přičemž analýza každého z nich byla provedena třikrát: Kalibrátor Analýza 1 Analýza 2 Analýza 3 Označení Koncentrace [U/l] [cpm] [cpm] [cpm] A 2,50 555 521 561 B 5,00 974 972 1013 C 10,0 1951 1867 1886 D 20,0 3787 3650 3635 E 40,0 7313 7206 7356 F 80,0 14396 14379 14339 Řešení: S využitím programu ADSTAT (modul Kalibrace : Kalibrační přímka) byla experimentálními daty pomocí metody nejmenších čtverců proložena kalibrační přímka vetvaru: cpm = 178,5 (±0,4)*c + 112,2(±16,7) přičemž oba parametry, směrnice i úsek jsou statisticky významné na hladině významnosti 0,05. Obr.1.1: Kalibrační přímka kalibrace TK Odhad směrodatné odchylky reziduí s(e) se rovná 50,8 cpm což je mírně nad úrovní přirozeného pozadí měření radioaktivity (cca 40 cpm). 2

Z analýzy vlivných bodů by se dalo usuzovat na přítomnost vlivných bodů vpřípadě bodu 10 a 15, které se dají charakterizovat jako středně vlivné outliery, body 16, 17 a 18 jsou charakterizovány jako extrémní. V případě řešení úkolu však nebyl vyloučen žádný vlivný bod. Limity přesnosti kalibracejsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 1, pod bodem (4) Kalibrační meze. Přímé bodové odhady i korigované Naszodiho modifikované odhady koncentrací jsou v případě všech tří kontrolních vzorků vždy prakticky shodné, z čehož vyplývá, že provedení korekce na vychýlení přímého bodového odhadu v daném případě není nutná. Bodové i intervalové odhady jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 1, pod bodem (5) Kalibrační tabulka. Závěr: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků tedy jsou: Vz. č. 1: Vz. č. 2: Vz. č. 3: c 1 = 3,567 (2,936 4,199); 0,395; (2,37) U/l c 2 = 13,15 (12,52 13,77); 0,395; (2,37) U/l c 3 = 25,02 (24,44 25,64); 0,395; (2,37) U/l Byly stanoveny následující limity přesnosti kalibrační přímky: Kritická úroveň, yc: 1.4760E+02 xc: 1.9812E-01 Limita detekce, yd: 1.8271E+02 xd: 3.9480E-01 Mez stanovitelnosti, ys: 5.3478E+02 xs: 2.3672E+00 3

Příklad 2: Nelineární kalibrace U nellineární (křivkové) kalibrační závislosti vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. Kalibrační závislost v případě imunoradiometrické analýzy (IRMA) neuron-specifické enolázy (NSE), charakterizující změnu naměřené četnosti radioaktivity (cpm) v závislosti na koncentraci NSE, má nelineární charakter. Zjistěte koncentrace NSE v případě tří kontrolních vzorků, jestliže při analýze těchto vzorků byly změřeny hodnoty cpm: 550, 4310 a 6350. Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení, jestliže byly experimentálně zjištěny pro jednotlivé kalibrátory A, B, C, D a E následující hodnoty cpm (přičemž analýza každého z nich byla provedena třikrát): Kalibrátor Analýza 1 Analýza 2 Analýza 3 Označení Koncentrace [µg/l] [cpm] [cpm] [cpm] A 0,00 208 221 215 B 24,5 2380 2490 2394 C 49,0 7805 7783 7853 D 98,0 19596 19635 19619 E 154,0 26900 27009 26831 Řešení: Vzhledem k tvaru kalibrační závislosti byla pro proložení kalibrační křivky zvolena v programu ADSTAT metoda Kubický spline v modulu Kalibrace. S ohledem na esovitý charakter křivky, na základě srovnání hodnot parametrů RSC, Mer[%] a s(e) a z porovnání limit přesností stanovení, byla zvolena varianta s jedním uzlovým bodem, přičemž jeho umístění bylo zvoleno pro souřadnici x = 55 µg/l. Umístění uzlového bodu v oblasti mezi 40-80 µg/l nemělo zásadní vliv na uvedené parametry. Počet uzlů 0 1 Reziduální součet čtverců, RSC 4.1627E+05 2.6695E+04 Průměr absolutních hodnot reziduí, Me 1.3954E+02 3.0800E+01 Průměr relativních reziduí, Mer[%] 14.394 0.921 Odhad reziduálního rozptylu, s^2(e) 3.7843E+04 2.6695E+03 Odhad směrodatné odchylky reziduí, s(e) 1.9453E+02 5.1668E+01 Koeficienty kalibračnírovnicevetvaru y=e[i]*x 3 + f[i]*x 2 + g[i]*x + h[i] jsou pro oba úseky i=1,2 uvedeny v Příloze č.2, část Výstup pod bodem (1)Parametry kalibrace. Proložená kalibrační křivka jeznázorněna na obr. č. 2.1. 4

Obr.2.1.: Kalibrační křivka kalibrace NSE Odhad směrodatné odchylky reziduí s(e) se rovná 51,7 cpm což je mírně pozadí měření radioaktivity (cca 40 cpm). nad úrovní přirozeného Limity přesnosti kalibrace jsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 1, pod bodem (4) Kalibrační meze. Inverzní bodové odhady koncentrací i jejich intervalové odhady jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 2, část výstup, pod bodem (5) Kalibrační tabulka. Závěr: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků tedy jsou: Vz. č. 1: Vz. č. 2: Vz. č. 3: c 1 = 9,78 (8,92 10,61); 4,975; (6,370) µg/l c 2 = 34,17 (33,92 34,41); 4,975; (6,370) µg/l c 3 = 43,05 (42,83 43,29); 4,975; (6,370) µg/l Byly stanoveny následující limity přesnosti kalibrační závislosti: Kritická úroveň, yc: 2.811329E+02 xc: 4.975441E+00 Limita detekce, yd: 3.393416E+02 xd: 6.370262E+00 5

Příklad 3: Rozlišení mezilineární a nelineární kalibrací U experimentální kalibrační závislosti rozhodněte o počtu uzlových bodů, typu splinové závislosti a současně vyčíslete bodový a intervalový odhad pro tři neznámé koncentrace a současně vyčíslete i limity přesnosti. Vpřípadě imunoradiometrického stanovení růstového hormonu (STH) vyjadřuje kalibrační křivka závislost naměřené četnosti radioaktivity (cpm) na koncentraci STH. Pro konstrukci kalibrační závislosti použijte následující experimentální data zjištěná při analýze jednotlivých kalibrátorů (opakovaně, každý 3x), obsahujících deklarované množství růstového hormonu. (viz. Tabulka 3.1.). Současně vyčíslete limity přesnosti stanovení Pro tři neznámé vzorky, u nichž byly změřeny hodnoty cpm: 556, 2385 5265 zjistěte jako bodové a intervalové odhady odpovídající koncentrace STH., Kalibrátor Označení Koncentrace [µg/l] cpm1 cpm2 cpm3 A 0 6,000000 E+01 7,500000 E+01 9,400000 E+01 B 0,5 2,950000 E+02 3,120000 E+02 2,770000 E+02 C 1,0 5,730000 E+02 5,280000 E+02 5,590000 E+02 D 2,0 1,095000 E+03 1,120000 E+03 1,151000 E+03 E 4,0 2,550000 E+03 2,531000 E+03 2,518000 E+03 F 6,0 4,031000 E+03 4,052000 E+03 4,079000 E+03 G 8,0 5,472000 E+03 5,443000 E+03 5,420000 E+03 H 10,0 6,567000 E+03 6,545000 E+03 6,581000 E+03 Tabulka 3.1.: Experimentální data kalibrace STH Řešení: S využitím programu ADSTAT (modul Lineární regrese : Regresní diagnostika) byla indikována nevhodnost použití lineárního kalibračního modelu (zřetelně vyplývá zrozložení experimentálních dat i z nenáhodného rozložení tvaru závislosti reziduí na predikci. (viz. Obr.3.1.) Obr.3.1.: Kalibrační přímkaazávislost reziduí na predikci. Ve druhé fázi bylo provedeno pomocí programu ADSTAT (modul Kalibrace Kalibrační přímka) zhodnocení vhodnosti jednotlivých typů nelineární kalibrace pomocí funkcí Kvadratický spline a 6

Kubický spline, přičemž byl sledován vliv počtu uzlů na reziduální součet čtverců (RSC), průměr relativních reziduí (Mer[%]) a odhad směrodatné odchylky reziduí s(e). Rovněž byl sledován vlivna kritickou úroveň a limitu detekce kalibrace. Výsledky testování optimálního způsobu proložení nelineární kalibrační závislosti jsou shrnuty v tabulce č. 3.2. Kvadratický spline Kubický spline Uzly 0 1 2 3 0 1 1 [6,0] 2 3 RSC 274000 14100 8670 7740 9070 8170 7995 7820 7640 Me 96,6 20,1 16,3 15,3 16,5 16,0 15,7 15,4 15,1 Mer 34,8 5,79 3,32 3,30 3,35 3,43 3,40 3,31 3,25 s(e) 114 26,5 21,3 20,7 21,3 20,7 20,5 20,8 21,2 x c - 0,051 0,052 0,053 0,049 0,055 0,053 0,057 0,059 x d - - 0,098 0,099 0,093 0,102 0,099 0,104 0,105 Tabulka 3.2. Testování optimálního počtu uzlů azpůsobu proložení splinové kalibrační závislosti. Na základě provedeného rozboru lze usuzovat, že optimálním způsobem proložení nelineární kalibrační závislosti je použití kubického splinu, přičemž počet uzlů neovlivňuje zásadnímzpůsobem parametry charakterizující reziduální rozptyl proložení. Optimálnímpočtem se jeví 1uzel,přičemž by bylo vhodnější jeho mírně excentrické umístění kvyšším hodnotám vzhledem k rozsahu koncentrací (např. jeho posunutí do polohy c = 6,0 µg/l). I když při použití polynomu 3. stupně je docíleno dobré vizuální shody regresní křivky s experimentálními body, je na grafu závislosti reziduí na predikci i z grafu Jacknife reziduí patrná přítomnost bodů, ovlivňujících kvalitu proložení (viz.obr.3,2,). Obr.3.2.: Graf závislosti reziduí na predikci a graf Jacknife reziduí. Z tohoto pohledu se jako vlivné body jeví především měření č. 10a21, podezřelým jeiměření č. 18. Tato skutečnost byla rovněž potvrzena na základě detekce vlivných bodů provedené programem ADSTAT (modul Lineární regrese : Regresní diagnostika), což je zřejmé např. z L-R grafu nebo i McCulloh-Meeterova grafu pro indikaci vlivných bodů (viz. Obr. 3.3.). Z originálních experimentálních dat byly proto vyloučeny body č. 10 a 21 a bylo opakovaně provedeno zhodnocení reziduálních parametrů kalibrace a zjištěny limity přesnosti kalibrace. Výsledné parametry se pouze zanedbatelně lišily připoužití jednoho a žádného uzlu (při použití nulového počtu uzlů však nebyly vyčísleny limity přesnosti kalibrace x c ax d ). 7

Závěr: Proto byl jako výsledný model kalibrace použit kubický spline s jedním uzlovým bodemvestředu rozsahu nezávisle proměnné, tj. pro koncentraci STH c=5,0 µg/l. Proložená kalibrační křivka je uvedena na Obr. 3.4. Hodnoty jednotlivých parametrů kalibrační křivky jsou uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 3,část Výstup, bod (1) Parametry kalibrace. Obr.3.3.: L-R a McCulloh-Meeterův graf pro indikaci vlivných bodů. Obr.3.4.: kalibrace STH. Limity přesnosti kalibrace byly zjištěny pomocí programu ADSTAT : x c = 0,048 µg/l x d = 0,090 µg/l a jsou uvedeny rovněž vpříloze č. 3, Výstupu z programu ADSTAT, část Výstup, bod (4) Kalibrační meze. Inverzní bodové odhady koncentrací jsou pro jednotlivé kontrolní vzorky uvedeny ve výstupu z programu ADSTAT Příloha č. 3, část Výstup, bod (5) Kalibrační tabulka, kromě toho také vnásledující tabulce č. 3.4.. y x LL LU Cpm µg/l µg/l µg/l Vzorek č. 1 556 1,012 0,985 1,040 Vzorek č. 2 2385 3,797 3,773 3,820 Vzorek č. 3 5265 7,702 7,667 7,738 Tabullka 3.4.: Nalezené koncentrace jednotlivých kontrolních vzorků 8

Název souboru: Kalibrace Adresář: E:\VYUKA\LS\Diskety\LS89002\Bartos\Kalibrace Šablona: D:\Program Files\Microsoft Office\Sablony\Normal.dot Název: 1 Předmět: Autor: Ing. Vladimír Bartoš Klíčová slova: Komentáře: Datum vytvoření: 31.08.00 14:35 Číslo revize: 3 Poslední uložení: 31.08.00 14:57 Uložil: Ing. Vladimír Bartoš Celková doba úprav: 20 min. Poslední tisk: 14.09.00 13:12 Jako posledníúplný tisk Počet stránek: 8 Počet slov: 1 614 (přibližně) Počet znaků: 9 204 (přibližně)