ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Kultivační stanovení: Stanovení koliformních bakterií Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D. 217 17 5642 Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování: 2015 1
Kultivační stanovení: Stanovení koliformních bakterií Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení koliformních bakterií v nedezinfikovaných vodách (povrchových, podzemních, odpadních vodách, apod.). Lze ji použít i pro pitné vody, kde je nadměrný růst doprovodné mikroflóry. Není vhodná pro vzorky s vysokým obsahem nerozpuštěných látek, které ruší membránovou filtraci nebo kde vysoký počet jiných organismů omezuje růst stanovovaných bakterií. Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/100 ml, tj. nález jedné kolonie na ploše membránového filtru při filtraci 100 ml vzorku. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/100 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek filtrace 100 ml. Pracovní rozsah: Pracovní rozsah je od 0 KTJ/100 ml (dáno požadavkem vyhlášky č. 252/2004 Sb.). Shora pracovní rozsah není omezen, lze filtrovat menší objem vzorku nebo použít desetinné ředění vzorku. Stanovený ukazatel: Koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky z čeledi Enterobacteriaceae, které netvoří spory, jsou schopné růst na kultivačním médiu obsahujícím žlučové soli (na Endoagaru). Mají schopnost fermentovat laktózu při teplotě 36 C ± 2 C se současnou tvorbou kyselin, plynu a aldehydu během 24 h a mají negativní cytochromoxidázový test. Podstata zkoušky: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku se filtruje přes membránový filtr, který se přenese na selektivní kultivační agarové médium s laktózou. Naočkované misky s membránovými filtry se kultivují při 36 C ± 2 C po dobu 18 h až 24 h. Pozitivním cytochromoxidázovým testem se vyloučí kolonie bakterií, které nepatří do skupiny koliformních bakterií. Přístroje a pomůcky: Analytické váhy citlivost 0,01 g. Autokláv (121 ± 3 C). Bunsenův kahan. Membránové filtry o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 m. Erlenmayerovy láhve, lahve DURAN 45 se šroubovým uzávěrem. Filtrační zařízení s vývěvou SARTORIUS. Pinzety. Pipety s možností aplikace objemu 1 a 10 ml (popř. 0,1 ml dle povahy vzorku a potřeby), jednorázové špičky. 2
Sterilní plastové Petriho misky o průměru 60 mm. Termostat 36 C ± 2 C Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku. Endo agar (HiMedia M1481 anebo M029). Roztok bazického fuchsinu. Roztok pro cytochromoxidázový test. Ředící roztok (fyziologický roztok). Postup zkoušky: Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 C až 25 C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku. Promíchání vzorku: Vzorek se musí dokonale promíchat intenzivním protřepáním, aby se bakterie rovnoměrně rozptýlily v celém objemu vzorku. Volba vhodného objemu vzorku: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku má být volen tak, aby na membránovém filtru o průměru 5 cm vyrostlo nejvýše 100 kolonií. Pro pitné vody je stanoven objem filtrovaného vzorku 100 ml. U surových vod povrchových, kde je předpoklad vyššího mikrobiálního znečištění se použije přiměřeně menší objem filtrovaného vzorku, případně vzorek zředěný. Stupeň zředění se určuje podle zkušenosti z předchozích rozborů, u vzorků neznámého složení se připravuje stupňů ředění více. Pro každý stupeň zředění se užívá zřeďování v poměru 1:10. Zřeďování se provádí v lahvičkách se zábrusovým uzávěrem obsahujících 9 ml nebo 90 ml sterilního ředícího roztoku přidáním 1 ml nebo 10 ml vzorku neředěného nebo již zředěného v nižším stupni. Lahvička se uzavře a promíchá intenzivním protřepáním. Filtrace: Zapojí se filtrační přístroj a vývěva. Plamenem kahanu se vysterilizuje pevný, porézní disk spodní části filtrační nálevky. Sterilní pinzetou se na něj umístí sterilní membránový filtr o velikosti pórů 0,45 m a upevní se sterilní nálevka. Při zavřeném kohoutu vývěvy se nalije nebo odpipetuje do nálevky požadovaný objem vzorku. Následuje otevření výpustného kohoutu spodní části nálevky a pomocí vakua vývěvy se vzorek přefiltruje. Kultivace: Po odsátí celého objemu vody se odstraní nálevka a membránový filtr se přenese sterilní pinzetou na pevné kultivační médium (Endo agar) v Petriho misce. Filtr se klade pozvolna tak, aby nevznikly mezi kultivačním médiem a filtrem vzduchové bubliny. Takto připravené misky se obrácené dnem vzhůru uloží do termostatu a kultivují se při teplotě 36 C ± 2 C 18 h až 24 h. Konfirmace: Cytochromoxidázovým testem se vyloučí kolonie bakterií, které mají podobné morfologické a biochemické vlastnosti, ale nepatří do skupiny koliformních bakterií. Pinzetou se z Petriho misky přenese membránový filtr s vyrostlými koloniemi na kousek filtračního papíru nasyceného roztokem pro cytochromoxidázový test. Je nutné používat filtrační papír, který se činidlem nebarví modře. Po dvou minutách se spočítají kolonie koliformních bakterií, které jsou tmavočervené a mají negativní cytochromoxidázový test (vyloučí se kolonie, které působením činidla na cytochromoxidázu zmodraly), viz obr. 1 a 2. 3
Vyhodnocení zkoušky: Počet koliformních bakterií se vyjadřuje u nezředěných vzorků na zpracovaný objem vzorku, tj. na 100 ml. U vzorků filtrovaných z menšího objemu a u zředěných vzorků se přepočítává na 100 ml. V nezředěném vzorku se udává celkový počet kolonií i v tom případě, že vyrostlo méně než 10 kolonií na misce. Ve zředěném vzorku se uvádějí výsledky pouze z ředění, kde na miskách vyrostlo 10 až 100 kolonií. Misky, na kterých vyrostlo v důsledku nesprávné volby ředění více než 100 kolonií, se označují jako nepočitatelné a nevyhodnocují se. Obr. 1. Stanovení koliformních bakterií, vlevo kolonie na membránovém filtru po filtraci 50 ml vzorku, vpravo kolonie na membránovém filtru po filtraci 100 ml vzorku. Obr. 2. Konfirmace koliformních bakterií cytochromoxidázovým testem, kterým se modré kolonie, které jsou pozitivní, vyloučí. Vlevo kolonie na membránovém filtru po filtraci 50 ml vzorku, vpravo kolonie na membránovém filtru po filtraci 100 ml vzorku. 4
Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako počet KTJ na zpracovaný objem vzorek, např. 100 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit. Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN 75 7837 Jakost vod Stanovení koliformních bakterií v nedesinfikovaných vodách 5