ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgM

ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgM Katalogové číslo: OD-345 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgM ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti antigenu Herpetického viru typu 6 (HHV-6) v lidském séru. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro laboratorní diagnostiku chorob vyvolaných nebo souvisejících s lidským herpetickým virem typu 6, např. dětské nemoci (exanthema subitum), akutních virových infekcí a febrilních křečí u kojenců, infekčních mononukleóz bez heterofilních protilátek a oportunních infekcí u pacientů s oslabenou imunitou, včetně infekcí provázených neurologickými komplikacemi. Test nerozlišuje protilátky proti HHV-6 typu A a B. Pozitivní výsledek testu lze interpretovat jako suspektní probíhající nebo recentně prodělanou aktivní infekci. Doplňkovým testem pro sérologické vyšetření infekce HHV6 je stanovení IgG protilátek (ELISA- VIDITEST anti-hhv6 IgG (CSF) v séru, případně stanovení intrathekální syntézy těchto protilátek v mozkomíšním moku. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán nativní antigen HHV-6. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené směsí specifických antigenů STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml pozitivního kontrolního séra CONTROL + 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CONTROL - 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou (konjugát anti-igm Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml ředicího roztoku anti-hhv6 r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB-BF 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička 1 ml RF sorbentu 51x koncentrovaného RF SORB 51x 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Ředící roztok DIL r.t.u. je určen pouze pro soupravu ELISA-VIDITEST anti-hhv-6 IgG, IgM. Chromogensubstrátový roztok TMB-BF r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA- VIDITEST, které obsahují TMB-BF, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB, TMB-O. 1

5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm. (Referenční filtr 620-690 nm není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a kontrolní séra. Připravte si ředicí roztok plus (DIL PLUS) pro ředění sér následujícím způsobem: Přidejte 1 díl RF sorbentu RF SORB 51x k 50 dílům ředicího roztoku r.t.u. DIL ředění 51x (např. 1 ml RF sorbentu + 50 ml ředicího roztoku r.t.u.). Řeďte jen takové množství, které spotřebujete pro ředění sér v testu. b. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem plus 101x (např. 5 μl séra + 500 μl ředicího roztoku plus) a inkubujte 10 min. při laboratorní teplotě. Ředicí roztok plus obsahuje anti-lidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Séra, naředěná v ředícím roztoku plus, vytvoří opalescenční roztok. Sraženinu není třeba před aplikací odstraňovat. Kontrolní séra neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni při 32 až 37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10 o C. d. Konjugát anti-igm Px, chromogensubstrátový roztok TMB-BF a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP PRO KVALITATIVNÍ/SEMIKVANTITATIVNÍ STANOVENÍ PROTILÁTEK V SÉRU: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky po 100 μl kontrolními séry a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem (DIL PLUS) pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte pozitivním kontrolním sérem CONTROL +, které slouží zároveň jako kalibrátor. Další jamku negativním kontrolním sérem CONTROL - a zbývající jamky ředěnými testovanými séry (S1, S2, ) (viz Tab 1.). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte CONTROL + na tři jamky, vyšetřovaná a negativní kontrolní sérum aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu anti-igm Px r.t.u. CONJ. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μl promývacího roztoku (viz bod c). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB-BF. Inkubujte 20 minut (+/- 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. 2

h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab.1: Schéma aplikace vzorků: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL PLUS S5 b CONTROL + S c CONTROL + d CONTROL - e f g h S1 S2 S3 S4 8. HODNOCENÍ TESTU Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL PLUS = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD CONTROL +. Pokud aplikujete CONTROL + na tři jamky a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD CONTROL + vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru je uvedena v Certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení 1. Stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1, bod 2) 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,00 + 2,01-3,00 ++ > 3,00 +++ Příklad: Získaná OD CONTROL + = 1,119; 1,145 Průměrná hodnota OD CONTROL + = 1,132 OD vzorku séra = 0,800 Korekční faktor CONTROL + = 0,16 Cut-off hodnota = 1,132 x 0,16 = 0,181 Hodnota indexu = 0,800 / 0,181 = 4,42 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. 3

9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: IgM protilátky proti HHV6 se tvoří přechodně po prodělané akutní infekci. Při rekurentních infekcích se tvoří specifické IgM jen v nízkých titrech a nemusí být ELISA testem prokazatelné. Malé děti mohou být v akutní fázi infekce séronegativní a vytvořit IgM protilátky až v období rekonvalescence. Test může zachycovat i křížově reagující protilátky proti HHV7 a CMV. Séra pacientů s polykolonální aktivací imunitního systému (infekční mononukleoza, toxoplazmoza, některá autoimunitní a lymfoproliferativní onemocnění) mohou poskytovat v testu falešně pozitivní výsledky. Pro určení diagnózy je nutno výsledky testu interpretovat vždy v kontextu s klinickými příznaky a výsledky dalších laboratorních vyšetření. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu pro kvalitativní (semikvantitativní) hodnocení Hodnota OD CONTROL + by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Poměr OD negativní kontroly CONTROL - / cut off by měl být 0,8 Test je určen pro stanovení specifických IgM protilátek v lidském séru. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy reprodukovatelnosti (interassay) a během testu opakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 7%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±δ CV opak. 16 0,808 0,074 5,8 % 16 2,777 0,046 1,6% 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±δ min max CVrepro 4 1,798 0,166 1,6-2,039 9,2% 5 2,631 0,19 2,286-2,807 7,2% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním 45 HHV-6 IgM-pozitivních vzorků charakterizovaných na jiné komerční soupravě. Citlivost testu byla 93%. Specifita testu byla stanovena testováním 245 HHV-6 IgM-negativních vzorků. Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 94%. Hraniční výsledky nebyly zahrnuty do kalkulace. Výsledek v ELISA-VIDITEST anti HHV-6 IgM HHV-6 status negativní hraniční pozitivní celkem IgM - negativní 228 3 14 245 IgM - pozitivní 3 1 41 45 4

10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. Přesto lze testovat takové vzorky pouze s výhradami. Přídavek RF sorbentu do ředícího roztoku pro séra odstraňuje interferenci revmatoidního faktoru u většiny vzorků. Vzorky s vysokou hladinou revmatoidního faktoru však mohou poskytovat falešně pozitivní výsledky. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Promývací roztok a stop roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST. Není-li v návodu uvedeno jinak. b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. d. Kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-igm Px jsou konzervovány ProClinem 300. e. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. f. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXSPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 C až +10 C. Za těchto podmínek je exspirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. 5

c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 C až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 C až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte 100 μl/ jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Krok 3. Aplikujte 100 μl/ jamku Px konjugátu r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Krok 4. Aplikujte 100 μl/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB-BF Inkubujte 20 minut při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 μl/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 / 620-690 nm do 20 minut Doporučená literatura: Salahuddin S.Z., Ablashi D.V., Markham P.D., Joseph S.F., Sturzenegger S., Kaplan M. Halligan G., Biberfeld P., Wong-Stall F., Kramarsky B., Gallo R.C.; Isolation of a new virus, HBLV, in patiens with lymphoproliferative disorders. Science 234: 596-601, 1986 De Bolle L., Naesens L., De Clercq E., Update on Human Herpesvirus 6 Biology, Clinical Features and Therapy, Clinical Microbiology Reviews, 217-245, 2005 Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014 Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu ČR. 6