ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF) OD-087 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: +420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG: ELISA souprava pro ELISA souprava pro semikvantitativní nebo kvantitativní detekci protilátek třídy IgG proti viru varicella zoster (VZV) v séru a pro stanovení intrathekální syntézy. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo spojených s VZV, např. planých neštovic a pásového oparu, včetně infekcí provázených neurologickými komplikacemi (encefalitis, meningitis, cerebellitis, vaskulitis, myelitis a zánětlivé neuropatie). Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku neuroinfekcí, očních infekcí a kožních exanthematických onemocnění. Doplňkovými testy pro sérologické vyšetření VZV jsou detekce IgM, či IgA protilátek a stanovení avidity IgG protilátek proti VZV (ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM, ELISA-VIDITEST anti-vzv IgA, ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG a avidita IgG). 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán nativní antigen VZV. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizované antigeny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Intenzita zabarvení substrátu odpovídá množství protilátek v testovaném vzorku. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml Standardu A=negativního kontrolního séra, r.t.u. 1) ST A/CTRL- 1 lahvička 1,3 ml Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 1 lahvička 1,3 ml Standardu E=Stamdard 2 (pozitivní kontrolní sérum), r.t.u. ST E/ST 2 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-igg Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1
Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA- VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm. (Referenční filtr 620-690 nm není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, negativní kontrolní sérum a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (5 l séra + 500 l ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku + 450 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni při +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Konjugát anti-igg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP PRO KVALITATIVNÍ/SEMIKVANTITATIVNÍ STANOVENÍ PROTILÁTEK V SÉRU: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl standardy a ředěnými testovanými vzorky podle schématu (viz Tab. 1): První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte Standardem 1 ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku pozitivním kontrolním sérem ST E/ST 2 a další negativním kontrolním sérem ST A/CTRL-, zbývající jamky ředěnými testovanými séry (S1, S2, ). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 l promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 l konjugátu anti-igg Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 l promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. 2
f. Napipetujte do jamek po 100 l chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut ( 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 l stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab. 1: Schéma aplikace vzorků: a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DIL b ST D/ST 1 c ST D/ST 1 d ST E/ST 2 e ST A/CTRLf S1 g S2 h S 8. HODNOCENÍ TESTU: Kvalitativní a semikvantitativní hodnocení lze využít pouze pro stanovení protilátek v séru. Pokud chcete stanovit intrathekální syntézu protilátek v mozkomíšním moku, využijte kvantitativní stanovení pomocí programu VIDISOFT a postup uvedený v příloze k návodu. Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu 1 ST D/ST 1 ze dvou jamek. Pokud jste Standard 1 aplikovali na tři jamky a některá se liší o více jak 20% od průměru, nepoužívejte ji při výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu 1 ST D/ST 1 vynásobíte korekčním faktorem. Korekční faktor Standardu 1 se určuje pro každou šarži soupravy a je uveden v Certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. 3
8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (kap. 8.1. bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,50 + 2,51-5,00 ++ 5,01-8,00 +++ > 8,00 ++++ Příklad: Získaná OD Standardu 1 = 1,807; 1,704; 1,750 Průměrná hodnota OD = 1,754 Korekční faktor = 0,15 Cut-off hodnota = 1,754 x 0,15 = 0,263 OD vzorku séra = 0,800 Hodnota indexu = 0,800 / 0,263 = 3,04 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 9. CHARAKTERISTIKY TESTU: 9.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér a poměr hodnot OD standardů ST E/ST 2 / ST D/ST 1 by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 9.2 Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 9.2.1 Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 9.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. 4
Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A min max CV repro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 9.2.3 Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 9.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno pomocí porovnání výsledků vyšetření vzorků soupravou VIDITEST s výsledky vyšetření dvěma srovnávacími komerčními ELISA testy a testem nepřímé imunofluorescence. panel sér celk. poč pozitivní hraniční negativní hodnocení pozitivní 134 127 3 4 citlivost: 96,9% negativní 90 3 2 85 specifita: 96,6% Hraniční výsledky nebyly brány při hodnocení v potaz. 9.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy. 10. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv- 1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 5
11. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA- VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrát. roztok TMB a konjugát anti-igg Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 12. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 13. DOPORUČENÁ LITERATURA: Provost PJ, Krah DL, Kuter BJ, Morton DH et al. Antibody assays suitable for assesing immune response to live varicella vaccine. Vaccine 1991; 9: 111 Wasmuth EH, Miller WJ. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for antibody to varicella zoster virus using purified VZV blycoprotein antigen. J med Virol 1990; 32: 189-93. Leung J, Harpaz R, Baughman AL, Heath K et al. Evaluation of laboratory methods for diagnosis of varicella. Clin Infect Dis 2010; 51: 23-32. Landry ML, Cohen SD, Mayo DR, Fong,CKY et al. Comparison of fluorescent antibody to membrane antigen test, indirect immunofluorescence assay and commercial enzyme linked immunoassay for determination of antipody to varicella zoster virus. J Clin Microbiol 1987; 25: 832-835. Gershon AA, Steinberg SP. Antibody response to varicella zoster and the role of antibody in host defense. Amer J Med Sci 1981;282: 12-17 6
14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění Aplikujte kontrolní sérum, standardy a testované vzorky (100 L / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte konjugát anti-igg Px r.t.u. (100 L / jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L / jamku), vyklepněte Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 L / jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte stop roztok (100 L / jamku) Změřte absorbanci při 450 / 620-690 nm do 10 minut Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Akademie věd ČR, rady programu Nanotechnologie pro společnost. Datum poslední verze tohoto návodu: 09/2015 7
8