Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního aditiva (viz Izolace RNA). 1. Napipetovat 500 μl lyzačního pufru (Lysis/Binding Buffer) do vychlazené homogenizační mikrozkumavky. 2. Vložit zmraženou tkáň, důkladně zašroubovata homogenizovat 2 50 s při 6500 rpm na přístroji MagNA Lyser (Roche) (Obrázek 3.4). Mezi jednotlivým homogenizačními procesy je nutné mikrozkumavky ochladit na ledě z důvodu velkého zahřátí roztoku, které může vést ke zvýšení aktivity RNáz nebo fyzikální denaturaci RNA. 3. Stočit při maximálních otáčkách 5 minut (v malé centrifuze). 4. Odsát supernatant do čisté zkumavky. Obrázek 3.4 Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche Izolace RNA: 1. Přidat homogenizační aditivum v takovém objemu, který odpovídá 1/10 množství lyzačního pufru a krátce provortexovat (např. pokud bylo přidáno 600 µl lyzačního pufru, objem homogenizačního aditiva bude 60 μl). 2. Nechat stát 10 min. na ledu.
3. Přidat směs kyselého fenol:chloroformu o stejném objemu jako lyzačního pufru v bodě 1 a důkladně vortexovat. 4. Centrifugovat: 13400 rpm / 5 min. / laboratorní teplota. Pozn. Poloměr rotoru centrifugy je 6 cm. 5. Přenést opatrně vrchní vodnou fázi do nové mikrozkumavky, přenesený objem zapsat. 6. Přidat absolutní etanol o množství, které odpovídá 1,25 násobku objemu vodné fáze přenesené v bodě 5. 7. Umístit filtr do nové mikrozkumavky. 8. Přenést směs lyzát/etanol na filtr (max. objem filtru je 700 µl). 9. Centrifugovat: 13400 rpm/ 10 sec. 10. Odstranit filtrát. V případě, že je celkový objem směsi větší než 700 µl opakovat postup (body 8, 9), dokud není přefiltrován veškerý obsah mikrozkumavky. 11. Odstranit filtrát a přidat 700 μl promývacího roztoku 1. 12. Centrifugovat: 13400 rpm/ 10 sec. 13. Odstranit filtrát a přidat 500 μl promývacího roztoku 2/3 na filtr (krok zopakovat 2x). 14. Centrifugovat: 13400 rpm/ 10 sec. 15. Odstranit filtrát a znovu centrifugovat při 13400 rpm/ 1min. 16. Přemístit filtr do nové mikrozkumavky. 17. Napipetovat 50 μl elučního roztoku předehřátého na 95 C do středu filtru. Pozn. Vyšší teplota elučního roztoku zajišťuje lepší efektivitu eluce. 18. Centrifugovat: 13400 rpm/ 30 sec. 19. Odstranit kolonku a mikrozkumavky s RNA umístit na led. 20. Změřit koncentraci a ověřit čistotu RNA na spektrofotometrech NanoDrop 2000 a Qubit Fluorometer. 21. Zkumavky s eluátem, který obsahuje vyizolovanou RNA, uschovat při - 80 C.
Stanovení koncentrace a čistoty RNA Pracovní postup Měření na spektrofotometru NanoDrop ND- 1000: 1. Spustit program ND- 1000 V3.7.1 a v úvodním okně zadat Nucleic Acid. 2. Zvednout raménko přístroje a provést inicializaci přístroje přidáním 1,5 µl DEPC- Treated water, popřípadě elučního roztoku použitého při izolaci. Kapku nanést na měřící část spodní části přístroje. Raménko opatrně přiklopit (Obrázek 3.5) a v dialogovém okně zmáčknout OK. Obrázek 3.5 A a B Nanášení kapky s rozpuštěnou nukleovou kyselinou na měřící část přístroje NanoDrop ND-1000; C Přístroj NanoDrop ND-1000 se sklopeným raménkem připravený k měření. 3. Po inicializaci zvednout raménko přístroje a čistou buničinou osušit všechnu kapalinu. 4. V dialogovém okně vpravo nahoře nastavit jako Sample Type RNA- 40. 5. Na měřící část nanést 1,5 µl elučního roztoku, přiklopit raménko a zmáčknout BLANK. 6. Opět osušit veškerou kapalinu a nanést 1,5 µl vzorku, přiklopit raménko a zmáčknou MEASURE. 7. Odečíst koncentraci vzorku (uváděna v ng.µl - 1 ) a poměry A260/A280 a A260/A230 značící čistotu vzorku. Součástí výstupu je i graf udávající absorpční spektrum měřené RNA (Obrázek 3.6). Obrázek 3.6 Výstup měření koncentrace RNA na spektrofotometru NanoDrop ND-1000.
Měření na spektrofotometru Qubit Fluorometer: Pozn. Na základě předpokládaného množství měřené RNA je nutné vybrat ze dvou pracovních kitů dodávaných speciálně k tomuto spektrofotometru: RNA HS (5-100 ng), který nabízí přesné a vysoce selektivní stanovení RNA a RNA BR (20-1000 ng) vhodný pro rychlou kvantifikaci RNA. 1. Na základě počtu měřených vzorků vypočítat potřebné množství pracovního roztoku (viz. pracovní schéma Obrázek 3.7). Pozn. K počtu vzorků je nutné navíc přičíst 2 RNA standardy, na každý vzorek je potom potřeba 190 µl pracovního roztoku. Počítejte však s malou pipetovací ztrátou a pro každý vzorek použijte objem pracovního roztoku 200 µl. Obrázek 3.7 Pracovní schéma měření koncentrace RNA na spektrofotometru Qubit.
2. Připravit pracovní roztok naředit Quant- it reagencii a Quant- it pufr v poměru 1:200 tak, aby výsledný objem odpovídal objemu vypočtenému v bodě 1. 3. Do 0,5 ml PCR mikrozkumavky připravit standardní roztoky RNA (standard 1 a standard 2) smícháním 10 µl standardu a 190 µl pracovního roztoku. 4. Do 0,5 ml PCR mikrozkumavky připravit vzorky smícháním 2 µl vyizolované RNA a 198 µl pracovního roztoku. 5. Všechny vzorky i standardy na 2-3 s vortexovat, krátce centrifugovat a inkubovat 2 minuty při laboratorní teplotě. 6. Zapnout spektrofotometr Qubit a zvolit požadovanou assay. 7. Nakalibrovat přístroj vložením prvního standardu do držáku a stisknout GO. Stejný postup opakovat s druhým standardem. 8. Po kalibraci vložit do držáku mikrozkumavky s prvním vzorkem a stisknutím GO změřit absorbanci RNA. Koncentraci vzorku získat stisknutím Calculate sample concentration a po přepočtu na objem 2 µl odečíst hodnotu koncentrace v ng/µl. 9. Po měření odstranit všechny mikrozkumavky, vypnout přístroj a vzorky uložit do mrazáku na - 80 C.
3.3 Stanovení integrity RNA Pracovní postup Příprava Gelu: 1. Nechat všechny reagencie 30 min. při RT. 2. Vortexovat RNA 6000 Nanodye (barva) 10s a centrifugovat. 3. Přidat 1µl RNA 6000 Nanodye k 65 µl gelu. 4. Zvortexovat a inkubovat ve tmě při 4 C. 5. Centrifugovat při RT, 13 000 g. Nanášení gelu a vzorků na čip: 1. Ekvilibrovat gel na RT. 2. Vložit čip (Obrázek 3.10) do prime station. 3. Nanést 9µl gelu s barvou do jamky (1) (podle Obrázku 3.10). 4. Zavřít prime station a stlačit stříkačku až dokud není slyšet cvaknutí. 5. Čekat 30 sekund a uvolnit stříkačku pomocí mechanizmu. 6. Zkontrolovat, zda se stříkačka vrátila do polohy 0,3ml. 7. Čekat 5 sekund a pak ji pomalu vytáhnout do původní polohy (1ml). 8. Nanést 9µl gelu s barvou do jamek (2,3). 9. Nanést 5µl RNA 6000 Nanomarker do každé jamky (4-16). 10. Nanést 1µl RNA ladder (žebříček) (4). 11. Nanést 1µl vzorku do jamek (5-16). 12. Zvortexovat připravený čip 60s/ 2400 rpm. 13. Vložit do přístroje Agilent 2100 Bioanalyzer (do 5 min). 14. Spustit analýzu. Obrázek 3.10 Schématické znázornění čipu pro orientaci nanášení gelu, markeru, žebříčku a vzorků