Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně VLIV ASIMILOVATELNÉHO DUSÍKU NA PRŮBĚH FERMENTACE MOŠTŮ RÉVY VINNÉ Disertační práce Vedoucí disertační práce Vypracoval Doc. RNDr. Ing. Marie Kyseláková, CSc. Ing. Mojmír Baroň Lednice 2010

Mendel university in Brno EFFECT OF ASSIMILABLE NITROGEN ON GRAPE MUST FERMENTATION PhD - Dissertation Supervisor PhD - Student Doc. RNDr. Ing. Marie Kyseláková, CSc. Ing. Mojmír Baroň Lednice 2010

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že disertační práce byla vypracována samostatně, že všechny použité literární zdroje jsou správně a úplně citovány. Tato práce je z hlediska obsahu majetkem Zahradnické fakulty MENDELU v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkana ZF MENDELU.... podpis doktoranda Rád bych na tomto místě poděkoval rodině, přátelům a především své ženě Kateřině za vstřícnost a podporu, kterou mi poskytli při zpracování této práce. Můj vděk patří také paní Doc. RNDr. Ing. Marii Kyselákové CSc. za pomoc a cenné rady.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné SOUHRN Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné Disertační práce byla zaměřena na problematiku asimilovatelného dusíku v moštech z Mikulovské a Znojemské vinařské podoblasti, jeho utilizaci během fermentace a postfermentační produkty. Dále se práce zaobírá různými faktory ovlivňující obsah asimilovatelného dusíku v hroznech. Součástí práce je také sledování rozdílů odběru dusíkatých látek u dvou různých komerčně dostupných druhů kvasinek a prověření metod detekce dusíkatých zdrojů. V teoretické části je podrobně popsána evoluce dusíkatých látek v révě vinné. Pozornost je dále věnována především problematice utilizace dusíkatých zdrojů kvasinkami a důsledkům ovlivňujících organoleptické vlastnosti vína. Závěr teoretické části tvoří kompilace dostupných analytických metod detekce dusíkatých látek. Pro pokus byl vytvořen plán odběru vzorků v letech 2007 a 2008 obsahující varianty z různých vinařských podoblastí, s různým způsobem zatravnění meziřadí, dvojicí podnoží a odrůd. Vzorky byly odebrány u moštů, kde byl měřen obsah amonných iontů a asimilovatelného dusíku, a mladých vín, kde byla sledována změna asimilovatelného dusíku a produkce kyseliny octové během fermentace. Výsledky byly hodnoceny nejdříve jako celek bez ohledu na jednotlivé ovlivňující faktory. Sloužily tak k monitorování obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z jižní Moravy a k obecným závěrům, kde se potvrdilo, že tyto mošty obsahují vysoké množství amonných iontů a asimilovatelného dusíku a nemají tudíž problémy s výživou kvasinek během fermentace. Taktéž průměrná produkce kyseliny octové ukazuje na bezproblémový průběh fermentace bez přídavku výživy u většiny moštů. Posléze byla data statisticky zpracována a hodnocena z hlediska jednotlivých ovlivňujících faktorů a jejich interakcí. Zde byly nalezeny velice zajímavé rozdíly ve způsobu zatravnění a v příjmu dusíkatých látek jednotlivých odrůd. Interakce druhého řádu pak rozkryly vztahy mezi ročníky a chováním podnoží a odrůd. Další pokusná část byla zaměřena na rozdílný odběr volných aminokyselin odlišnými druhy kvasinek ( aromatické a neutrální ) během fermentace. Potvrdil se

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné intenzivnější odběr aromatických kvasinek, avšak výsledky nebyly jednoznačné. Velkou neznámou v problematice dusíkatých látek v enologii zůstává aminokyselina prolin. Poslední část práce se věnuje analytickým metodám detekce dusíku využitelného kvasinkami. Pozornost byla zaměřena na spektrofotometrickou metodu využívající ninhydrin jako derivatizační činidlo a na metodu formaldehydové titrace. Výsledky potvrdily univerzálnost, jednoduchost a dostatečnou přesnost formaldehydové titrace, jejíž aplikace v praxi by přinesla značné výhody technologům a je v závěru této práce vřele doporučována.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné SUMMARY Effect of assimilable nitrogen on grape must fermentation This PhD-dissertation thesis deals with the content of assimilable nitrogen in grape musts, its consumption by yeasts during fermentation and production of postfermentation products (metabolites). Various factors influencing the content of assimilable nitrogen in grapes were investigated as well. The author also presents information about monitoring of differences existing in contents of nitrogen compounds in fermenting musts started with two different types of commercially available yeasts and about screening methods used for the detection of N-sources. In the theoretical part, the evolution of nitrogen compounds in grape vine is described in detail. Attention was paid above all to the problem of utilization of nitrogen sources by yeasts and to factors influencing sensory characteristics of wine. The theoretical part of this thesis also presents a survey of analytical methods enabling to detect nitrogen compounds. Experiments were performed according to a sampling plan elaborated for years 2007 and 2008. Experimental variants involved wine samples originating from different South Moravian wine-growing subregions, different types of inter-row grass stand, and different combinations of rootstocks with varietal scions. Samples were taken not only from fermenting musts but also from young wine and the following parameters were estimated: content of ammonium ions, content of assimilable nitrogen, changes in the level of assimilable nitrogen, and production of acetic acid in the course of fermentation. At first, the obtained results were evaluated as a whole, i.e. regardless to individual factors mentioned above. These data enabled to monitor contents of assimilable nitrogen in musts and to draw a general conclusion that these musts contain high concentrations of both ammonium ions and assimilable nitrogen so that there is no danger of having problems with the nutrition of yeasts in the course of fermentation. Also the average production of acetic acid was low; this indicated that in the majority of must samples without added nutrients, the course of fermentation was smooth and trouble-free. All results were statistically analysed and evaluated with regard to individual factors influencing the content of assimilable nitrogen in must and wine and also to their interactions. Very interesting differences existed between variants with different types

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné of grassland stands on the one hand and the uptake of nitrogen compounds by individual varieties. Interactions of the second order indicated that there were different relationships between vintage years on the one hand and the behaviour of rootstocks and varieties on the other. In another experiment, the differences in the uptake of free amino acids by different species of yeasts (i.e. "aromatic" and "neutral" ones) in the course of fermentation were studied. The obtained results confirmed that in case of "aromatic" yeasts the uptake of nutrients was higher; however, this difference was not significant. It can be said that proline still remains to be a great unknown variable as far as the problem of supply of nitrogen compounds in oenology is concerned. The final part of this thesis deals with analytical methods used for detection of nitrogen available for yeasts. Attention was paid to a spectrophotometric method using ninhydrin as a derivatizing agent and to the method of formaldehyde titration. The obtained results confirm that the method of formaldehyde titration is universal, simple and sufficiently accurate so that it can be recommended for oenological practice as a useful and efficient analytical tool.

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné OBSAH 1. ÚVOD...9 2. TEORETICKÁ ČÁST...10 2.1 Dusíkaté sloučeniny...10 2.1.1 Dusík a réva vinná...10 2.1.2 Evoluce dusíkatých látek v hroznech...12 2.2 Asimilovatelný dusík v moštu a víně...23 2.2.1 Amonné ionty v moštu...23 2.2.2 Aminokyseliny v moštu...24 2.3 Utilizace asimilovatelného dusíku kvasinkami...25 2.3.1 Asimilační mechanismy dusíku...26 2.3.2 Syntéza aminokyselin...28 2.3.3 Katabolismus aminokyselin...32 2.3.4 Důsledky utilizace dusíku...34 2.4 Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace...46 2.4.1 Vliv asimilovatelného dusíku na stavbu buněčné stěny kvasinek...46 2.4.2 Vliv asimilovatelného dusíku na rychlost fermentace...47 2.5 Požadavky na výživu...48 2.5.1 Příjem dusíku...48 2.5.2 Vliv provzdušnění a přídavku dusíku na průběh a úplnost fermentace...52 2.6 Metody stanovení...54 2.6.1 Metody stanovení veškerého asimilovatelného dusíku...54 2.6.2 Metody stanovení volných aminokyselin...55 2.6.3 Metody stanovení amonných iontů...59 3. CÍL PRÁCE...61 4. DESIGN POKUSU...62 5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST...64 5.1 Materiál...64 5.1.1 Výběr podnože...64 5.1.2 Výběr odrůdy...65 5.1.3 Výběr vinařské podoblasti...67 5.1.4 Výběr agrotechnických podmínek...68 5.1.5 Materiál, metodika zpracování a odběr vzorků...68 5.2 Metody měření...70 5.2.1 Stanovení cukernatosti refraktometrem...70 5.2.2 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) formaldehydovou titrací...71 5.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) spektrofotometricky po derivatizaci ninhydrinem...72 5.2.4 Stanovení amonných iontů a kationtů elektromigrační metodou...73 5.2.5 Stanovení kyseliny octové elektromigrační metodou...74 5.2.6 Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s předkolonovou derivatizací...75

Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné 5.2.7 Meteorologická data...77 6. VÝSLEDKY...82 6.1 Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy...82 6.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech...85 6.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008...87 6.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech z vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko...89 6.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech...92 6.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech...94 6.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech...97 6.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory...100 6.2 Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci...104 6.3 Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové...106 6.4 Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek...107 6.5 Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace...109 6.5.1 Metoda FAN...109 6.5.2 Formaldehydová titrace...110 7. DISKUSE...112 7.1 Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy...112 7.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech...112 7.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008...113 7.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech z vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko...114 7.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech.114 7.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech...114 7.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech...115 7.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory...116 7.2 Změna asimilovatelného dusíku před a po fermentaci...118 7.3 Vliv množství asimilovatelného dusíku v moštech na produkci kyseliny octové...118 7.4 Dynamická změna jednotlivých aminokyselin během fermentace za přítomnosti odlišných druhů kvasinek...119 7.5 Porovnání metody FAN a formaldehydové titrace...119 8. ZÁVĚR...121 9. DOPORUČENÍ PRO PRAXI A DALŠÍ VÝZKUM...123 10. SEZNAM GRAFŮ...125 11. SEZNAM TABULEK...127 12. POUŽITÁ LITERATURA...128 13. PŘÍLOHY 136

Úvod 1. ÚVOD Je známo, že dusík silně ovlivňuje růst letorostů a barvu listů révy vinné. Nadbytek dusíku však vede také k nadměrnému růstu, vyšší náchylnosti k houbovým chorobám, vadnutí třapiny a k celkovému snížení kvality hroznů. Naopak nedostatek dusíku omezuje intenzitu růstu a snižuje výnos. Optimalizace dusíkatého hnojení vyžaduje přesné znalosti časového průběhu příjmu dusíku rostlinou. 1 V posledních letech se stále častěji objevují práce a diskuse na téma asimilovatelného dusíku a jeho vlivu na fermentaci hroznových moštů. Ve světě je tato problematika v hojné míře řešena. U nás až na minimum výjimek se vědecké práce tímto problémem nezabývají. Dusíkaté látky uložené v bobulích jsou velmi důležité pro rozmnožování a vlastní činnost kvasinek. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, které při kvašení vždy převládají, mohou využít dusík ve formě aminokyselin či amonných iontů a odtud je odvozen všeobecně používaný termín dusík asimilovatelný kvasinkami. Nedostatek asimilovatelného dusíku v moštu je znám jako hlavní důvod zpomalené a neúplné fermentace 2,3 a produkce sirných sloučenin 4,5. Celkový obsah dusíku v moštu může dále postihnout také aroma vína 6 a ovlivnit produkci kyseliny octové či vysoce karcinogenního ethylkarbamátu. 7 V praxi se setkáváme s nedostatkem asimilovatelného dusíku v prvé řadě u špatně vyzrálých hroznů, dále u stresovaných hroznů pocházejících z vinic nedostatečně hnojených dusíkem či bylo-li během vegetace sucho či vysoké teploty. V těchto případech je nutné nedostatek asimilovatelného dusíku kompenzovat přídavkem živných solí do moštu, určených pro kvasinky, případně vitamínu B1 (tiaminu). 8 Přirozeně hrozny s vyšší cukernatostí potřebují k řádnému prokvašení asimilovatelného dusíku více. Je známo, že obsah asimilovatelného dusíku moštu je závislý na hnojení, klimatických podmínkách, na délce vyluhování slupek v moštu, ale také na odrůdě, ročníku, původu a v neposlední řadě na technologii výroby vína. 9,10,11 Mimo všechny tyto faktory z velké části závisí využití asimilovatelného dusíku na metabolismu kvasinek a podmínkách fermentace. Nejvíce zastoupené aminokyseliny u moštů jsou arginin, prolin, kyselina glutamová, glutamin a kyselina γ-aminomáselná. 9

Teoretická část 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Dusíkaté sloučeniny 2.1.1 Dusík a réva vinná Dusík se v révě vinné zúčastňuje jako stavební látka tvorby mnoha sloučenin. Vzhledem k tomu, že urychluje růst révy vinné, bývá jeho používání přirovnáváno k ovládání plynového pedálu při jízdě autem. Působí příznivě i na plodnost révy, pokud je ve vyrovnaném poměru s ostatními živinami. Je složkou chlorofylu a spoluzajišťuje tak přeměnu sluneční energie na energii chemickou, je stavebním kamenem všech aminokyselin, ze kterých se tvoří bílkoviny. V hnojivech se vyskytuje ve formě amoniakální (čpavkové) NH + 4, kterou rostliny více přijímají na alkalické půdě. Pro tvorbu bílkovin se musí v pletivech tato forma vázat na glycidy, protože již malé přebytky amoniakální formy jsou pro buňky toxické. Dále se dusík vyskytuje v ledkové - formě (dusitanové, dusičnanové) NO 2 či NO - 3. V této formě se může ukládat i v buňkách a neškodí jim. Pro tvorbu bílkovin se musí redukovat na formu NH + 4. Dále může být v hnojivech ve formě anodické (močovina) NH - 2, kterou nemůže rostlina přímo přijímat. 2.1.1.1 Nedostatek dusíku Nedostatek dusíku se na révě projeví světle zelenožlutým zbarvením listových čepelí, červenavým zbarvením os letorostů, které zůstávají slabé a jejich vrcholky jsou vzpřímené. Též listové řapíky mají načervenalé zbarvení, listové čepele jsou malé, stejně jako hrozny. Růst je pomalý, asimilace nízká, a proto je i cukernatost nízká. Jakost vína trpí nízkou extraktivností. 2.1.1.2 Nadbytek dusíku Naopak nadbytek dusíku se projeví hlavně zjemněním pletiv na celé rostlině. Proto se zvyšuje vnímavost k napadení houbovými chorobami a snižuje se vzdornost proti 10

Teoretická část suchu a mrazu. Vyzrálost dřeva se zhoršuje, zvyšuje se sprchavost a projevuje se vadnutí i hnití třapiny a hnití bobulí. 2.1.1.3 Interakce s jinými živinami Interakce s jinými živinami se projevuje v tom, že dusík podporuje příjem fosforu, pokud se dává v mírných dávkách. Vysoké dávky dusíku brzdí příjem fosforu, což lze využít při přehnojení fosforem. Vysoká hladina draslíku v révě podporuje příjem dusíku. Je-li obsah draslíku v půdě nízký, pak jeho příjem brzdí vyšší dávky dusíkatých hnojiv a současně se málo využívají amoniakální hnojiva. Dáváme-li vyšší dávku síranu draselného, pak je lepší použít dusík v amonné formě. Jinak k draselné soli lze využít dusičnany. NH + 4 forma je antagonistou k hořčíku, který se těžko přijímá na písčitých půdách, proto na těchto půdách musíme hnojit především ledkovým dusíkem, abychom nezvyšovali nedostatek hořčíku. Při větším nadbytku dusíku může vzniknout nedostatek bóru. Síran amonný používáme hlavně na vápenitých půdách, protože se při jeho použití spotřebovává vápník. Ledek vápenatý používáme hlavně na kyselých a suchých půdách, protože forma NH + 4 zvyšuje příjem vody a to hlavně tehdy, kdy se současně přijímá chlór. Ledek se však vymývá z půdy rychleji než síran amonný. 2.1.1.4 Příjem dusíku Příjem dusíku je závislý nejen na velikosti úrody, ale též na velikosti keřů. Dále jsou velké rozdíly mezi podnožemi a mezi naštěpovanými odrůdami, stejně jako mezi různými stanovišti. Dusík se přijímá a nejvíce potřebuje před rašením a při počátečním růstu letorostů, dále po odkvětu při nasazování a růstu bobulí a v menší míře při zaměkávání bobulí. 2.1.1.5 Dávkování dusíku Dávkování dusíku se řídí obdobím potřeby a vododržnosti půdy, jakož i odrůdou. V hlinitých půdách můžeme používat močovinu, dále síran amonný, který se rozmetává v předjaří. Obě hnojiva se mohou ve vododržných půdách použít v celé dávce najednou. Používáme-li ledek amonný s vápencem, pak dáváme v těžké půdě 2/3 dávky zjara a 1/3 po odkvětu. V lehké štěrkovité půdě dáme 1/2 dávky zjara a 1/2 dávky po odkvětu. Velmi opatrně hnojíme dusíkem odrůdy Neuburské, Sauvignon, Tramín a Veltlínské červené rané, které rostou bujně a využívají dusík lépe než ostatní odrůdy, 11

Teoretická část což platí především o Neuburském. Při nízké potřebě dusíku (bujné odrůdy, vododržná půda) dávkujeme zjara 30 kg dusíku na hektar (tj. 10 kg ledku amonného s vápencem na 1000 m 2 vinice). Druhá dávka dusíku se dává v době před odkvetením révy, tak aby se účinek dusíku projevil po nasazení bobulí. Většinou se doporučuje paušální dávka 20 kg na 1 ha (tj. 10 kg ledku vápenatého na 1000 m 2 vinice), která se dává ve formě rychle působícího ledku vápenatého. Protože se obsah dusíku v půdě rychle mění, nemůžeme se opírat o půdní rozbor a dávky musíme volit do značné míry podle pozorování růstu a úrodnosti. Kdybychom se chtěli blíže informovat o správnosti postupu, museli bychom kontrolovat příjem dusíku pomocí listové diagnostiky. 2.1.1.6 Vliv na jakost vína Na jakost vína působí dusík příznivě tím, že se zvyšuje extraktivnost a plnost vín, stoupá výtěžnost moštu, ale zvyšuje se i obsah bílkovin a množství zákalů. 12 2.1.2 Evoluce dusíkatých látek v hroznech Zásoby révy dusíkatými látky obstarává jak phloem (lýko), tak xylem (dřevo) rostliny. Transport dusíku v révě se neodmyslitelně odehrává ve formě amonných iontů nebo aminokyselin. Nitráty se vyskytují spíše zřídka z důvodu jejich rychlé redukce v kořenovém a listovém systému. Glutamin reprezentuje okolo 50 % organického dusíku. Z pohledu dusíkatých látek existují dvě důležité syntézy v tvorbě hroznů. První v období tvorby bobulí a druhá v období zaměkávání bobulí a konce zrání. Těsně před koncem zrání může koncentrace dusíku opět stoupnout. Při sběru je polovina dusíku v rostlině obsažena v bobulích. Pokud jsou hrozny nezralé reprezentuje více než polovinu dusíkatých látek amonný ion. Od zaměkávání bobulí potom koncentrace amonných iontů klesá, přičemž roste koncentrace organických dusíkatých látek. Množství volných aminokyselin během zrání roste 2 až 5 násobně, dosahujících 2 8 g.l -1 jako ekvivalentu leucinu. Ve zralém moštu reprezentují aminokyseliny 50 90 % celkového dusíku. Syntéza amonných kationů s α ketoglutarovou kyselinu tvoří asimilační cestu dusíkatých látek v hroznech. Tato syntéza je katalyzována enzymy glutamin syntetázou a glutamát dehydrogenázou. Ostatní aminokyseliny jsou syntetizovány přesunem dusíku z kyseliny glutamové na příslušné uhlíkaté skelety. 12

Teoretická část Při zpracování zralých hroznů tvoří arginin 6 40 % celkového dusíku moštu a je tudíž dominantní aminokyselinou. Ve skutečnosti hraje velice důležitou roli v metabolismu dusíkatých látek uvnitř bobulí (viz Graf 1). Existuje blízké spojení mezi argininem a jinými aminokyselinami (ornithinem, aspartovou a glutamovou kyselinou či prolinem). Ve výsledku může během zrání transformací argininu hladina prolinu stoupnout 25 30-krát. Navíc aspartová kyselina ovlivňuje rezervu kyseliny oxaloctové, která se podle potřeby mění během zrání na kyselinu jablečnou nebo cukry. Zrání je také doprovázeno aktivní syntézou proteinů. Koncentrace rozpustných proteinů dosahuje maxima před úplnou zralostí a potom pozvolna klesá. Množství proteinů se tak může v moštu pohybovat v rozmezí 1,5 100 mg.l -1. Koncentrace vysokomolekulárních nerozpustných proteinů, součástí buněčných stěn, je vysoká od počátku vývoje bobulí a růst pokračuje i během zrání. Mošt ze zralých hroznů obsahuje sotva 20 % celkového dusíku bobulí. Zbytek zůstává ve slupkách a zrncích, ačkoli se ke konci zrání mění v rozpustnou formu dusíku (amonné ionty a aminokyseliny). Graf 1: Úloha argininu v metabolismu dusíku bobulí. 2.1.2.1 Celkový dusík Obsah celkového dusíku (vyjádřeno v g.l -1 dusíku) v hroznovém moštu slouží jako ukazatel zralosti v závislosti na ročníku. Může se rok od roku lišit i čtyřnásobně 13

Teoretická část v závislosti na odrůdě révy a oblasti pěstování. Například v oblasti Champagne je obsah dusíku v moštech z bílých odrůd dvou až třínásobný než v oblasti Bordeaux. Tento fakt má potom jistě za důsledek rozdílný přístup k fermentaci. 13 Dusíkaté látky, které nejsou spotřebovány během fermentace, pak logicky zůstávají ve víně, kde jsou potom součástí bezcukerného extraktu. Obecně mají červená vína v průměru téměř dvojnásobné množství dusíku oproti vínům bílým. Je to způsobeno technikou zpracování, zahrnující vyšší teplotu macerace, která evokuje snadné uvolňování dusíkatých látek ze slupek a semen. Váha dusíkatých sloučenin ve víně, počítána aproximativně s použitím empirického koeficientu 6,25, je v rozmezí 0,5 až 4,0 g.l -1. To znamená, že u suchých vín můžou tyto látky reprezentovat až 20 % bezcukerného extraktu. 2.1.2.2 Minerální dusík Minerální dusík, ve formě amonných solí, je během růstové fáze nejběžnější formou v dužině bobulí. Amoniakální dusík reprezentuje 80 % celkového dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovaných kořeny rostliny. Má dominantní vliv na změnu barevnosti bobulí a jeho koncentrace začíná rapidně klesat s počátkem transaminačních reakcí. V Krebsově cyklu a prodýcháváním cukrů vzniká velké množství α-ketokyselin, jejichž aminace vede k formování mnoha dusíkatých organických látek (viz 2.1.2 Evoluce dusíkatých látek). Jakmile jsou hrozny plně zralé, minerální dusík reprezentuje méně než 10 % celkového dusíku. Amonné ionty jsou nejsnadněji využitelným zdrojem kvasinek. Jejich koncentrace rapidně ovlivňuje dynamiku, se kterou mošt začíná fermentovat stejně jako potenciál samotné fermentace. Tato forma dusíku ke konci alkoholové fermentace obvykle úplně zmizí. V případě, že koncentrace amonných iontů v moštu je nižší než 50 mg.l -1 se pro zajištění hladkého průběhu rozkvasu doporučuje přidat fosfát či sulfát diamonný v množství 10 g.hl -1. Systematické přidávání amonných solí bez analýz o nutnosti přídavku se silně nedoporučuje. Může totiž snadno dojít k tvorbě vína s nízkou koncentrací vonných látek, především vyšších alkoholů, jejich esterů a etylacetátů mastných kyselin. 14

Teoretická část Během školení a zrání na kvasnicích či po malolaktické fermentaci se může ve víně objevit několik desítek mg.l -1 anorganického dusíku. Bakterie účastnící se přeměny kyseliny jablečné na mléčnou neasimilují amonné ionty a ve skutečnosti je mohou i vylučovat. Přesto se doporučuje přidávat fosfát diamonný v kombinaci s thiaminpyrofosfátem do vín, u nichž zamýšlíme druhou fermentaci v uzavřeném tanku či láhvi. 2.1.2.3 Různé formy organického dusíku Existuje mnoho organických látek obsahujících dusík. V následující sekci jsou popsány nejdůležitější z nich. 1. Aminokyseliny s obecným vzorcem: Aminokyseliny mají molekulární hmotnost pod 200 g.mol -1 a ve víně a moštu jich bylo identifikováno 32 (viz Tabulka 1). Aminokyseliny zaručují v moštu a víně pufrovou kapacitu. 14 Tyto sloučeniny jsou velice užitečné kvůli jejich antioxidačním, antimikrobiálním, emulgujícím a povrchově aktivním vlastnostem. 15

Teoretická část Tabulka 1: Aminokyseliny v hroznech a víně 16

17 Teoretická část

Teoretická část Aminokyseliny jsou deriváty karboxylových kyselin, které obsahují ve svých molekulách jednu nebo několik aminoskupin. Z pohledu struktury jsou v moštu a víně, z přítomných 20 běžných aminokyselin s výjimkou γ aminobutyrové kyseliny a β alaninu, všechny α aminokyseliny (karboxylová skupina a aminoskupina jsou vázány na stejný uhlík v řetězci). Aminokyseliny jsou tedy amfoterní sloučeniny. Podle schématu: může být R vodík, jak je tomu v případě jedné aminokyseliny glycinu (glycocollu), prototypu aminokyseliny, jenž je součástí mnoha proteinů. Substituent R vázaný na C α se označuje jako postranní řetězec a rozhoduje o individuálním charakteru aminokyseliny. Může to být také alifatický, aromatický nebo heterocyklický substituent, který může obsahovat další amino- a karboxylové skupiny. Aminokyseliny se rozdělují podle několika hledisek. Prvním kritériem je rozdělení na aminokyseliny kódované a nekódované (nestandardní). Kódované aminokyseliny jsou buď vázané, zabudované do molekul proteinů podle genetického kódu uchovávaného v DNA, nebo volné, které tvoří aminokyselinovou hotovost, tzv. pool. Nekódované aminokyseliny jsou často jednoduché deriváty základních 20-ti aminokyselin, jiné mají neobvyklou strukturu. Bývají důležitými složkami biologicky aktivních polypeptidů, jsou např. nervovými mediátory (glycin, kyselina γ- aminomáselná) nebo meziprodukty různých metabolických pochodů (např. meziprodukty biosyntézy močoviny jako citrulin a ornithin). Biologický význam většiny nestandardních aminokyselin není přesně znám, ale jejich toxicita svědčí o jejich roli v ochraně organismu. 15 Nejpoužívanější dělení aminokyselin je podle polarity jejich postranních řetězců; tak se rozlišují tři hlavní typy aminokyselin: 1) s nepolárním postranním řetězcem jsou ve vodě méně rozpustné než ostatní a uplatňují se v hydrofobních interakcích bílkovin. Patří sem glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin, prolin, fenylalanin a tryptofan 18

Teoretická část 2) s polárním nenabitým postranním řetězcem mohou vytvářet vodíkové můstky. Řadí se sem serin, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin a cystein 3) s polárním nabitým postranním řetězcem podílejí se na elektrostatických interakcích proteinů a) zásadité aminokyseliny, při fyziologickém ph kladně nabité tj. lysin, arginin a histidin b) kyselé aminokyseliny, při fyziologickém ph záporně nabité tj. kyseliny asparagová a glutamová. Z biologického hlediska je důležité dělení aminokyselin na esenciální a neesenciální podle schopnosti organismu danou aminokyselinu syntetizovat. Esenciální aminokyseliny musí živočichové bezpodmínečně získat s potravou. Při jejich nedostatečném příjmu dochází k vážným poruchám metabolismu a déletrvající nedostatek může končit smrtí. Živočišné organismy podle druhu potřebují 8 až 10 esenciálních aminokyselin. Pro člověka jsou to valin, leucin, isoleucin, lysin, threonin, methionin, fenylalanin a tryptofan. Histidin a arginin jsou postradatelné jen v dospělosti, v době vývoje v dětském věku jsou esenciální. Další dvě aminokyselin jsou podmíněně postradatelné pouze při dostatku esenciálních aminokyselin, z nichž se tvoří, a to tyrosin vznikající z fenylalaninu a cystein syntetizovaný z methioninu. 16 Jsou-li v proteinu obsaženy všechny esenciální aminokyseliny, jde o tzv. plnohodnotný protein. Neesenciální aminokyseliny potřebuje organismus ke svému růstu, ale dovede je syntetizovat z esenciálních aminokyselin. U člověka mezi ně patří glycin, alanin, serin, citrulin, tyrosin, cystein, prolin, kyseliny asparagová a glutamová. Aromatické cykly tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu působí jako chromofory a absorbují ultrafialové záření v oblasti 260 300 nm. Toho se využívá při jejich analytickém důkazu a při stanovení jejich koncentrace v peptidech a proteinech. Chemické vlastnosti aminokyselin jsou závislé na funkčních skupinách obsažených v jejich molekule. Uplatňují se především aminoskupiny a karboxylové skupiny. V kyselém prostředí je disociace karboxylu potlačena a aminokyselina se chová jako zásada aminoskupina poutá protony na volný elektronový pár a vzniká kation. V zásaditém prostředí je naopak podpořena disociace karboxylů aminokyselina vytváří anion. Ve vodných roztocích se aminokyseliny chovají jako amfoterní 19

Teoretická část elektrolyty. Na základě ionizace kyselé nebo bazické skupiny, aminokyseliny vyjadřují ve dvou rovnováhách. Jsou úplně disociovány (kromě aromatických aminokyselin). Disociace jednotlivých skupin závisí na ph. Při určitém ph se kladný náboj aminoskupiny vyrovná náboji karboxylu a celkový náboj molekuly je nulový. Je to tzv. izoelektrický bod pi a aminokyselina se nachází v tzv. izoelektrické formě, což je vlastně bipolární ion (amfion), navíc má aminokyselina minimální rozpustnost a nemigruje v elektrickém poli, třeba u elektroforézy. Různé náboje v molekule aminokyselin při daném ph se dá využít v separaci a stanovení pomocí iontoměničů. V jiných aminokyselinách je uhlík spojený se skupinou, která je chirální. Toto spojení dává asymetrickou vlastnost běžnou pro většinu biologicky důležitých látek: optickou aktivitu. Všechny přírodní aminokyseliny jsou opticky aktivní a podle stáčení polarizovaného světla se označují L - a D - aminokyseliny. Optická aktivita závisí na typu postranního řetězce, ale také na rozpouštědlu či ph roztoku. Existují aminokyseliny nesoucí tři funkční skupiny. Záleží jestli je v postranním řetězci obsažena kyselá nebo bazická skupina. Kyselina aspartová a glutamová jsou kyselé aminokyseliny, zatímco lysin, histidin, ornithin, citrulin a arginin jsou aminokyseliny bazické. Jiné aminokyseliny s více funkčními skupinami nejeví bazický nebo kyselý charakter. Obsahují hydroxyskupinu (serin, threonin a tyrosin), thiolovou nebo sulfidickou skupinu (cystein a methionin). Pouze aminokyseliny se třemi funkčními skupinami jsou zapojeny do katalytických vlastností enzymů. Je to překvapující skutečnost, že jenom několik málo aminokyselin je odpovědných za aktivitu enzymů, při jejich tak obrovském množství. 2. Oligopeptidy a polypeptidy vznikají spojením určitým počtem aminokyselin pomocí peptidické vazby. 20

Teoretická část Oligopeptidy obsahují maximálně čtyři aminokyseliny. Polypeptidy mají vysokou molární hmotnost (pod 10 000 g.mol -1 ) a mohou být separovány pouhou filtrací (ultrafiltrací, mikrofiltrací či nanofiltrací) a reprezentují majoritního dusíkatého zástupce ve víně. Některé malé peptidy mají také příjemné senzorické vlastnosti, které jsou ku prospěchu výroby vín. Dusík ve formě oligopeptidů není v moštu či víně lehce stanovitelný. Oligopeptidy v sobě obsahují dusík maximálně ze čtyř aminokyselin. Klasickým a nejdůležitějším zástupcem je tripeptid glutathion. Je známo, že mléčné bakterie obsahují aminopeptidázy, díky kterým jsou schopny asimilovat některé oligopeptidy, speciálně tripeptidy. 17 Tyto sloučeniny mají organoleptické vlastnosti ovlivňující chuť vína, ale další studie se tímto problémem nezabývaly. 3. Proteiny jsou makromolekuly vzniklé spojením velkým množstvím aminokyselin. Jejich molární hmotnost je nad 10 000 g.mol -1 a jejich struktura obsahuje krom peptidické vazby i postranní vazby, které vytváří třírozměrné struktury: sférickou, helix, apod. Hrozny a následně víno obsahují mnoho proteinů s širokým rozsahem molární hmotnosti (30 000 150 000 g.mol -1 ). Některé nestabilní proteiny jsou zodpovědné za zákaly v bílých vínech. Jiné proteiny se spojují s frakcemi sacharidů, např. mannoproteiny či isolektiny, identifikovány v moštu odrůdy Chardonnay. 18 4. Amidy s obecným vzorcem: 21

Teoretická část Tato kategorie je reprezentována malým množstvím asparaginu a glutaminu. Močovina je také počítána do této skupiny: stejně jako ethylkarbamát: který je velice přísně kontrolován z důvodu jeho vysoké zdravotní závadnosti. Močovina je diamid kyseliny uhličité. Může být také považována za amid kyseliny karbamové. Další reakcí močoviny s amoniakem vzniká organický imid zvaný guanidin. Izomerace kyanátu amonného na močovinu představuje v živém organismu most mezi anorganickou a organickou chemií. Močovina je bezbarvá tuhá látka s teplotou tání 132 C a vysokou rozpustností ve vodě (1000 g.l -1 ) a etanolu (100 g.l -1 ). Má chemické vlastnosti amidů. Může být hydrolyzována na kyselinu uhličitou a amoniak. Toho je ve velké míře využíváno v zemědělství a v mnoha chladících systémech. Má také velmi široký rozsah průmyslových využití. Močovina se stanovuje pomocí enzymu ureázy a následné detekce uhličitanu amonného. Víno obsahuje méně než 1 mg.l -1 a je jistě mikrobiálního původu. Močovina je z hlediska vinařství důležitá především jako prekurzor etylkarbamátu. Enzym ureáza se extrahuje z bakterie Lactobacillus fermentum. Předmět měření je redukce nadměrného množství močoviny ve víně, aby se předešlo vzniku etylkarbamátu. 22

Teoretická část Močovina je finální produkt metabolismu savců a představuje způsob odbourání dusíku z denaturovaných proteinů. 5. Nukleový dusík je přítomny v purinových a pyrimidinových bázích, nukleosidech a nukleotidech a nukleových kyselinách. Tato forma dusíku v moštu či víně zatím nebyla studována. 6. V hexozách byl nalezen dusík ve formě aminoskupin vzniklých v cukrech záměnou OH skupiny za NH 2 - glukosamin a galaktosamin. 7. Pyraziny jsou šestičlenné heterocykly obsahující dva dusíky a čtyři uhlíky. Postranní uhlovodíkové řetězce často mění jejich velmi výrazné aromatické vlastnosti, které jsou zodpovědné například za aroma charakteristické pro Cabernet Sauvignon. 2.2 Asimilovatelný dusík v moštu a víně Dusík asimilovatelný kvasinkami se dělí na amoniové ionty a volné aminokyseliny. Jeho obsah v moštech se pohybuje v rozmezí desítek až stovek mg N.l -1 (s optimem kolem 200) a většinou postačuje k tomu, aby mohla být fermentace úplná. Následující sekce obsahuje dosavadní znalosti o amonných iontech a aminokyselinách vyskytujících se v hroznech potažmo moštu, jejich obvyklé koncentrace a principy jejich změn v souvislosti s dozráváním hroznů. Jsou diskutovány nejvíce zastoupené aminokyseliny a jejich variabilita v moštech. Další část se věnuje mechanismům asimilace, biosyntézy a degradace aminokyselin a amonných iontů uvnitř kvasinek. Taktéž jsou diskutovány důsledky těchto metabolismů, které probíhají během alkoholové fermentace či malolaktické fermentace a ovlivňují produkci nových látek ve víně. 2.2.1 Amonné ionty v moštu Obsah amonných iontů v hroznech byl od šedesátých let spojován s procesem dozrávání hroznů. Ukázalo se, že značně variuje v závislosti na klimatu, ročníku, 23

Teoretická část odrůdě, podnoži a oblasti pěstování. Koncentrace amonných iontů v moštu začíná nabírat na vážnosti především v teplých oblastech v případě přezrálého materiálu. Běžné hodnoty amonia se pohybují v rozmezí desítek až stovek mg.l -1. 19 Množství amonných iontů v moštu může být použit jako indikátor rychlosti fermentace, jelikož slouží výhradně ke stavbě buněčných stěn kvasinek a tvorbě proteinů. 20 Jejich obsah by neměl významně převyšovat množství potřebné k těmto procesům a to především z důvodů zdravotních. Při přebytku amonných iontů dochází k vzniku řady nežádoucích produktů jako jsou těkavé kyseliny, močovina apod. 21,22 2.2.2 Aminokyseliny v moštu Aminokyseliny tvoří hmotnostně největší část celkového dusíku v moštu a víně. Volné aminokyseliny se pohybují v koncentraci 1 4 g.l -1, v závislosti na ročníku. Ve zralých hroznech aminokyseliny obvykle reprezentují 30 40 % celkového dusíku. Obvykle se ukazuje dominantní obsah některých aminokyselin v moštech, hlavně argininu, prolinu, α alaninu, serinu, kyseliny glutamové a její amidové formy glutaminu, který zajišťuje transport amonných iontů. Arginin a prolin jsou charakteristické pro jisté odrůdy. Prolin je nejvíce zastoupen u odrůd Chardonnay, Cabernet Sauvignon a Merlot, naopak arginin dominuje v odrůdách Pinot Noir a Aligoté. Na rozdíl od prolinu, arginin je bez větších problémů asimilován kvasinkami. Výsledky 23 také demonstrují zvýšení volných aminokyselin během zrání. Koncentrace se od zaměkání po optimální zralost více než zdvojnásobí. Ačkoli se tento jev opakuje každý rok, nelze udělat jednoznačný závěr. Obsahy aminokyselin v období dozrávání často kolísají a potenciál fermentace neroste spolu se zralostí hroznů především kvůli koncentraci prolinu. Ve skutečnosti je potřeba provést mnohem detailnější analýzy jednotlivých aminokyselin a především prolinu a argininu. Obsah prolinu se dva týdny před sběrem rapidně zvýší. Z toho důvodu byly studovány nejvíce zastoupené odrůdy oblasti Champagne. Byla sledována korelace obsahu prolinu a poměru cukr/kyseliny, jako zralosti hroznů (IM). 24,25 Korelace mezi těmito parametry byla formulována do následující rovnice. 24

Teoretická část Prolin by mohl být znakem zralosti. Což může vysvětlovat také fakt snížení potenciálu fermentace při zralosti hroznů. V letech, kdy jsou hrozny dost zralé musí být mošt monitorován a může být zapotřebí přídavek fosfátu či sulfátu diamonného. To je důležité především u odrůd, kde je obsah prolinu vysoký, jako je například Chardonnay. U této odrůdy se může dva týdny před sběrem význačně zvýšit obsah prolinu a obsah argininu zůstává téměř stejný. 2.3 Utilizace asimilovatelného dusíku kvasinkami Mimo aminokyselin z hroznů, které mohou být částečně nebo úplně metabolizovány kvasinkami během růstové fáze, jsou některé aminokyseliny produkovány kvasinkami na konci kvašení. Některé jsou uvolněny proteolýzou během autolýzy mrtvých kvasinek, jiné jsou produkovány enzymatickou degradací hroznových proteinů. Navíc jsou zdrojem živin pro bakterie během jablečno-mléčného kvašení. Obsah aminokyselin v moštu je závislý na hnojení, klimatických podmínkách a v neposlední řadě na původu hroznů. Během samotné fermentace pak mimo všechny tyto faktory z velké části závisí obsah aminokyselin na metabolismu kvasinek a podmínkách fermentace (kmen kvasinek, teplota, doba uložení na kvasnicích, přídavek amonné soli, apod.). 9 Vývoj jednotlivých aminokyselin během fermentace a následně jejich složení v hotovém víně je také značně ovlivněno technologií. Například vína vyrobená v atmosféře CO 2 obsahují méně kyseliny asparagové, serinu, alaninu, valinu, tyrosinu, lysinu a histidinu, ale podstatně více treoninu a citrulinu. 26 Ohřev rmutu má velký vliv na celkový obsah dusíku v moštech, zejména na jeho biologický potenciál, tj. na schopnost prokvašení. Ohřevem se obsah celkového dusíku zvýší, obsah bílkovinného dusíku sníží. Je to způsobeno eliminací bílkovin teplem, jejich sloučením s tříslovinami nebo i štěpením proteolytickými enzymy. Ohřevem se uvolní dusík obsažený v semínkách a třapinách a přejde do moštu, tím se obsah celkového dusíku zvyšuje. Bílkovinný dusík se teplem eliminuje, takže jeho obsah klesá. Obohacení moštu sloučeninami dusíku se pokládá za přínos, protože se projeví zvýšeným biologickým potenciálem kvasinek. Ohřev rmutu při zpracování hroznů zvyšuje obsah téměř všech aminokyselin. 25

Teoretická část Vína z lisovaných hroznů mají vždy vyšší obsah dusíkatých látek než vína ze samotoků. Zvyšováním tlaku při lisování se zvyšuje i obsah dusíkatých látek. Rozdílné podmínky výroby vína (např. teplota a rychlost kvašení) mohou zvýšit obsah aminokyselin ve víně, vliv má i jablečno-mléčná fermentace. 8 Jablečno-mléčná fermentace obvykle nastává na konci alkoholové fermentace, je to biologický proces odkyselování. Tento proces uskutečňují mléčné bakterie (Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus). Mnoho výrobců povzbuzuje tuto reakci očkováním čisté kultury, jejíž volba opět ovlivňuje utilizaci dusíkatých látek. 27 Koncentrace aminokyselin se během jablečno-mléčné fermentace mění, u některých se koncentrace zvyšuje, u jiných snižuje. Vína po jablečno-mléčné fermentaci mají nižší koncentrace argininu, γ-aminomáselné kyseliny a methioninu. 28 Podle některých autorů jablečno-mléčná fermentace koncentraci aminokyselin značně redukuje krom fenylalaninu a ornithinu, který vzniká z argininu působením mléčných bakterií, a následně se přeměňuje na prolin a močovinu. 29 Jiní autoři tvrdí, že jablečno-mléčná fermentace neredukuje obsah tyrosinu a fenylalaninu. 30 Důležité je také zda byla fermentace provedena apikulátními či ušlechtilými kmeny kvasinek. 31 Odrůda, region a ročník ovlivňuje koncentraci aminokyselin, avšak alkoholová a jablečno-mléčná fermentace může tento znak zamaskovat. Z toho důvodu je autentifikace vín dle jednotlivých aminokyselin jen velmi obtížná a dosažitelná pouze při striktním dodržením stále stejné technologie. Aminokyselinový profil byl úspěšně využit při rozlišování původního šampaňského od šumivých vín. Celkový obsah aminokyselin je v šampaňském víně podstatně vyšší, kromě argininu. 2.3.1 Asimilační mechanismy dusíku Penetrace amonia a aminokyselin do těl kvasinek aktivuje množství membránových proteinových transportérů či permeas. S. ceravisiae má nejméně dva specifické přenašeče amoniových iontů. 32 Jejich aktivita je inhibována několika aminokyselinami, v nekompetitivním chováním. Transport aminokyselin zajišťují dvě odlišné skupiny přenašečů: Obecná aminokyselinová permeasa (OAP) transportuje všechny aminokyseliny. Amonný ion inhibuje a zastavuje činnost OAP. OAP se proto uplatňuje během druhé 26

Teoretická část poloviny fermentace, kdy už mošt neobsahuje amonné ionty. Hraje tedy roli tzv. dusíkového mrchožrouta ve smyslu likvidace zbylých aminokyselin. 33 Do druhé skupiny přenašečů patří specifické permeasy. S. ceravisiae má mnoho těchto specifických permeas pro aminokyselin (nejméně 11). Každá z nich zajišťuje transport jedné či několika aminokyselin. Na rozdíl od OAP avšak amonný ion nelimituje aktivitu těchto permeas. Od začátku lag fáze během prvního stadia fermentace zajišťují tito přenašeči rapidní asimilaci aminokyselin obsažených v moštu. 34 Glutamát a glutamin, křižovatky syntézy aminokyselin, nejsou jedinými asimilovanými aminokyselinami. Prakticky většina aminokyselin je z moštu vyčerpána během fermentace prvních 30 g cukru. Alanin a arginin jsou aminokyseliny nacházející se běžně v moštech. Kvasinky tyto aminokyseliny a amonný ion využívají až po vyčerpání ostatních aminokyselin, které jsou akutně zapotřebí. Mimoto, kvasinky masivně asimilují arginin pouze v případě vyčerpání všech amonných iontů z media. Někdy také nezkonzumují kys. γ-aminomáselnou. V drtivé většině nespotřebují ani prolin, ačkoli se v moštu vždy nachází. Během fermentace spotřebují kvasinky 1-2 g.l -1 aminokyselin. S blížícím se koncem fermentace kvasinky vylučují signifikantní, ale různé množství aminokyselin. Na konci alkoholové fermentace zbude několik set miligramů aminokyselin na litr, z čehož z pravidla více jak polovinu tvoří právě prolin. V protikladu s hexosami, které vnikají do těl kvasinek pomocí usnadněné difuse, amonium a aminokyseliny vyžadují aktivní transport. Jejich koncentrace v buňkách kvasinek je vyšší než v okolním mediu. Permeasy zajišťují transport molekul aminokyselin (nebo amonných iontů) s transportem protonů. Protony se pohybují směrem koncentračního gradientu, koncentrace protonů v prostředí je vyšší než v cytoplasmě. Aminokyseliny a protony jsou svázány do stejného transportního proteinu a prochází stěnou simultánně. Takový transport dvou látek stejným směrem se nazývá symport (viz Graf 2). Samozřejmě proton procházející stěnou musí být následně vyloučen, aby nedocházelo k okyselování cytoplasmy. Tento pohyb je opět proti gradientu koncentrace a vyžaduje tudíž energii. ATP-asa zajišťuje exkreci protonů přes plasmatickou membránu, známou jako protonová pumpa. 27

Teoretická část Graf 2: Transport aminokyselin skrze plazmatickou membránu. Etanol silně limituje transport aminokyselin. Modifikuje složení a vlastnosti fosfolipidů plasmatické membrány. Membrána se tak stává více permeabilní. Protony z prostředí masivně vnikají do cytoplasmy pomocí jednoduché difuse. ATP-asa v membráně musí rapidně navýšit svou aktivitu pro vyrovnání vnitrobuněčného ph. V okamžiku, kdy nastane tato situace je symport aminokyselin zastaven. Jinak řečeno, na začátku fermentace a do doby, kdy je koncentrace etanolu nízká, mohou kvasinky rapidně asimilovat aminokyseliny a koncentrovat je do vakuol pro jejich pozdější využití. 35 2.3.2 Syntéza aminokyselin Amonné ionty a aminokyseliny nacházející se v moštu zásobují kvasinky dusíkem. Kvasinky také mohou aminokyseliny zpracovávat rovnou na skládání proteinů. Fixují amonný ion na uhlíkatý skelet získaný z metabolismu cukrů. Kvasinky tak využívají stejný reakční postup jako všechny organismy. Důležitou roli v tomto procesu hrají aminokyseliny glutamát a glutamin. 36,37 NADP + glutamát dehydrogenáza (NADP + GDH), produkovaná genem GDH1, produkuje glutamát (viz Graf 3) z amonného iontu a molekuly kyseliny α-ketoglutarové, která je meziprodukt cyklu kyseliny citrónové. Kvasinky také vlastní NAD + glutamát dehydrogenázu (NAD + GDH), produkt GDH2 genu. Tato dehydrogenáza se uplatňuje 28

Teoretická část v katabolismu glutamátů. Doprovází inverzní reakci osvobozující amonný ion na syntézu glutaminu. Graf 3: Inkorporace amonného iontu za vzniku glutamátu. Aktivita NADP + GDH je na maximu v případě, že je v mediu dostatečné množství amonných iontů jako zdroje dusíku. Aktivita NAD + GDH je principiálně na maximu v případě, že zdroj dusíku bude glutamát. Glutamin syntetáza (GS) vytváří z glutamátu a amonného iontu glutamin. Tato amidace ovšem vyžaduje hydrolýzu molekuly ATP (viz Graf 4). Graf 4: Syntéza glutaminu. Během transaminačních reakcí slouží glutamát jako donor aminoskupiny v syntéze různých aminokyselin. Pyridoxal fosfát je transaminační kofaktor (viz Graf 5), je získáván z pyridoxinu (vitamin B 6 ). 29

Teoretická část Graf 5: Pyridoxal fosfát a pyridoxamin fosfát. Uhlíkový skelet aminokyselin pochází z meziproduktů glykolýzy (pyruváty, 3- fosfoglyceráty, fosfoenolpyruváty), Krebsova cyklu (α-ketoglutaráty, oxalacetáty) nebo z pentózo-fosfátového cyklu (ribóza 5-fosfát, erytróza 4-fosfát). Některé z těchto reakcí jsou velmi jednoduché, jako vznik asparátu nebo alaninu transaminací glutamátu na oxalacetát nebo pyruvát: Oxalacetát + glutamát aspartát + α-ketoglutarát Pyruvát + glutamát alanin + α-ketoglutarát Ostatní biosyntézní cesty jsou komplexnější, ale stále probíhají v kvasinkách stejně jako ve zbytku živého světa. Aminokyseliny mohou být klasifikovány do šesti biosyntetických rodin v závislosti na jejich původu a uhlíkatém prekursoru (Graf 6). 30

Teoretická část Graf 6: Biosyntézní cesty aminokyselin. 1. Z glutamátu a α-ketoglutarátu je formován glutamin, prolin a arginin. 2. Asparagin, methionin, lysin, treonin a isoleucin vznikají z aspartátu, který byl získán z oxalacetátu. ATP může aktivovat methionin za vzniku S- adenosylmethioninu, který je následně demethylován za vzniku S- adenosylhomocysteinu. Hydrolýzou, která uvolní adenin vzniká homocystein. 3. Pyruvát je počáteční látka při tvorbě alaninu, valinu a leucinu. 4. 3-fosfoglycerát vede k formaci serinu a glycinu. Kondenzace homocysteinu a serinu produkuje cystathionin, prekurzor cysteinu. 5. Imidazolový cyklus histidinu vzniká z ribózy-5-fosfátu a adeninu ATP. 6. Aminokyseliny obsahující aromatický cyklus (tyrosin, fenylalanin, tryptofan) jsou získávány z erytrozy 4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu. Tyto dvě sloučeniny jsou meziprodukty pentozového cyklu a glykolýzy. Jejich kondenzace formuje 31

Teoretická část shikimáty. Kondenzáty těchto sloučenin s jinou molekulou fosfoenolpyruvátu produkují chorismáty, prekurzory aromatických aminokyselin. 38 2.3.3 Katabolismus aminokyselin Amonný ion je pro syntézu aminokyselin potřebných k produkci proteinů základní složkou, ale kvasinky ne vždy najdou potřebné množství ve svém prostředí. Naštěstí jsou schopny získávat amonium i z ostatních aminokyselin pomocí různých reakcí. Nejběžnější reakční cesta je přenos α-amino skupiny některé z dostupných aminokyselin na α-ketoglutarovou kyselinu za vzniku glutamátu. Tato reakce je katalyzována aminotransferasou či transaminasou jejichž složkou je pyridoxal fosfát (PLP). Glutamat je následně oxidativní cestou deaminován za vzniku NH + 4 (Graf 7). Tyto dvě reakce mohou být následovně shrnuty: α-aminokyselina + NAD + + H 2 O α-ketokyselina + NH 4 + +NADH + H + Graf 7: Oxidativní deaminace aminokyselin, katalyzovaná transaminázou a glutamát dehydrogenázou. Během transaminace je pyridoxal fosfát přechodně transformován na pyridoxamin fosfát (PMP). Aldehydická skupina PLP se váže na ε-amino skupinu lysinové části, která je aktivním centrem aminotransferasy. Tím vzniká meziprodukt (E-PLP) (Graf 8). 32

Teoretická část Graf 8: Úloha pyridoxal fosfátu v transaminačních reakcích. α-aminoskupina aminokyseliny nahradí ε-amino skupinu navázanou na PLP. Rozštěpením tohoto meziproduktu pak vzniká PMP a keto-kyselina, odpovídající zúčastněné aminokyselině. PMP následně může cyklem reagovat s jinou keto-kyselinou za vzniku nové, potřebné aminokyseliny a současně se regeneruje na PLP. Tyto reakce mohou být shrnuty do následujícího schématu: Aminokyselina 1 + E-PLP keto-kyselina 1 + E-PMP Keto-kyselina 2 + E-PMP aminokyselina 2 + E-PLP V souhrnu: Aminokyselina 1 + keto-kyselina 2 keto-kyselina 1 + aminokyselina 2 Některé aminokyseliny jako jsou serin a threonin obsahují hydroxylovou skupinu na β-uhlíku a mohou být přímo deaminované dehydratací. Tuto reakci katalyzuje dehydratasa za vzniku příslušné keto-kyseliny a amonia (Graf 9). 33

Teoretická část Graf 9: Deaminace serinu pomocí dehydratázy. 2.3.4 Důsledky utilizace dusíku Tak jako u všech organismů i u kvasinek je velmi důležitá povaha jejich výživy. Na základě dostupnosti výživy a podmínek utilizace dusíku je kvasinkami produkováno velké množství látek značně ovlivňující finální produkt víno. Některé z těchto látek nesou pozitivní charakter a jiné mohou být zdrojem organoleptických defektů 39,40 2.3.4.1 Vznik sirnatých látek Nejběžnější vadou vína související se stresem kvasinek je zápach a chuť po sulfidech a merkaptanech známých pod pojmem sirka. 41 Nejčastěji jde o produkci sulfanu neboli sirovodíku připomínajícího zápach shnilých vejcí. Je jasné, že jde o produkt metabolismu sirnatých látek. Ačkoli vznik této vady vína je stále předmětem diskuzí, již desítky let je známo, že v případě nedostatku asimilovatelného dusíku je riziko vysoké (viz Graf 10). 42 34

Teoretická část Graf 10: Lineární a nelineární regrese vývoje H 2 S (µg.l -1 ) v závislosti na koncentraci volného amino-dusíku (mg.l -1 ) během fermentace. 42 Další známou příčinou této vady je redukce síranových a siřičitanových aniontů na sulfidy během alkoholové fermentace (viz Graf 11). Tento jev je opět doprovázen nedostatečnou výživou kvasinek. Dle některých prací 43 je zásadní především koncentrace amonných iontů a methioninu v médiu. 44 35

Teoretická část Graf 11: Koloběh sirnatých látek v buňce kvasinky. 2.3.4.2 Vznik vyšších alkoholů a esterů Alkoholy s více než dvěma atomy uhlíku jsou známy jako vyšší alkoholy. Několik z nich jsou vyráběny v průběhu fermentace a dosahují koncentrace v řádu 150-550 mg.l - 1. 45 Tyto alkoholy a jejich estery mají velmi intenzivní vůně, které hrají důležitou roli v 36

Teoretická část aroma vína. V přirozené koncentraci (méně než 300 mg.l -1 ) přispívají k aromatické složitosti vína. Ve vyšším obsahu maskují potenciál vína. Jinak je tomu v případě fenyletanolu jehož vysoká koncentrace je žádána pro jeho krásnou květnatou vůni. Estery těchto alkoholů mají často příjemné ovocné a květinové vůně podílející se především na aroma mladých vín. Kvasinky mohou vylučovat keto-kyseliny vzniklé z deaminace aminokyselin pouze po jejich dekarboxylaci na aldehydy a následné redukci na alkoholy (Graf 12). Tento mechanismus, známý jako Ehrlichova reakce, vysvětluje vznik vyšších alkoholů ve víně. Tabulka 2 ukazuje některé vyšší alkoholy a jejich korespondující aminokyseliny, jako prekursory těchto alkoholů. Graf 12: Formování vyšších alkoholů z aminokyselin (Ehrlichova reakce). Několik experimentů však jasně ukázalo, že za vznik vyšších alkoholů ve víně není zodpovědná pouze reakční cesta degradace aminokyselin. Nejméně propan-1-ol a butan- 1-ol nemají prekursory v aminokyselinách, sic jsou ve víně obsaženy v nezanedbatelném množství. Navíc syntézy některých aminokyselin neprodukují odpovídající vyšší alkoholy, ačkoli jsou tyto aminokyseliny v mediu obsaženy. Není žádný jasný vztah mezi množstvím aminokyselin v moštu a množstvím odpovídajících vyšších alkoholů ve víně. Objevilo se, že vyšší alkoholy produkované kvasinkami jsou spojeny nejen s degradací aminokyselin, ale také se syntézou keto-kyselin. Tyto keto-kyseliny jsou získávány při metabolismu cukrů. Například již zmíněný propan-1-ol nemá korespondující aminokyselinu. Je totiž produkován z α-ketomáselné kyseliny, která může vznikat z pyruvátu a acetyl koenzymu A. α-ketoisokaproát je prekursor isoamylalkoholu a meziprodukt syntézy leucinu, který může být produkován také z α- acetolaktátu získaného z pyruvátu. Některé zdroje uvádí, že většina vyšších alkoholů ve víně je formována při metabolismu cukrů bez zapojení aminokyselin 46 jiné to popírají. 47 37

Teoretická část Tabulka 2: Vyšší alkoholy, jejich koncentrace ve víně a prekurzory vzniku. Fyziologická funkce vyšších alkoholů produkovaných kvasinkami není zcela jasná. Je možné, že jde pouze o zbytky metabolismu cukrů, detoxikační proces vnitrobuněčného media nebo způsob regulování metabolismu aminokyselin. S výjimkou fenyletanolu, který má ve vůni charakter růží, vyšší alkoholy nevoní sami o sobě příliš vábně. Většina, jako třeba isoamylalkohol, má těžký odér rozpouštědel. Methionol je zvláštní alkohol, protože obsahuje atom síry. Vůní připomíná vařené zelí a má nejnižší práh citlivosti (1,2 mg.l -1 ). Může být zodpovědný za 38

Teoretická část mnoho zápachů a reduktivních vad aroma vína. Obecně by se vinaři měli vyvarovat přílišného množství vyšších alkoholů ve víně, nicméně jejich přiměřená koncentrace je neodmyslitelnou součásti komplexnosti aroma vína. Naštěstí jejich organoleptický dopad je omezený jejich obvyklou koncentrací, ale zaleží také na celkové aromatické intenzitě vína. Například nadměrný výnos či déšť v období dozrávání hroznů může naředit mošt, což ve vůni vede k nízké koncentraci příjemných aromatických látek a těžkému charakteru vyšších alkoholů. Parametry, které mají dopad na vysokou produkci vyšších alkoholů jsou dobře známy: Vysoké ph, rostoucí teplota fermentace, přílišné množství vzduchu při kvašení. Při výrobě červeného vína, kdy dochází k luhování rmutu, rostoucí teplotě a přístupu kyslíku, nelze vznik vyšších alkoholů omezit. Při výrobě bílého vína teplota fermentace do 22 C zamezuje tvorbě vyšších alkoholů. Nedostatek amonných iontů a aminokyselin v moštu paradoxně vede také k přehnanému formování vyšších alkoholů. V těchto podmínkách musí kvasinky pečlivě využívat veškerý dusík dostupný z transaminačních reakcí. Zbylé uhlíkové skelety jsou pak po řadě reakcí vyloučeny ve formě vyšších alkoholů. Odkalení moštu obecně vede k omezení vzniku vyšších alkoholů. Další faktory ovlivňující vznik vyšších alkoholů je druh kvasinek. Jisté typy, jako je Hansenula anomala jsou dlouho známy jako producenti vyšších alkoholů, především v aerobních podmínkách. 48 Ukázalo se, že S. bayanus (krom uvarum) produkují prokazatelně vyšší množství fenyletanolu než S. cerevisiae, u kterých záleží také na druhu. 49 Produkce vyšších alkoholů (vyjma fenyletanolu) by mělo být jedním z kritérií selekce dalších kvasinek. 46 V důsledku esterifikační aktivity produkují kvasinky také řadu esterů (řádově mg.l -1 ). Nejdůležitějším z těchto acetátů jsou isoamylacetát (banánové aroma) a fenyletylacetát (aroma růží). Etylestery středně dlouhých mastných kyselin sem také patří, ačkoli tvorba těchto esterů není spojena s metabolismem dusíku. Ty jsou formovány kondenzací acetylkoenzymu A. Tyto estery mají daleko zajímavější aroma než ostatní. Hexanoát má květnato-ovocné aroma připomínající zelené jablíčko. Etyldekanoát má odér mýdla. Při výrobě bílého vína lze zvýšit produkci těchto esterů snížením teploty fermentace a zvýšením čistoty moštu. Jistý typ kvasinek (71B) produkuje širokou paletu těchto sloučenin, což přispívá ke kvasnému charakteru mladých vín. Estery jsou však 39

Teoretická část během prvního roku zrání v láhvi rapidně hydrolyzovány a nemají pak velký vliv na charakter bílého vína. 2.3.4.3 Vliv asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin Těkavé kyseliny a acetáty, jsou důležitou součástí aroma vína. Jejich zvýšená koncentrace může negativně ovlivnit kvalitu vína. Množství těkavých kyselin produkovaných během kvašení se pohybuje v mezích 0,25 0,5 g.l -1, ale může být mnohem vyšší díky různým podmínkám fermentace, například špatnému zdravotnímu stavu hroznů nebo oxidačním prostředím. Asimilovatelný dusík ovlivňuje také množství těkavých kyselin ve víně. Bylo zjištěno, že obsah glycerolu je od obsahu dusíku nezávislý. 50 Ke studiu vlivu dusíku na těkavé kyseliny ve víně bylo použito 12 různých moštů s vysokou cukernatostí, které byly zakvášeny v laboratorních podmínkách. Asimilovatelný dusík na začátku fermentace ovlivnil množství vzniklých těkavých kyselin, především kyseliny octové (viz Graf 13). Graf 13: Vliv asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin. 50 Dále se v práci uvádí nový poznatek o optimálním přidaném množství amonných iontů. Přidáním síranu amonného na koncentraci 210 mg N.l -1 lze snížit množství vznikajících těkavých kyselina o 40 % oproti neošetřenému moštu. Navíc v případě neopatrného a přehnaného přídavku výživy na koncentraci 300 mg N.l -1 se sice docílí 40

Teoretická část velmi rychlého průběhu fermentace, avšak za cenu vyššího množství těkavých kyselin (viz Graf 14). Graf 14: Vliv přídavku dusíku na obsah těkavých kyselin. 50 Další z vlivů přídavku asimilovatelného dusíku na obsah těkavých kyselin je správné načasování. Pokud se přidá potřebné množství výživy na začátku fermentace, sníží se obsah vznikajících těkavých kyselin okolo 20-30 %. Pokud však přijde přídavek výživy až ve stacionární fázi, dojde k nárůstu rychlosti fermentace, ale množství těkavých kyselin se neredukuje ba naopak hrozí jejich nárůst. 50 2.3.4.4 Vznik biogenních aminů Bioaminy nebo-li biogenní aminy, vzorcem R NH 2, jsou také sledovány z důvodu zdravotní závadnosti na člověka (histamin). Již od dob Hippokrata jsou biogenní aminy nebo-li bioaminy považovány za zdraví škodící látky. Jejich hlavní výskyt je v jídlech a nápojích produkovaných mléčnými bakteriemi, jako jsou třeba sýry, sušené salámy, jablečné víno a pivo. Byly také nalezeny v nesprávně skladovaných potravinách jako jsou ryby a maso. Ze všech látek spadajících do této skupiny je především histamin hlavním cílem kontrol. Histamin způsobuje alergické reakce a bolesti hlavy. Vína ho 41

Teoretická část obsahují řádově jednotky či desítky mg.l -1 a i takové koncentrace jsou v některých evropských zemích zakázány. Dnes existují analytické metody identifikující a stanovující až dvacet bioaminů současně. 51,52 Toto uspořádání umožňuje detailní zkoumání těchto sloučenin s cílem odstranění jejich možný negativní vliv po požití vína. Z biochemického pohledu vznikají bioaminy dekarboxylací aminokyselin pomocí aktivity enzymu zvaného dekarboxyláza. 53 Tento proces se děje výhradně za přítomnosti pyridoxal fosfátu, který obsahují kvasinky a některé druhy bakterií. Biogenní aminy tak vznikají pouze při fermentaci. Jistý druh bakterií jako jsou Pediococcus nebo Lactobacillus tímto enzymem disponují. Mohou ho však také syntetizovat indukčně v přítomnosti nějakého prekurzoru. Arginin je jedním z častých prekurzorů některých bioaminů. Graf 15 ukazuje dekarboxylaci arginindekarboxylázou za vzniku agmatinu, prekurzoru bioaminu putrescinu. Ornithin může být přímí prekurzor putrescinu a zapříčiňovat tak vznik dalších dvou bioaminů, sperminu a spermidinu. Arginin je tak přímí či nepřímí prekurzor čtyř biogenních aminů. Krom zmíněných bioaminů jsou přítomni ve víně ještě methylamin, dimethylamin, ethylamin, hexylamin, isopentylamin, piperidin, propylamin, pyrolidin a tryptamin. Vína u kterých proběhla malolaktická fermentace mají obsah biogenních aminů logicky vyšší než vína, u kterých malolaktická fermentace neproběhla. Běžná koncentrace bioaminů ve víně je do několika desítek mg.l -1. 54,55 Histamin se objevuje ve víně již během alkoholové fermentace, ale jeho obsah se zvyšuje především během malolaktické fermentace. Neexistuje žádná korelace mezi obsahem histidinu v moštu a obsahem histaminu ve víně. Ačkoli vína obsahují několik mg.l -1 histaminu, koncentrace histaminu u některých vín přesahuje 10 mg.l -1, což je v rozporu s legislativou některých států. Přesný důvod a podmínky zodpovědné za vznik většího množství histaminu ve víně zatím není docela dobře známí. Nejpravděpodobnější vysvětlení zatím stojí na přítomnosti určitých druhů bakterií, které mají vysoký obsah histidindekarboxylázy. 42

Teoretická část Jak se dá očekávat ošetření vína 50 g.hl -1 bentonitu výrazně snižuje koncentraci bioaminů. Toto ošetření je částečně účinné z důvodu kladného náboje aminů při ph vína a negativním náboji bentonitu. 43

Teoretická část Graf 15: Role argininu při syntéze biogenních aminů. 44

Teoretická část 2.3.4.5 Vznik ethylkarbamátu Etylkarbamát je etylester kyseliny karbamové. Jakkoli je kyselina karbamová nestálá a rozpadá se velice rychle na oxid uhličitý a amoniak, její estery jsou stabilní a nazývají se uretany. Ve vinařství, a obecně v jakémkoli kvasném průmyslu, je etylkarbamát považovaný za nezáviděníhodný karcinogen. Tento fakt je však zveličován médii. Etylkarbamát má ve vyšších dávkách také utišující a spánek indukující vlastnosti. V minulosti byla tato látka používána v potravinářském průmyslu a především do nápojů jako konzervační prostředek, ale nyní je již zakázán. Bylo napsáno mnoho prací na téma obsahu etylkarbamátu ve vínech z různých oblastí. 56,57 Bylo zjištěno, že obsah etylkarbamátu se různí spolu s odrůdami, přehnaným hnojením ve vinici, ale tyto faktory nejsou příliš signifikantní. Vyšší obsah etylkarbamátu může být také způsoben technologií vysokou teplotou při maceraci nebo neodstopkováním hroznů. Karbamát syntetizují kvasinky a obsahují také jeho prekurzory. Svou roli hrají také bakterie. Vína po malolaktické fermentaci mají vždy o několik µg.l -1 karbamátů více. Přitom nemají všechny druhy bakterií stejný vliv. Heterofermentativní bakterie rodu Oenococcus oeni produkují méně karbamátů než homofermentativní bakterie rodu Lactobacillus plantarum. Navíc byla nalezena korelace mezi koncentrací bioaminů a etylkarbamátu. Tyto negativní projevy bakterií jsou umocněny zvýšeným ph vína. Vliv na obsah etylkarbamátu má také skladování. Podmínky skladování a především teplota během distribuce a prodeje vín mohou způsobit zvýšení těchto nežádoucích látek. Za zvýšení koncentrace karbamátů ve starších ročnících vín je zodpovědná především močovina a některé aminokyseliny arginin, citrulin apod. 45

Teoretická část 2.4 Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace 2.4.1 Vliv asimilovatelného dusíku na stavbu buněčné stěny kvasinek Nízký obsah asimilovatelného dusíku má za důsledek sníženou rychlost průběhu fermentace. 58,59 Limitující obsah asimilovatelného dusíku je zodpovědný za redukci tvorby buněčných stěn kvasinek a nepřímo tedy způsobuje sníženou schopnost glykolýzy. Tyto efekty také záleží na zdroji dusíku. Jako výborný zdroj dusíku jsou považovány amonné ionty, glutamin či asparagin. Naopak velmi špatné zdroje jsou prolin, který se v podstatě nespotřebovává a močovina. 60 Kvasinky rychle odjímají dusíkaté látky z media a skladují je ve svých vakuolách pro pozdější využití. Předpokládá se, že tento způsob adaptace má význam v dalších fázích fermentace, kdy je již v mediu naakumulované větší množství etanolu, který má silné inhibiční účinky na transport aminokyselin. Chemické složení buněčných stěn záleží na kultivačních podmínkách a kompozici media. Uvádí se, že syntéza buněčné hmoty kvasinek je přímo úměrná množství asimilovatelného dusíku v mediu, dokud není obsah dusíkatých látek v kvasinkách na hranici 50 % jejich váhy. Také bylo zjištěno, že kvasinky dokáží syntetizovat veškeré proteiny z anorganického dusíku v podobě amonných iontů a organického uhlíku. 61 Plasmatická membrána je místo prvotního kontaktu buňky s okolím a tudíž samotné přežití celé kvasinky závisí na flexibilní a adaptabilní kapacitě této membrány. V buněčných stěnách kvasinek je obsah mastných kyselin jeden z nejvíce variabilních faktorů, který je přímo ovlivněný především teplotou, výživou a rychlostí růstu. Studium vlivu asimilovatelného dusíku na množství mastných kyselin v membránách buněčných stěn kvasinek ukázalo, že v případě vysokého obsahu asimilovatelného dusíku v mediu se růst kvasinek směsí aminokyselin a amonia zpomaluje. 62 Dále se zjistily rozdíly v obsahu nasycených a nenasycených mastných kyselin v závislosti na složení prostředí. V prostředí samotných amonných iontů či samotných aminokyselin bylo v membráně detekováno menší množství mastných kyselin s vysokým stupněm nenasycenosti, než v případě směsi aminokyselin a amonia. Vysoký stupeň nenasycenosti mastných kyselin v membráně je charakteristický pro tzv. suché 46

Teoretická část kvasinky, které jsou schopny zpracovat veškerý zkvasitelný cukr na alkohol i při vysokém procentu alkoholu v médiu. 63 2.4.2 Vliv asimilovatelného dusíku na rychlost fermentace Asimilovatelný dusík je jedním z hlavních komponentů moštu, jenž je zodpovědný za rychlost a úplnost fermentace. Touto problematikou se v dnešní době zabývá velké množství studií, nicméně výsledky a tvrzení jsou mnohdy protichůdné. Studie kinetiky alkoholové fermentace čtyř komerčně dostupných kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae v syntetickém prostředí s vysokým obsahem cukru za různých počátečních koncentrací asimilovatelného dusíku ve formě amonných iontů (120 290 mg N.l -1 ) ukázala, že více než růst buněčné hmoty je ovlivněna rychlost spotřeby cukrů. Byly objasněny tři hlavní efekty na rychlost spotřeby cukrů. Pro maximální rychlost spotřeby cukrů existuje optimální počáteční koncentrace amonných iontů v médiu. Jestliže je koncentrace vyšší nastává inhibice. 64 V poslední řadě bylo zjištěno, že rychlost spotřeby cukrů je úměrná počáteční koncentraci asimilovatelného dusíku. Ve všech případech spotřeba amonných iontů rostla s počáteční koncentrací a optimální nároky se pohybovaly mezi 0,62 až 0,91 mg N na gram cukru v závislosti na druhu kvasinek. U různých druhů kvasinek nebyla nalezena obecná korelace mezi rychlostí spotřeby cukru a nároky na dusík. 65 Další zajímavá práce byla zaměřena na alkoholovou fermentaci běžící při konstantní rychlosti regulovanou přídavkem asimilovatelného dusíku a kontrolovanou produkcí oxidu uhličitého. Během regulační periody byl držen obsah dusíku v buňkách kvasinek, a tím i aktivita, na konstantní hodnotě. Tímto způsobem upravená fermentace sloužila k porovnání efektivnosti přídavku různých aminokyselin během stacionární fáze. Výsledky byly porovnávány s předchozími studiemi. 66,67,68 Jako předmět dalších studií byly vybrány aminokyseliny glycin, jehož asimilace byla překvapivě shledána velmi dobrou a methionin, který byl sice asimilován, nicméně ho bylo k udržení konstantní rychlosti fermentace, na rozdíl od jiných aminokyselin, potřeba signifikantně více. 69 47

Teoretická část 2.5 Požadavky na výživu 2.5.1 Příjem dusíku Henschke a Jiránek 70 analyzovali spousty teoretických prací na toto téma. Tyto práce byly uskutečněny ve velice širokém rozsahu podmínek a tak nejsou vždy úplně použitelné v praxi. Hroznový mošt obsahuje relativně vysokou koncentraci dusíkatých látek (0,1 1 g rozpustného dusíku na litr), ačkoli tato čísla reprezentují pouze čtvrtinu dusíku obsaženého v bobulích. Tyto látky tvoří amonné ionty (3-10 % celkového dusíku), aminokyseliny (25-30 %), polypeptidy (25-40 %) a proteiny (5 10 %). Koncentrace dusíku v hroznech závisí především na odrůdě, podnoži a podmínkách růstu zvláště na hnojení. Je snížena v případě napadení plísní a v případě, že rostlina trpí suchem, které je obecně spíše pozitivní pro produkci kvalitních červených vín. Obsah dusíku v hroznech je velice variabilní i z hlediska hustoty a uspořádání výsadby. V přezrálých hroznech se může obsah dusíku zvýšit v důsledku snížení obsahu vody. Při výrobě suchých bílých vín ovlivňuje obsah amonných látek a bílkovin doba a způsob extrakce. Pomalé lisování a macerace slupek zvyšuje obsah extrahovaných látek a tím i látek dusíkatých. 71 Kvasinky nezbytně potřebují přijímat dusík z moštu pro jejich růst. Amonné ionty jsou snadno asimilovatelné a můžou po syntéze nahrazovat jakékoli potřeby dusíkatých látek, především aminokyselin, avšak polypeptidy a bílkoviny neovlivňují růst S. cerevisiae dokud je nedokáží hydrolyzovat. S. cerevisiae nepotřebují přímo aminokyseliny při příjmu dusíkatých látek, dokud jsou schopny je individuálně syntetizovat. Přídavek aminokyselin však kvasinky stimuluje více než pouhé amonné ionty. Směs amonných iontů a aminokyselin se ukázal jako nejlepší zdroj dusíku. Kvasinky využívají aminokyseliny trojím způsobem: 1. Přímou integrací bez transformace na bílkoviny. 2. Ziskem aminoskupiny, která je dále použita na syntézu jiných látek obsahující tuto skupinu. Zbylý uhlíkový skelet je vyloučen. Takové reakce vedou k formování vyšších alkoholů ve víně. 48

Teoretická část 3. Molekuly aminokyselin mohou být použity jako zdroj uhlíku v metabolických reakcích. Kvasinky zároveň zužitkovávají zbylý amoniakální dusík. Asimilace různých aminokyselin závisí na fungování transportního systému a na systému regulace metabolismu. 72 Vlivem různorodosti složení moštu nejsou výsledky vždy identické. Asimilace aminokyselin neznamená vždy růst těl kvasinek. Nejsnadněji asimilovatelné aminokyseliny nejsou nejvíce zastoupeny v buňkách kvasinek, nýbrž jsou nejlépe transformovatelné. Kvasinky mají obtíže asimilovat arginin pokud je jediným zdrojem dusíku, je však asimilován pokud je dodán ve směsi s ostatními aminokyselinami. Kvasinky ho nevyužívají pokud je ve směsi amonný iont. 73 K eliminování obtížností spojených se složením moštu, Henschke a Jiranek 70 uskutečnili experiment v modelovém prostředí. Jejich výsledky znamenaly nový způsob vnímání této problematiky. Ačkoli komplexní směs aminokyselin a amonných solí je efektivnější pro růst kvasinek a rychlost fermentace, v praxi jsou používány amonné soli pro zvýšení koncentrace dusíku v moštu a to především z důvodu jednoduchosti. Byly dosaženy pozitivní výsledky při laboratorních pokusech, ale jejich efektivita se ztrácí v praktických podmínkách. Navíc přídavek asimilovatelného dusíku není vždy řešením problematické finální fáze fermentace, i když akceleruje fermentaci v počátku. Velice dlouhou dobu byl jako amonná sůl používán fosfát amonný. Fosfátový ion vyskytující se také v metabolismu cukrů byl také považován za výhodu pro fermentaci. Ve skutečnosti je mošt dostatečně bohatý na fosfáty a z tohoto důvodu je výhodnější použití síranu amonného jako výživy kvasinek. EU reguluje přídavky obou solí na 30 g.hl -1, odpovídající množství 63 mg.hl -1 dusíku. V USA je limit 95 g.hl -1 fosfátu amonného. V Austrálii nesmí přídavek vést ke koncentraci fosfátů vyšší než 40 g.hl -1. Standardní množství je kolem 10 20 g.hl -1. 100 g amonných solí fosfátů či sulfátů obsahuje přibližně 27 g amonia a 73 g fosfátových a sulfátových iontů. Přídavek této formy dusíku zvyšuje aciditu, jelikož obsahuje silný anion. Přídavkem 10 g amonné soli na hektolitr může vzrůst kyselost moštu o 0,35 g.l -1 (ek. H 2 SO 4 ) nebo o 0,52 g.l -1 (ek. kyseliny vinné). Počáteční koncentrace amonných iontů a aminokyselin v moštu je jeden z nejdůležitějších faktorů výživy. Pokud je koncentrace amonných iontů nižší než 25 mg.l -1, je nezbytné ho přidat. Vhodná je koncentrace mezi 25 a 50 mg.l -1. Nad tuto koncentraci nemá přídavek dusíku smysl. Je nepravděpodobné, že by přídavek ovlivnil 49

Teoretická část aktivaci fermentace. Pokud jsou hodnoty, vyjádřeny ve smyslu volného amino-dusíku (FAN free amino nitrogen) detekovatelného pomocí ninhydrinu, mezi 70 a 140 mg.l -1, pak je pro úplnou fermentaci nezbytné mít koncentraci cukrů mezi 160 a 250 g.l -1. 70 Bely a kol. (1990) 58 zjistili, že přídavek dusíku byl efektivní, pokud byla koncentrace asimilovatelného dusíku pod 130 mg.l -1, ale naopak je-li vyšší než 200 350 mg.l -1, je další přídavek spíše škodlivý. Aernyho (1996) 74 formaldehydový index umožnil jednoduché vyhodnocení množství volných aminokyselin a amonných iontů. Formaldehydový index rovný jedné odpovídá 14 mg.l -1 volného amino-dusíku. Podle Lorenziniho (1996) 75 je přídavek dusíku do moštů švýcarských odrůd nezbytný pokud je index menší než 10 a doporučený index je 10 14. Formaldehydová metoda slouží jako rychlé a jednoduché zjištění asimilovatelného dusíku (mimo prolin). Tato metoda je často využívána pro monitorování zralosti a fermentace. U kvasinek S. cerevisiae požadavky na dusík variují druh od druhu, Julien a kol. (2000) 76 tak navrhly test pro srovnání požadavků na dusík jednotlivých kmenů kvasinek S. cerevisiae během stacionární fáze fermentace. Během testu bylo měřeno množství dusíku potřebného na udržení konstantní rychlosti fermentace během stacionární fáze. Požadavky na dusík se lišil o násobek 2 26. Určení potřeby dusíku hraje důležitou roli při výběru druhu kvasinek použitých pro mošty s nedostatečným množstvím dusíku. Studie z Bordeaux z let 1996 až 2000, Masneuf a kol. (2000) 77 naměřili množství dusíku 36 270 mg.l -1 v bílých moštech s nedostatkem u 22 % vzorků (množství menší než 140 mg.l -1 ). V červených 46 354 mg.l -1 s nedostatkem v 49 % vzorků a v rosé 42 294 mg.l -1 s nedostatkem v 60 % a 89 % u botrytických moštů. Choné (2000) 78 analyzoval mošt odrůdy Cabernet Sauvignon v roce 1997 a zjistil signifikantní rozdíly v množství dusíku, od 95 218 mg.l -1. Dokonce byly nalezeny rozdíly v koncentraci u moštů z rostlin v rámci jednoho vinohradu, 25 45 mg.l -1 nebo rozdíly v moštech z hroznů v rámci jedné silněji plodící rostliny, 152 294 mg.l -1. Všechna tato data ukazují výskyt a frekvenci nedostatku asimilovatelného dusíku v moštech, který je daleko běžnější, než se dříve předpokládalo, což je možné částečně přisoudit také technice obdělávání vinohradu. Obecně byla přijímána myšlenka, že množství dusíku v moštech ze severních vinohradů severní hemisféry (vlivem teploty, oceánského klima) je dostatečně vysoké. Přídavek dusíku je extrémně důležitý k zisku dobré kinetiky fermentace. V některých případech je dokonce výhodné použít více než 40 g.l -1 síranu amonného, což vyžaduje 50

Teoretická část změnu legislativy EU (povoleno do 30 g.l -1 ). Některé výzkumy ukázaly, že přehnané zvýšení množství dusíku může mít negativní vliv i na rychlost fermentace, proto je vhodné uzpůsobit množství přídavku podle množství dusíku přirozeně zastoupeného v moštu a ujistit se, že celkové množství nepřesahuje 200 mg.l -1. Přídavek nadměrného množství dusíku může zbýt jako zbytkový dusík po konci fermentace. Ačkoli na toto téma nejsou žádná dostupná data, zbylý dusík může mít negativní vliv na mikrobiální stabilitu vína. Přebytek amonného dusíku také může vést k modifikaci aroma vína, jelikož kvasinky nemají potřebu deaminovat aminokyseliny, za produkce vyšších alkoholů a jejich esterů jak bylo rozebráno v kapitole 2.3.4.2. To ovlivňuje aroma především bílých vín. Koncentrace cukrů v moštu ovlivňuje dopad dávkování dusíku na rychlost fermentace. Pro běžné koncentrace cukru (kolem 200 g.l -1 ) přídavek dusíku zvýší biomasu kvasinek, čímž v důsledku zvýší rychlost fermentace, fermentace je pak úplná během několika dnů. Pro mošty s vysokou koncentrací cukru je situace značně složitá. Mošty často trpí nedostatkem jak dusíkatých látek, tak látek zajišťující prokvasitelnost těchto moštů, tzv. survival faktorů. V takovém případě platí, že fermentace je po přídavku výživy na začátku akcelerována, oproti kontrolnímu vzorku. Jak fermentace pokračuje, mezera mezi kontrolním a přiživeným vzorkem se zmenšuje. Nakonec se, z důvodu nedostatku nedusíkatých látek, fermentace spontánně zastaví na podobném množství reziduálního cukru. Křivka II (Graf 16) popisuje efekt přidaného dusíku (nebo jiný aktivační efekt) na mošt s vysokou koncentrací zbytkového cukru, normální koncentrací dusíku a nedostatku survival faktorů. Na druhou stranu, pokud je zpomalení fermentace zapříčiněno pouze nedostatkem dusíku, přídavek amonné soli fermentaci stimuluje (křivka III, Graf 16). Zpomalení fermentace může být někdy tímto způsobem eliminováno. 51

Teoretická část Graf 16: Příklad teoretické aktivace fermentace moštů. S 0 : počáteční koncentrace cukru v médiu, S 1 : koncentrace cukru po dokvašení. (I) Kontrola: zastavení fer. Při zbytkovém cukru S 0 S 1, (II) výživou aktivovaná fer. s nedostatkem survival faktorů, (III) výživou aktivovaná fer. s nedostatkem dusíkatých látek. 71 Ostatní faktory ovlivňují asimilaci dusíku během fermentace. Kvasinky mají druhově specifické vlastnosti. 79 Henschke a Jiranek 70 ukázali, že různé druhy S. Cerevisiae fermentující hroznové mošty asimilují množství dusíku variující od 329 451 mg.l -1 při 15,5 C a 392 473 mg.l -1 při 20 C. Což ukazuje mimo jiné i na to, že s rostoucí teplotou roste množství potřebného dusíku. 80 2.5.2 Vliv provzdušnění a přídavku dusíku na průběh a úplnost fermentace Julien a kol. (2000) 76 srovnávali potřeby dusíku a kyslíku několika druhů kvasinek používajících se ve vinařství. Kyslík má největší efekt na asimilování dusíku. Je dlouho známo, že kvasinky potřebují v prostředí kyslíku více dusíku. 81 To bylo objeveno, když v prostředí bez kyslíku kvasinky spotřebovaly 200 mg.l -1 asimilovatelného dusíku, zatímco v prostředí s kyslíkem spotřebovaly 300 mg.l -1. V aerobním prostředí mohou spotřebovat až 735 mg.l -1 dusíku bez proporcionálního navýšení počtu buněk. V experimentu uskutečněném Rozés a kol. (1988) 82 byl použit mošt obsahující 222 g.l -1 cukru a normální obsah amonného dusíku (35 mg.l -1 NH + 4 odpovídá přibližně 200 mg.l -1 dusíku) a byla předčasně ukončena fermentace za nepřístupu vzduchu. Přídavkem 0,15 g.l -1 NH + 4 (nebo 0,5 g.l -1 síranu amonného) vzrostla rychlost fermentace na začátku, ale nezvýšilo se množství prokvašeného cukru. Naopak provzdušněním třetího 52

Teoretická část dne od začátku fermentace bylo dosaženo vyšší rychlosti a úplného prokvašení cukru. Přídavek NH + 4 nezvýšil kinetiku fermentace, naopak po akceleraci začátku fermentace se aktivita kvasinek zastavila na 9 g.l -1 zbytkového cukru. Samozřejmě musí být výsledky těchto experimentů vztaženy k podmínkám pokusu (obsah cukru a dusíku v moštu). Výsledek tak nemusí být za jiných podmínek stejný, především když v experimentu byl signifikantní nedostatek dusíku. V každém případě experiment prokázal, že přídavek dusíku nemusí vždy eliminovat problémy s úplným dokončením fermentace. Je potřeba pomocí dalších experimentů s nedostatkem dusíku nalézt možné řešení. Dopad kyslíku na kinetiku fermentace, bez ohledu na jakýkoli přídavek amonných iontů, je podle všeho komplikovaný a závisí na mnoha faktorech, stejně tak, jako na parametrech moštu (obsah cukru a případný nedostatek dusíku) a fyzikálních podmínkách fermentace. 83 V každém případě přídavek dusíku akceleruje fermentaci a ta probíhá rychleji a úplně. Je však stále obtížné identifikovat podmínky, během kterých přidaný dusík prodlouží konverzi cukru a zamezuje zastavení fermentace, a to především u moštů s vysokým obsahem cukru. Načasování přídavku amonných solí je velmi důležité. Přídavek před začátkem fermentace způsobí, že kvasinky mají nejlepší podmínky během růstové fáze, kdy je v mediu malé množství alkoholu. Dokáží asimilovat přídavek dusíku (100 mg.l -1 ) z 50 100 %. Zvýšení asimilace dusíku však nutně neznamená zvýšení potenciálu fermentace. To vysvětluje, proč přídavek dusíku neakceleruje finální fázi fermentace či restartování zastavené fermentace. Sablayrolles a kol. (1996) 83 zveřejnili jiné zjištění. Podle těchto autorů je nejvýhodnější přídavek dusíku spolu s provzdušněním uprostřed fermentace. Kombinace těchto operací má daleko větší dopad na kinetiku fermentace, než samotné provzdušnění a ukazuje tak optimální řešení pro eliminaci předčasného ukončení fermentace. 84 Lze konstatovat že, přídavek amonných solí do moštu s nízkým obsahem dusíkatých látek (do 140 mg.l -1 ) zvýší kinetiku fermentace s různým efektem na růst kvasinek a konverzi cukru. Pro maximální efektivitu by neměl celkový dusík po přídavku překročit 200 mg.l -1. Některé experimenty ukázaly zpomalení fermentace nadměrným přídavkem amonných solí. Pokud mošt má dostatečné množství dusíkatých látek, přídavek dusíku pouze akceleruje začátek fermentace, ale efekt se v dalším průběhu ztrácí. Přídavek 53

Teoretická část amonných solí nevyřeší problémy ve finální fázi fermentace moštů s vysokým obsahem cukru či striktně anaerobních podmínek fermentace. Ačkoli přídavek amonných solí usnadňuje fermentaci moštů s nedostatkem dusíku, pro komplexní náhled na problematiku by měl být obsah dusíkatých látek analyzován před zahájením fermentace spolu s množstvím cukru a kyselin. Přídavek kyslíku na začátku fermentace, kdy jsou kvasinky v růstové fázi je stále nejlepší způsob akcelerace a zamezení předčasného zastavení fermentace. Názory na optimální načasování přídavku amonných solí se liší od počátku do poloviny fermentace. V každém případě je přídavek výživy efektivní jako akcelerátor fermentace, než jako prevence před zůstatkem nechtěného zbytkového cukru. 71,85 Přídavky v pozdějších fázích fermentace jsou již bezpředmětné a mohou způsobovat spoustu negativ. 2.6 Metody stanovení Metody stanovení jsou pro pochopení záměrně rozděleny na: - stanovení veškerého asimilovatelného dusíku - stanovení jednotlivých aminokyselin - stanovení amonných iontů. 2.6.1 Metody stanovení veškerého asimilovatelného dusíku V minulosti byla navržena řada metod na měření asimilovatelného dusíku. Je nutné podotknout, že jejich výsledky nejsou vždy jednoznačné a není dosud známo, která z metod je stoprocentně spolehlivá. Metoda FAN (free amino nitrogen) byla poprvé popsána v roce 1972 v EBC (the European Brewing Commission). Metoda využívá jako činidlo ninhydrin, které reaguje spolu s volnou α-aminokyselinou za vzniku CO 2, NH 3 a příslušného aldehydu. Vzorky jsou měřeny na spektrofotometru. Metoda indikuje všechny α-aminokyseliny včetně prolinu, což zkresluje množství asimilovatelného dusíku v moštu. Ninhydrin reaguje částečně také s amonnými ionty. Obdržené výsledky jsou dobrým odhadem indexu 54

Teoretická část výživnosti zkoumaných šťáv (spodní mez detekce 18,1 mg.l -1 ). Metoda je podrobně popsána v experimentální části (viz sekce 5.2.2). Přesnější metoda používající o-ftaldialdehyd (NOPA) 86 je schopna detekovat dusík přítomný v α-aminokyselinách pomocí derivatizace primární aminoskupiny specifickou látkou o-ftaldialdehydem (OPA). Metodou NOPA je detekováno asi 3,5 % amoniových iontů, které jsou druhým hlavním zdrojem asimilovatelného dusíku. Některé zdroje 87 uvádí shodu výsledků metod FAN a NOPA a jiné 88 tuto shodu popírají. Další jednoduchou a poměrně přesnou metodou je formaldehydová titrace spojená s potenciometrickou detekcí. Tato metoda je aparaturně nenáročná a má dosti nízkou spodní mez detekce (8,5 mg.l -1 ) 89,71. Tato metoda bude také podrobně popsána v experimentální části. 2.6.2 Metody stanovení volných aminokyselin Z důvodu rozlišení amonných iontů a jednotlivých aminokyselin a jejich případného vývoje v čase je potřeba složitějších analytických postupů a přístrojů. V této části práce je představeno několik nejběžnějších z nich. Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) Tato metoda pracuje s úzkými kolonami (průměr 2 až 8 mm) k jejichž plnění se používá tříděný materiál s malými částicemi (o průměru 3 až 10 mm). Průtok pohyblivé kapalné fáze zde neprobíhá účinkem gravitace, ale pod tlakem čerpadla. Eluát vytékající z kolony prochází průběžně detektorem, který automaticky a kontinuálně měří některou z fyzikálních vlastností eluátu, např. absorpci v UV nebo viditelné oblasti spektra (spektrofotometrické UV-VIS detektory), fluorescenci (fluorescenční detektory), vodivost (vodivostní detektory), index lomu (refraktometrický detektor) apod. Poloha píku na ose x (retenční čas) charakterizuje kvalitu a výška píku (případně plocha píku) udává kvantitu po srovnání se současně děleným standardem nebo použitím vnitřního standardu. K derivatizaci se nejčastěji používají látky dietyletoxymetylenmalonát (DEEMM), o - ftaldialdehyd (OPA), merkaptoethanol a fenylisothiokyanát (PITC). 55

Teoretická část Předností HPLC je rychlost analýzy, vysoká dělící schopnost, možnost automatické detekce, identifikace a kvantitativního vyhodnocení chromatogramu. Touto technikou je možné dělit i termolabilní a polární látky. V současné době se jedná o metodu nejpoužívanější a její podrobný popis včetně podmínek separace bude popsán v experimentální části. Kapilární zónová elektroforéza Zahrnuje separaci směsi různých ionogenních látek v roztoku průchodem elektrického proudu, detekci zón a následné kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení záznamu signálu. Základní charakteristikou zónové elektroforézy je migrace vzorku v prostředí základního elektrolytu, který vede elektrický proud, ale také pufruje potřebnou vlastnost elektrolytu, např. ph. Složení základního elektrolytu je konstantní podél celé migrační dráhy a nemění se s časem. Díky tomu jsou efektivní mobility a tím i migrační rychlosti složek vzorku konstantní během celé analýzy. Pro separaci je nutné, aby migrační rychlosti různých látek byly navzájem různé. Toho se dosáhne vhodnou volbou základního elektrolytu. Prakticky se postupuje tak, že do kapiláry naplněné základním elektrolytem se dávkuje vzorek a po vložení elektrického napětí mezi konce kapiláry začne protékat elektrický proud. Jednotlivé složky vzorku začnou migrovat navzájem různými rychlostmi, čímž dochází k separaci. Vytvořené zóny separovaných látek procházejí detektorem v různých časech. Kvalitativním údajem je migrační čas, což je doba od startu pro průchod zóny detektorem, anebo odpovídající vzdálenost na záznamu analýzy od startu k maximu detekovaného píku. Provádí se srovnání migračních časů píků analyzovaných látek se standardy analyzovanými za týchž podmínek. Kvantitativní analýza je založena na srovnávání velikosti plochy nebo výšky píku vzorku a standardu. Při stanovení aminokyselin pomocí kapilární zónové elektroforézy je problémem schopnost aminokyselin být podle ph prostředí ve formě kationtů nebo aniontů, není však snadné najít podmínky, při kterých by všechny aminokyseliny migrovaly stejným směrem. Aby putovaly ke katodě, používá se někdy elektroosmóza. Většina aminokyselin neabsorbuje v UV oblasti, je proto nutné připravit deriváty aminokyselin, které mohou být detekovány UV nebo fluorescenčním detektorem. K derivatizaci se používá nejčastěji fenylisothiokyanát (PITC). 56

Teoretická část Nízké meze detekce (10-7 mol.l -1 ), reprodukovatelných migračních časů a vysoké přesnosti dávkování vzorku se dosahuje spojením kapilární zónové elektroforézy s izotachoforézou. Jako derivatizační činidla se používají o-ftaldialdehyd a fluorescein isothiokyanát. Papírová chromatografie (PC) a tenkovrstvá chromatografie (TLC) Rozdělovací chromatografie na papíře je technika, která se dříve používala hlavně pro analýzu aminokyselin a sacharidů v biologických tekutinách. Pro časovou náročnost je dnes její použití omezené. V rutinním provozu se obvykle nahrazuje tenkovrstevnou chromatografií. Rozdělovací chromatografie na papíře využívá různé rozpustnosti dělených látek ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách. Jedna kapalina (nepohyblivá fáze) je zakotvena do chromatografického papíru, který je nosičem, na němž dělení probíhá. Druhá kapalina, která představuje mobilní fázi, se pohybuje po chromatografickém papíře. Látky se dělí na základě rozdělovacích koeficientů definovaných jak poměr koncentrací látky rozpuštěné ve dvou kapalných, vzájemně nemísitelných fázích (vodné a organické). Dělení látek probíhá na chromatografickém papíře, jehož vlákna poutají nepohyblivou kapalnou fázi z atmosféry chromatografické komory. Můžeme si tuto fázi představit jako vlhkost papíru. Pohyblivá kapalná fáze je obvykle organická fáze, do které je zasunut spodní okraj chromatografického papíru s nanesenými vzorky. Přetéká přes nepohyblivou vodnou fázi zadržovanou vlákny papíru. Dělené látky se rozpouštějí ve vodné i organické fázi podle svých rozdělovacích koeficientů a pohybují se různou rychlostí po papíře ve směru toku pohyblivé fáze. Tím dochází k dělení látek v podobě skvrn nebo pásů. Kombinací papírových a sloupcových metod je chromatografie na tenkých vrstvách. Liší se hlavně tím, že zvolený materiál je rozprostřen na skleněné, celuloidové nebo hliníkové podložce, kde tvoří tenkou vrstvu. Využívá principů rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie. V praxi je velmi oblíbená pro svoji rychlost (10 až 30 minut) a jednoduchost provedení. 57

Teoretická část Iontově výměnná chromatografie (IEC) Je založená na výměně iontů mezi pevnou fází (iontoměnič) a mezi vodnou pohyblivou fází. Touto technikou je možné dělit pouze takové látky, které jsou ve vodných roztocích disociovány na ionty. Principem metody je tedy dělení látek iontové povahy podle velikosti svých disociačních konstant a tedy podle velikosti elektrického náboje. Iontoměniče jsou vysokomolekulární látky nerozpustné ve vodě, které mají schopnost provádět výměnu iontů. Podle chemického složení rozlišujeme ionexy anorganické (zeolit tj. alkalicko-hlinité křemičitany) nebo ionexy organické (syntetické pryskyřice např. styren divinylbenzenové kopolymery). Molekula ionexu má na svém povrchu řadu funkčních skupin (např. SO 3 H, NH 2, OH, COOH apod.), podle kterých dělíme iontoměniče na katexy (vyměňují vodíkové ionty za kationty) a anexy (vyměňují hydroxylové ionty za anionty). Výměna iontů je vratný pochod. Dělení probíhá na kolonách, které jsou obvykle temperovány a naplněny iontoměničem. Dělené ionty jsou reverzibilně poutány na jeho funkční skupiny různě velkými elektrostatickými silami. Látky poutané pevněji se budou nacházet v horní části kolony a naopak. Rozdělené látky se ze sloupce uvolní technikou eluční chromatografie (promýváním sloupce pufrem) nebo gradientovou elucí (sloupec se promývá pufry, ve kterých se mění iontová síla a ph). Ionty vázané na iontoměnič se postupně z ionexu vytěsní a nahradí za ionty z pufru. Opouštějí kolonu v pořadí pevnosti vazby nejdříve vytéká látka nejméně pevně vázaná. Frakce jsou odděleně jímány automatickým sběračem frakcí a vyhodnoceny. Pro úspěšné dělení je třeba zvolit správný druh ionexu i velikost jeho částic. Používá se čistých komerčních ionexů pro analýzy. V jiném případě je třeba převést iontoměnič do žádaného cyklu podle návodu výrobce (do vodíkového cyklu proléváním sloupce roztokem kyseliny chlorovodíkové a do hydroxylového cyklu roztokem hydroxidu sodného). Cyklus úpravy je třeba několikrát opakovat. Po barevné reakci rozdělených aminokyselin s ninhydrinem se provádí kontinuální měření absorbance při dvou vlnových délkách, registrované zapisovačem. Primární aminokyseliny dávají s ninhydrinem fialové zbarvení detekovatelné při vlnové délce 570 nm, sekundární aminokyseliny (prolin, hydroxyprolin) zbarvení žluté s maximální absorpcí při 440 nm. 58

Teoretická část Poloha píku (retenční čas na ose x) určuje kvalitu a je pro danou aminokyselinu charakteristická. Z plochy píku pak stanovujeme množství aminokyseliny ve vzorku srovnáním s plochou píku známého množství standardu této aminokyseliny. Nukleární magnetická rezonance (NMR) NMR spektroskopie patří mezi optické metody. Je to nedestruktivní, selektivní metoda schopná simultánní detekce velkého počtu nízkomolekulárních složek v komplexních směsích. Velkou výhodou je jednoduchá a časově nenáročná příprava vzorku. Metoda NMR využívá magnetických vlastností některých atomů, které mohou v magnetickém poli absorbovat elektromagnetické záření, jehož vlnová délka odpovídá radiovým vlnám. Na spektru se získají absorpční maxima, ze kterých můžeme určit strukturu organických látek i jejich konfiguraci. Atomová jádra prvků s lichým protonovým nebo hmotnostním číslem mají magnetický moment a v magnetickém poli se orientují do určitých poloh, kterým odpovídají určité energetické hladiny. NMR využívá pro měření vodík 1 H a uhlík 13 C. Do grafické závislosti se vynáší na osu x chemický posun δ (tj. relativní vyjádření rozdílu mezi polohou signálu standardu a měřené látky), na osu y intenzita naměřeného signálu. Signály aminokyselin ve víně jsou v NMR spektru překryty signály sloučenin ve víně převládajících, tj. voda, ethanol a glycerol, je proto nutno tyto signály potlačit. 2.6.3 Metody stanovení amonných iontů Měření amonných iontů se provádí nejčastěji enzymatickou či spektrofotometrickou cestou. Při enzymatickém stanovení se využívá enzymu glutamátdehydrogenázy. Spektrofotometrické metody Existuje řada spektrofotometrických metod, kde je využíváno specifických reakcí k tvorbě barevných sloučenin. Tímto způsobem lze při různých vlnových délkách kvantifikovat množství amonných iontů v měřeném vzorku. 59

Teoretická část Stanovení s Nesslerovým činidlem Stanovení je založeno na reakci amoniaku a hydroxidu alkalických kovů s tetrajodortuťnatanem sodným nebo draselným za vzniku Millonovy báze (oxodimerkuriaminjodid). Uvedený jodid je málo rozpustná žlutohnědá sloučenina, která za podmínek stanovení při nízkých koncentracích amoniaku vytváří žlutohnědé koloidní roztoky, které lze fotometricky vyhodnotit. Metoda je vhodná ke stanovení amonných iontů v koncentraci od 0,05 až 4 mg.l -1. Iontově selektivní metody Při iontově selektivních metodách je využito migrace kladně nabitých amonných iontů v elektrickém poli a jejich následná kvantifikace dle kalibrační křivky. Do iontově selektivních metod patří také izotachoforéza, která bude popsána podrobně v experimentální části (viz kapitola 5.2). 60

Cíl práce 3. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo zjistit běžné koncentrace asimilovatelného dusíku ve velkém počtu hroznů z různých vinařských podoblastí jižní Moravy v ročnících 2007 a 2008. Dále bylo cílem porovnat množství asimilovatelného dusíku v hroznech odrůd Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené v ročnících 2007 a 2008 pro různé vinařské podoblasti, agrotechnické podmínky a odlišné podnože Kober 5 BB a SO 4. Vždy varioval jeden faktor a ostatní ovlivňující faktory byly fixovány. Následně byla ve stejných variantách sledována změna asimilovatelného dusíku (před a po fermentaci). U všech pokusů byl měřen současně obsah amonných iontů a cukernatost. U mladých vín bylo monitorováno množství kyseliny octové v souvislosti s obsahem výživy během fermentace, z čehož bylo cílem vyvodit důsledky nedostatečného či naopak nadměrného množství výživy pro průběh fermentace a vznik post-fermentačních produktů. Sekundárním cílem bylo zjištění vlivu asimilovatelného dusíku na průběh fermentace za přítomnosti dvou různých druhů komerčně dostupných kvasinek S. cerevisiae. V průběhu alkoholové fermentace byl u těchto vzorků sledován vývoj jednotlivých aminokyselin se zaměřením na pořadí a dynamiku utilizace. Posledním cílem práce bylo porovnat ninhydrinovou metodu FAN a formaldehydovou titraci u dostatečně průkazného počtu analýz a vyvodit shodu či neshodu jejich výsledků. 61

Design pokusu 4. DESIGN POKUSU Kvůli rozdílným požadavkům na příjem dusíku tvoří vybrané odrůdy Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. Z důvodu odlišné srážkové činnosti a půdních vlastností jsou vzorky odebírány ze dvou různých vinařských podoblastí, Mikulovské a Znojemské. Dalším sledovaným vlivem je střídavé zatravnění meziřadí oproti meziřadí nezatravněnému. Z hlediska studia vlivu jednotlivých podnoží révy jsou sledovány podnože Kober 5 BB a SO 4, jejichž rozdíl v příjmu dusíku by měl být markantní a představují současně podnože často využívané v daných lokalitách. Pro maximální srovnávací schopnost je vždy zafixován zbytek sledovaných faktorů ovlivňujících měření. Příklad: Vzorek 1 tvoří odrůda Ryzlink rýnský z Mikulovské podoblasti, střídavě zatravněné meziřadí, na podnoži Kober 5 BB. Vzorek 2 odrůda Veltlínské zelené z Mikulovské podoblasti, střídavě zatravněné meziřadí, na podnoži Kober 5 BB atd. Tabulka 3: Plán jednotlivých variant pro rok 2007 a 2008. Oblast Zatravnění Podnož Odrůda 1 RR Kober 5 BB VZ 2 3 S RR 17 SO 4 4 VZ 18 5 RR M Kober 5 BB 6 VZ 7 N RR SO 4 8 VZ 9 RR Kober 5 BB 10 VZ 11 S RR SO 4 12 VZ 13 RR Kober 5 BB 14 Z VZ 15 N RR SO 4 VZ 16 62

Design pokusu Tím je získáno 16 základních variant v roce 2007 a tentýž počet v roce 2008. Další 4 varianty v každém roce představují dvojice moštů (3 a 4) zakvášených pomocí dvou druhů kvasinek. Zde je sledován vývoj aminokyselin v pěti bodech fermentace (varianty 17 a 18). Tento design pokusu vyústil v 52 vzorků (16 variant před a po fermentaci plus 4 varianty v pěti bodech fermentace) v roce 2007 a stejného počtu v roce 2008. Bohužel se 4 varianty (viz Tabulka 3 - červeně vyznačené) nepodařilo zajistit a tím se počet vzorků omezil na 44 (12 variant před a po fermentaci plus 4 varianty v pěti bodech fermentace). Odběr vzorků dle designu pokusu viz Přílohy. Z 12 variant bylo každý rok vyrobeno 14 vín, přičemž dvě varianty (3 a 4) byly zakvašeny pomocí dvou druhů kvasinek. V součtu bylo v každém roce provedeno 24 měření cukernatosti, 48 měření celkového asimilovatelného dusíku (před a po fermentaci), 24 měření amonných iontů (před fermentací) a 24 měření kyseliny octové (po fermentaci). Všechny rozbory měly dvě opakování. Dále 20 měření sedmnácti nejzastoupenějších aminokyselin. V součtu bylo provedeno 280 různých měření ve dvou letech. Posledním cílem práce bylo porovnání metod FAN detekce na základě ninhydrinových komplexů a formaldehydové titrace. U metody využívající ninhydrin byla vytvořena kalibrační řada. Dále byla tato metoda testována na odezvu aminokyselin s různým počtem atomů dusíku v molekule. Šlo o aminokyseliny L - alanin, L - lysin a L - arginin. U formaldehydové titrace nebyla nutná kalibrace a metoda tak byla testována pouze na odezvu amonných iontů. 63

Experimentální část 5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1 Materiál 5.1.1 Výběr podnože Kober 5 BB. Roste bujně v podnožové vinici a na ni naštěpované evropské odrůdy mají také bujný růst. Postupně se zakládají podnožové vinice jen z osvědčených viruprostých klonů této podnože. Z našeho šlechtění je zapsán v SOK klon MO XVI/50. Z německých klonů jsou nejznámější a nejvíce využívané 13 Gm, Fr. 148, Wü 137, 101 N. V rakousku vznikl z původních výsadeb F. Kobera ve Wiener Neustat klon vyšlechtěný J. Weissem, který nese označení opírající se o původní materiál: V. Berlandieri x V. Riparia Teleki, Selektion Kober Nr. 5 BB, Klon A 3/12 Weiss. Vzdornost proti révokazu je dobrá, proti háďátkům velmi dobrá, proti vyššímu obsahu vápna v půdě je v sušších půdách dostatečná, proti suchu je střední až vyšší. Osvědčuje se nejlépe na hlinitých i štěrkovitých půdách ve vlhkých oblastech a při nižším obsahu aktivního vápníku. Podnož Kober 5 BB je vhodná hlavně pro plodné odrůdy, které nejsou náchylné na sprchávání květenství a které nemají příliš plodný růst: Ryzlink vlašský, Müller- Thurgau, Veltlínské zelené, Sylvánské, Rulandské, Chardonnay, Modrý portugal a André. Při intenzivním pěstování révy je nutno vzít v úvahu, že odebírá z půdy přednostně dusík a fosfor a jen omezené množství draslíku a hořčíku, což může vést k nevyrovnané výživě. Projevuje se to pak často totálním vyčerpáním keřů a jejich odumíráním, a to hlavně na půdách pro ni méně vhodných, kde je obsah aktivního vápníku vyšší než 10 % za současného působení vyšší vlhkosti. Hodí se hlavně pro půdy neutrální, případně s kyselou reakcí, kde je lepší příjem draslíku. V nových výsadbách by se měly používat jen osvědčené a viruprosté klony podnože a vyloučit staré mateční vinice se širokou populací různých typů této podnože. Při předrychlování štěpů na této podnoži je třeba k vytvoření kalusu středně vysoká teplota (26 28 C). Oppenheim SO 4. V podnožové vinici roste středně bujně. Naštěpované odrůdy na ní rostou též středně bujně. V podnožové vinici vyzrává réví brzy a dobře. Urychluje 64

Experimentální část zrání hroznů a vyzrávání dřeva naštěpovaných odrůd. Má velmi dobrou vzdornost proti révokazu a háďátkům. Má velmi dobrou odolnost proti vysokému obsahu vápna v půdě (do 20 %). Je však málo suchovzdorná, a proto se hodí do hlinitých, rovnoměrně vlhkých půd. Nehodí se pro lehké a málo úrodné půdy, ani pro půdy vysychavé. Je vhodná pro všechny jakostní odrůdy a zejména pro takové, které jsou náchylné na sprchávání nebo příliš bujně rostou. Většina odrůd pro výrobu jakostních vín na ní dosahuje nejlepších výsledků. Plodné odrůdy se na ní mohou pěstovat jen v dobrých půdních podmínkách a při dobré výživě. Je vhodná i pro sklepníkovou kulturu révy vinné. V SOK je zapsán klon SO 4 PO 07. Tato podnož, která pochází z původní podnože Teleki 4, byla vyšlechtěna ve vinařské škole a pokusném ústavu v Oppenheimu. Tam vznikla též její mutace, která má obojaké květy a přináší drobné plody. Byla nazvána Binova a je poněkud bujnějšího růstu, urychluje zrání plodů i dřeva a má ještě vyšší odolnost proti vápnu (do 30 % aktivního vápníku). Tyto podnože byly vybrány z důvodu jejich rozdílného příjmu dusíku a bujnosti růstu. Jsou také jedny z mála, které mají tradici ve výsadbách ve vybraných vinařských podoblastech a tudíž byly vybrané naštěpované odrůdy relativně dostupné. 5.1.2 Výběr odrůdy Ryzlink rýnský je typickou odrůdou severních vinařských oblastí. Předpokládá se, že vznikl v Porýní jako samovolné křížení lesní révy s některým kultivarem dovezeným do tamní oblasti Římany. Raší pozdě, takže někdy unikne jarním mrazíkům, roste bujně, ve stáří středně, hrozny vyzrávají velmi pozdě, ale jejich jakost se dá vystupňovat pozdními sběry, které patří ke zvláštnostem vín vyráběných z této odrůdy. Je poměrně vzdorný proti houbovým chorobám, jen plíseň šedá napadá snadno třapinu, a to již před kvetením. Je proto vhodné použít přípravky proti plísní šedé před kvetením, případně po nasazení bobulí a před uzavřením hroznů. Trpí také fyziologickým vadnutím třapiny, hlavně při jednostranném přehnojením dusíkem a draslíkem, kdy se objeví bujný růst a zhoršený příjem vápníku a hořčíku. Platí to zvláště na kamenitých a suchých půdách, kam se často vysazuje. Ryzlink rýnský je velmi náročnou odrůdou na polohu. Vyžaduje jen jižní svahy do 200 m nadmořské výšky. Nároky na půdu jsou malé. Vhodné jsou podnože SO 4, 5 C, 125 AA, K 1, G 26. Nesmí se vysazovat na bujné podnoži do dobré půdy, pak sprchá. 65

Experimentální část Svědčí mu větší vzdálenosti výsadby a řez na tažně, jejichž délka musí být volena tak, aby nevznikaly krátké letorosty s řídkými hrozny. Vhodné zatížení se pohybuje od 8 do 12 oček na m 2 v závislosti na prošlechtění materiálu a požadavku na jakost hroznů. Vyžaduje vyrovnané hnojení a opatrnou aplikaci dusíku. Nesmí se hnojit čerstvým hnojem, používá se rozleželý kompost. Hlavní předností je vysoká odolnost proti mrazům, pravidelné sklizně, malá pracnost při ošetřování keřů, menší náchylnost k houbovým chorobám a výborné víno. Nedostatky jsou v pozdním zrání, náchylnosti na onemocnění třapiny a sklon ke sprchávání. Ryzlink rýnský se řadí mezi světově uznávané nejlepší odrůdy pro výrobu jakostních vín. Veltlínské zelené raší poměrně brzy, má středně bujný růst a hrozny vyzrávají pozdě. List je středně velký, pětilaločný, se středně hlubokými zářezy, vrcholky letorostů jsou bílé plstnaté. Hrozny jsou velké, křídlaté, se středně velkými bobulemi, zelené nebo zeleno-žluté barvy, v závislosti na prošlechtění jsou husté nebo řídké či sprchlé. Odolnost proti peronospoře je nižší, plísní šedou trpí málo, odolnost proti oidiu je střední. Zimními mrazy trpí středně, jarními více. Odrůda vyžaduje velmi dobré polohy a nejvhodnější jsou půdy hluboké, sprašové nebo hlinité, s dostatečnou vodní jímavostí. Dává dobré výsledky hlavně z osvědčeného klonového materiálu na podnožích Kober 5 BB, CR 2, K 1, SO 4. Odrůda je vhodná pro Guyotův řez s jedním tažněm nebo pro vedení Vertiko s velmi krátkým řezem na čípky, případně i pro Moserovo vedení s řezem na střídavé čípky. Zatížení odpovídá v rozmezí 4 6 oček na m 2. Na vápenitých půdách trpí chlorózou. Sklizně jsou vysoké a pravidelné. Víno je pepřnatě kořenité, někdy hořkomandlové, jindy s lipovou vůní na sprašových půdách. Je osvěžující příjemnými kyselinkami, pobízivé chuti a dosahuje výborné jakosti jen z velmi dobře vyzrálých hroznů, které zrají pomalu vzhledem ke své velikosti. Pro odrůdu je důležité sledovat pečlivě vývoj podmínek pro infekci houbovými chorobami koncem července, kdy je nejnáchylnější. 12 Tyto odrůdy byly vybrány z důvodu jejich rozdílného příjmu dusíku a bujnosti růstu ve prospěch odrůdy Veltlínské zelené. Mají také tradici ve výsadbách ve vybraných vinařských podoblastech a tudíž byly relativně dostupné. 66

Experimentální část 5.1.3 Výběr vinařské podoblasti Mikulovská vinařská podoblast Mikulovskou vinařskou podoblast charakterizují vápencové elevace Pavlovských vrchů. Na jejich úbočích a v širším okolí jsou rozšířeny vápenité jíly, písky i mohutné sprašové návěje. Město Mikulov se v minulosti stalo významným vinařským střediskem díky výborným viničním polohám, jak v bezprostřední blízkosti města, tak v mnoha obcích v okolí, z nichž vynikly zejména Valtice ozdobené zámkem, v jehož sklepeních se nachází Národní salon vín. Ve Valticích je i naše nejstarší vinařská škola. Středem zdejší krajiny je Pálava - poslední výběžek vápencových Alp a perla vsazená na okraj lužních lesů dolního Podyjí. Tato chráněná krajinná oblast spolu s lednicko-valtickým areálem zve k výletům do přírody a k zastavení u dobrého vína v četných vinárnách a soukromých sklepech. Význačné postavení díky kvalitě vín si tu získaly již ve středověku obce Sedlec, Dolní Dunajovice, Pavlov, Perná, Dolní a Horní Věstonice, Novosedly a Brod nad Dyjí. Na vápenitých půdách v okolí Pálavy vyzrává Ryzlink Vlašský do význačné jakosti odrůdového vína s nezaměnitelným charakterem zvláštní minerálnosti, která vynáší nenapodobitelnou souhrou pobízivou strukturu vín této staré odrůdy, která tu našla svůj pravý domov. Výbornou jakostí tu vynikají i Rulandské bílé a Chardonnay. V hlinitějších půdách Dunajovických vrchů se k Ryzlinku vlašskému přidává další odrůda typická pro Mikulovsko - Vetlínské zelené. Na méně vhodných polohách to je i Müller Thurgau a na Valticku Neuburské a Sylvánské zelené. Severně od Pálavy se nachází obce Strachotín, Pouzdřany a Popice známé víny Ryzlinku Rýnského, Tramínu a Pálavy, která vznikla na Šlechtitelské stanici vinařské v Perné, podobně jako odrůda Aurelius. Znojemská vinařská podoblast Podoblast je součástí Lechovického bioregionu. Uplatňuje se v ní západní proudění a dešťový stín Českomoravské vysočiny spolu s občasnými vpády chladnějšího vzduchu. Tím se zpomalí vegetace ve prospěch zvýraznění aromatických látek v období zrání hroznů. Na jihu se vyskytuje štěrkopískové terasy a návěje spraší. Na severu přechází území kolem Dolních Kounic do prvohorních útvarů Brněnského masivu. 67

Experimentální část Město Znojmo bylo vždy význačným vinařským střediskem a dokládá to spleť dlouhých chodeb vinných sklepů přímo pod městem. V blízkosti města se táhnou prvotřídní viniční polohy od Kraví hory směrem na Hnánice se štěrkovým podložím překrytým místně spraší, případně i s polohami jílů. Od Znojma na jih se táhne podél hranice s Rakouskem řada známých viničních tratí přes Šatov, Chvalovice, Vrbovec, Hnízdo, Slup, Jaroslavice až do Hrušovan nad Jevišovkou, většinou s půdami sprašovými nebo štěrkopísky. Na východ podél Dyje jsou viniční svahy v Tasovicích a Hodonicích. Ve střední části Znojemska leží několik význačných viničních celků na Únanovce a Jevišovce se známými vinařskými obcemi Těšetice, Lechovice, Borovice. Velký areál vinic v okolí Hostěradic a Miroslavi je znám polohami Volné pole a Weinperky. Podoblast je hlavně známa bílými aromatickými víny. Bílé odrůdy tu jsou na ploše 2365 ha. Podle rozšíření jsou zastoupeny hlavně Veltlínské zelené, Müller Thurgau, Ryzlink rýnský, Sauvignon, Ryzlink vlašský, Rulandské bílé. Z výrazně aromatických odrůd to je hlavně Tramín, Pálava a Muškát Moravský. Modré odrůdy jsou na ploše 1064 ha a to hlavně Svatovavřinecké, Frankovka, Rulandské modré a Zweigeltrebe. 5.1.4 Výběr agrotechnických podmínek Z agrotechnických podmínek byly vybrány dvě varianty a to střídavé zatravnění a nezatravněné meziřadí. Smysl tohoto výběru tkví v možné konkurenci půdního porostu a tudíž sníženému odběru dusíku z půdy a v dostupnosti ve zvolených vinařských podoblastech. 5.1.5 Materiál, metodika zpracování a odběr vzorků Tabulka 4 znázorňuje původ jednotlivých hroznů. Červeně označené varianty se nepodařilo zajistit. Hrozny byly odebrány z velkého počtu keřů pro zajištění objektivity. Následně byly ručně odstopkovány a rozmačkány. Minimální hmotnost bobulí bez třapin činila 5 kg pro každou variantu. Po šetrném lisování na mechanickém lisu byl mošt sířen na 40 68

Experimentální část mg.l -1 SO 2 a odkalen spontánní sedimentací (12 hodin v chladu). Následovalo zamražení moštů na 18 C. Po rozmražení byly odebrány první vzorky moštů (před fermentací). Poté byly mošty přelity do nádob o objemu 2 l a očkovány čistou kulturou kvasinek BS universální bílé (krom variant s různým druhem kvasinek). Kvašení probíhalo při sklepní teplotě cca 12 C. Krom variant 17 a 18 (odběry během fermentace) proběhly odběry po fermentaci ve fázi ukončení produkce oxidu uhličitého. Tabulka 4: Odběrná místa materiálu. Oblast Zatravnění Podnož Odrůda Zdroj Vinselekt Michlovský a.s. 1 RR Rakvice Kober 5 BB Vinselekt Michlovský a.s. 2 VZ Rakvice 3 S Vinselekt Michlovský a.s. RR Rakvice SO 4 Vinselekt Michlovský a.s. 4 VZ Rakvice 5 RR ----------------- M Kober 5 BB Mojmír Baroň st. 6 VZ Lednice Školní zemědělský 7 N RR podnik Lednice SO 4 Josef Smetana 8 VZ Lednice ÚKZÚZ 9 RR Oblekovice Kober 5 BB ÚKZÚZ 10 VZ Oblekovice 11 S ÚKZÚZ RR Oblekovice SO 4 ÚKZÚZ 12 VZ Oblekovice 13 Z RR ----------------- Kober 5 BB 14 VZ ----------------- Ladislav Kříž 15 N RR SO 4 Vrbovec VZ ----------------- 16 69

Experimentální část Varianty 17 a 18 (viz kap. 4) byly zakvašeny pomocí dvojice různých komerčně dostupných kvasinek S. cerevisiae - BS universální bílé a BS 2 aromatické. Odběry v pěti bodech fermentace probíhaly dle následujícího schéma. Odběr 1 2 3 4 5 Hodiny od zákvasu 2 26 50 74 98 5.2 Metody měření Metody měření byly zvoleny na základě dostupnosti analytických přístrojů v laboratoři ústavu vinohradnictví a vinařství a na základě zkušeností s danými metodami. Všechny použité analytické metody patří do referenčních metod a tudíž je jejich spolehlivost více než dostačující. 5.2.1 Stanovení cukernatosti refraktometrem Princip: Obsah cukru v moště stanovíme na základě měření indexu lomu světla refraktometrem jako rozpustnou sušinu moštu vyjádřenou v hmotnostních % sacharózy. Přístroje a pomůcky: Refraktometr měřící s přesností 0,1 % rozpustné sušiny nebo index lomu na čtyři desetinná místa, kalibrovaný při 20 C. Postup: Zkoušený mošt temperujeme na 20 C a filtrujeme (20-25 ml) přes složenou suchou gázu do 25 ml kádinky (první podíly filtrátu se nejímají). Odměříme teplotu filtrátu s přesností na 0,5 C. Stanovíme hmotnostní % rozpustné sušiny filtrátu s přesností 0,1 %. Měření několikrát opakujeme. Provedeme korekci jednotlivých výsledků podle tabulky korekčních hodnot koncentrace rozpustné sušiny měřené refraktometricky vyjádřené v hmotnostních % sacharózy podle teploty měření. 70

Experimentální část Vyhodnocení: Jednotlivá měření statisticky zpracujeme a na základě stanovení obsahu rozpustné sušiny nalezneme koncentraci redukujících cukrů v testovaném moště. 5.2.2 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) formaldehydovou titrací Protože aminokyseliny mají amfoterní povahu, není možné použít k jejich stanovení běžné acidometrické nebo alkalimetrické titrace. Aminoskupinu však lze zablokovat, např. reakcí s formaldehydem: 2 HCHO + NH 2 -CHR-COOH 2(HO-CH 2 -) 2 N-CHR-COOH (dimethylolaminoskupina) Pak se plnou měrou uplatní kyselý charakter karboxylové skupiny. Takto modifikované aminokyseliny můžeme titrovat hydroxidy podobně jako např. kyselinu octovou. Roztoky a materiál: 0,1 M a 0,01 M vodný roztok hydroxidu sodného. Neutrální roztok formaldehydu: k 50 ml 40 % formaldehydu přidáme 1 ml 0,5 % alkoholického roztoku fenolftaleinu. Následně přidáme 0,01 M NaOH až do slabě růžového zbarvení. 0,5 % alkoholický roztok fenolftaleinu. Pracovní postup: 10 ml vzorku zneutralizujeme 0,1 M roztokem NaOH a přidáme 5 ml neutrálního roztoku formaldehydu. Následně směs titrujeme 0,01 M roztokem NaOH do růžového zbarvení (bod ekvivalence ph 8,8). Vyhodnocení: Pomocí spotřeby roztoku NaOH vypočítáme ekvivalentní množství aminodusíku. 71

Experimentální část 1 ml 0,01 M NaOH odpovídá 0,14 mg N. Údaj v mg N byl přepočítán na objemovou jednotku původního vzorku: x = a*0,14*100*f x množství dusíku v mg N.l -1 a spotřeba roztoku NaOH v ml f faktor roztoku NaOH Chemikálie: NaOH (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR) fenolftalein (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR) formaldehyd (c = 40 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR) Formaldehydová metoda současně detekuje část amonných iontů (80-120 %), které reagují s formaldehydem za vzniku hexamethylentetraaminu a příslušného množství oxoniových iontů. 5.2.3 Stanovení celkového asimilovatelného dusíku (α-dusíku) spektrofotometricky po derivatizaci ninhydrinem Pro měření asimilovatelného dusíku byla použita ninhydrinová metoda. Tato metoda byla poprvé zveřejněna roku 1948 (Moore a Stein, 1948) 90. Od té doby prošla tato metoda mnohými úpravami vedoucí k jejímu zjednodušení a přizpůsobení pro různý původ vzorků. V literatuře lze najít různé kombinace experimentálních podmínek. Ke zjednodušení metody, komplikovaných experimentálních podmínek a zvýšení efektivnosti výrazně přispěla práce. 91 Tato práce se zabývá vztahem doby ohřevu, ph a kompozicí pufrů na formování barevných sloučenin. Pracovní postup: Příprava 4N pufru octanu sodného byla provedena přídavkem kyseliny octové do hydroxidu sodného. 92,93 Pro upravení ph pufru byl použit roztok hydroxidu sodného resp. kyseliny chlorovodíkové. 72

Experimentální část V 75 ml dimetylsulfoxidu (DMSO) bylo rozpuštěno 2 g ninhydrinu a 0,3 g hydrindantinu. Po přidání 25 ml pufru octanu sodného byl roztok umístěn do lednice při 4 C. Čerství roztok ninhydrinu byl připraven každý pracovní den. Roztok aminokyselin (1 ml) a ninhydrinu (1 ml) byl nastříknut do zkumavky a ohříván ve vroucí vodní lázni po dobu 10 min. Po zahřátí je roztok neprodleně zchlazen v ledové lázni. Po přidání 5 ml 50 % alkoholu je vzorek řádně protřepán a absorbance je měřena při 570 nm na spektrofotometru. Od každého vzorku byly provedeny dva nezávislé experimenty a výsledná hodnota byla tvořena průměrem těchto hodnot. Kalibrace byla vytvořena komerčně dostupným softwarem lineární regresí metodou nejmenších čtverců. Ninhydrinová metoda současně detekuje část amonných iontů (30 35 %). Přístroje a chemikálie: spektrofotometr (HELIOS γ, Thermo electron, Velká Británie) kyseliny chlorovodíková (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR) NaOH (čistota 99,5 %, Lach-Ner, s.r.o, ČR) dimethylsulfoxid (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR) ninhydrin (Sigma Aldrich, USA) hydrindantin (Sigma Aldrich, USA) 5.2.4 Stanovení amonných iontů a kationtů elektromigrační metodou Princip: Izotachoforéza je moderní analytická separační technika. Umožňuje analyzovat směsi ionogenních látek v roztocích a získat v krátké době (obvykle 4 až 40 minut) snadno vyhodnotitelné údaje o kvalitativním i kvantitativním složením vzorku. Běžná chyba kvantitativního stanovení je 1 3 %, v řadě případů je však dosažitelná chyba nižší. Izotachoforéza pracuje s malým množstvím vzorku a zpravidla umožňuje stanovit již desítky ng látek, což při nástřiku jednotek až desítek µl vzorku vede k analyzovatelným koncentracím na úrovni desítek až jednotek ppm. Izotachoforéza náleží mezi elektroforetické techniky: je založena na migraci nabitých částic v elektrickém poli. Specifikem metody je přítomnost ostrých zónových rozhraní 73

Experimentální část oddělujících odseparované zóny jednotlivých čistých složek vzorku, které migrují za sebou stejnou rychlostí (odtud název izo-tacho). K potlačení elektroosmózy je využíváno přídavku hydroxypropylmetylcelulózy (HPMC). Úprava vzorku: Ředění vzorku 1/100. V případě nutnosti byl vzorek zbaven volného oxidu uhličitého zahřátím nebo ultrazvukem. Před analýzou bylo nutné odstranit mechanické nečistoty filtrací nebo odstředěním. Detekční limity jsou pro amonný ion 0,2 mg.l -1, pro draslík 0,4 mg.l -1, pro sodík a vápník 0,2 mg.l -1 a pro hořčík 0,1 mg.l -1. Podmínky analýzy: Vedoucí elektrolyt: 5 mm H 2 SO 4 + 7 mm-18-crown-6 + 0,1 % HPMC Koncový elektrolyt: 10 mm (1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan) BTP Hnací proud: počáteční 100 µa, koncový 50 µa Doba analýzy: 10 minut Mód analýzy: kationický Přístroje a chemikálie: Isotachoforéza (Ionosep 2003, Recman, ČR) kyseliny sírová (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR) kyselina 18-crown-6 (Sigma Aldrich, USA) HPMC (Sigma Aldrich, USA) BTP (Sigma Aldrich, USA) 5.2.5 Stanovení kyseliny octové elektromigrační metodou Úprava vzorku: Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 1 ml vína a 1 ml 30 % peroxidu vodíku (odstranění siřičitanu, který migruje ve směsné zóně s jantaranem). Baňka se doplní po značku a roztok se analyzuje bez dalších úprav. Jelikož se přítomný siřičitan oxiduje peroxidem vodíku na síran, je nutné pro kvantitativní analýzu síranu analyzovat ještě 74

Experimentální část 100x zředěný roztok vína bez přídavku peroxidu vodíku. V případě analýz perlivých vín je nutno zbavit vzorek volného oxidu uhličitého zahřátím nebo ultrazvukem. Detekční limity pro 100x ředěný vzorek se pohybují od 50 do 200 mg.l -1. Podmínky analýzy: Vedoucí elektrolyt: 10 mm HCl +5,5 mm BTP + 0,1 % HPMC (ph 6,2) Koncový elektrolyt: 5 mm MES (kyselina morfolinethansulfonová) Hnací proud: počáteční 70 µa, koncový 30 µa Doba analýzy: 20 minut Mód analýzy: anionický Přístroje a chemikálie: Isotachoforéza (Ionosep 2003, Recman, ČR) kyseliny chlorovodíková (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR) HPMC (Sigma Aldrich, USA) BTP (Sigma Aldrich, USA) MES (Sigma Aldrich, USA) 5.2.6 Stanovení aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s předkolonovou derivatizací Při stanovení aminokyselin je mobilní fází demineralizovaná voda a acetonitril. Aminokyseliny se převádí před analýzou na stabilní derivát, který neintegruje s nosičem. Mezi hlavní výhody HPLC patří především rychlost, účinnost, automatizovatelnost, snadná kvantifikovatelnost výsledků a reprodukovatelnost. Mobilní fáze je kapalina a může být jenosložková nebo vícesložková. V této práci byla použita vícesložková s gradientovou elucí. Výhodou gradientové eluce je vyšší citlivost, lepší rozdělení složitějších směsí a kratší čas analýzy. Pro analýzu byl použit Waters Alliance HPLC systém se separačním modulem 2695. Tento modul ovládá programování metody, složení a průtok mobilní fáze, průtok kapaliny pro oplach těsnění pístů a jehly, dávkování vzorků, průtočné odplyňování, činnost externích detektorů, vyhřívání kolony, vyhřívání a chlazení vzorků a umožňuje ukládání metod. Režim externího řízení je zajištěn chromatografickým programem Empower. 75

Experimentální část Přístroje: ultrazvuková lázeň demineralizátor (Mili-Q) třepačka vakuová odparka vortex kapalinový chromatograf Waters Alliance HPLC systém Podmínky Waters Alliance 2695: Kolona: AccQ Tag Amino Acid Analysis (4 µm Nova-Pak C18, 3,9 mm 150 mm) Detektor: fluorescenční (excitační vlnová délka 250 nm, emisní 395 nm) Mobilní fáze: A 100 ml AccQ Tag eluent (acetát-fosfátový pufr) v 1 l demineralizované vody B acetonitril C demineralizovaná voda (18 MΩ) Průtok: 1 ml.min -1 Nástřik: 10 µl Teplota: 37 C Max tlak: 4000 psi (26 MPa) Doba analýzy: 53 minut Doba zdržení rozpouštědla: 20 minut Gradient: Čas (min) Průtok (ml.min -1 ) % A % B % C počáteční 1,0 100 0 0 0,5 1,0 99 1 0 18,0 1,0 95 5 0 19,0 1,0 91 9 0 29,5 1,0 83 17 0 33,0 1,0 0 60 40 36,0 1,0 100 0 0 65,0 1,0 0 60 40 100,0 0,0 0 60 40 76

Experimentální část Chemikálie: kyseliny chlorovodíková (c = 0,1 mol.dm -3, Penta, ČR) kyselina α-aminomáselná (Sigma Aldrich, USA) borátový pufr (AccQ Taq Eluent A koncentrát, Waters Corporation, USA) methanol (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR) acetonitril (čistota HPLC grade, Lach-Ner, s.r.o, ČR) odplyněná demineralizovaná voda derivatizační činidlo Waters AccQ Fluor (6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl karbamát, Waters Corporation, USA) Příprava vzorku: Do 100 ml Erlenmayerovy baňky bylo napipetováno 10 ml vzorku a 12 ml methanolu, baňka byla zakryta alobalem a přes noc byl vzorek deproteinován v mrazáku. Druhý den byl vzorek přefiltrován do hruškové baňky a na odparce vyhřáté na 50 C byl odpařen do sucha, poté byl vložen do exikátoru (min. 2 hodiny). Odparek byl rozpuštěn v 0,1 M HCl a roztok převeden do 50 ml odměrné baňky, následováno přídavkem 2 ml vnitřního standardu. Poté byl roztok přefiltrován přes mikrofiltr do vialek a následovala derivatizace vzorku. Příprava standardu: Bylo naváženo 6,45 mg kyseliny aminomáselné do 25 ml baňky, obsah byl doplněn po rysku demineralizovanou vodou (2,5 mm roztok). Pak bylo do vialky napipetováno 40 µ L vnitřního standardu, 40 µ L standardní směsi aminokyselin a 920 µ L demineralizované vody. 5.2.7 Meteorologická data Znojemsko má velmi teplé mezoklima s dešťovým stínem z Českomoravské vrchoviny, odkud občas sestupuje chladný vrchovinný vzduch a retarduje vegetaci. Je považováno za extrémně suchý region. Mikulovsko je nejtypičtějším panonským bioregionem, v němž vystupuje z Mikulovské pahorkatiny Pálava jako bradlo tvořené jurskými vápenci, obklopené 77

Experimentální část křídovými sedimenty a s místním zastoupením spraší. Srážková činnost je zde z důvodu pálavských vrchů dosti nesourodá. V roce 2007 a 2008 byla posbírána meteorologická data z obou vinařských podoblastí. Konkrétně šlo o stanoviště Mikulovsko Březí, Znojemsko Oblekovice. V rámci experimentu byl sledován úhrn srážek a denní teploty pro vegetační období, tj. v měsících duben až říjen. Veškerá meteorologická data viz Přílohy. V roce 2007 činil v Oblekovicích pro období duben až říjen úhrn srážek 346,6 mm, průměrná denní teplota byla 16,37 C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 17. 160 140 120 Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2007 - Oblekovice srážky teplota vzduchu 25 20 Úhrn srážek [mm] 100 80 60 15 10 Teplota [ o C] 40 20 5 0 Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen 0 Graf 17: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2007. Na stanovišti v Březí činil úhrn srážek za stejné období 403,58 mm a průměrná teplota byla 16,36 C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 18. 78

Experimentální část 160 140 120 Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2007 - Březí srážky teplota vzduchu 25 20 Úhrn srážek [mm] 100 80 60 15 10 Teplota [ o C] 40 20 5 0 0 Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen Graf 18: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2007. V roce 2008 činil v Oblekovicích pro období duben až říjen úhrn srážek 363,5 mm, průměrná denní teplota byla 15,34 C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 19. 79

Experimentální část 120 100 Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2008 - Oblekovice srážky teplota vzduchu 25 20 Úhrn srážek [mm] 80 60 40 15 10 Teplota [ o C] 20 5 0 Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen 0 Graf 19: Meteorologická data ze stanice Oblekovice pro vegetační období v roce 2008. Na stanovišti v Březí činil úhrn srážek za stejné období pouze 262,4 mm a průměrná teplota byla 16,95 C. Průměry teplot a úhrny srážek jsou znázorněny viz Graf 20. 80

Experimentální část 120 100 Měsíční úhrny srážek a průměrné teploty vzduchu v roce 2008 - Březí srážky teplota vzduchu 25 20 Úhrn srážek [mm] 80 60 40 15 20 0 Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen 10 Teplota [ o C] 5 0 Graf 20: Meteorologická data ze stanice Březí pro vegetační období v roce 2008. Srovnání meteorologických dat z obou stanic ukazuje, že v roce 2007 byl úhrn srážek pro Znojemskou vinařskou podoblast nižší a to především v nejdůležitějších měsících červen, červenec, srpen a září. Naopak v roce 2008 byl úhrn srážek výrazně nižší pro Mikulovskou vinařskou podoblast. Tato data potvrzují značnou ročníkovou nesourodost srážkové činnosti napříč ročníky pro obě oblasti. 81

Výsledky 6. VÝSLEDKY 6.1 Asimilovatelný dusík v moštech z jižní Moravy Ke zpracování dat byly použity komerčně dostupné softwary EXCEL a STATISTICA verze 9,0. Z důvodu velkého množství dat a grafů jsou především v případech ANOVA a bodových grafů uvedeny jen průkazné výsledky. Srovnávací grafy znázorňují průměrné hodnoty jednotlivých variant. Jako srovnávací znak průkaznosti vlivu faktorů byl vybrán interval směrodatné chyby průměru. V každé sekci je také formou histogramů sledována intervalová četnost. Zde je pozornost soustředěna na obsahy amonných iontů nižší než 70 mg.l -1, u kterých může potenciálně nastat problém s iniciací fermentace a na extrémní obsahy asimilovatelného dusíku (zkratka AN assimilable nitrogen) nižší než 200 mg.l -1 a vyšší než 300 mg.l -1, takové mošty mohou špatně prokvášet, respektive mohou následně vína vykazovat vyšší množství těkavých kyselin 21. Následující dvojice tabulek obsahuje původní matrici dosažených výsledků za rok 2007 a 2008. Jsou zde znázorněny veškeré zkoumané varianty, příslušné výsledky tvoří průměry dvou měření. Veškerá data viz Přílohy. Tabulka 5: Naměřená data pro rok 2007. Vzorek Oblast Zatravnění Podnož Odrůda Cukernatost Ref. mg.l -1 AN mg.l -1 1 M S K5BB RR 20 179,1 273,01 2 M S K5BB VZ 21 142,6 286,80 3 M S SO4 RR 24,5 81,56 259,23 4 M S SO4 VZ 23,5 116,9 263,36 5 M N K5BB VZ 22,5 148,9 390,22 6 M N SO4 RR 19,5 172,08 168,22 7 M N SO4 VZ 23 144 381,94 8 Z S K5BB RR 22 95,47 169,60 9 Z S K5BB VZ 20,5 133,92 215,10 10 Z S SO4 RR 23 120,5 165,46 11 Z S SO4 VZ 22,5 101,42 274,39 12 Z N SO4 RR 24,5 92,1 242,68 Pozn.: AN asimilovatelný dusík NH 4 + 82

Výsledky Tabulka 6: Naměřená data pro rok 2008. Vzorek Oblast Zatravnění Podnož Odrůda Cukernatost Ref. mg.l -1 AN mg.l -1 1 M S K5BB RR 19,50 119,30 215,10 2 M S K5BB VZ 21,50 108,48 267,50 3 M S SO4 RR 18,50 149,65 151,67 4 M S SO4 VZ 19,50 125,25 237,16 5 M N K5BB VZ 19,50 137,28 286,80 6 M N SO4 RR 20,00 140,04 248,19 7 M N SO4 VZ 20,50 102,15 386,08 8 Z S K5BB RR 22,50 109,50 227,15 9 Z S K5BB VZ 24,50 118,10 278,53 10 Z S SO4 RR 23,00 119,50 218,52 11 Z S SO4 VZ 19,50 122,73 333,68 12 Z N SO4 RR 20,50 104,96 246,82 Pozn.: AN asimilovatelný dusík NH 4 + Následující tabulka ukazuje dosažené výsledky obsahů amonných iontů a asimilovatelného dusíku v moštech za zkoumané období bez ohledu na ročníky. Tabulka 7: Statisticky zpracované souhrnné výsledky pro rok 2007 a 2008. Proměnné NH 4 + Počet Int. Int. Průměr Medián Minimum Maximum Sm.odch. měření spolehl. spolehl. 48 124,4 117,3 131,5 121,6 79,5 186,8 24,6 AN 48 257,8 238,7 276,9 251,7 149,7 402,5 65,7 Pozn.: AN asimilovatelný dusík V letech 2007 a 2008 bylo u moštů z vinařské oblasti Morava naměřeno 48 hodnot amonných iontů s průměrem 124,4 mg.l -1 s průměrem 257,8 mg.l -1 (viz Tabulka 7). a 48 hodnot asimilovatelného dusíku 83

Výsledky 22 Histogram: NH 4 + K-S d=,08323, p>.20; Lilliefors p>.20 Očekávané normální 20 18 16 Počet pozorování 14 12 10 8 6 4 2 0 50 75 100 125 150 175 200 x <= hranice kategorie Graf 21: Rozdělení četností obsahu amonných iontů. Graf 21 ukazuje četnost obsahu amonných iontů u všech zkoumaných vzorků. Nejvíce hodnot amonných iontů bylo naměřeno v intervalu 100 125 mg.l -1. Pod 70 mg.l -1 amonných iontů neobsahoval žádný vzorek. 20 Histogram: Asimilovatelný dusík K-S d=,13488, p>.20; Lilliefors p<,05 Očekávané normální 18 16 14 Počet pozorování 12 10 8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450 x <= hranice kategorie Graf 22: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku. 84

Výsledky Graf 22 ukazuje četnost obsahu asimilovatelného dusíku u všech zkoumaných vzorků. Nejvíce hodnot asimilovatelného dusíku bylo naměřeno v intervalu 250 300 mg.l -1. Pod 200 mg.l -1 obsahovalo 8 vzorků, 16,67 %. Naopak nad 300 mg.l -1 to bylo taktéž 8, 16,67 %. 6.1.1 Vliv cukernatosti na množství asimilovatelného dusíku v moštech Tabulka 8 znázorňuje korelační matici cukernatosti (ref.), obsahu amonných iontů a asimilovatelného dusíku ve všech měřených moštech. Červené hodnoty ukazují na průkaznou korelaci mezi obsahem NH + 4 a cukernatostí. Tabulka 8: Korelační tabulka pro cukernatost, amonné ionty a asimilovatelný dusík. + Proměnné Průměry Sm.odch. Ref. NH 4 AN Ref. 21,48 1,85 1,00-0,52 0,14 + NH 4 124,40 24,58-0,52 1,00 0,03 AN 257,80 65,69 0,14 0,03 1,00 Pozn.: AN asimilovatelný dusík Byly sestaveny bodové grafy. Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a cukernatostí moštů byla shledána neprůkaznou (Graf 23), stejně jako korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a amonných iontů (Graf 24). 20 10 Bodový graf: Cukernatost vs. Asimilovatelný dusík AN = 149,46 + 5,0442 * Ref. Korelace : r =,14190 X: Ref. N = 48 Průměr = 21,479167 Sm.Odch. = 1,847823 Max. = 25,000000 Min. = 18,500000 Y: AN N = 48 Průměr = 257,801667 Sm.Odch. = 65,687577 Max. = 402,470000 Min. = 149,690000 0 500 450 Asimilovatelný dusík [mg/l] 400 350 300 250 200 150 100 50 16 18 20 22 24 26 28 0 10 20 Cukernatost [Ref.] 95% hladina spolehlivosti Graf 23: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a cukernatostí moštu. 85

Výsledky 20 10 0 Bodový graf: NH + 4 vs. Asimilovatelný dusík AN = 246,59 +,09009 * NH4+ Korelace : r =,03371 X: NH4+ N = 48 Průměr = 124,395417 Sm.Odch. = 24,576341 Max. = 186,801300 Min. = 79,521000 Y: AN N = 48 Průměr = 257,801667 Sm.Odch. = 65,687577 Max. = 402,470000 Min. = 149,690000 Asimilovatelný dusík [mg/l] 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 NH 4 + [mg/l] 0 10 20 95% hladina spolehlivosti Graf 24: Korelace mezi obsahem asimilovatelného dusíku a množstvím amonných iontů. Byla však nalezena již zmiňovaná průkazná negativní korelace mezi množstvím amonných iontů a cukernatostí (viz červená čísla Tabulka 8 a Graf 25). 20 10 Bodový graf: Cukernatost vs. NH 4 + NH4+ = 271,41-6,844 * Ref. Korelace : r = -,5146 X: Ref. N = 48 Průměr = 21,479167 Sm.Odch. = 1,847823 Max. = 25,000000 Min. = 18,500000 Y: NH4+ N = 48 Průměr = 124,395417 Sm.Odch. = 24,576341 Max. = 186,801300 Min. = 79,521000 0 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 16 18 20 22 24 26 28 0 10 20 Cukernatost [Ref.] 95% hladina spolehlivosti Graf 25: Korelace mezi obsahem amonných iontů a cukernatostí moštu. [mg/l] NH 4 + 86

Výsledky 6.1.2 Asimilovatelný dusík v moštech v roce 2007 a 2008 V sekci 5.1.2 jsou výsledky porovnány z hlediska ročníku 2007 a 2008. Tabulka 9 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro oba roky. Tabulka 9: Statisticky zpracované výsledky pro rok 2007 a 2008. Rok + NH 4 Int. spolehl. Int. spolehl. AN 2007 127,38 114,09 140,67 257,50 226,73 288,28 2008 121,41 115,08 127,75 258,10 233,10 283,10 Pozn.: AN asimilovatelný dusík Int. spolehl. Int. spolehl. Srovnání ročníků 2007 a 2008 ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší v roce 2007 (viz Graf 26). 170 Srovnání koncentrace NH 4 + v letech 2007 a 2008 160 150 140 NH 4 + [mg/l] 130 120 110 100 90 2007 2008 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch Graf 26: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech v letech 2007 a 2008. Rok Dále v tomto roce byly obsahy těchto iontů značně variabilnější než v roce 2008, jak lze usoudit z četností histogramu (viz Graf 27). 87

Výsledky 8 Histogram: NH 4 + Rok: 2007 NH4+ = 24*10*normal(x; 127,3792; 31,4724) Rok: 2008 NH4+ = 24*10*normal(x; 121,4117; 15,0055) 7 6 5 Počet pozorování 4 3 2 1 0 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 Rok: 2007 NH 4 + [mg/l] Rok: 2008 Graf 27: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro rok 2007 a 2008. Naopak průměrný obsah celkového asimilovatelného dusíku byl mírně vyšší v roce 2008 (viz Graf 28). Z hlediska variability byl trend stejný jako v roce předešlém (viz Graf 29). 340 Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku v letech 2007 a 2008 320 300 Asimilovatelný dusík [mg/l] 280 260 240 220 200 180 160 2007 2008 Rok Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch Graf 28: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech v letech 2007 a 2008. 88

Výsledky 12 Histogram: Asimilovatelný dusík Rok: 2007 AN = 24*50*normal(x; 257,5021; 72,881) Rok: 2008 AN = 24*50*normal(x; 258,1013; 59,2072) 10 8 Počet pozorování 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450 100 150 200 250 300 350 400 450 Rok: 2007 Asimilovatelný dusík [mg/l] Rok: 2008 Graf 29: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro rok 2007 a 2008. Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l -1 byl 0 pro oba roky. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l -1 bylo 6 v roce 2007 a 2 v roce 2008. Naopak 4 vzorky v každém roce disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l -1. 6.1.3 Asimilovatelný dusík v moštech z vinařských podoblastí Mikulovsko a Znojemsko V sekci 5.1.3 jsou výsledky porovnány z hlediska vinařských podoblastí Mikulovské a Znojemské. Tabulka 10 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě vinařské podoblasti. Tabulka 10: Statisticky zpracované výsledky pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. Podoblast + NH 4 Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. Mikulovsko 133,38 123,00 143,76 272,52 244,46 300,59 Znojemsko 111,82 105,37 118,27 237,19 213,96 260,42 Pozn.: AN asimilovatelný dusík 89

Výsledky Srovnání podoblastí ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl prokazatelně vyšší v Mikulovské vinařské podoblasti (viz Graf 30), kde byly obsahy těchto iontů také značně variabilnější (viz Graf 31). 170 160 Srovnání koncentrace NH 4 + pro vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 150 140 NH 4 + [mg/l] 130 120 110 100 90 M Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko Z Graf 30: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko. 7 Histogram: NH 4 + Podoblast: M NH4+ = 28*10*normal(x; 133,3779; 26,7739) Podoblast: Z NH4+ = 20*10*normal(x; 111,82; 13,7861) 6 5 Počet pozorování 4 3 2 1 0 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 Podoblast: M NH 4 + [mg/l] Podoblast: Z Graf 31: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. 90

Výsledky Stejně tak byl průměrný obsah asimilovatelného dusíku průkazně vyšší v hroznech z Mikulovské podoblasti (viz Graf 32). Z hlediska variability byl trend stejný (viz Graf 33). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíkupro vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko 360 Průměr 340 Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 320 Asimilovatelný dusík [mg/l] 300 280 260 240 220 200 180 M Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko Z Graf 32: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z vinařské podoblasti Mikulovsko a Znojemsko. 14 Histogram: Asimilovatelný dusík Podoblast: M AN = 28*50*normal(x; 272,5214; 72,375) Podoblast: Z AN = 20*50*normal(x; 237,194; 49,6346) 12 10 Počet pozorování 8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450 100 150 200 250 300 350 400 450 Podoblast: M Asimilovatelný dusík [mg/l] Podoblast: Z Graf 33: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro vinařskou podoblast Mikulovsko a Znojemsko. 91

Výsledky Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l -1 byl 0 pro obě podoblasti. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l -1 byl 4 pro podoblast Mikulovskou a 4 pro Znojemskou. Naopak 6 vzorků z podoblasti Mikulovské disponovalo obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l -1, oproti Znojemské, kde byly pouze 2. 6.1.4 Vliv podnoží Kober 5BB a SO 4 na asimilovatelný dusík v moštech V sekci 5.1.4 jsou výsledky porovnány z hlediska podnoží Kober 5BB a SO 4. Tabulka 11 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě sledované podnože. Tabulka 11: Statisticky zpracované výsledky pro podnož Kober 5BB a SO 4. + Podnož NH 4 Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. K 5BB 129,27 117,83 140,70 260,98 233,54 288,42 SO 4 120,92 111,41 130,42 255,53 227,90 283,17 Pozn.: AN asimilovatelný dusík Srovnání jednotlivých podnoží ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro podnož Kober 5BB (viz Graf 34). 160 150 Srovnání koncentrace NH 4 + na podnožích K5BB a SO4 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 140 NH 4 + [mg/l] 130 120 110 100 90 K5BB SO4 Podnož Graf 34: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4. 92

Výsledky Variabilita obsahu amonných iontů byla pro měřené vzorky vyšší u podnože Kober 5BB (viz Graf 35) 6 Histogram: NH 4 + Podnož: K5BB NH4+ = 20*10*normal(x; 129,265; 24,4344) Podnož: SO4 NH4+ = 28*10*normal(x; 120,9171; 24,5184) 5 4 Počet pozorování 3 2 1 0 60 80 70 100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 60 80 70 100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 Podnož: K5BB Podnož: SO4 + NH 4 [mg/l] Graf 35: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro podnož Kober 5BB a SO 4. Stejně tak byl průměrný obsah celkového asimilovatelného dusíku v průměru vyšší v hroznech vypěstovaných na podnoži Kober 5BB (viz Graf 36). 340 Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku na podnoži K5BB a SO4 320 300 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch Asimilovatelný dusík [mg/l] 280 260 240 220 200 180 160 K5BB SO4 Podnož Graf 36: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z podnože Kober 5BB a SO 4. 93

Výsledky Naopak větší počet extrémních hodnot asimilovatelného dusíku byl nalezen u podnože SO 4 (viz Graf 37). 12 Histogram: Asimilovatelný dusík Podnož: K5BB AN = 20*50*normal(x; 260,982; 58,6311) Podnož: SO4 AN = 28*50*normal(x; 255,53; 71,2681) 10 8 Počet pozorování 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450 100 150 200 250 300 350 400 450 Podnož: K5BB Asimilovatelný dusík [mg/l] Podnož: SO4 Graf 37: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro podnož Kober 5BB a SO 4. Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l -1 byl 0 pro obě podnože. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l -1 byl 2 pro podnož Kober 5BB a 6 pro SO 4. Podobně 2 vzorky na Kober 5BB disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l -1, oproti podnoži SO 4, kde bylo naměřeno takových hodnot 6. 6.1.5 Vliv zatravnění meziřadí na množství asimilovatelného dusíku v moštech V sekci 5.1.5 jsou výsledky porovnány z hlediska zatravnění meziřadí. Tabulka 12 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro obě sledované varianty. Tabulka 12: Statisticky zpracované výsledky pro střídavé a nezatravněné meziřadí. + Zatravnění NH 4 Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. S 121,50 113,23 129,77 239,77 222,15 257,39 N 130,19 115,58 144,80 293,87 250,90 336,84 Pozn.: AN asimilovatelný dusík 94

Výsledky Srovnání střídavého a nezatravněného meziřadí ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro meziřadí nezatravněné (viz Graf 38). 160 150 Srovnání koncentrace NH 4 + při střídavém a nezatravněném meziřadí Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 140 NH 4 + [mg/l] 130 120 110 100 90 S Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné N Graf 38: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí. Z histogramu (Graf 39) lze vyčíst vysokou četnost obsahu amonných iontů v extrémních hodnotách, což ukazuje na velkou nevyrovnanost těchto iontů v hroznech z vinic bez zatravněného meziřadí. 95

Výsledky 10 Histogram: NH 4 + Srovnani_zatravneni 10v*48c Zatravnění: S NH4+ = 32*10*normal(x; 121,4988; 22,9344) Zatravnění: N NH4+ = 16*10*normal(x; 130,1888; 27,4186) 9 8 7 Počet pozorování 6 5 4 3 2 1 0 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 60 80 100 120 140 160 180 200 70 90 110 130 150 170 190 Zatravnění: S NH 4 + [mg/l] Zatravnění: N Graf 39: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro střídavě zatravněné a nezatravněné meziřadí. Stejně tak byl obsah celkového asimilovatelného dusíku průkazně a výrazně vyšší u hroznů pocházejícího z nezatravněných vinic (viz Graf 40), kde byla také vyšší variabilita hodnot (viz Graf 41). Srovnání koncentrace asimilovatelného dusíku při střídavém a nezatravněném meziřadí 400 Průměr 380 Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 360 Asimilovatelný dusík [mg/l] 340 320 300 280 260 240 220 200 180 S N Zatravnění S-střídavé, N-nezatravněné Graf 40: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech ze střídavého a nezatravněného meziřadí. 96

Výsledky Graf 41: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro střídavé a nezatravněné meziřadí. Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l -1 byl 0 pro obě alternativy. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l -1 byl 6 pro střídavé zatravnění a 2 pro nezatravněné meziřadí. 2 vzorky ze střídavého zatravnění disponovaly obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l -1, oproti černému úhoru, kde bylo takových hodnot naměřeno 6. Na tomto místě je však nutné vzít v úvahu dostupnost materiálu, který limitoval počet variant s nezatravněným meziřadím na 16, oproti 32 ze zatravnění střídavého. 6.1.6 Vliv odrůdy na množství asimilovatelného dusíku v moštech V sekci 5.1.6 jsou výsledky porovnány z hlediska odrůdy. Tabulka 13 znázorňuje dosažené hodnoty amonných iontů a asimilovatelného dusíku pro odrůdy Veltlínské zelené a Ryzlink rýnský. 97

Výsledky Tabulka 13: Statisticky zpracované výsledky pro odrůdu Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. Odrůda NH 4 + Pozn.: AN asimilovatelný dusík Int. spolehl. Int. spolehl. AN Int. spolehl. Int. spolehl. RR 123,65 110,70 136,60 215,47 198,18 232,76 VZ 125,14 117,93 132,36 300,13 275,50 324,76 Srovnání odrůd ukázalo, že průměrný obsah amonných iontů byl vyšší pro odrůdu Veltlínské zelené (viz Graf 42). Srovnání koncentrace NH 4 + u odrůd Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené 160 150 Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch 140 NH 4 + [mg/l] 130 120 110 100 90 RR Odrůdy RR-Ryzlink rýnský, VZ-Veltlínské zelené VZ Graf 42: Srovnání obsahu amonných iontů v moštech z odrůdy Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. Histogram (Graf 43) ukazuje širokou intervalovou četnost obsahu amonných iontů u odrůdy Ryzlink rýnský. 98

Výsledky 7 HIstogram: NH 4 + Odrůdy: RR NH4+ = 24*10*normal(x; 123,6467; 30,6724) Odrůdy: VZ NH4+ = 24*10*normal(x; 125,1442; 17,0964) 6 5 Počet pozorování 4 3 2 1 0 60 80 70 100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 60 80 70 100 120 140 160 180 200 90 110 130 150 170 190 Odrůdy: RR NH 4 + [mg/l] Odrůdy: VZ Graf 43: Rozdělení četností obsahu amonných iontů pro odrůdu Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. Obsah celkového asimilovatelného dusíku byl průkazně a výrazně vyšší u hroznů pocházejících z odrůdy Veltlínské zelené (viz Graf 44), byla zde také vyšší variabilita hodnot (viz Graf 45). 380 360 340 Srovnání koncentrace asimilovatelného u odrůd Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené Průměr Průměr±SmCh Průměr±SmOdch Asimilovatelný dusík [mg/l] 320 300 280 260 240 220 200 180 160 RR VZ Odrůdy RR-Ryzlink rýnský, VZ-Veltlínské zelené Graf 44: Srovnání obsahu asimilovatelného dusíku v moštech z odrůdy Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. 99

Výsledky 14 Histogram: Asimilovatelný dusík Odrůdy: RR AN = 24*50*normal(x; 215,4713; 40,9389) Odrůdy: VZ AN = 24*50*normal(x; 300,1321; 58,3248) 12 10 Počet pozorování 8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 400 450 100 150 200 250 300 350 400 450 Odrůdy: RR Asimilovatelný dusík [mg/l] Odrůdy: VZ Graf 45: Rozdělení četností obsahu asimilovatelného dusíku pro odrůdu Ryzlink rýnský a Veltlínské zelené. Počet vzorků jejichž koncentrace amonných iontů byla nižší než 70 mg.l -1 byl 0 pro obě alternativy. Počet vzorků s obsahem asimilovatelného dusíku nižším než 200 mg.l -1 byl 8 pro Ryzlink rýnský a 0 pro Veltlínské zelené. Naopak 0 vzorků Ryzlinku rýnského disponovalo obsahem dusíku vyšším než 300 mg.l -1, oproti Veltlínu zelenému, kde takových hodnot bylo naměřeno celých 8. 6.1.7 Interakce mezi ovlivňujícími faktory Část 5.1.7 obsahuje výsledky a vztahy získané pomocí analýzy rozptylu (ANOVA). Analýza byla provedena do stupně 2. Vyšší stupeň byl vzhledem k počtu měření považován za irelevantní. Jako průkazné vyšly následující interakce. Interakce ročníku a podnože ve vztahu k množství amonných iontů V roce 2007 bylo naměřeno prokazatelně vyšší množství amonných iontů u podnože Kober 5BB než v roce 2008. Naopak u podnože SO 4 byl tento trend mírně opačný a neprůkazný (viz Graf 46). 100

Výsledky Graf 46: Vliv interakce ročníku a podnože na množství amonných iontů. Interakce oblasti a zatravnění ve vztahu k množství amonných iontů U hroznů pocházejících z Mikulovské vinařské podoblasti bylo naměřeno prokazatelně vyšší množství amonných iontů u střídavého zatravnění než u hroznů ze Znojemska. Stejný a mnohem silnější rozdíl byl naměřen u nezatravněného meziřadí (viz Graf 47). Koncentrace NH 4 + [mg/l] 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 Vliv interakce podoblasti a zatravnění na množství NH 4 + Wilksova lambda=,82141, F(3, 30)=2,1742, p=,11174 Dekompozice efektivní hypotézy Vertik. sloupce označ. +/- sm. chyby M Vinařská podoblast M-Mikulovsko, Z-Znojemsko Z Zatravnění S Zatravnění N Graf 47: Vliv interakce podoblasti a zatravnění na množství amonných iontů. 101