MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 MARKÉTA VALOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Antioxidanty ve výživě člověka Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc. Vypracovala: Markéta Valová Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Antioxidanty ve výživě člověka vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.. podpis.

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala všem, kteří přispěli k úspěšnému dokončení této bakalářské práce, zejména prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za cenné rady a všestrannou spolupráci. Za velkou podporu během celého studia jsem vděčná své rodině a všem svým blízkým.

ABSTRAKT V současné době se zvyšuje zájem odborníků, z oborů potravinářství i medicíny, o problematiku antioxidantů a volných radikálů. Antioxidanty jsou látky, které chrání potraviny před zkázou způsobenou oxidací, která se může projevit zejména žluknutím tuků, a tím prodlužují jejich trvanlivost. Antioxidanty jsou velmi důležité v prevenci vzniku a proti působení volných radikálů, které vznikají in vivo během metabolismu molekulárního kyslíku. Antioxidanty a volné radikály se vyskytují ve zdravém organismu v rovnováze. Pokud je tato rovnováha porušena ve prospěch volných radikálů, dochází k oxidačnímu stresu. Oxidační stres vede k poškození DNA, proteinů, lipidů i sacharidů a je příčinou mnoha lidských onemocnění. V této bakalářské práci jsou zmíněny příčiny a důsledky oxidačního stresu, výskyt přirozených antioxidantů v organismu člověka a látky s antioxidační aktivitou, které se přirozeně vyskytují v potravinách a potravinových surovinách. Klíčová slova Antioxidanty, volné radikály, oxidační stres, antioxidační aktivita, potraviny ABSTRACT Currently, the interest of experts in field of food and medical science in the issue of antioxidants and free radicals increases. Antioxidants are substances which protect foods from deterioration caused by oxidation, which may arise in fat rancidity, due to prolong its shelf live. Antioxidants are very important in the prevention of formation and effect of free radicals generated in vivo during the metabolism of molecular oxygen. Antioxidants and free radicals are in a healthy body in balance. If that balance is broken in favor of free radicals then leads to oxidative stress. Oxidative stress leads to DNA, proteins, lipids and carbohydrates damage and it is the cause of many human diseases. In this work it is mentioned causes and consequences of oxidative stress, the occurrence of natural antioxidants in the human body and substances with antioxidant activity, which occurs naturally in foods and food ingredients are discussed. Keywords Antioxidants, free radicals, oxidative stress, antioxidant activity, food

OBSAH 1 ÚVOD... 10 2 CÍL PRÁCE... 10 3 OXIDACE V BIOLOGICKÝCH SYSTÉMECH... 11 4 DEFINICE VOLNÝCH RADIKÁLŮ... 12 4.1 VZNIK VOLNÝCH RADIKÁLŮ... 14 4. 1. 1 Příčiny vzniku volných radikálů... 14 4. 2 PŘÍZNIVÉ ÚČINKY VOLNÝCH RADIKÁLŮ... 16 4. 3 POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL VOLNÝMI RADIKÁLY... 16 4. 4 NEMOCI ZPŮSOBENÉ OXIDAČNÍM STRESEM... 17 4. 4. 1 Srdečně-cévní onemocnění... 18 4. 4. 2 Rakovina... 18 4. 4. 3 Diabetes mellitus... 19 4. 4. 4 Další onemocnění... 20 5 DEFINICE ANTIOXIDANTŮ... 20 5. 1 KRITÉRIA DĚLENÍ ANTIOXIDANTŮ... 22 6 ANTIOXIDAČNÍ SYSTÉM ORGANISMU ČLOVĚKA... 24 6. 1 ANTIOXIDAČNÍ ENZYMY... 26 6. 1. 1 Superoxiddizmutáza... 26 6. 1. 2 Glutationperoxidáza... 26 6. 1. 3 Kataláza... 27 6. 2 DALŠÍ ANTIOXIDANTY... 28 6. 2. 1 Glutathion... 28 6. 2. 2 Melatonin... 29 6. 2. 3 Kyselina lipoová... 29 7 LÁTKY S ANTIOXIDAČNÍM ÚČINKEM, PŘIROZENĚ SE VYSKYTUJÍCÍ V POTRAVINÁCH A POTRAVINOVÝCH SUROVINÁCH... 30 7. 1 ANTIOXIDAČNÍ VITAMÍNY... 30 7. 1. 1 Karotenoidy... 30 7. 1. 2 Vitamín E... 32

7. 1. 3 Vitamín C... 35 7. 1. 4 Koenzym Q10... 37 7. 2 FENOLICKÉ ANTIOXIDANTY... 37 7. 2. 1 Fenolické monomery... 39 7. 2. 2 Flavonoidy... 40 7. 3 STOPOVÉ PRVKY... 41 7. 3. 1 Selen... 41 7. 3. 2 Zinek... 42 7. 3. 3 Měď... 43 8 TESTOVÁNÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY POTRAVIN A JEJICH SLOŽEK... 44 8. 1 METODY ZALOŽENÉ NA ELIMINACI RADIKÁLŮ... 44 8. 2 METODY ZALOŽENÉ NA HODNOCENÍ REDOXNÍCH VLASTNOSTÍ LÁTEK... 45 9 ZÁVĚR... 46 10 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 47 11 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 51 12 PŘÍLOHY... 52

SEZNAM TABULEK Tab. 1 Reaktivní formy kyslíku a dusíku... 13 Tab. 2 Hlavní buněčné cílové struktury pro volné radikály... 17 Tab. 3 Substituenty u jednotlivých forem vitamínu E... 33 Tab. 4 Deriváty kyseliny skořicové a hydroxybenzoové a jejich výskyt... 39 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Schéma zdrojů volných radikálů... 15 Obr. 2 Antioxidační systém člověka... 25 Obr. 3 Vzorec glutationu... 28 Obr. 4 Oxidoredukční přeměny glutationu a jeho vztah k antioxidačním enzymům... 28 Obr. 5 Vzorec melatoninu... 29 Obr. 6 Vzorec kyseliny lipoové... 30 Obr. 7 Rozdělení karotenoidů... 31 Obr. 8 Přehled vzorců karotenoidů... 32 Obr. 9 Vzorec α-tokoferolu... 32 Obr. 10 Vzorec tokotrienolu... 32 Obr. 11 Strategická pozice vitamínu E v membránách... 33 Obr. 12 Vychytávání volných radikálů pomocí α-tokoferolu... 34 Obr. 13 Kyselina askorbová jako donor elektronů, resp. redukční činidlo... 35 Obr. 14 Schéma působení fenolického antioxidantu při zneškodňování peroxylového radikálu lipidu... 38 Obr. 15 Deriváty kys. skořicové... 39 Obr. 16 Deriváty kys. hydroxybenzoové... 39 Obr. 17 Vzorec chromenu... 40 Obr. 18 Vzorec flavanu... 40 Obr. 19 Chemické struktury flavonoidů... 40

SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1 Shrnutí faktorů ovlivňující zdravé stárnutí... 52 Příloha 2 Celkové účinky ROS na organismus... 53 Příloha 3 Účinky ROS tvorba tumoru, proces aterogeneze, poškození oční čočky... 54 Příloha 4 Obsah vitamínu E (mg/kg nebo mg/l) v jedlém podílu některých potravin... 55 Příloha 5 Celkový obsah polyfenolových sloučenin v rostlinných surovinách a nápojích... 56

1 ÚVOD V současnosti se klade velký důraz na vyrovnané složení a pestrost stravy. Optimální složení výživy se správným poměrem základních živin (bílkovin, sacharidů a tuků), dostatečným množstvím vitamínů, minerálů a dalších antioxidačních látek je základem v prevenci všech civilizačních onemocnění. Bylo prokázáno, že antioxidanty, běžně se vyskytující v potravinách, snižují výskyt jak kardiovaskulárních, tak i nádorových onemocnění. Za nejdostupnější zdroje antioxidantů v potravě jsou považovány zejména ovoce, zelenina, obiloviny, káva, čaj a některé alkoholické nápoje, např. víno a pivo. Antioxidanty se záměrně přidávají také do potravin v průběhu výroby, za účelem prodloužení jejich úchovnosti. V chemii potravin se antioxidanty řadí k přídatným látkám a jejich použití v potravinářství stanovuje příslušná legislativa. 2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce je zpracování poznatků získaných studiem literatury na téma antioxidanty ve výživě člověka. Nejprve bych se zaměřila na problematiku oxidace v biologických systémech a poté se budu snažit vysvětlit funkci volných radikálů a antioxidantů v lidském organismu. Dále se budu snažit sestavit ucelený přehled látek s antioxidačním účinkem, které se přirozeně vyskytují v potravinách a potravinových surovinách. Stručně se také zmíním o testování antioxidační kapacity potravin. 10

3 OXIDACE V BIOLOGICKÝCH SYSTÉMECH Volné radikály mohou způsobovat oxidační poškození biologických tkání. Velice obecně můžeme oxidací pojmenovat libovolnou chemickou reakci, při které dochází ke ztrátě elektronu z atomu (Youngson, 1995). Jako vedlejší produkty při oxygenní fotosyntéze (u rostlin) a v dýchacím řetězci (u živočichů) vznikají toxické volné radikály, které způsobují oxidaci lipidů, biologických membrán, následně proteinů a nukleových kyselin, popřípadě i dalších biomolekul (Stratil, 2009). V průběhu oxidační reakce jsou patrné čtyři odlišné fáze: iniciace, propagace, inhibice, terminace. Základní schéma oxidačního mechanismu a její inhibice za pomocí antioxidantu je vyjádřeno následujícími reakcemi. (R 2 N 2 = azo sloučenina, LH = oxidovaný substrát, AH = antioxidant) Iniciace: R 2 N 2 2R + N 2 R + O 2 ROO ROO + LH ROOH + L Propagace: L + O 2 ROO LOO + LH LOOH + L Inhibice: LOO + AH LOOH + A Terminace: A + (n-1)loo neaktivní produkty neradikálové povahy LOO + LOO neaktivní produkty neradikálové povahy (Huang et. al., 2005) Jakmile se organismy přizpůsobily životu v kyslíkaté atmosféře, musely se u nich nutně vyvinout detoxikační ochranné mechanismy, které by je chránily před vlivem volných radikálů. Tyto mechanismy nazýváme antioxidačním ochranným systémem a zahrnují látky jak enzymatické, tak neenzymatické povahy. V tukovém prostředí jsou nejvýznamnějšími antioxidanty tokoferoly a karoteny. Ve vodném prostředí mají nejdůležitější funkci kyselina askorbová a glutation (Stratil, 2005; Sies, 1997). Nerovnovážný stav mezi oxidačními látkami a antioxidanty, ve prospěch oxidantů, se nazývá oxidační stres. Tento stav vede k poškození biomolekul, což má za následek chorobný stav organismu (Sies, 1997). Singletový kyslík, který vzniká fotosenzibilizovanými reakcemi, je v organismu účinně zhášen např. β-karotenem, vitamínem C nebo vitamínem E. 11

Superoxidový radikál ( O - 2 ) vzniká jednoelektronovou redukcí tripletového kyslíku a je likvidován enzymem superoxiddismutázou (má koenzymy Mn nebo Zn a Cu). Peroxid vodíku je rozkládán zejména mikrosomální katalasou (kofaktorem je Fe) nebo glutathionperoxidasou (kofaktorem je Se). Enzymaticky neodstraněný peroxid vodíku je spontánně jednoelektronově redukován a vzniká velmi reaktivní hydroxylový radikál: H 2 O 2 + e - HO + HO - nebo H 2 O 2 + Fe 2+ HO + HO - + Fe 3+ (Fentonova reakce) Hydroxylový radikál (HO ) je nejnebezpečnější toxickou formou kyslíku. Poškozuje mitochondriální, mikrosomální a endoplasmatické retikulární membrány. Působí hlavně v místě vzniku, kde atakuje především nenasycené mastné kyseliny vázané ve fosfolipidech membrán. Urychluje tak stárnutí buněk a vývoj degenerativních onemocnění (Stratil, 2005; Rahman, 2007). 4 DEFINICE VOLNÝCH RADIKÁLŮ Chceme-li si objasnit definici volných radikálů, musíme znát některé pojmy, popisující strukturu hmoty. Jádro atomu, složené z kladných protonů a neutrálních neutronů, je obklopeno zápornými elektrony. Atomy se chemickými vazbami spojují v molekuly. V neutrálním atomu nebo molekule je počet protonů a elektronů vyrovnaný. Pokud v atomu či molekule není stejný počet protonů a elektronů, částice se nazývá ion. Záporný anion má více elektronů než protonů, v kladném kationu jsou ve větším počtu protony. Elektrony zaujímají v atomech a molekulách definované prostory, tj. energetické hladiny, zvané orbitaly. Každý orbital může obsahovat maximálně dva elektrony a ty musí mít opačný spin (řekněme pro představu směr rotace ). Pokud atom nebo molekula (nezáleží zda neutrální nebo ion) obsahuje alespoň jeden orbital s jediným, tedy nepárovým, elektronem, částice se nazývá volný radikál. Většina biomolekul nejsou radikály, protože obsahují orbitaly plně obsazené dvěma elektrony (Šípek, 2000). Již tedy víme, že volné radikály jsou látky (atomy, molekuly nebo ionty) schopné samostatné existence, které mají ve svém elektronovém obalu nepárový elektron, popř. více nepárových elektronů (Rahman, 2007). Stabilní konfigurace vyžaduje párové seskupení elektronů, a proto se snaží volné radikály chybějící elektron doplnit. Z toho lze vyvodit základní vlastnosti volných radikálů: malá stabilita a vysoká 12

reaktivita většiny volných radikálů (Racek, 2003; International Food Information Service, 2009). Reakcí volného radikálu s jiným atomem vznikne další atom, který postrádá jeden elektron a tak pokračuje reakce stále dále. Vzniká tak řetězová reakce tisíců jiných atomů (Stone, 2003). V nedávné době bylo zjištěno, že v organismu běžně vzniká řada reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species - ROS) a reaktivních forem dusíku (reactive nitrogen species - RNS). Jde o látky, které snadno a rychle reagují s různými biologickými strukturami - mastnými kyselinami, lipidy, aminokyselinami, proteiny nebo nukleovými kyselinami. Volné radikály jsou většinou spojovány s negativním vlivem na organismus, jejich funkce ve zdravém organismu je ale nepostradatelná. Tabulka 1. ukazuje, že jen některé reaktivní formy kyslíku a dusíku jsou volné radikály (Šípek, 2000; Benzie, Strain, 2005). Tab. 1 Reaktivní formy kyslíku a dusíku (Šípek, 2000) REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU Volné radikály Látky, které nejsou volnými radikály superoxid, O 2 peroxid vodíku, H 2 O 2 hydroxylový radikál, HO kyselina chlorná, HOCl peroxyl, ROO ozon, O 3 alkoxyl, RO singletový kyslík 1 O 2 hydroperoxyl, HOO REAKTIVNÍ FORMY DUSÍKU Volné radikály Látky, které nejsou volnými radikály oxid dusnatý, NO nitrosyl, NO + oxid dusičitý, NO 2 nitroxid, NO kyselina dusitá, HNO 2 oxid dusitý, N 2 O 3 oxid dusičitý,n 2 O 4 + nitronium,no 2 peroxynitrit,onoo alkylperoxynitrit, ROONO 13

4.1 Vznik volných radikálů Volné radikály vznikají z molekul třemi způsoby: 1) homolytickým štěpením kovalentní chemické vazby, přičemž každý fragment získá jeden nepárový elektron 2) přidáním jednoho elektronu k molekule (redukce) 3) ztrátou jednoho elektronu (oxidací) K homolytickému štěpení vazby je zapotřebí mnoho energie, např. vysoká teplota, ultrafialové nebo ionizující záření. V biologických systémech však vznikají volné radikály energeticky snadnějším způsobem odejmutím nebo přijetím elektronu (Šípek, 2000). 4. 1. 1 Příčiny vzniku volných radikálů Volné radikály (VR) se dostávají do organismu zvenčí, ale velké množství VR vzniká také v průběhu metabolismu. Podle toho rozdělujeme příčiny vzniku VR na exogenní a endogenní. Za fyziologických podmínek můžeme zmínit 4 nejdůležitější zdroje VR (Racek, 2003; Stratil, 2005; Bender, 2005): 1) elektronový transport při aerobní respiraci v mitochondriích 2) peroxisomální metabolismus mastných kyselin 3) reakce cytochromu P 450 4) fagocytující buňky Existuje však mnoho dalších zdrojů pro vznik volných radikálů (Racek, 2003; Stratil, 2005): Exogenní příčiny: Ionizující záření (γ-paprsky, X-paprsky) UV-světlo, modré světlo (léčba hyperbilirubinémie u novorozenců) Vysoký obsah škodlivin ve vzduchu (tepelné elektrárny, průmysl, doprava) Kouření (vykouření jedné cigarety představuje zatížení organismu 10 17 VR) 14

Intoxikace (polychlorované bifenyly, tetrachlormethan, chloroform, alkohol volné radikály vznikají až při metabolismu těchto látek, na kterém se velmi často podílí enzym cytochrom P 450 ) Potrava (volné radikály vznikají zejména při tepelném zpracování potravin, dále také při drcení a vlivem světla) Endogenní příčiny: Průnik elektronů z dýchacího řetězce v mitochondriích Vznik kyseliny močové (v reakci katalyzované xantinoxidázou) např. při úrazech, nekrózách, pooperačních stavech Rozpad fagocytů a makrofágů (záněty, popáleniny, atd.) Vznik methemoglobinu Syntéza prostaglandinů Zvýšený metabolismus estrogenů Autooxidace thiolů Hyperglykémie Nadměrná fyzická aktivita, svalový výkon na kyslíkový dluh Obr. 1 Schéma zdrojů volných radikálů (Willcox et. al.,2004) 15

4. 2 Příznivé účinky volných radikálů Volné radikály nemají v lidském organismu jen škodlivý vliv, ale sehrávají také řadu pozitivních funkcí (Rahman, 2007). Volné radikály mají významnou funkci například v imunitním systému. Umožňují bílým krvinkám a makrofágům obranu proti infekci při tzv. respiračním vzplanutí. Jednou z fyziologických funkcí volných radikálů je zneškodnění patogenů fagocyty. V membráně fagocytů se nachází enzym NADPH-oxidáza, který usnadňuje jednoelektronovou redukci molekulárního kyslíku na superoxid. Ten je pak přeměňován na účinnější ROS, z nichž největší význam má kyselina chlorná, která patogen zničí. Volné radikály se podílejí také na reakcích, při kterých vznikají některé důležité látky, např. při biosyntéze cholesterolu a žlučových kyselin. Mají také důležitou roli při detoxikaci některých xenobiotik (např. léků). Peroxid vodíku je nezbytný pro oxidaci jodidu na elementární jód, který je využit štítnou žlázou k jodaci aromatických jader tyroxinu. Superoxid a peroxid vodíku jsou sloučeniny nezbytné k úspěšnému oplodnění vajíčka spermií. Superoxid je třeba k narušení membrány vajíčka, peroxid vodíku je vytvářen vajíčkem po oplodnění a za pomocí molekul tyrosinu, zabraňuje dalšímu pronikání spermií do vajíčka. Neopomenutelný je i příznivý účinek oxidu dusnatého, jehož funkcí je výrazný vazodilatační účinek. Svůj význam má i v regulaci imunitních pochodů, při erekci a jako neurotransmiter (Racek, 2003; Šípek, 2000). 4. 3 Poškození biomolekul volnými radikály Reaktivními formami kyslíku a dusíku může být atakována prakticky kterákoliv molekula organismu a může tak dojít k jejímu oxidačnímu poškození. Nejzávažnější je poškození fosfolipidů buněčných membrán, vedoucí k poruše životně důležitých membránových dějů nebo dokonce k zániku buňky. Další je závažné poškození nukleových kyselin, které může mít za následek mutagenezi, karcinogenezi nebo i zánik buňky. Poškození bílkovin může být příčinou inaktivace enzymů a jiných bílkovin s různým biologickým významem (Racek, 2003; Bender, 2005). 16

Tab. 2 Hlavní buněčné cílové struktury pro volné radikály (Šípek, 2000) Cíl Poškození Následky nenasycené mastné kyseliny v lipidech ztráta dvojných vazeb, tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy) změněná fluidita lipidů, změny v propustnosti membrán, vliv na membránově vázané enzymy, tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy proteiny agregace a síťování, fragmentace a štěpení, modifikace thiolových skupin a benzenových jader AMK, reakce s hemových železem změny v transportu iontů, vstup Ca 2+ do cytosolu, změny v aktivitě enzymů DNA štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce, křížové vazby řetězců mutace, translační chyby, inhibice proteosyntézy 4. 4 Nemoci způsobené oxidačním stresem Pro vědecký výzkum je stále velmi zajímavé studium prevence chronických onemocnění. Studie prokázaly, že díky stravě a změně životního stylu se můžeme vyvarovat až 80-ti% srdečně-cévních onemocnění, 90-ti% Diabetes melittus druhého typu a přibližně 30-ti% karcinomů. Během několika posledních desetiletí propukla mezi vědci debata o tom, zda oxidace, přesněji řečeno oxidační stres, je základní příčinou nebo až druhotným jevem při mnohých chronických onemocněních a stárnutí. Proto se stále více vědeckých studií zaměřuje na zjišťování role antioxidantů v prevenci oxidačního stresu (Willcox et. al., 2004). 17

4. 4. 1 Srdečně-cévní onemocnění Hlavní příčinou úmrtí v USA, Evropě a Japonsku jsou kardiovaskulární onemocnění (Willcox et. al., 2004). Na čelním místě v pořadí příčin celkové mortality v České republice stojí taktéž kardiovaskulární onemocnění, zvláště ischemická choroba srdeční a infarkt myokardu. Příčinou naprosté většiny případů ischemické choroby srdeční a infarktu myokardu je koronární ateroskleróza (Šípek, 2000). Ateroskleróza je dlouhodobě se vyvíjející a probíhající chronické onemocnění, při kterém dochází k degenerativním změnám cévní stěny. Dochází k ukládání tukových látek a sekundárně také vápníku, což vede k poškozování tepen. Následkem je úbytek až ztráta specializovaných funkcí cévní stěny zejména její pružnosti. Postupem času může tento stav vést k postupnému zužování cévy s následným místním nedokrvením příslušné části organismu (Komprda, 2009). Látky kolující v krevním řečišti se dostávají do těsného styku s vnitřní výstelkou cév a mohou stěny cév poškodit. Mezi tyto látky řadíme především oxidací změněné lipoproteidy o nízké hustotě, tzv. LDL částice, aminokyselinu homocystein, nikotin a oxid uhelnatý (složky cigaretového kouře, které se dostávají z krve do plic). Dalším významným rizikovým faktorem, který může mechanicky poškozovat cévní stěnu, je hypertenze (vysoký krevní tlak) (Komprda, 2009). Bylo provedeno mnoho studií, které zkoumaly vliv různých antioxidačních preparátů na snížení úmrtnosti na SCO. Výsledky však byly většinou rozporuplné a neprůkazné. Čínští vědci dokázali, že současné podávání β-karotenu, selenu a vitamínu E snižuje celkovou úmrtnost způsobenou srdečně-cévním onemocněním o 9%. Italští a britští vědci v další studii dokázali, že suplementace vitamínem E může snižovat úmrtnost na kardiovaskulární onemocnění až o 20% a náhlou úmrtnost až o 35% (Willcox et. al., 2004). S antioxidačním potenciálem souvisí saturace organismu kyselinou askorbovou, jejíž význam se zdůrazňuje při regeneraci α-tokoferolu (Šípek, 2000). 4. 4. 2 Rakovina Také v oboru onkologie se věnuje velká pozornost volným radikálům, zejména pro jejich mnohostranné působení. Ne všechny mechanismy působení jsou zcela 18

objasněny, a proto jsou stále cílem mnohých studií a výzkumů (Willcox et. al., 2004; Rahman, 2007). Volné radikály se mohou podílet na vzniku nádorového bujení, protože jako tzv. sekundární promotory působí vznik mutací, které následně vedou k indukci onkogenů. Na druhé straně mají volné radikály také význam při destrukci nádorových buněk. Prostřednictvím volných radikálů cytotoxické T-lymfocyty ničí nádorové buňky a také některá cytostatika působí protinádorově díky spoluúčasti volných radikálů. Současně si ale musíme uvědomit, že právě kyslíkové radikály jsou zodpovědné za některé závažné nežádoucí účinky cytostatik (Šípek, 2000). Velmi agresivní rakovinné buňky vyžadují určitou vyrovnanou hladinu oxidačního stresu k udržování rovnováhy mezi proliferací (opakované množení buněk) a apoptózou (programovaná smrt buňky, která není doprovázena zánětlivou reakcí). Tyto buňky produkují velké množství peroxidu vodíku, který má funkci signální molekuly je zapojen do procesu přežití rakovinných buněk. Antioxidanty mají za úkol potlačit tyto signální molekuly peroxidu vodíku a tím inhibovat proliferaci nádorových buněk. Odhaduje se, že 88 90% nádorů u lidí je způsobeno vlivem prostředí, ve kterém člověk žije a přibližně 35% je způsobeno stravou (Willcox et. al., 2004). 4. 4. 3 Diabetes mellitus Údaje z pokusných i klinických studií dokazují, že oxidační stres hraje důležitou roli v patogenezi cukrovky 1. i 2. typu (Willcox et. al., 2004). V krvi a tkáních nemocných je prokazatelně vyšší tvorba reaktivních forem kyslíku, lipoperoxidů a současně snížené hladiny antioxidačně působících látek (vitamín C, E, kyselina lipoová) a antioxidačních enzymů (superoxiddizmutáza, kataláza) (Šípek, 2000). U diabetu 1. typu (inzulin dependentní, na inzulinu závislý) dochází v průběhu autoimunitního procesu ke zvýšení počtu zánětlivých buněk a lokální koncentrace prozánětlivých cytokinů. Tím je stimulována tvorba volných radikálů, které mohou poškozovat β-buňky Langerhansových ostrůvků (Racek, 2003). Studie demonstrovaly kladný efekt různých antioxidantů na jednu z komplikací, diabetickou neuropatii. V jedné z nich byla diabetickým pacientům podávána kyselina lipoová, vitamín E a selen, po dobu 12 týdnů. Výsledky ukázaly zlepšení v neurologických symptomech a snížení peroxidace lipidů (Willcox et. al., 2004). 19

4. 4. 4 Další onemocnění Existuje velmi mnoho dalších onemocnění, na jejichž vzniku nebo průběhu se volné radikály také podílejí. Uvedu alespoň některé z nich. Při mnohých neurologických onemocněních má velký vliv oxidační stres. Centrální nervový systém má malou antioxidační kapacitu a velké množství lipidové tkáně, která může být volnými radikály poškozena. Zvýšený vznik volných radikálů i lipoperoxidace byly prokázány u Parkinsonovy i Alzheimerovy choroby (Racek, 2003; Rahman, 2007). Některé poruchy imunitního systému mohou být vyvolány negativním vlivem volných radikálů. Antioxidanty chrání imunitní systém kontrolou produkce volných radikálů (Willcox et. al., 2004). Volné radikály hrají také důležitou roli při vzniku některých onemocnění oka, které je přímo vystaveno škodlivému prostředí. K těmto onemocněním patří například katarakta (šedý zákal) a věkem podmíněná makulární degenerace (Racek, 2003; Willcox et. al., 2004). 5 DEFINICE ANTIOXIDANTŮ Volné radikály odebírají molekulám elektron, působí tedy oxidačně. Všechny látky, které jejich působení brání jsou označovány jako antioxidanty (Racek, 2003). Antioxidantem můžeme nazvat jakoukoli sloučeninu, která je schopna zpomalovat nebo zabraňovat degeneraci, poškození nebo zničení tkáně způsobené oxidací (Youngson, 1995). Antioxidanty jsou látky, které zpomalují oxidativní žluknutí tuků v mnohých potravinách. Mnoho tuků, především rostlinných olejů, obsahuje přirozeně se vyskytující antioxidanty (zejména vitamín E), které je dočasně chrání před oxidací (Bender, 2005). Antioxidanty jsou velmi významnou pomocí pro zvýšení obrany organismu proti nadměrnému působení volných radikálů. Působí tak, že převádějí volné radikály na nereaktivní nebo alespoň méně reaktivní formy (Kalač, 2003). Definice antioxidantů se může na první pohled zdát jednoduchá, ale je nutné ji doplnit několika poznámkami a komentáři. Definice ze slovníku říká, že antioxidant je látka, která brání oxidaci nebo zpomaluje reakce vyvolené vlivem volných radikálů. Mnoho antioxidantů se využívá jako konzervační látky v potravinářství, ale i v dalších oborech. Například u potravinářských produktů a mýdel se využívá antioxidantů pro 20

zabránění žluknutí, u benzínů a dalších ropných produktů pro zpomalení tvorby pryskyřic a dalších nežádoucích látek, u gumy pro zpomalení procesu stárnutí. Z biologického hlediska je možné antioxidanty definovat jako látky, které se přidávají do produktů, aby zbránily nebo zpomalily zhoršení jejich kvality vlivem kyslíku z atmosféry. Z pohledu biochemie nebo medicíny jsou antioxidanty enzymy nebo jiné organické látky, které jsou schopné působit proti škodlivému vlivu oxidace na nejrůznější tkáně (Huang et. al., 2005). Kritéria antioxidantů v roli antioxidační ochrany (Benzie, Strain, 2005): Antioxidanty musí být schopny reagovat s ROS v místě, kde se v těle nacházejí Při interakci ROS a antioxidantu nesmí vzniknout reaktivnější forma ROS než byla doposud V těle musí být dostatek antioxidantu, aby si mohl dovolit reagovat s ROS a zajistit tak dostatečnou ochranu Jak jsem se již zmínila, dostatek antioxidantů v potravě pomáhá snížit riziko vzniku civilizačních onemocnění (např. SCO a některé typy rakoviny). Je důležité si uvědomit, že účinnost přirozených antioxidantů z ovoce, zeleniny, čaje, kávy a celozrnných obilovin je výrazně vyšší než při stejné dávce čistých látek podávaných ve formě potravních doplňků např. tablet. V posledních letech bylo navíc zjištěno, že při vysokém a dlouhodobém pravidelném příjmu některých antioxidantů v čistém stavu dochází ke změně jejich účinku, antioxidační účinky se mění v prooxidační, tedy na pravý opak. Tento jev byl prokázán především u β-karotenu, vitamínu E, vitamínu C a některých flavonoidů. Mechanismus tohoto obrácení účinku však nebyl dosud zcela objasněn. Musíme si však uvědomit, že toto zjištění nic nemění na doporučení přijímat co nejvíce antioxidantů přirozeně obsažených v potravě, protože zde téměř v žádném případě nehrozí předávkování (Kalač, 2003). 21

5. 1 Kritéria dělení antioxidantů V této kapitole bych se chtěla pokusit sestavit ucelený přehled antioxidantů. Jedná se o velmi různorodou skupinou látek a je obtížné najít vhodné kritérium pro jejich třídění. Antioxidanty můžeme rozdělovat dle následujících hledisek (Racek, 2003): a) Podle ovlivnění tvorby volných radikálů Primární brání vzniku volných radikálů; např. inhibitory NADPHoxidázy, chelatační látky, inhibitory adheze neutrofilů Sekundární likvidují již vzniklé volné radikály; např. enzym superoxiddismutáza Terciární opravují nebo eliminují molekuly poškozené působením volných radikálů; např. restrikční endonukleáza b) Podle původu Endogenní vytváří se v organismu; např. enzym kataláza nebo hormon melatonin Exogenní vstupují do organismu zvenčí; např. vitamín C c) Podle rozpustnosti ve vodě či v tucích Hydrofilní rozpustné ve vodě poměrně rychle a snadno se dostávají do organismu, ale špatně pronikají přes buněčnou membránu do buněk a do centrálního nervového systému (např. vitamin C) Lipofilní rozpustné v tucích (hydrofobní) pomaleji se dostávají na místo účinku, ale působí v lipoproteinech a membránách, proto se někdy také nazývají membránové antioxidanty (např. vitamin E) Amfofilní spojují vlastnosti dvou předchozích skupin (např. melatonin) d) Podle lokalizace v buňce či mimo buňku Extracelulární působící mimo buňku; jejich význam je menší Intracelulární působící uvnitř buňky; rozhodující význam pro ochranu před volnými radikály 22

e) Podle velikosti molekuly Nízkomolekulární např. β-karoten, vitamin C Vysokomolekulární především enzymy, které se podílejí zejména na intracelulární antioxidační ochraně; např. superoxiddismutáza f) Podle mechanismu účinku Katalyzátory jsou to látky, které se při reakci nespotřebovávají; např. enzymy a některé sloučeniny kovů, které napodobují enzymy svým mechanismem účinku Chelatační látky působí tak, že váží přechodné kovy např. Fe, Cu nebo Ni a tím brání jejich uplatnění ve Fentonově reakci; stejně působí i některé bílkoviny, např. transferin, haptoglobin nebo laktoferin Inhibitory enzymů g) Podle typu volného radikálu, na který daný antioxidant působí Superoxid např. superoxiddismutáza Hydroxylový radikál např. albumin, cholesterol, manitol, dopamin Singletový kyslík např. vitamín C, vitamín E, β-karoten Oxid dusnatý např. aminoguanidin, N-methyl-L-arginin Kyselinu chlornou např. histidin, methionin h) Praktický způsob dělení antioxidantů Z výše uvedených příkladů vyplývá, že nelze při dělení antioxidantů zvolit pouze jediné kritérium. Bylo by nedostatečné a navíc se jednotlivá hlediska částečně překrývají. Proto se většinou pro zjednodušení uvádí následující rozdělení antioxidantů: Přirozené antioxidanty látky, které je člověk schopen produkovat nebo je přijímá v potravě a které se zapojují do metabolismu, např. vitamíny. Umělé antioxidanty mezi umělé antioxidanty můžeme zařadit např. celou řadu léčiv, které mají mimo jiné i antioxidační účinky. Řadíme zde také látky přirozené, které jsou chemicky nebo jinak modifikovány, a tak získávají nové, požadované vlastnosti (Racek, 2003). 23

6 ANTIOXIDAČNÍ SYSTÉM ORGANISMU ČLOVĚKA Pro nalezení pravé příčiny vzniku ochranného antioxidačního systému se musíme podívat daleko do historie naší planety. Fotosyntetická aktivita sinic způsobila před 2,5 miliardami let silný vzestup koncentrace kyslíku v zemské atmosféře. Začal tak na organismy působit určitý stres, který mohly přežít jen druhy, které se dokázaly tomuto prostředí přizpůsobit. Vyvinul se u nich mechanismus chránící je před vysoce reaktivními formami kyslíku (Šípek, 2000). Organismus používá tří možných typů ochrany: 1) Nejefektivnějším způsobem ochrany je mechanismus preventivní. Cílem je to, aby volné radikály vůbec nevznikaly. Toho lze dosáhnout regulací aktivity enzymů nebo vychytáváním tranzitních sloučenin z reaktivních pozic (antioxidační enzymy, látky chelatující přechodné kovy). 2) Další možností je záchyt a odstranění již vzniklých radikálů. Jde tedy o inhibici iniciační fáze řetězové reakce a přerušení propagační reakce. Tyto látky se označují jako vychytávače nebo zametače (scavengers), lapače (trappers) a zhášeče (quenchers). Takto účinkují například hydrofilní vitamín C, lipofilní vitamín E, glutation, karotenoidy, flavonoidy nebo amfofilní kyselina lipoová. 3) Posledním způsobem jsou obecné reparační mechanismy likvidace nebo opravy poškozených biomolekul. Například fosfolipázy odstraňují poškozené mastné kyseliny z fosfolipidů, proteázy štěpí oxidačně modifikované peptidy a proteiny a restrikční endonukleázy opravují poškozenou DNA (Stratil, 2005; Šípek, 2000). Antioxidační ochranný systém organismu člověka představuje velmi složitý komplex mechanismů, které pracují ve vzájemném propojení. Schematické zobrazení hlavních rekcí je zachyceno na obr. 2. Jednotlivé součásti ochranného antioxidačního systému jsou velmi různorodé, vyskytují se v různých koncentracích, mají nestejnou intenzitu i mechanismus, kterým účinkují (Benzie, Strain, 2005). 24

Obr. 2 Antioxidační systém člověka (zpracováno podle Willcox et. al., 2004; Benzie, Strain, 2005; Šípek, 2000) Vysvětlivky: O 2 - superoxid SOD superoxiddizmutáza H 2 O 2 peroxid vodíku GSH redukovaný glutathion GSSG oxidovaný glutathion NADPH+H+ redukovaný nikotinamidadenindinukteotidfosfát NADP+ nikotinamidadenindinukteotidfosfát HClO kyselina chlorná HO hydroxylový radikál ROS reaktivní formy kyslíku (Reactive oxygen species) PUFA polynenasycené mastné kyseliny (Polyunstaurated fatty acids) RO 2 alkylperoxylový radikál DHA dehydroaskorbát FR Fentonova reakce 25

6. 1 Antioxidační enzymy Enzymy mají významnou roli při vzniku a vzájemných přeměnách ROS. Některé enzymy jsou nezbytné pro správnou funkci organismu (tvorbou volných radikálů), jiné enzymy se uplatňují při vzniku volných radikálů, které poškozují buňky a tkáně. Pro mou práci je nejdůležitější velká skupina enzymů, která je základem intracelulární, antioxidační ochrany organismu. Jak již bylo naznačeno, nejdůležitější je vzájemná spolupráce všech enzymových i neenzymových antioxidantů v celém antioxidačním systému (Rahman, 2007; Percival, 1998). 6. 1. 1 Superoxiddizmutáza Superoxiddizmutáza (anglicky superoxide dismutase, SOD) je přirozený, základní antioxidační enzym, který likviduje superoxidový radikál (O -. 2 ). Superoxidový radikál vzniká jednoelektronovou redukcí kyslíku a je považován za nejčastěji se vyskytující volný radikál v živých organismech. Superoxidový radikál je účinně zhášen a přeměňován na méně toxický peroxid vodíku, dle následující reakce. 2 O -. 2 + 2 H + H 2 O 2 + O 2 Vzniklý peroxid vodíku musí být následně odstraňován, především enzymy katalázou a peroxidázou (Racek, 2003; Brian, 2009). Samotná molekula superoxidového radikálu není příliš reaktivní, ale rizikem je to, že z něj mohou vznikat další, mnohem reaktivnější formy kyslíku, např. hydroxylový radikál. Ten je nejnebezpečnější zejména proto, že má velmi krátký poločas rozpadu (řádově 10-9 s). Rozeznáváme tři druhy superoxiddizmutázy, které se vzájemně liší obsaženým atomem kovu (kofaktorem) (Racek, 2003; Šípek, 2000; Rahman, 2007): a) Cu 2+ /Zn 2+ SOD b) Mn 2+ SOD c) Fe 2+ SOD 6. 1. 2 Glutationperoxidáza Jak jsem se již zmínila, organismus rozkládá superoxidový radikál na peroxid vodíku, ze kterého následně může vzniknout daleko nebezpečnější hydroxylový radikál. 26

Proto je snahou organismu zbavit se přebytku peroxidu vodíku. Za tímto účelem se vyvinuly dva systémy. Prvním je enzym kataláza, o kterém se zmíním v další kapitole. Druhým jsou enzymy peroxidázy (Rahman, 2007; Brian, 2009). Glutathionperoxidáza (GSHPx) je enzym, který katalyzuje redukci peroxidu vodíku a současnou oxidaci glutationu (GSH), obsahujícího cystein: H 2 O 2 + 2 GSH 2 H 2 O + GSSG Aby glutathionperoxidáza mohla účinně likvidovat peroxid vodíku, je potřeba regenerovat glutathion. To zajišťuje enzym glutathionreduktáza, který používá k redukci glutathionu koenzym NADPH: GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Glutathionperoxidáza se vyskytuje v několika různých formách, které se vzájemně liší stavbou molekuly a nacházejí se v různých částech buňky. Jako příklad bych uvedla cytosolovou (cgshpx), gastrointestinální (gi GSHPx) nebo plazmatickou (pgshpx) glutathionperoxidázu. Většina forem glutathionperoxidázy jsou selenoproteiny, které obsahují jako součást peptidového řetězce selenocysteinový zbytek. Proto se nedostatek selenu v dietě projeví jako pokles aktivity GSHPx, ale až při značném deficitu (Šípek, 2000; Rahman, 2007). 6. 1. 3 Kataláza Kataláza (CAT) je enzym, který zajišťuje štěpení peroxidu vodíku na vodu a kyslík, dle následující rovnice (Brian, 2009). 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Kataláza však rozkládá pouze peroxid vodíku ve vysokých koncentracích a tím se liší od peroxidáz, které působí na nízké koncentrace peroxidu vodíku (popř. i jiných hydroperoxidů). Peroxidázy navíc ještě potřebují další kosubstrát, který je v reakci oxidován. Nejvyšší aktivita katalázy v lidském organismu je v mitochondriích a peroxisomech jaterních buněk a v cytoplasmě erytrocytů. Význam pro organismus spočívá v ochraně buněk před toxickým vlivem peroxidu vodíku a navazuje tak, spolu s peroxidázami, na činnost superoxiddizmutázy (Racek, 2003; Šípek, 2000; Rahman, 2007; Brian, 2009). Kataláza má ze všech enzymů pravděpodobně největší schopnost reakce s volnými radikály. Jedna molekula katalázy je schopna přeměnit asi 6 miliónů molekul peroxidu vodíku na vodu a kyslík za jednu minutu (Mates et. al.,1999). 27

6. 2 Další antioxidanty 6. 2. 1 Glutathion Glutathion patří mezi nejdůležitější intracelulární neenzymové antioxidanty, který je chemickou strukturou tripeptid, konkrétně γ-glutamylcysteinylglycin. Vyskytuje se buď ve formě redukované jako thiol GSH (která převažuje) nebo ve formě oxidované jako disulfid GSSG. Aby nedošlo k narušení antioxidační kapacity buňky, snaží se organismus udržet stabilní poměr GSH/GSSG. Hlavní funkcí glutationu je odstraňovat ROS, udržovat v redukované formě sulfhydrilové skupiny (-SH) proteinů a regenerovat tokoferol a askorbát. V neposlední řadě je GSH nezbytným substrátem glutathionperoxidáz (Percival, 1998; Rahman, 2007). Obr. 3 Vzorec glutationu (Velíšek, Cejpek; 2008) Obr. 4 Oxidoredukční přeměny glutationu a jeho vztah k antioxidačním enzymům (zpracováno podle Komprda, 2008) 28

6. 2. 2 Melatonin Melatonin je hormon epifýzy, který řídí cirkadiální rytmy a má významnou antioxidační aktivitu. Vzniká acetylací a metylací serotoninu. Je rozpustný v tucích i ve vodě, což mu umožňuje pronikat přes membrány i přes hematoencefalickou bariéru (odděluje vnitřní prostředí mozku obratlovců od cévního systému) (Racek, 2003; Rahman, 2007). Obr. 5 Vzorec melatoninu (Komprda, 2008) Funkce melatoninu jako antioxidantu (Reiter et. al., 2003): Působí přímo jako scavenger volných radikálů Stimulace antioxidačních enzymů Zvyšování efektivnosti mitochondriální oxidativní fosforylace a snížení unikání elektronů (a tím snížení vzniku volných radikálů) Rozšiřování účinnosti ostatních antioxidantů Některé studie však význam melatoninu jako antioxidantu do určité míry zpochybňují, protože je produkován v noci, přestože největší nápor VR je ve dne. Při experimentech na pokusných zvířatech byl antioxidační účinek pozorován až při koncentracích, které převyšovaly fyziologické koncentrace o 3-4 řády (Pekárková et. al., 2001). 6. 2. 3 Kyselina lipoová Kyselinu lipoovou můžeme nazvat univerzálním antioxidantem, protože reaguje s alkylperoxylovými radikály RO 2, askorbylovými radikály, hydroxylovým radikálem HO, superoxidem O 2-, tokoferolovými radikály a HClO. Lipoát se také 29

významně podílí na regeneraci tokoferolu, a to buď přímo, nebo nepřímo přes askorbát (Šípek, 2000; Percival, 1998). Obr. 6 Vzorec kyseliny lipoové (www 1) 7 LÁTKY S ANTIOXIDAČNÍM ÚČINKEM, PŘIROZENĚ SE VYSKYTUJÍCÍ V POTRAVINÁCH A POTRAVINOVÝCH SUROVINÁCH 7. 1 Antioxidační vitamíny 7. 1. 1 Karotenoidy Karotenoidy jsou přírodní pigmenty, žluté až červené barvy, které jsou syntetizovány rostlinami a mikroorganismy, nikoliv však živočichy (Paiva, 1999). Dosud bylo v přírodě charakterizováno asi 600 karotenoidů (a to nepočítáme cis- a trans-izomery), ze kterých je asi 10% využíváno jako prekurzoru vitamínu A. K nejdůležitějším karotenoidům patří β-karoten, lykopen, α-karoten, γ-karoten, β- kryptoxantin, lutein a zeaxantin. Dle své chemické struktury se karotenoidy řadí mezi tetraterpeny, tzn. obsahují 8 izoprenových jednotek, celkem tedy 40 atomů uhlíku (Hlúbik, Opltová, 2004; Shahidi et al., 2007). Hlavní biologická funkce karotenoidů v lidském organismu (Stratil, 1993; Paiva, 1999): Antioxidační působení zhášejí vysoce reaktivní kyslíkové radikály (scavengers) Funkce provitamínu A Snižují poškození jater Snižují výskyt rakoviny kůže Inhibují mutagenezi Inhibují vývoj nádorů 30

Hlavními zdroji lykopenu v potravě jsou rajčata a výrobky z nich, meloun, papája, grapefruit a šípky. Hlavními zdroji β-karotenu je mrkev, meruňky, mango, kapusta, špenát a brokolice. Hlavními zdroji α-karotenu v potravě jsou mrkev a dýně. Hlavními zdroji luteinu a zeaxantinu v potravě jsou špenát, kapusta, brokolice, hrách, růžičková kapusta, hlávkový salát a vaječný žloutek. Hlavními zdroji kyptoxantinu v potravě jsou avokádo, pomeranče, papája a mučenka jedlá (Voulitainen et. al., 2006). Karotenoidy se dle své chemické struktury dělí na (Paiva, 1999): a) Karoteny b) Xantofyly kyslíkaté deriváty karotenů Obr. 7 Rozdělení karotenoidů (zpracováno podle Velíšek, Cejpek, 2008; Velíšek, 1999) 31

Obr. 8 Přehled vzorců karotenoidů (Velíšek, 1999) 7. 1. 2 Vitamín E Vitamin E byl poprvé objeven v listovém salátu a pšenici a byl pojmenován následujícím písmenem abecedy. Později bylo zjištěno, že tento vitamín je zapotřebí k narození dětí. Proto se začal používat název tokoferol, který vznikl z řeckých slov tokos (narození), phero (přinést) a koncovka ol, která znamená alkohol (Chow, 2001). Vitamin E je souhrnný název pro skupinu osmi izomerů, z nichž biologicky nejvýznamnější je α-tokoferol (Kalač, 2003). Struktura typická právě pro tento vitamín a jeho charakteristická poloha v membránách zaručují jeho jedinečné účinky. Molekula vitamínu E je tvořena chromanovým kruhem tzv. hlava a fytylovým řetězcem tzv. ocas. Pro celou molekulu je typické, že hlava je vždy hydrofilní a ocas je vždy hydrofobní. Do skupiny vitamínu E patří 4 formy tokoferolu a 4 formy tokotrienolu. Vzájemně se liší substituenty na chromanovém kruhu, jak je znázorněno v tabulce 3 (Papas, 2001; Benzie, Strain, 2005; Morrissey, Kiely, 2005). Obr. 9 Vzorec α-tokoferolu (www 2) Obr. 10 Vzorec tokotrienolu (www 3) 32

Tab. 3 Substituenty u jednotlivých forem vitamínu E (www 3) Forma R 1 R 2 R 3 Alfa (α) CH 3 CH 3 CH 3 Beta (β) CH 3 H CH 3 Gama (γ) H CH 3 CH 3 Delta (δ) H H CH 3 Na následujícím obrázku je znázorněna typická pozice vitamínu E v dvouvrstevné struktuře buněčné membrány. Molekula vitamínu se zachytí ve vnitřní části membrány svým hydrofobním ocasem a hydrofilní hlava je umístěna v hydrofilním prostředí membrány (Papas, 2001; Traber, 2005). Obr. 11 Strategická pozice vitamínu E v membránách (Papas, 2001) Vitamín E chrání zejména buněčné membrány před lipoperoxidací. Při peroxidaci lipidů přeměňuje alkylperoxylové radikály lipidů LOO na hydroperoxidy LOOH, které jsou následně rozkládány působením enzymu gluthionperoxidázy. Tím je přerušen řetězec lipoperoxidace a alkylperoxylové radikály mastných kyselin nemohou napadat další molekuly mastných kyselin (Bender, 2005). Tokoferol se přitom mění na tokoferylový radikál, který je stabilnější a je díky askorbátu zčásti redukován zpět na tokoferol (Racek 2003; Morrissey, Kiely, 2005). 33

Význam ochranných funkcí vitamínu E je obrovský a mnohostranný. Nejdůležitější je význam preventivní, ve smyslu snížení rizika SCO, Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby nebo vzniku očního zákalu. Vitamín E inhibuje shlukování a ulpívání krevních destiček na cévní stěnu (agregace a adheze trombocytů). Další významnou funkcí je ovlivnění proliferace buněk hladkého svalstva, což je jeden z nejdůležitějších bodů v řetězci patologických změn v cévní stěně, který vede ke vzniku aterosklerózy (Hlúbik, Opltová, 2004). Stanovení doporučené denní dávky není zcela jednoduché, protože existují dva přístupy k této problematice. Denní potřeba pro zabránění zjevného nedostatku je stanovena na 5 12 mg/den. Je však zapotřebí brát v úvahu, že při doporučeném zvýšeném příjmu nenasycených mastných kyselin, je nutno navýšit toto množství o 0,4-0,6 mg α-tokoferolu na 1 g nenasycených mastných kyselin. Druhou možností je optimální příjem s cílem snížení rizika chronických degenerativních onemocnění, např. rakovina nebo SCO. Toto množství je stanoveno na 40 60 mg/den (Stratil, 1993; Komprda, 2007). Deficit vitamínu E se projevuje jako nezánětlivé svalové onemocnění nebo svalová porucha (myopatie), nezánětlivé onemocnění nervu (neuropatie) nebo jako nekróza jater. Dále se zkracuje doba přežívání červených krvinek a nastává ztráta plodnosti. Na molekulární úrovni dochází k poškození buněčných membrán (Chow, 2001). Hlavním zdrojem tokoferolů v potravě jsou rostlinné oleje, ořechy, mák, sezamové semínko, kukuřice, hrášek a obilné výrobky. Z živočišných zdrojů jsou nejdůležitější vejce a vnitřnosti (Hlúbik, Opltová, 2004; Stratil, 1993; Chow, 2001). Obr. 12 Vychytávání volných radikálů pomocí α-tokoferolu (Komprda, 2008) 34

7. 1. 3 Vitamín C Vitamín C (kyselina L-askorbová neboli γ-lakton 2-oxo-L-gulonové kyseliny) patří mezi esenciální mikronutrienty, rozpustné ve vodě, které jsou nezbytné pro mnoho biochemických dějů. Reverzibilní oxidačně-redukční systém, který využívá vitamín C, je charakterizován přenosem dvou elektronů. Lidé, primáti a morčata ztratili schopnost tento vitamín syntetizovat ve svém organismu, a proto jej musí přijímat v potravě (Hlúbik, Opltová, 2004; Johnston et. al., 2001). Obr. 13 Kyselina askorbová jako donor elektronů, resp. redukční činidlo (Komprda, 2008) Funkce vitamínu C jsou velmi rozmanité a všechny probíhající procesy nejsou zcela objasněny. Je však jasné, že kyselina askorbová je kofaktorem nejméně osmi enzymů, působí při syntéze kolagenu, karnitinu a katecholaminů, podílí se na metabolismu aminokyseliny tyrozinu a na redukci peroxidů (Komprda, 2007). Vitamín C se podílí na tvorbě mezibuněčné hmoty, a proto je nezbytný pro tvorbu a funkci všech tkání a orgánů, velmi důležitý je také při hojení ran, zlomenin apod. (Stratil, 1993). Kyselina askorbová působí intracelulárně jako donor elektronů, při inkorporaci železa do feritinu, resp. uvolňování železa z této zásobní bílkoviny. Extracelulárně působí vitamín C proti oxidaci LDL (lipoproteiny o nízké hustotě), regeneruje tokoferol z tokoferoxylového radikálu a redukuje dietární Fe 3+ na Fe 2+ (forma ve které se může železo vstřebat). Kyselina askorbová je také součástí jaterních mikrozomálních enzymů, které se účastní oxidace léčiv a toxických látek a má důležitou regulační funkci při translaci genetické informace. Je známo, že vitamín C je důležitý pro imunitní obranu organismu, protože je nezbytný pro biosyntézu imunoglobulinů. Klinické studie dokazují, že vitamín C chrání proti širokému spektru virových chorob a je důležitý v prevenci nádorových onemocnění (Hlúbik, Opltová, 2004; Komprda, 2007). 35

Pro tuto práci je samozřejmě klíčová role kyseliny askorbové jako antioxidantu, který působí v biologických tkáních, kde snadno vychytává reaktivní volné radikály a tím efektivně chrání ostatní substráty před oxidativním poškozením. Antioxidační účinek spočívá v redukci anorganických i organických radikálů, které lze rozdělit do následujících kategorií (Padayatty, 2003; Hlúbik, Opltová, 2004): Sloučeniny s nepárovým počtem elektronů (volné radikály) např. superoxid, hydroxylový radikál, alkoxyl, peroxyl, hydroperoxyl Velmi reaktivní sloučeniny, které ale nejsou volnými radikály např. kyselina chlorná, nitrosaminy, ozon Sloučeniny, které vznikají reakcemi s předcházejícími dvěma skupinami a poté reagují s vitamínem C např. regenerace α-tokoferolu Přechodné reakce zprostředkované kovy např. železo a měď (Padayatty, 2003) Velmi důležitá je výše zmíněná kooxidační funkce při regeneraci α-tokoferolu. Při eliminaci volných radikálů rozpustných v tucích vznikají z α-tokoferolu tokoferoxylové radikály, současně se kyselina askorbová mění na askorbylový radikál. Tato funkce vitamínu C je považována za velmi důležitou, protože zabraňuje prooxidačnímu působení α-tokoferylu (Hlúbik, Opltová, 2004). Další funkcí vitamínu C je preventivně posilovat imunitní systém a předcházet chronickým degenerativním onemocněním. Doporučený denní příjem pro dospělého člověka je 75 mg. Potřeba kyseliny askorbové však vzrůstá při vysoké tělesné zátěži, při stresu, při diabetu nebo při zánětlivém procesu v organismu a u silných kuřáků. Maximální denní příjem by neměl být vyšší než 1000 mg, protože vyšší dávky jsou zbytečně vylučovány močí, představují silnou zátěž pro ledviny a mohou vyvolat jejich poškození (Komprda, 2007; Stratil, 1993; Johnston et. al., 2001). Nejvýznamnějším projevem úplného deficitu vitamínu C je vznik skorbutu (kurdějí), což se klinicky projevuje jako poruchy tvorby kostí, poruchy růstu, náchylnost ke krvácení vnitřních orgánů, kůže a sliznic. V hospodářsky vyspělých zemích se skorbut v současnosti prakticky nevyskytuje. Více pravděpodobný je výskyt hypovitaminózy, která se vyskytuje zejména v předjaří. Projevuje se únavou, sníženou výkonností, nechutenstvím, zvýšenou náchylností k infekčním onemocněním nebo ztíženým hojením ran (Komprda, 2007; Stratil, 1993). 36

Nejvýznamnějším zdrojem vitamínu C v potravě je čerstvé ovoce a zelenina. Výborným zdrojem jsou pomeranče, grapefruity, kiwi, mango, jahody, šípky, černý rybíz, paprika, kadeřavá petržel a brokolice (Velíšek, 1999; Padayatty, 2003). Avšak při dlouhodobém a nadměrném užívání vitamínu C (především v syntetické formě) v přítomnosti Fe 3+ se jeho účinek může změnit v prooxidační (Padayatty, 2003; Holeček, Rokyta, Vlasák, 2008). 7. 1. 4 Koenzym Q10 Koenzym Q10 neboli ubichinon je látka s antioxidačním účinkem, která se vyskytuje ve všech buňkách lidského těla (proto název ubichinon). V celém lidském těle jsou obsaženy asi 2 g. Z hlediska chemické struktury jde o derivát benzochinolu a označení Q10 znamená, že sloučenina obsahuje 10 izoprenových jednotek ve vedlejším lipofilním řetězci. Působí tedy jako lipofilní antioxidant (Holeček, Rokyta, Vlasák, 2008; Šípek, 2000). Koenzym Q10 se nachází především v mitochondriích a má důležitou funkci při přenosu elektronů v dýchacím řetězci (Racek, 2003). Další důležitou funkcí je funkce antioxidační. Působí tak, že lapá peroxylový a alkoxylový radikál a má schopnost regenerovat lipofilní antioxidant tokoferol (Šípek, 2000). Z přirozených potravinových zdrojů jsou nejvýznamnější maso, hlavně příčně pruhovaná svalovina a srdce, dále ryby, zelenina a sója. Významné množství vzniká také v těle člověka syntézou z tyrosinu, pro kterou je však zapotřebí nejméně 8 vitamínů a jiných látek. Doporučený denní příjem je nejméně 10 mg, terapeutická dávka bývá 100-300 mg. Vstřebávání koenzymu Q10 můžeme zlepšit podáváním před jídlem, které obsahuje alespoň malý podíl oleje. Stárnutím organismu se koncentrace koenzymu Q10 snižuje. Nedostatek se projevuje jak oslabením imunitního systému, tak i poklesem tvorby T-lymfocytů (Holeček, Rokyta, Vlasák, 2008; Šípek, 2000). 7. 2 Fenolické antioxidanty Mezi polyfenolické antioxidanty můžeme zařadit velmi rozsáhlou skupinu sloučenin, které se vyskytují v rostlinné stravě, a to zejména v ovoci, zelenině, čaji, víně a kakau. Tuto širokou skupinu sloučenin spojuje to, že vždy obsahuje minimálně jedno 37