Fluorospektrometr NANODROP ND-3300 Návod na obsluhu v 2.8 Obsah 1. Přehled... 2 2. Úvodní nastavení... 3 3. Provoz... 4 4. Vytvoření/editace metod... 6 5. Profilování fluorescence... 6 6. Obecné modulové funkce... 7 7. Kvantifikace NK... 8 8. Kvantifikace proteinů... 9 9. Ostatní fluorofory... 9 10. Archivace a práce s daty... 9 11. Kontrola zdroje... 10 12. Problémy... 10 13. Údržba a záruka... 11 1/11
1. Přehled Thermo Scientific Nanodrop 3300 Fluorospektrometr využívá patentovanou technologii retence vzorků (povrchové napětí) k měření fluorescence v malém objemu. Unikátně čistá optika retenčního systému, v kombinaci s vhodným zpracováním signálu pro bílé LED diodové aplikace, umožňuje měření vzorku v široké škále vlnových délek pouze v 1 2 µl objemu bez použití kyvety a nákladné výměny filtrů. Excitační zdroj vychází z jedné ze tří elektroluminiscenčních diod v pevném stavu, které jsou orientovány kolmo k detektoru. 2048 - složka CCD pole detektoru (400-750 nm) je propojena optickým vláknem k povrchu optického měření. Spektrometr je konfigurován s filtrem, který slouží k eliminaci světelného šíření pod 395 nm. Na obrázku níže jsou uvedeny některé společné fluorofory, které mohou být měřeny na přístroji Nanodrop 3300 spolu s nejvhodnější excitací LED diody. UV LED max=365 nm; equipped with cut filter that eliminates excitation above 400 nm. Example Applications: GFP wt Em509 Quinine Sulfate Em450 Hoechst 33258 Em450 4-MU Em450 Q Dots various Blue LED max= 470 nm; equipped with cut filter that eliminates excitation above 495 nm. White LED range= 460-650 nm; uses virtual filtering. Example Applications: GFP wt Em509 EGFP Em509 FITC-FAM Em515 Alexa 488 Em520 PicoGreen Em525 RiboGreen Em525 Alexa 555 Em565 B-Phycoerythrin Em575 Q Dots various Example Applications: Cy3, Alexa 555 Em565 Alexa 568 Em600 Cy5, Alexa 647 Em667 Sulforhodamine 101 Em 600 5-CMTREm570 Q Dots various TET Em535 HEX Em555 Virtuální filtrování - bílé LED diody Abychom excitovali širší spektrum fluoroforů (rozsah od 460 do 650 nm), je vybrán zdroj bílé LED diody. Bílá LED dioda je složena z modré LED diody a žluto-oranžového fosforu, který je excitován modrou LED diodou, tak aby dal přibližně bílé spektrum (typicky namodralého vzhledu). Virtuální filtrace: jako referenční spektrum je brána mapa intenzit vlnových délek 2/11
bílé LED diody žlutého píku, měření vzorku, a pak matematicky stanoven reprezentativní vzorek signálu z celkového signálu. Zbytkový signál (s odstraněným pozadím) je vypočítán a zobrazen přes příslušné vlnové délky, které jsou určeny virtuálním emisním filtračním intervalem ( λ). λ je symetricky aplikován okolo vybrané analýzy nm (emisní vlnová délka). Všechna fluorescenční čtení mimo interval virtuálního filtru jsou nastavena na nulu. 2. Úvodní nastavení Software NANODROP funguje pouze na IBM PC kompatibilních počítačích s těmito minimálními vlastnostmi: Windows 2000, XP, Visa (pouze 32 bit), Windows 7 Professional (32 a 64 bit) 233 MHz nebo vyšší procesor CD ROM 1GB RAM pro 32 bit a 2 GB pro 64 bit systém 40 MB volného místa na disku Dostupný USB port Instalace Software je nutné nainstalovat před připojením přístroje. Při jeho instalaci se řiďte pokyny na obrazovce počítače, které Vás instalací vedou. Potom připojte zdroj energie a propojte USB kabel. Opět proběhne instalace ovladačů, při které se řiďte pokyny na obrazovce. Síťový zdroj zůstává zapojen trvale, spotřeba představuje asi 5W. Registrace Prosím registrujte se na www.nanodrop.com. Rádi Vás budeme informovat o novinkách v souvislosti s Vaším přístrojem. 3/11
3. Provoz Základní kroky jsou popsány níže: 1. S otevřeným horním ramenem napipetujte na spodní část vzorek. 2. Přiklopte horní rameno a proveďte inicializační krok pomocí PC softwaru. Automaticky se vytvoří sloupec vzorku mezi horním ramenem a spodní částí. Měření je hotové. 3. Jakmile otevřeme a otřeme buničinou, vlákna je měření hotové, výkyvné rameno obě části suchou která nezanechává Po ukončení každého měření běžně postačuje otřít obě ramena buničinou. Po proměření většího množství vzorků ovšem doporučujeme otřít i povrch přístroje kolem ramen. Po posledním měření rovněž doporučujeme otřít povrchy neionizovanou vodou. Pokud je nutná dekontaminace povrchů je možné ji provést například 0,5% roztokem chlornanu sodného nebo jinými přípravky (viz dále). U bílkovin a roztoků obsahujících surfaktanty může dojít k tomu, že u maloobjemových vzorků 1ul se objeví problémy s vytvářením sloupce mezi rameny. Řešením je otřít povrch obou ramen 30-40x pomocí buničiny. Vlastnosti povrchů se opět upraví a sloupec se bude vytvářet bez problémů. Pokud ve výjimečných případech problém přetrvává i dále, řešením je použití nekonstitučního přípravku PR-1. Problematické může být měření u nehomogenních roztoků nukleových kyselin. Příkladem jsou genomická DNA, fágová DNA a viskózní roztoky dalších nukleových kyselin. Řešením je zahřátí vzorků na 55 C a intenzivní protřepání (vortexing). Běžně nedochází v průběhu měření k takové míře odpařování, která by měření ovlivnila. U vysoce těkavých rozpouštědel, jako je hexan, může v průběhu měření dojít k odpaření vzorku. Úspěšně lze používat méně těkavá rozpouštědla, jako např. DMSO. V případě potřeby lze vzorek opět odsát z povrchu ramen pomocí pipety. 4/11
Aplikační moduly Software Nanodrop umožňuje řadu režimů, které byly připraveny pro potřeby laboratorních pracovníků. Budou probrány postupně. Kvantifikace NK - 33258 Hoechst dye, PicoGreen dye, RiboGreen dye, Quant-it DNA HS a Quant-It DNA BR metody. Kvantifikace proteinů - Quant-iT Protein, Fluorescamine, Fluoraldehyde OPA, a FluoroProfile assays. Ostatní fluorofory - FITC (Fluorescein) (metody užívající buď Modrou nebo Bílou LED), Cy3-Alexa Fluor 555 a Cy5-Alexa Fluor 647, 4-methyl umbelliferone, quinine sulfate, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 633, DyLight 649 a DyLight 680. Create/Edit Method Umožňuje vytvářet a editovat metody Fluorescence Profiler Je určen pro výběr excitace LED diody. Data Viewer Tento modul umožňuje uživateli pracovat s naměřenými daty. User s Manual.pdf verze podrobného manuálu v AJ. User Preferences Umožňuje základní nastavení pro každého uživatele. Source Check Tento mudul se požívá k ověření, zda LED diody fungují správně. Account Management Tento modul umožňuje řízení přístupových práv k datům. Toto může provádět pouze administrátor. Existují 3 typy uživatelských účtů: Hladina 10 nejvyšší, může zavádět nové uživatele, upravovat jejich data, vymazat je a určit přístupová hesla. V okamžiku instalace má úroveň 10 pouze Administrátor, jehož heslo je NANODROP. Doporučujeme toto heslo změnit. Každý uživatel může obdržet tuto úroveň bezpečnosti, ovšem nedoporučujeme to. Hladina 5 doporučeno pro běžného uživatele. Jeho účet je chráněn heslem a data jsou ukládána v jeho podadresáři. Hladina 0 umožňuje provádět měření každému uživateli pod jménem DEFAULT. Účet není chráněn heslem. V rámci tohoto modulu je rovněž možné měnit heslo. Administrátor určí, zda a kdy budou jednotlivá hesla exspirovat 5/11
4. Vytvoření / editace metod Každá metoda má svůj název jak pro inherentní fluorofory (např. FITC) a take pro aplikace (např. PicoGreen). Pět tlačítek ve spodní části seznamu metod v Editoru metod umožňují konfigurovat, měnit, přesouvat a ukládat nové metody. Poznámka: Kosočtverce označují předdefinované metody, které nemohou být modifikovány. 5. Profilování fluorescence Modul Profilování fluorescence byl navrhnut, aby umožnil uživateli zjistit excitační zdroj/emisní profil specifických nebo neznámých fluoroforů. Následující okna se objeví po vyběru tohoto modulu v hlavním menu: Jako první se proměří blank. Po změření blanku se automaticky zobrazí další okno. 6/11
Dále se setře blank ubrouskem a nanese 1-2 ul požadovaného vzorku. Klikne se na tlačítko MEASURE, aby se automaticky vyexcitoval vzorek postupně třemi LED diodami a poté se zobrazí jejich příslušné emisní profily. Pozn.: Pro detekci je min. 30 RFU. Software automaticky vybere LED diodu, která poskytuje největší RFU signál. Pokud se vygeneruje fluorescenční signál více než jedna LED dioda, může si uživatel uložit více metod. 6. Společné funkce Blank (F3) Před fluorescenčím měřením je nutné nahrát blank. Není nutné měřit blank před každým měřením. Measure (F1) Tlačítko umožňuje měřit vzorky. Re-blank (F2) Tlačítko umožňuje nahrát nový blank a také zobrazí přepočítaná poslední měření s tímto novým blank. 7/11
Print Screen (F4) Tlačítko umožňuje vytisknout aktuální obrazovku. Print Report (F5) Tímto tlačítkem se vytiskne existující report vzorku. Recording (F6) Umožňuje nahrát formát reportu. Show Report (F7) Zobrazí požadovaný report měření. View Standard Curve Zobrazí standardní křivku. Open Protocol Otevře protokol metody. Reset Window Kliknutím smažete aktuální měření. Method Jaká metoda je vybrána. Source Zobrazuje, který zdor metoda využívá. Measurement Type Zobrazuje výběr typu měření. Sample ID Název vzorku. 7. Kvantifikace Nukleových kyselin Předdefinované metody Je zde předdefinováno 6 aplikací, ve kterých se měří koncentrace nukleových kyselin: dsdna 33258 Hoechst dye dsdna PicoGreen dye Quant-It DNA BR Quant-It DNA HS RNA RiboGreen dye Sybr Green I 8/11
8. Kvantifikace proteinů Předdefinované metody Jsou zde předdefinovany 4 aplikace, ve kterých se měří koncentrace proteinů: Fluorescamine FluoroProfile Fluoraldehyde OPA Quant-iT Protein 9. Ostatní fluorofory Zde je předdefinováno 11 metod: Modré LED metody: Fluorescein, FITC, FAM DyLight 488 UV LED metody: DyLight 405 Quinine Sulfate 4-methyl umbelliferone Bílé LED metody: Cy3,Alexa Fluor 555 Cy5,Alexa Fluor 647 DyLight 549 DyLight 633 DyLight 649 DyLight 680 10. Archivace a práce s daty Data vzorků ze všech aplikačních modulů se automaticky uloží do archivačních souborů a lze je otevřít buď integrovaným softwarem v programu Data Viewer nebo tabulkovým programem jako je MS Excel. Data jsou ukládána na adrese: C:\ND-3300 Data User name Application Module (Hoechst dsdna, PicoGreen dsdna, RNA RiboGreen, etc.) Data Viewer Jedná se o užitečný program, který umožňuje uživateli upravovat formáty výstupů, importovat uložená data a přepočítávat data získaná z přístroje Nanodrop. S daty se dá pracovat i bez připojeného přístroje ND-3300. 9/11
11. Problémy V této části je popsáno řešení možných problémů. Jedná se o řešení poměrně triviálních problémů v USB komunikaci, kde hlavní je zajistit mechanické spojení PC a přístroje, jinak je třeba použít utilit podle v manuálu popsaného postupu. U ostatních potenciálních závad doporučujeme obrátit se na Vašeho distributora nebo přímo na společnost Nanodrop. 12. Kontrola zdroje Tento modul zkontroluje, jestli zdroje LED diod správně fungují. Následující spektra jsou typické příklady kontroly zdrojů modré a bílé LED diody. Pozn.: Při měření musí být povrch čistý a suchý. V tomto modulu není vyžadováno proměření blanku. Pokud kontrola spektra nebude vypadat jako zobrazeno na příkladech, doporučujeme opakovat měření s čistým a suchým povrchem. Pro další informace kontaktujte Vašeho lokálního distributora. Modrá LED dioda Kontrola zdroje Bílá LED dioda Kontrola zdroje 10/11
UV LED dioda Kontrola zdroje Obrazy se automaticky ukládají a archivují zde: C:\ND-3300 Data\Operation & Performance Images. 13. Údržba a záruka Čištění Základním požadavkem je udržení čistoty ramen přístroje. Po dokončení každého měření setřete vzorek z horního i dolního ramene. Rovněž doporučujeme, abyste po dokončení každého bloku měření otřeli obě ramena neionizovanou vodou. Postupujte přitom následovně: + Aplikujte 5 ul vody na spodní rameno + Mechanicky vytvořte pomocí horního ramene sloupec, nechte ho cca 2-3 minuty působit + Otřete vodu z obou ramen čistou buničinou Poznámka dh20 běžně stačí na čištění, v případech například zaschlých bílkovin doporučujeme použít 0,5M HCl s následným použitím 5ul H20 na odstranění případné reziduální HCl. Nepoužívejte pro aplikaci vody nebo roztoku Sava střičku. Záruka Společnost Nanodrop poskytuje záruku na díly i práci po dobu dvou roků od data zakoupení. Kompatibilita s rozpouštědly Spektrofotometr je kompatibilní s většinou rozpouštědel používaných v biomedicínské laboratoři. Tyto zahrnují metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, acetone, eter, chloroform, CCl4, DMSO, DMF, Acetonitril, THF, toluen, hexan, benzen, NaOH, chlornan sodný, ředěnou HCl, ředěnou HNO3, ředěnou kyselina octová Přístroj není kompatibilní s veškerými formami kyseliny fluorovodíkové (HF). 11/11