CHORUS. INFLUENZA A IgA

CHORUS INFLUENZA A IgA 81192 (36 testů) Výrobce: DIESSE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Itálie

OBSAH 1 Úvod... 3 2 Princip testu... 4 3 Složení soupravy... 4 4 Další potřebné vybavení k provedení testu... 5 5 Skladování a stabilita komponent... 6 6 Bezpečnost práce... 6 7 Technické připomínky... 7 8 Vzorky a jejich skladování... 7 9 Pracovní postup.... 8 10 Validita testu... 8 11 Hodnocení výsledků... 8 12 Interpretace výsledků... 9 13 Charakteristika soupravy... 9 14 Literatura... 11 15 Vysvětlení symbolů... 12 2/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

Kvantitativní stanovení IgA protilátek proti Influenza A viru v lidském séru na přístrojích Chorus/Chorus Trio pomocí jednorázového testovacího zařízení 1 Úvod Chřipka je akutní horečnaté virové onemocnění dýchacích cest mající často epidemický až pandemický výskyt. Infekce se zpravidla přenáší kapénkovou cestou. Virus se šíří ze sliznice horních cest dýchacích do celého dýchacího systému. Tam faktory virulence umožňují množení viru a vyvolávají zánět sliznice dýchacích cest. Po uplynutí inkubační doby (1 až 3 dny) se objevují příznaky onemocnění. Mezi první symptomy onemocnění je řazena horečka, která je často doprovázena třesavkou, následně se objeví příznaky kataru, které přispívají ke klinickému obrazu onemocnění zahrnujícímu bolestivý, suchý kašel, tracheitidu, laryngitidu a často rhinitidu a konjunktivitidu. Sérové protilátky se objevují 2. týden po nástupu onemocnění, vrchol titru následuje kolem 4. týdne a perzistuje měsíce až roky, než postupně klesne Influenza je vysoce nakažlivá, snadno se šíří a je každoročně zodpovědná za značnou nemocnost a velký počet úmrtí. Zvláště rizikoví jsou starší lidé a oslabení jedinci, u kterých se může rozvinout vážné onemocnění a komplikace. V průběhu epidemie mohou viry influenzy způsobit 10000 až 20000 úmrtí starších lidí a pacientů s chronickými kardiovaskulárními a plicními onemocněními. Viry chřipky tvoří skupinu virů s principiálně podobnými morfologickými, chemickými a biologickými vlastnostmi. Byly identifikovány typy A, B a C, u kterých je známo mnoho antigenních variant. Rozlišení typů je možné pomocí odlišné antigenity jejich nukleoproteinu, který je pokryt matrixovým proteinem opět se specifickou antigenitou. Oba interní antigeny jsou však pro imunitu méně významné. Zásadními antigeny jsou hemaglutinin a neuraminidáza. Oba patří mezi povrchové antigeny a jejich antigenita se neustále mění, což se označuje jako antigenní drift nebo shift. Výskyt epidemie nebo pandemie nové chřipky je posílen zejména variabilitou antigenu, protože nové driftové a shiftové varianty infikují populaci, která je pouze částečně imunní nebo v extrémních případech kompletně náchylná k onemocnění. Serologická diagnóza akutní infekce je založena na detekci čtyřnásobného nebo většího nárůstu IgG titru protilátek mezi sérem z akutní fáze a sérem z rekonvalescenční fáze. Vyžaduje se tak odběr dvojic vzorků séra v intervalu asi 2 týdnů mezi prvním a druhým odběrem. Ačkoliv je serologická diagnóza založená na detekci IgG zpětná, a má proto omezenou využitelnost v mnoha klinických situacích, považuje se za nezbytný krok při sledování propuknutí infekcí influenzy a posouzení účinnosti vakcín a specifické antivirové léčby. 3/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

2 Princip testu Test je založen na principu ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Antigen se naváže na pevnou fázi. V průběhu inkubace vzniká vazba mezi specifickými IgA protilátkami vyšetřovaného séra a imobilizovaným antigenem. Zároveň prostřednictvím Ředícího roztoku vzorků obsahujícího protilátku proti lidskému IgG dojde k blokování IgG protilátek. Po promytí, která eliminují nenavázané proteiny, se provádí inkubace s konjugátem. Konjugát je roztok s obsahem monoklonálních protilátek proti lidskému IgA značených křenovou peroxidázou. Po další sérii promytí, které odstraní nenavázaný konjugát, se přidá substrát reagující s peroxidázou. Intenzita modrého zbarvení, které vznikne, je přímo úměrné koncentraci specifických protilátek přítomných v testovaném lidském séru. Jednorázový test obsahuje všechny reagencie nutné k provedení testu na přístrojích Chorus. Výsledky jsou vyjádřeny pomocí INDEXU. 3 Složení soupravy Souprava umožňuje provést 36 stanovení. Testovací jednotka 6 6 ks 6 samostatných balení po 6 jednotlivých jednorázových testech Kalibrátor 1 175 µl Roztok lidského séra o známé koncentraci protilátek, obsahující Proclin a Gentamicin, v pracovním ředění Pozitivní kontrola 1 425 µl Roztok lidského séra o známé koncentraci protilátek, obsahující Proclin a Gentamicin, v pracovním ředění Pracovní návod 1 ks Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu a ze samostatných balení odeberte stanovený počet jednorázových testů pro vlastní analýzu. Zbylé jednorázové testy vraťte zpět do obalu se sušidlem (silikagel gel obsahující oxid křemičitý), vytlačte vzduch a hermeticky uzavřete stisknutím uzávěru. Skladujte při +2 C až +8 C. 4/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

Obrázek 1 Schéma jednorázového testu Pozice 8 Pozice 7 Pozice 6 Místo pro štítek s čárovým kódem Prázdná pozice Mikrotitrační jamka s potaženým antigenem Influenza A virus antigen Pozice 5 Nepotažená mikrotitrační jamka Pozice 4 TMB Substrát 0,35 ml Tetrametylbenzidin 0,26 mg/ml a 0,01% H 2 O 2 stabilizovaný v 0,05 mol/l citrátového pufru (ph 3,8) Pozice 3 Ředicí roztok vzorků 0,35 ml Proteinový roztok obsahující protilátku proti lidskému IgG a 0,05% fenol, 0,02% Bronidox a indikátor přítomnosti séra Pozice 2 Konjugát 0,35 ml Roztok monoklonálních protilátek značených peroxidázou ve fosfátovém pufru obsahujícím 0,05% fenol a 0,02%Bronidox Pozice 1 Prázdná jamka Do této jamky se přidá neředěné vyšetřované sérum 4 Další potřebné vybavení k provedení testu Tyto reagencie nejsou součástí balení. Promývací roztok 83606 Čistící roztok 2000 83605 Sanitační roztok 83604 Chorus Negativní kontrola / Ředicí roztok vzorků 83607 Destilovaná nebo deionizovaná voda Běžné laboratorní sklo: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety na přesný odběr 50 až 200 μl roztoku Jednorázové rukavice Roztok chlornanu sodného (5 %) Nádoby na potenciálně infekční materiál 5/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

5 Skladování a stabilita komponent Reagencie se musí skladovat při teplotě +2 C až +8 C. V případě skladování při nesprávné teplotě se musí zopakovat kalibrace a validovat test pomocí kontrolního séra (viz 10, Validita testu). Datum exspirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku soupravy. Po otevření mají reagencie omezenou stabilitu. Jednorázový test 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Pozitivní kontrola 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Kalibrátor 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C 6 Bezpečnost práce Souprava je určena pouze pro diagnostické účely in vitro. Tato souprava obsahuje materiály lidského původu, které byly testovány a vykázaly negativní výsledky při použití metod schválených FDA pro stanovení přítomnosti HbsAg a anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátek. Protože však žádný diagnostický test nemůže poskytnout úplnou záruku, že infekční agens nejsou přítomna, je třeba s veškerým materiálem lidského původu zacházet tak, jako by byl potenciálně infekční. Při zacházení s materiálem lidského původu je nutné dodržovat všechny místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Likvidace zbytků pro provedení testu S použitými vzorky sér, kalibrátory, jednorázovými testy je třeba zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem a likvidovat je v souladu s platnou legislativou. Zdravotní a bezpečnostní informace 1. Nepipetujte ústy. Používejte rukavice na jedno použití a ochranu očí. Po umístění jednorázového testu do přístroje Chorus si důkladně umyjte ruce. 2. Některé reagencie obsahují nízké koncentrace škodlivých nebo dráždivých látek Pokud se některá s těchto reagencií dostane do kontaktu s kůží nebo očima, důkladně omyjte dané místo vodou. Konjugát obsahuje fenol TMB Substrát je roztok kyseliny 3. Neutralizované kyseliny nebo jiný tekutý odpad by se měl dekontaminovat přidáním dostatečného množství chlornanu sodného tak, aby konečná koncentrace dosahovala minimálně 1,0 %. Pro zajištění účinné dekontaminace ponechejte tento odpad 30 minut v 1% chlornanu sodném. 4. Rozlitý potenciálně infekční materiál je třeba okamžitě odstranit pomocí absorpčního papírového ručníku a kontaminovanou oblast umýt, například 1,0% chlornanem sodným, a to předtím, než budete v práci pokračovat. Chlornan sodný 6/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

nepoužívejte na rozlité tekutiny s obsahem kyseliny, ty musíte nejprve otřením vysušit. 5. Materiály použité k čištění potřísněných povrchů, včetně rukavic, se musí likvidovat jako potenciálně životu nebezpečný odpad. Materiály obsahující chlornan sodný nevkládejte do autoklávu. 7 Technické připomínky Pro získání spolehlivých výsledků je nutné přesné dodržování návodu. Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu (+18 C až +30 C) a test proveďte do 60 minut. Zkontrolujte a dodržujte následující informace: Substrát obsažený v pozici 4 je bezbarvý. Nepoužívejte jednorázové testy, které toto nesplňují. Testovaný vzorek je dokonale na dně jamky rozprostřen. Zkontrolujte zda-li všechny reagencie v testu jsou přítomny a jestli není jednorázový test poškozen. Nepoužívejte testy, které nemají reagencie. Jednorázové testy jsou určeny pro použití na přístroji Chorus. Důkladně dodržujte pokyny pro použití a řiďte se návodem k obsluze přístroje. Chorus přístroj správně nastavený (viz návod k obsluze). Neměňte čárový kód umístěný na držadle jednorázového testu. Nepoužívejte testy s poškozenými štítky s čárovými kódy. Defektní čárové kódy lze vložit do přístroje manuálně. Během skladování a použití nevystavujte jednorázové testy silnému světlu ani výparům chlornanu. Použití silně hemolytických vzorků nebo vzorků s mikrobiální kontaminací může vést k nereprodukovatelným výsledkům. Než vložíte jednorázový test do přístroje, zkontrolujte, že reakční jamka neobsahuje cizí tělesa. Pipetujte sérum (50 µl) do pozice 1 jednorázového testu (viz obrázek 1). Nepoužívejte jednorázový test po uplynutí expiračního data. 8 Vzorky a jejich skladování Jako vzorek k vyšetření může být použito sérum, získané odběrem žilní krve. Zachází se s ním v souladu se všemi opatřeními předepsanými správnou laboratorní praxí. Čerstvé sérum lze skladovat 4 dny při +2 C až +8 C. Séra je možné uchovávat při -20 C a lze je rozmrazit maximálně 3krát. Neskladujte vzorky v mrazácích s funkcí vlastního rozmrazování. 7/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

Rozmrazené vzorky je potřeba před použitím důkladně protřepat. Kvalita vzorku může být vážně narušena kontaminací, která vede k chybným výsledkům. Nepoužívejte silně lipemické, ikterické, hemolytické nebo kontaminované vzorky. Test nelze použít na lidskou plazmu. 9 Pracovní postup. 1. Otevřete balení, vyjměte požadovaný počet jednorázových testů a zbytek uzavřete zpět do sáčku poté, co vytlačíte vzduch. 2. Zkontrolujte stav jednorázového testu (viz 7 Technické připomínky). 3. Pipetujte 50 μl neředěného séra do pozice 1 každého testu. Při každé změně šarže soupravy použijte jednorázový test pro kalibraci. 4. Jednorázový test umístěte do přístroje. Proveďte kalibraci (je-li nutná) a vlastní stanovení podle pokynů uvedených v návodu k obsluze Chorus přístroje. 10 Validita testu Pomocí kontrolního séra ověřte správnost získaných výsledků. Použijte je v souladu s instrukcemi uvedenými v návodu na obsluhu. Pokud test ukáže, že se hodnota kontrolního séra pohybuje mimo přijatelné rozmezí, kalibraci je třeba opakovat. Předchozí výsledky budou automaticky opraveny. Pokud je výsledek kontrolního séra i nadále mimo přijatelné rozmezí, kontaktujte prosím: Tel: +39-0577-587121 (technická podpora) Tel: +39-0577-587154 11 Hodnocení výsledků Přístroj Chorus vyjadřuje výsledky jako INDEX (je to poměr mezi naměřenou hodnotou absorbance testovaného vzorku a CUT-OFF hodnotou). Hodnocení výsledků je popsáno v tabulce (Tabulka 1). Tabulka 1 Hodnocení výsledků INDEX menší než 0,9 Hodnocení negativní 0,9 až 1,1 hraniční větší než 1,1 pozitivní V případě hraničního výsledku zopakujte test. Pokud zůstává test nadále hraniční, je vhodné opakovat z nového odběru, který bude proveden s určitým časovým odstupem (1 až 2 týdny.) 8/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

12 Interpretace výsledků Test nelze použít pouze jako jedinou metodu pro stanovení klinické diagnózy. Negativní výsledky nemusí vylučovat eventuální infekci. Vzorky séra odebrané během akutní fáze onemocnění mohou vykazovat negativní výsledek, jelikož sérokonverze může přetrvávat ještě 3 až 4 týdny, až následně se protilátky objeví. V případě nálezu zvýšeného titru IgA protilátek doporučujeme odebrat za 8 až 14 dní další vzorek a zjistit případný nárůst titru protilátek. Interpretace serologických nálezu popisuje tabulka (Tabulka 2). Tabulka 2 Interpretace sérologických nálezů IgG IgA/IgM Interpretace nálezu + - předchozí infekce - + + + nedávná nebo probíhající infekce doporučujeme nový odběr po 1 až 2 týdnech pro zvýraznění sérokonverze pravděpodobná nedávná infekce pozitivita specifických IgA a IgM protilátek může přetrvávat dlouhou dobu Serologický nález je třeba vždy interpretovat pouze v kontextu s výsledky ostatních laboratorních testů a s klinickým obrazem pacienta. 13 Charakteristika soupravy 13.1 Analytická specifita Analytická specifita byla testována na 24 vzorcích obsahujících potenciálně interferující látky: ANA (4 vzorky) Bilirubin (4 vzorky) C-reaktivní protein (4 vzorky) Triglyceridy (4 vzorky) Hemolyzovaná séra (4 vzorky) Mononukleóza (4 vzorky) 9/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

13.2 Diagnostická citlivost a specifita Pro stanovení citlivosti a specifity bylo využito srovnání výsledků na jiné referenční soupravě. Při srovnání bylo testováno 145 vzorků. Výsledky srovnání jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 3). Tabulka 3 Výsledky srovnání zařazení testovaných vzorků Referenční souprava DIESSE Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní 70 4 74 Negativní 4 67 71 Celkem 74 71 145 Souprava vykazuje 94,4 % specifitu (CI 95% 86,4 až 97,8) a 94,6% citlivost (CI 95% 86,9 až 97,9). 13.3 Přesnost měření Intra-assay: testované vzorek byly opakovaně změřen; průměr naměřených hodnot, směrodatná odchylka a variační koeficient (%) jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 4). Tabulka 4 Intra-assay stanovení Vzorek Opakování vzorku Průměr naměřených hodnot Směrodatná odchylka Variační koeficient (%) IAA-C 2 15 1,0 0,17 7 Inter-assay: všechny testované vzorky byly analyzovány ve třech po dnech; průměr naměřených hodnot, směrodatná odchylka a variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 5). Tabulka 5 Inter-assay stanovení Vzorek Průměr naměřených hodnot (INDEX) Den 1 Den 2 Den 3 Průměrná hodnota Směrodatná odchylka Variační koeficient (%) IAA-C 1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,06 30* IAA-C 2 1,1 1,1 1 1,1 0,06 5,5 IAA-C 3 2 1,9 1,9 1,9 0,06 3,2 *Artefakt způsobený známou chybou variačního koeficientu, který se stává extrémně citlivým i na velmi malé změny průměru, blíží-li se průměrná hodnota nule. 10/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

14 Literatura 1. Voeten J.T.M et al. Journal of Clinical Microbiology, 36, 3527-3531, 1998. 2. Pachucki C.T.. Seminars in Respiratory Infections, 7, 46-53, 1992. 3. Harmon M.W. Laboratory Diagnosis of viral infections Ed. Lennette E.H., Smith T.S., 587-601, (1999). 4. G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin. Chem. 22:1243 (1976). 5. 5. R. Ziegalmaier et al.: ELISA. la Ricerca Clin. Lab. 10: 83 (1980) 11/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010

15 Vysvětlení symbolů Datum výroby Použít do data Nepoužívat opakovaně Čtěte přiložené dokumenty Výrobce Počet testů Skladovací teplota Čtěte návod k použití Biologická rizika Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Číslo šarže Diesse Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy Tel. 0577-587111 12/12 Rif. IO-09/236-C; IFU. 81192/MIT Ed. 06.12.2010