Stedoškolská odborná innost 2006/2007 Obor 03 Chemie Vývoj neinvazivní diagnostiky asthma bronchiale - zmny hladin marker v denním biorytmu Autor: Jan Pech O8B Gymnázium Nad Štolou 1 Praha 7 ÚOT VŠCHT Praha Vedoucí práce: Ing. Petr Kaer Ph.D. ÚOT VŠCHT Praha Praha, bezen 2007
Prohlašuji tímto, že jsem pedloženou práci vypracoval samostatn pod vedením Ing. Petra Kaera, Ph.D., za podpory lidí uvedených v podkování a uvedl jsem veškerou použitou literaturu v seznamu literatury. V Praze, dne 18.3.2007 Jan Pech, autor 2
Podkování Na tomto míst bych rád podkoval osobám bez jejichž podpory a pomoci by tato práce nevznikla. Rád bych podkoval Ing. Petrovi Kaerovi Ph.D. z ÚOT VŠCHT Praha, vedoucímu mé práce za podporu a cenné rady. Dále patí mj velký dík Kamile Syslové z ÚOT VŠCHT Praha za pomoc a podporu pi práci i bojích s technikou. MUDr. Jindišce Lebedové CSc. a Mgr. Hurtové z Ústavu pracovního lékaství 1.LF UK dkuji za zajištní odbr KVV. Musím podkovat též Prof. Ing. Liborovi ervenému DrSc., vedoucímu ÚOT VŠCHT Praha, za umožnní práce jeho skupin. Nemohu opomenout mé spolužaky Lenku Pokornou, Magdu Chorvátovou a Petru Dupalovou, které se mnou jako dobrovolnice absolvovaly odbry KVV. Za všestrannou pomoc a podporu musím podkovat též mým rodim. Mj dík patí též RNDr. Štpánce Selingerové a Ing. Han Kaerové z Gymnázia Nad Štolou, za podporu a pomoc s administrativou. 3
Obsah Abstrakt 5 Seznam zkratek 6 1. Úvod 7 2. Kondenzát vydechovaného vzduchu 9 3. Sledované látky 3.1. Leukotrieny 10 3.2. 8-isoprostan 12 3.3. Stabilita leukotrien 13 4. Asthma bronchiale 14 5. Oxidativní stres 16 6. Analytická instrumentace 6.1. HPLC/MS 17 6.2. Hmotnostní spektrometr 18 6.3. Použité pístroje, vybavení a chemikálie 20 7. Experimentální ást 7.1. Odbr a zpracování vzork 21 7.2. Píprava vzork pro HPLC/MS analýzu 22 7.3. Optimalizace podmínek analýzy 24 7.4. HPLC/MS analýza 25 8. Výsledky a diskuse 26 9. Závr 30 Literatura 31 4
Abstrakt Pedkládaná práce je souástí ešení širší problematiky Vývoj neinvazivní diagnostiky asthma bronchiale, který je realizován na Ústavu organické technologie VŠCHT Praha ve spolupráci s Klinikou nemocí z povolání 1. LF UK a VFN. Cílem tohoto projektu je vyvinout spolehlivou, rychlou a nenáronou neinvazivní metodu pro diagnózu asthma bronchiale, využívající monitorování hladin biomarker - leukotrien v kondenzátu vydechovaného vzduchu pomocí vysoce citlivé a selektivní analytické metody - HPLC/MS. Pedkládaná práce si kladla za cíl popsat zmny hladin biomarker výše zmínného onemocnní v prbhu 24 hodin. Znalost tchto zmn je dležitá pro pesné urení diagnózy bez ohledu na dobu odbru kondenzátu vydechovaného vzduchu. Pro zpracování vzork byla úspšn aplikována již vyvinutá separaní metoda immunoafinitní extrakce a hmotnostn spektrometrické analýzy. Výsledkem experimentální ásti je popis vývoje hladin marker v prbhu 24 hodin. Bhem dne, kdy je tlo aktivní, dochází k rovnomrnému rstu hladin marker a ve spánku k jejich poklesu. Paraleln byl též zkoumán vývoj hladiny 8-isoprostanu jakožto markeru oxidativního stresu. Výsledky byly podobné markerm asthma bronchiale. Abstract This study is a part of wider research Development of Noninvasive Diagnostics of Asthma Bronchiale, conducted at the Department of Organic Technology of the Institute of Chemical Technology Prague in a collaboration with the Department of Occupational Diseases of the 1st Faculty of Medicine, Charles University Prague. The aim of the project is to develop a reliable fast and unassuming noninvasive method to diagnose asthma bronchiale, using monitoring of leucotrien biomarker levels in the exhaled breath condensate (EBC) by means of the High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry instrumentation. The presented work tries to describe alterations of the asthma bronchiale biomarker levels during 24 hours. Knowledge of the daily shifts is important for the precise diagnose determination aside from a condensate collection time. EAC samples were successfully analyzed with already developed methods utilizing the immunoaffinit exctraction and the mass spectrometry analysis. The result of the experiment can be summarized in the following description of the biomarker level evolution during 24 hours: During daytime, when a body is active, levels of the biomarkers evenly grow, while during sleep they considerably decrease. Daily evolution of 8-isoprostan (an oxidative stress biomarker) level was studied in parallel. The results are similar to the asthma bronchiale biomarkers. 5
Seznam zkratek KVV kondenzát vydechovaného vzduchu LTA 4 leukotrien A 4 LTB 4 leukotrien B 4 LTC 4 leukotrien C 4 LTD 4 leukotrien D 4 LTE 4 leukotrien E 4 CysLTs cysteinylované leukotrieny (LTC 4, LTD 4, LTE 4 ) LTB 4 -d 4 - [6,7,14,15 2 H] leukotrien B 4 LTE 4 -d 3 - [20,20,20 2 H] leukotrien E 4 HPLC/MS vysokoúinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií COPD chronická obstrukní plicní nemoc GC plynová chromatografie ESI elektrosprejová ionizace APCI chemická ionizace za atmosférického tlaku MRM multiple reaction monitoring používaný mód hmotnostního spektrometru CID srážkov indukovaná disociace 6
1. Úvod Asthma bronchiale je onemocnní, jehož incidence v moderní populaci neustále roste jako dsledek zvyšujícího se potu alergen v životním prostedí. Ze stejného dvodu klesá i vk, kdy dochází k výskytu prvního astmatického záchvatu. Vasná diagnostika uvedeného onemocnní je dležitá z hlediska zahájení úinné terapie a minimalizace poškození pacienta. V souasné dob v praxi používané diagnostické metody spoívají v kombinaci invazivních a semi-invazivních metod, které jsou pro pacienta zatžující a v pípad dtí až stresující záležitostí. Analýza dechového kondenzátu (KVV) je pomrn novou metodou, která pedstavuje alternativní cestu, kterou je možné charakterizovat jako zcela neinvazivní a i pro dtského pacienta nezatžující diagnostickou metodu. Princip metody spoívá v kvantifikaci specifických látek - biomarker pro uvedené onemocnní, které se vyskytují v uvedené tlní tekutin a jejichž koncentraní hladina je v dsledku probíhající zántlivé reakce v dýchacích cestách a plicích významn zvýšena. K analýze dechového kondenzátu se používají biochemické metody, nebo metody využívající vysoce citlivé a specifické techniky na bázi hmotnostní spektrometrie. V souasné dob se problematika využití kondenzátu vydechovaného vzduchu jako zdroje biomarker celé ady plicních onemocnní nachází ve stavu, kdy byla popsána celá ada metodik jejich stanovení, ovšem výsledky uvedených studií vykazují znaný rozptyl, který je dán opomenutím celé ady specifických faktor, které je nutné respektovat pi zpracování a následné analýze této tlní tekutiny. Pedkládaná práce je souástí obsáhlejšího projektu vývoje neinvazivní diagnostické metody pro asthma bronchiale a dalších onemocnní (silikóza, azbestóza) jejichž markery jsou podobné markerm asthma bronchiale. Výzkum je provádn na Ústavu organické technologie VŠCHT Praha ve spolupráci s Ústavem pracovního lékaství 1.LF UK. Do souasné doby byla vytvoena metoda pro stanovení biomarker zmínných onemocnní v KVV kombinující tzv. immunoafinitní extrakci - vysoce specifickou separaci biomarker bronchiálního astmatu založenou na principu reakce monoklonální protilátky s píslušným markerem a hmotnostn spektrometrické analýzu vysoce citlivé a selektivní analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení daných marker. Cílem této práce je popsat vývoj hladin marker v prbhu dne jakožto jeden z dležitých aspekt pro správné vyhodnocení klinických výsledk a stanovení diagnózy. Hladina biomarker namená v KVV rzné denní dob se mže lišit, což by mohlo vést 7
ke zkreslení výsledk a tím až k nepesnému nebo dokonce chybnému stanovení diagnózy. Tento parametr je tedy nutné brát pi stanovení diagnózy v úvahu. 8
2. Kondenzát vydechovaného vzduchu Vyšetení vydechovaného vzduchu má dlouhou tradici. Již koncem 18. století jeho složení zkoumal francouzský chemik a léka Antoine Laurent de Lavoisier. S analýzou vydechovaného vzduchu se adu let bžn setkávají idii pi testování na požití alkoholu. Pro dech diabetik je typický charakteristický zápach zpsobený pítomností acetonu, kyseliny -hydroxymáselné a acetoacetátu.. Vydechovaný vzduch je však podstatn složitjší smsí látek, než by se mohlo zdát. Do souasnosti bylo ve vydechovaném vzduchu detekováno pes 200 látek a další pibývají. [1] Vydechovaný vzduch má dv fáze plynnou a kapalnou. V plynné fázi jsou obsaženy hlavn plyny uvolnné z krve a plyny pítomné ve vdechovaném vzduchu a dále tkavé látky uvolnné pi metabolických reakcích v lidském tle. Jde hlavn o oxid dusnatý, oxid uhliitý a oxid uhelnatý, vodu, peroxid vodíku a plynné uhlovodíky (ethan). V kapalné fázi, která je tvoena aerosolovými ásticemi strhávanými ze stn dýchacích cest a plicních sklípk, se nachází voda a mnoho složitých organických látek. Mezi nimi napíklad DNA, hormony (histamin, serotonin) a také velká skupina protein a metabolit kyseliny arachidonové. Práv metabolity kyseliny arachidonové tvoí skupinu látek, která nás zajímá. Nkteré z tchto látek (8-isoprostan, leukotrieny) jsou totiž citlivými markery a mediátory nkterých onemocnní - tedy substancemi, které svou pítomností nebo zvýšenou hladinou signalizují nastupující onemocnní ješt dlouho ped prvními klinickými píznaky nebo vypovídají o jeho rozsahu. [2,3] Vtšinu obsažených látek jak z plynné, tak z kapalné fáze - lze zkondenzovat dýcháním pes chladící zaízení. Tím získáme tzv. kondenzát vydechovaného vzduchu (KVV). V 1 ml KVV se nacházejí ádov desítky (1-200) pg pikogram výše zmínných metabolit kyseliny arachidonové. Jejich koncentrace pravdpodobn nejspolehlivji odráží jejich koncentraci v dýchacích cestách a sledováním jejich hladiny je možné hodnotit rozsah onemocnní a úspšnost léby. [2] V jiných pracích byly sledovány hodnoty tchto marker v rzných tlních tekutinách, napíklad v krevní plazm [3] nebo v moi [4]. Tyto koncentrace však vypovídají spíše o úhrnné tlní produkci než o obsahu v dýchacích cestách. 9
3. Sledované látky 3.1 leukotrieny Leukotrieny jsou spolen s prostaglandiny, prostacykliny, tromboxany souborn známé jako eikosanoidy (též ikosanoidy - ve všech pípadech jedná o C 20 -sloueniny). Jsou produkovány všemi savími bukami krom ervených krvinek a jsou to metabolity kyseliny arachidonové. Podobn jako hormony mají pi extrémn nízkých koncentracích znané fyziologické úinky. Zprostedkovávají napíklad: Zántlivou odpov Pocit bolesti a horeku Regulaci krevního tlaku Indukci srážení krve Kontrolu nkolika reprodukních funkcí, jako napíklad indukci porodních stah Regulaci cyklu spánku a bdní Od hormon se liší tím, že nejsou unášeny krevním eištm do místa úinku. Jsou to chemicky a biologicky nestálé látky (nkteré z nich se rozkládají in vitro 1 bhem nkolika minut), a díky tomu mají funkci spíše lokálních mediátor. Kyselina arachidonová (5,8,11,14-eikosatetraenová kyselina; viz obr. 1) je nenasycená mastná kyselina s 20 uhlíkovými atomy a tymi cis dvojnými vazbami. V tle je vázána ve fosfolipidech v bunných membránách. Psobením enzymu fosfolipázy A 2 je uvolována do organismu. inností enzymu 5-lipoxygenázy se kyselina arachidonová pemuje na nestabilní epoxidový leukotrien A 4 (LTA 4 ), který mže být dále pemován jednou ze dvou možných enzymatických drah. Psobením LTA 4 hydrolázy dochází ke vzniku leukotrienu B 4 (LTB 4 ), pípadn psobením enzymu LTC 4 syntetázy vzniká první len z tzv. cysteinylovaných leukotrien (cyslts) a to leukotrien C 4 (LTC 4 ). K cysteinylovaným leukotrienm dále adíme leukotrien D 4 (LTD 4 ) a leukotrien E 4 (LTE 4 ). V ad cyslts dochází k postupné pemn v ad LTC 4 LTD 4 LTE 4 následným psobením enzym glutamyltransferázy a dipeptidázy. Cys LTs se zejména uplatují v alergickém zántu. Jejich zdrojem jsou žírné buky a granulocyty. [1] 1 in vitro lat. ve skle, tj. ve zkumavce, za umlých laboratorních podmínek [5]. 10
COOH Kyselina arachidonová O 2 LYPOXYGENASA A 2 -H 2 O O COOH Leukotrien A 4 LEUKOTRIEN A4 HYDROLASA GLUTHION S TRANSFERASA H 2 O Gluthation OH OH COOH HOOC NH 2 O Leukotrien B 4 NH H N COOH S O GLUTAMYL TRANSFERASA OH COOH Leukotrien C 4 NH 2 H N COOH Kyselina glutamová S O OH COOH Leukotrien D 4 DIPEPTIDASA NH 2 Glycin S COOH OH COOH Leukotrien E 4 Obrázek 1: Schéma biosyntézy a pemn leukotrien 11
Cysteinylované leukotrieny LTC 4, LTD 4 a LTE 4 jsou nyní též považovány za složky pomalu reagujících látek anafylaxe 2, které se uvolují ze senzitizovaných plic po imunitní reakci. Tyto látky úinkují ve velmi malých koncentracích (až 10-10 mol/l) a jsou napíklad 10 000-krát úinnjší než histamin. Cysteinylované leukotrieny stahují hladké dýchací svalstvo, zvyšují propustnost cév, zužují dýchací cesty a stimulují tvorbu hlenu [6] ili zpsobují píznaky, které jsou popisovány v patofyziologii prduškové obstrukce 3. Na této skutenosti je postaven úinek moderních lék proti astmatu, které psobí jako vysoce selektivní antagonisté 4 cyslt 1 receptor. Uritá koncentrace leukotrien byla namena i v KVV zdravých lidí a rostla pímo úmrn se stupnm postižení bronchiálním astmatem [7]. Na rozdíl od koncentrace vydechovaného LTE 4, koncentrace vydechovaného LTB 4 má rostoucí tendenci u pacient s COPD 5 (99 pg/ml) [9] a u pacient s bronchiektazií 6 (80 pg/ml) [10] ve srovnání se zdravými lidmi (38 pg/ml) [9]. Koncentrace LTB 4 jsou rovnž zvýšené u fibrotik (76 pg/ml) [10]. Tyto zvýšené hodnoty potvrzují roli leukotrien v plicních zántlivých procesech. LTB 4 lze tedy považovat za marker probíhajícího akutního zántu. 3.2 8-isoprostan Další látkou, jejíž hladinu jsem se rozhodl sledovat je 8-isoprostan ze skupiny F2 isoprostan. Syntéza isoprostan bží na rozdíl od leukotrien dvma cestami: enzymatickou oxidací cyklooxigenázami a psobením volných kyslíkových radikál. Ve vtší míe vznikají isoprostany práv druhou cestou, tedy psobením volných kyslíkových radikál - neenzymatickou peroxidací membránových lipid, obsahujících kyselinu arachidonovou. Z toho je jasné, že isoprostany by mohly posloužit jako velmi citlivý marker oxidativního stresu. 7 2 anafylaxe prudká alergická reakce na cizorodé bílkoviny, která mže být i smrtelná [8]. 3 obstrukce pekážka, zamezení i ztížení prchodnosti dutým orgánem. Pí.: cizí tleso, kámen, hlen, nádor aj. [5]. 4 antagonisté opan psobící (nap. lék nebo sval) [5]. 5 COPD chronická obstrukní plicní nemoc. Chronické onemocnní, vznikající nejastji jako následek chronické bronchitidy, která postupn vedla k obstrukci ucpávání prdušek (opakované zánty, nadmrné množství hlenu. Dochází k poškozování plic (kašel, dušnost.) a nkdy též srdce [5] 6 bronchiektazie chorobné a trvalé rozšíení prdušek. nkdy je vrozené, astji vzniká jako následek nkterých (zejména opakovaných) zánt. V rozšíených prduškách probíhá tém stále zánt s infekcí (kašel s hojným vykašláváním, teploty a celkové píznaky chronického zántu ). Podávají se antibiotika a nkdy je nutné odstranní bronchiektazií operan [5] 7 oxidativní stres stav a dje vedoucí k vzniku velkého množství kyslíkových radikál, které mohou zpsobovat poškození bunk a tkání. Oxidativní stres je považován za patogenetický mechanismus pi mnohých chorobných stavech (zántech, ischémiích...) [5] 12
Obrázek 2: Struktura 8-isoprostanu 8 isoprostan (obrázek 2) byl detekován v KVV zdravých lidí, a to naznauje, že existuje jistý fyziologický limit míry postižení oxidativním stresem [11]. Podle mení provádných užitím GC/MS bylo zjištno, že u zdravých lidí jsou hodnoty 11 pg/ml KVV u muž a 7 pg/ml KVV u žen [11]. Bylo také zjištno, že pacienti s astmatem mají vyšší koncentrace 8 isoprostanu ve vydechovaném vzduchu a že hodnoty koncentrací korelují s rozsahem onemocnní [12]. Jak oráln, tak i inhalan podávané kortikosteroidy (látky bžn užívané pi léb astmatu) nedokázaly snížit hodnoty koncentrací namených u tžkých astmatik (až 50 pg/ml), to mže signalizovat, že léba kortikosteroidy nesnižuje oxidativní stres [12]. Zvýšené hodnoty 8-isoprostanu byly pozorovány též u kuák a pacient trpících COPD [11]. Podrobnjšímu sledování hladiny 8-isoprostanu se vnoval ve své práci [14] Chytil a zjistil souvislost hladiny 8-isoprostanu s postižením dalšími nemocemi na jejichž patogenezi se podílí oxidativní stres. Konkrétn se jedná o azbestózu, silokózu a mezoteliom pleury (druh rakoviny plic). 3.3 Stabilita leukotrien Leukotrieny jsou látky znan nestálé a snadno dochází k jejich degradaci. Je tedy nutné veškeré vzorky, ve kterých jsou obsažené, skladovat pi nízké teplot. Dle [1] bylo zjištno, že po dobu 2 msíc pi skladování pi 80 C nedocházelo k výrazné zmn v koncentraci sledovaných látek. Prbh odbourávání za laboratorní teploty byl odlišný u látek vyskytujících se v KVV a v mobilní fázi závisí mimo jiné na pítomných enzymatických systémech nicmén rychlost degradace sledovaných biomarker byla výrazná a poloas se pohyboval v jednotkách hodin za laboratorní teploty. V matrici KVV byla vedle rozpadu jednotlivých látek (velmi dobe patrného v mobilní fázi) sledována i jejich vzájemná pemna v ad LTC 4 LTD 4 LTE 4, která je katalyzována v KVV pítomnými enzymovými systémy. Rovnž poet cykl rozmrazení-zamrazení má negativní vliv na množství cys-lts detekovaných v KVV. Velmi nízká stabilita leukotrien v KVV je jeden z nejpravdpodobnjších dvodu pro rozdílné hodnoty uvádné v literatue. 13
Výše uvedené vlastnosti týkající se stability za rzných teplot isoprostany. platí také pro 4. Asthma Bronchiale Bronchiální astma se adí mezi plicní onemocnní, pi kterém dochází k intenzivnímu zúžení dýchacích cest v dsledku kontrakcí hladkého svalstva, edému mukózy 8 a pítomností vazkého hlenu v lumenu 9 bronch a bronchiol. Prchodnost dýchacích cest se v krátkých asových intervalech spontánn nebo v dsledku léby mní v závislosti na psobení uvolovaných místních spazmogen a vazoaktivních látek (histaminu, leukotrien a prostaglandin) v prbhu alergického procesu. Astma se podle vzniku píiny rozdluje na asthma atopické a astma neatopické. U atopického astmatu jsou spouštcím mechanismem alergické reakce xenobiotika. Cizorodými látkami mohou být inhalované ástice prach a pyl, páry, plyny nebo požité potraviny i léky. Tento druh asthmatu zpsobuje okamžitá hypersensitivita na daný alergen. To je doloženo i tím, že u více jak 75% astmatik se projevuje pozitivní kožní odpov na jeden nebo nkolik bžných alergen [13]. K astmatickému záchvatu pak dochází po inhalaci specifického alergenu. Naproti tomu u neatopického astmatu se nedají urit žádné vnjší alergeny, proto se tento proces považuje za endogenní, a astmatický záchvat mže být vyvolán chladem, infekcemi, stresem nebo tlesnou námahou. [14] K vyslovení správné diagnózy bronchiálního astmatu je poteba provést celou adu vyšetení. Vtšina dnes bžn používaných diagnostických metod jsou kombinací semiinvazivních a invazivních metod. Pi stanovení diagnostiky asthma bronchiale se nejprve pacientovi provádí spirometrické 10 mení ventilaní funkce plic. Pokud spirometrické vyšetení pináší normální výsledky, následuje bronchoprovokaní test nespecifickým podntem - podáním látek histaminu, nebo acetylcholinu. Bronchoprovokaní test velmi asto zatžuje pacienta a mže vést až k astmatickému záchvatu. Z tohoto dvodu jsou proti invazivním vyšetení asto vznášeny etické námitky s tím, že léka by ml lovku obtíže léit a ne je vyvolávat a to ani v zájmu stanovení diagnózy. Bronchoprovokaní test se specifickým podntem našel místo v pracovním lékaství, kdy je zapotebí prokázat profesionální pvod nemoci. Toto vyšetení se provádí jen na specializovaných pracovištích a 8 mukóza sliznice [5]. 9 lumen vnitek trubicovitého orgánu, zejména cévy, prdušky aj. [5]. 10 spirometrie metoda urená k vyšetení dechových funkcí plic [5]. 14
vyžaduje zvláštní opatrnost, protože úinek profesionálních dráždivých látek není pedvídatelný a mže vyvolat i tžkou klinickou reakci. Analýza dechového kondenzátu je pomrn novou metodou, která pedstavuje alternativní cestu, kterou je možné charakterizovat jako zcela neinvazivní a i pro dtského pacienta nezatžující diagnostickou metodu. Princip metody spoívá v kvantifikaci specifických látek - biomarker pro uvedené onemocnní, které se vyskytují v uvedené tlní tekutin a jejichž koncentraní hladina je v dsledku probíhající zántlivé reakce v dýchacích cestách a plicích významn zvýšena. K analýze dechového kondenzátu se používají biochemické metody, nebo metody využívající vysoce citlivé a specifické techniky na bázi hmotnostní spektrometrie. Biomarkery asthma bronchiale jsou cysteinylované leukotrieny tj. LTC 4, LTD 4 a LTE 4. Vzhledem k jejich probíhající vzájemné pemn pozorované i ve vzorku KVV (viz. kapitola 3.1) se jeví nejspolehlivjším stanovení jejich soutu tj. koncentrace tchto látek jako celku a nikoliv koncentrace jednotlivých leukotrien. 15
5. Oxidativní stres Oxidativní stres je proces vedoucí ke vzniku velkého množství volných kyslíkových radikál. Mezi choroby, na jejichž patogenezi se významn oxidativní stres podílí, patí mimo jiné azbestóza a silikóza asto ústící v rakovinu plic. Oxidativnímu stresu jsou také oproti nekuákm podstatn výraznji vystaveni kuáci. Volné radikály jsou všeobecn velmi reaktivní molekuly mající nepárové elektrony. Jsou produkovány kontinuáln v bukách jako produkt jejich metabolismu nebo únikem z mitochondriálního dýchacího cyklu. V mnoha reakcích vznikají ty nejreaktivnjší kyslíkové radikály nap.: superoxidový anion, peroxidový anion nebo hydroxylový radikál. Buky samy mají obsáhlou sadu antioxidaních mechanism, které zabraují tvorb tchto radikál a eliminují jejich niivý efekt. Reaktivní volné radikály, které vznikají uvnit buky, mohou oxidovat biomolekuly, ímž mohou buku poškodit nebo dokonce zniit. V patogenezi ady nemocí je psobení volných radikál zahrnuto, jenže chybí dostaten citlivá metoda pro detekci tchto velmi krátce žijících molekul pímo v živém systému. Díky tomuto analytickému problému je ada pedstav o psobení volných radikál nedokonalá i nevyjasnná. Proto u mnohých onemocnních není stále jasno, zdali jsou volné radikály píinou onemocnní nebo zda-li jsou formovány jako dsledek onemocnní. Z tohoto dvodu je dnes nutné nacházet biomarkery pro oxidativní stres, které mohou být využity v objasnní patogeneze chorob nebo mohou pomoci pi hledání mechanism psobení rzných xenobiotik [15]. 8-isoprostan se jeví jako jeden z tchto vhodných marker a vzhledem k tomu, že je, za pomoci naší metody, možné snadno stanovit jeho hladinu vedle leukotrien, byl pibrán jako další analyzovaná látka. 16
6.1 HPLC/MS Tato podivná zkratka v sob skrývá tandem dvojice velmi pesných instrumentálních analytických metod. HPLC High Performance Liquid Chromatography, esky vysokoúinná kapalinová chromatografie je jednou z velmi pesných a citlivých moderních metod separace látek. Umožuje dlení vtšiny organických i anorganických látek a užívá se hlavn pro separaci tepeln nestálých a málo tkavých látek. Na rozdíl od plynové chromatografie (GC - Gas Chromatography) zde hraje, krom typu a složení kolony, velkou roli také složení mobilní fáze. MS Mass Spectrometry, esky hmotnostní spektrometrie je fyzikáln-chemická metoda umožující urení hmotností atom a molekul dopadajících ve form iont na detektor. Ve spojení s HPLC nebo jiným druhem chromatografie je tato metoda vhodná pro stanovení stopových látek. Aby bylo možné látky analyzovat pomocí hmotnostní spektrometrie, je teba je nejprve pevést do plynné fáze a ionizovat je. Vzhledem k tomu, že na chromatografické kolon se látky nacházejí v kapalné fázi je toto spojení nároné, protože u starších typ ionizace (electron impact - ionizace nárazem elektronu nebo chemická ionizace) bylo nutné látky ped vlastní ionizací odpait, což mohl být s ohledem na jejich termickou stabilitu problém. Proto jsou nyní využívány novjší metody, které nevyžadují odpaení ped vlastní ionizací: ESI ionizace elektrosprejem [14] ESI umožuje souasn odpait rozpouštdlo a ionizovat látku, proto se velmi dobe hodí práv pro spojení HPLC s MS. Kapiky roztoku jsou vystikovány pi atmosférickém tlaku proti proudu ohátého dusíku, který pomáhá odpaování rozpouštdla, piemž je vloženo naptí 3-5 kv mezi výstupní kapiláru (tzv. jehlu) chromatografu a vnjší pláš elektrospreje. Díky povrchovému naptí, tlaku a vysokému elektrickému poli vytvoeného na povrchu roztoku vznikají malé nabité kapiky. Z tchto kapiek se krom rozpouštdla odpaují plynné ionty studované látky 11. Ty jsou dále vtahovány nabitou kapilárou a postupují do analyzátoru. Obrázek 3: Funkce ESI. Jet proud analytu s rozpouštdlem Needle tip hrot jehly pevzato 11 Jedná se o jev vypaování iont - Ion Evaporation IE [16] 17
APCI chemická ionizace za atmosférického tlaku Chemická ionizace za atmosférického tlaku má obdobnou instrumentaci jako elektrosprej s tím rozdílem, že dochází k reakci mezi ionizaním plynem a sledovanou látkou nejde tedy o pímou ionizaci - a stejn jako ESI se nejastji používá pi spojení s kapalinovou chromatografií. Zejména díky tmto ionizaním technikám bylo umožnno analyzovat látky vyšších molekulových hmotností, jejichž analýza byla ped tím dost obtížná nebo dokonce nemožná. Hmotnostní spektrometrie tak opouští ist chemické obory a bývá stále astji využívána všude tam, kde je nutné analyzovat rzné biologické materiály, ve kterých se studované látky vyskytují v koncentracích ádov pg/ml. Již dnes je tato technika využívána napíklad v toxikologii, pi analýze metabolit drog v tlních tekutinách nebo pi analýze protein. 6.2 Hmotnostní spektrometr Nyní bych se rád vnoval podrobnjšímu popisu instrumentace HPLC/MS. Budu vycházet z mnou používaného pístroje Varian 1200L. Základními jednotkami jsou pumpy mobilní fáze, vlastní HPLC kolona, asto se zaazenými pedkolonami a postkolonami, a vlastní hmotnostní spektrometr. Velmi užiteným pomocníkem je také autosampler a celé mení samozejm ídí poíta. Mobilní fáze je ze zásobních lahví erpána pumpami pes Obrázek 4: Hmotnostní spektrometr Varian 1200 L používaný pro analýzy s pipojeným ionizaním modulem pro APCI (pi analýzách však byl užíván ESI) foto: autor 18
degasser (odplyova) a v šestihlavém ventilu je k ní napichován vzorek. Následn mobilní fáze se vzorkem pokrauje na pedkolonu a kolonu. Za kolonou je zaazena ješt hlava pro pímé napíchnutí vzorku (direct inject), kterou je možné ovládat run a je tedy možné napíchnout vzorek i bez prchodu kolonou pímo do hmotnostního spektrometru. Tato hlava ústí do iontového zdroje (ESI nebo APCI) a do hmotnostního spektrometru (obrázek 4). Hmotnostní spektrometr se skládá z nasávací kapiláry (capillary), trojitého kvadrupólu (Q1, Q2, Q3), jehož funkce závisí na zvoleném modu, a citlivého detektoru (zlatá krabika). Uvnit spektrometru je neustále udržováno vakuum pomocí turbomolekulární pumpy (kruh uprosted). Na obrázku 5 mžete vidt schéma získané z ovládacího softwaru. Obrázek 5: Schéma hmotnostního spektrometru. Pevzato z ovládacího softwaru Varian. 19
6.3 Použité pístroje vybavení a chemikálie Pístroje Odbr KVV: Kondenzátor vydechovaného vzduchu (EcoScreen, Jaeger, Germany) HPLC/MS: Systém vysoce úinné kapalinové chromatografie s tandemovým hmotnostním spektrometrem sestávající z: dusíkový generátor (M 365, Peak Scientific, UK) autosampler (automatický dávkova) (Auto Sampler 410, Varian, USA) vysokotlaké pumpy pro HPLC (Pro Star 210, Varian, USA) HPLC kolona (Thermo Hypercarb: 100x2,1 mm, part. size 5 µm, Thermo, USA) hmotnostní spektrometr (1200 L, Varian, USA) dávkova pro direct inject (Pump 11, Harvard Apparatus, USA) Rozpouštdla Metanol LC/MS grade (Riedel de Haën, Nmecko) Voda LC/MS grade (Riedel de Haën, Nmecko) Acetonitril LC/MS grade (Riedel de Haën, Nmecko) Roztok NH 3 ve vod 28 % (Aldrich, USA) Plyny Vzduch technický (SIAD, R) Argon technický (SIAD, R) Dusík technický (SIAD, R) Standardy Leukotrien B 4 (Cayman Chemical, USA) [6, 7, 14, 15 2 H] Leukotrien B 4 (Cayman Chemical, USA) [20,20,20 2 H] Leukotrien E 4 (Biomol, USA) 8-isoprostan (Cayman Chemical, USA) [3,3,4,4 2 H] 8-isoprostan (Cayman Chemical, USA) Cysteinyl leukotriens (Biomol, USA) Sorbenty Imunoafinitní sorbent pro cysteinylované leukotrieny (Cayman Chemical, USA) Imunoafinitní sorbent pro 8-isoprostan (Cayman Chemicals, USA) 20
7.1 Odbr a zpracování vzork Pro analýzu byly získány 3 úplné sady vzork a jedna neúplná (chybí veerní a plnoní vzorek), odebrané v prbhu jednoho dne. Vzorky byly odebrány za pomoci pístroje EcoScreen (Jaeger, Nmecko) na Ústavu pracovního lékaství 1.LF UK v Praze. První odbr byl proveden v 7 hodin ráno, druhý v pl jedné odpoledne, tetí v šest hodin veer a tvrtý o plnoci. Zmínné asy nejsou s ohledem na dobu potebnou k odebrání KVV pesné. Na obrázku 6 mžete vidt schéma kondenzátoru vydechovaného vzduchu. Kondenzátor se skládá z náustku, jednocestného ventilu pro separaci vdechovaného a vydechovaného vzduchu (kondenzátorem prochází pouze vydechovaný vzduch), chladie, který užívá protiproudý chladící okruh, který umožuje provádt odbr pi -20 C, a pneumotachografu pístroje, který zaznamenává celkový objem vydechnutého vzduchu, prmrný objem jednoho výdechu a také stopuje as. Obrázek 6: Schéma kondenzátoru vydechovaného vzduchu. Pevzato z [1] Pro odbr byla zvolena doba 15 minut. Za tuto dobu byly získány 2 3 ml KVV. Na obrázku 7 mžete vidt kondenzátor vyjmutý z chladícího zaízení a na obrázku 8 vlastní prbh odbru. Nároky na pacienta pi odbru jsou minimální. Pacient pouze klidn dýchá, piemž je vyloueno dýchání nosem a nesmí dojít ke kontaminaci slinami. Bezprostedn po odbru byla ješt zmena spirometrie. Vzorek byl ihned po odebrání zmražen na -80 C. Skladování za takto nízkých teplot je klíová pro uchování sledovaných marker, protože v matrici KVV mže probíhat jednak 21
degradace molekul v dsledku vysoké (laboratorní) teploty, ale také jejich další pemny díky pítomným enzymatickým systémm. Obrázek 7 (vlevo): Kondenzátor se sbrnou nádobkou vyjmutý z chladící komrky Obrázek 8 (vpravo): Prbh odbru KVV. 2x foto: autor 7.2 Píprava vzork pro HPLC/MS analýzu Zamražené vzorky byly v termosce pevezeny z 1.LF UK na VŠCHT, kde byla zahájena jejich píprava pro analýzu. Vzhledem k velmi nízké koncentraci leukotrien v KVV (1 200pg/ml) bylo nutné látky ped vlastní analýzou separovat a zakoncentrovat. Ve stadiu pípravy je nyní separace pomocí tzv. imunomagnetické separace. Jde o metodu, kdy v prvním kroku je pipravena magnetická ástice (kulovitá mikroástice Fe 2 O 3, pokrytá inertním polymerem na bázi polyurethanu) Dynabead 280 M (DYNAL, Norsko) aktivovaná tosylovými reaktivními skupinami, jejímž prostednictvím je k povrchu navázána monoklonální protilátka (anti-cys-leukotrien). Tyto ástice jsou následn pidány ke KVV a tém okamžit probíhá reakce mezi leukotrieny a jejich antigeny. Pro zpracování byla ovšem zvolena starší osvdená metoda separace pomocí imunoafinitního sorbentu [1]. Základem této metody je vznik komplexu antigen-protilátka. Základní charakteristikou reakce mezi antigenem a protilátkou je její vysoká specifinost. Tedy pokud je k dispozici specifická protilátka monoklonální protilátka, mže být pi použití vhodné laboratorní techniky provedena extrakce sledovaného antigenu z biologického vzorku kvantitativn a tém exklusivn (minimální podíl nespecifických reakcí). 22