Fluorescenční mikroskopie. principy a použití

Podobné dokumenty
F l u o r e s c e n c e

Fluorescenční mikroskopie

Využití a princip fluorescenční mikroskopie

Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE

Využití a princip fluorescenční mikroskopie

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

Fluorescenční mikroskopie

Moderní nástroje pro zobrazování biologicky významných molekul pro zajištění zdraví. René Kizek

Fluorescence (luminiscence)

Principy a instrumentace

MOLEKULÁRNÍ METODY V EKOLOGII MIKROORGANIZMŮ

FIA fluorescenční imunoanalýza (fluorescence immuno-assay) CIA chemiluminiscenční imunoanalýza

FRET FRET. FRET: schéma. Základní vztahy. Základní vztahy. Fluorescence Resonance Energy Transfer

7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state )

M I K R O S K O P I E

Fluorescenční vyšetření rostlinných surovin. 10. cvičení

IMUNOFLUORESCENCE. Mgr. Petr Bejdák Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU

METODY STUDIA PROTEINŮ

Luminiscence. Luminiscence. Fluorescence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) chemicky (chemiluminiscence)

Barevné principy absorpce a fluorescence

Bioscience Imaging Centre

Luminiscence. Luminiscence. Fluorescence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) chemicky (chemiluminiscence)

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie. Pavel Matějka

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Luminiscence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence. chemicky (chemiluminiscence)

Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční sondy. Fluorescenční sondy. Indikátory pro anorganické ionty. Fluorescenční sondy pro využití v analytické chemii, medicíně a biologii

Barevné principy absorpce a fluorescence

Fluorescenční mikroskopie. -fluorescenční mikroskopie -konfokální mikroskopie

LUMINISCENČNÍ metody. Petr Breinek

ení s chemickými látkami. l rní optiky

LRR/BUBCV CVIČENÍ Z BUNĚČNÉ BIOLOGIE 3. TESTY ŽIVOTASCHOPNOSTI A POČÍTÁNÍ BUNĚK

Obsah přednášky Metody používané v cytologii Metody založené na barvení buněk

Barevné hry se světlem - co nám mohou říci o biomolekulách?

Bioimaging rostlinných buněk, CV.2

Přístrojové vybavení pro detekci absorpce a fluorescence

1. Teorie mikroskopových metod

Téma: Testy životaschopnosti a Počítání buněk

Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii

DODATEČNÉ INFORMACE dle 49 zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách

Vícebarevná průtoková cytometrie v klinice

Tisíc a jedno využití průtokové cytometrie v biologii rostlin. Jaroslav Doležel Ústav experimentální botaniky AV ČR Olomouc

Modul IB. Histochemie. CBO Odd. histologie a embryologie. MUDr. Martin Špaček

Přehled histologických barvení včetně imunohistochemie

Infračervená spektroskopie (FTIR) & Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie

Vlastní a nevlastní fluorofory; vlastní luminiscence buněk, fluorescenční sondy a značky

MIKROSKOPIE JAKO NÁSTROJ STUDIA MIKROORGANISMŮ

Fluorescenční a konfokální mikroskopie

Viková, M. : MIKROSKOPIE II Mikroskopie II M. Viková

ONLINE BIOSENZORY PŘI HLEDÁNÍ KONTAMINACE PITNÉ VODY

Spektroskopické metody. převážně ve viditelné, ultrafialové a blízké infračervené oblasti

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

Viková, M. : MIKROSKOPIE V Mikroskopie V M. Viková

1. Principy fluorescenční spektroskopie

Přístrojové vybavení pro detekci absorpce a fluorescence

Analýza buněčných populací pomocí průtokové cytometrie

Barevné hry se světlem - co nám mohou říci o biomolekulách?

ABSORPČNÍ A LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE V UV/Vis OBLASTI SPEKTRA

Struktura a skladba potravin Magisterský studijní program. Přednáška 4.

Dokumentace projektu. Fotoluminiscence. Autorky: Kateřina Limburská, Tereza Fleková Vedoucí projektu: Zdeněk Polák

Vybrané spektroskopické metody

Speciální spektrometrické metody. Zpracování signálu ve spektroskopii

Ž i v o t n o s t (= životaschopnost = vitalita = viabilita)

CZ.1.07/2.4.00/

Fluorescenční rezonanční přenos energie

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

6. Metody molekulové spektroskopie spektrofotometrie, luminiscenční metody

Hybridizace nukleových kyselin

FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ FLUORESCEINU

MOLEKULÁRNÍ METODY V EKOLOGII MIKROORGANIZMŮ

Kvantové tečky. a jejich využití v bioanalýze. Jiří Kudr SPOLEČNĚ PRO VÝZKUM, ROZVOJ A INOVACE CZ/FMP.17A/0436

Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů. Milan Číž

STUDIUM DOBY ŽIVOTA A SPEKTRÁLNÍCH ZMĚN FLUORESCENCE NANOČÁSTIC V BUNĚČNÉ BIOLOGII

Průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie Flow Cytometry

MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO NAPĚTÍ POMOCÍ NAPĚŤOVĚ CITLIVÝCH BARVIV

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin

Histochemie. Histochemie. Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty. Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty


BUNĚČNÁ STĚNA - struktura a role v rostlinné buňce

Teoretický úvod: FOTOTROPISMUS. Praktikum fyziologie rostlin

1.1 Zobrazovací metody v optické mikroskopii

ODŮVODNĚNÍ VEŘEJNÉ ZAKÁZKY

METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY. Veřejné zdravotnictví

Mikroskopické metody Přednáška č. 3. Základy mikroskopie. Kontrast ve světelném mikroskopu

PSI (Photon Systems Instruments), spol. s r.o. Ústav přístrojové techniky AV ČR, v.v.i.

laboratorní technologie

- Rayleighův rozptyl turbidimetrie, nefelometrie - Ramanův rozptyl. - fluorescence - fosforescence

DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay

Životaschopnost. (= vitalita = viabilita) počet živých buněk. 100 = [%] počet všech buněk

Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM

Helena Langhansová. 30. listopadu 2011

VYUŽITÍ KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE KE STUDIU DEGRADACE ORGANICKÉHO BARVIVA V BUNĚČNÉ BIOLOGII

Písemná zpráva zadavatele

Úloha č. 1: CD spektroskopie

Proč elektronový mikroskop?

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

IMUNOCYTOCHEMICKÁ METODA JEJÍ PRINCIP A VYUŽITÍ V LABORATOŘI

Transkript:

Fluorescenční mikroskopie principy a použití

Luminiscence objekt absorbuje záření určité vlnové délky, které se vnitroatomovým přeskupením změní na záření o delší vlnové délce excitace viditelné světlo, UV, x, α, β, γ

Stokesův zákon: λe < λf Stokesův posuv Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii. E = h. c/λ λ Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima

Luminiscence excitace světlem: fosforescence vyzařování světla trvá i po přerušení excitace fluorescence nemá setrvačnost, záření zaniká po přerušení excitace excitace vyvolaná chemickou reakcí: chemiluminiscence

Detekce fluorescence spektrofluorometry a microplate readers měří průměr vlastností vzorků (µl až ml). fluorescenční mikroskopy rozlišují fluorescenci ve dvou nebo třech rozměrech pro mikroskopické objekty (v průměru menší než ~ 0.1 mm). fluorescenční scannery ( microarray readers ) rozlišují fluorescenci ve dvou rozměrech pro makroskopické objekty jako jsou elektroforetické gely, bloty a chromatogramy. průtokové cytometry (Flow cytometers) měří fluorescenci každé buňky v protékajícím proudu, což umožňuje identifikovat a kvantifikovat subpopulace buněk ve velkém vzorku. konfokální mikroskopie

Princip fluorescenčního mikroskopu závěrný (bariérový) filtr excitační (budící) filtr vzorek

Excitační filtry - Olympus %T λ 500 nm

Bariérové filtry - Olympus 500 nm

Transmisní fluorescenční mikroskop

Dichroické zrcadlo a princip funkce

Epifluorescenční mikroskop - Olympus

Olympus BX-51 - epifluoescence

Kostky = kombinace filtrů a dichroického zrcadla pro epifluorescenci

Typy fluorescence primární fluorescence sekundární fluorescence autofluorescence barvení fluorochromy imunofluorescence = fluorochromem značené protilátky indukovaná fluorescence

Srovnání fluorescenčních barviv 351 nm UVA 488 nm 568 nm 648 nm

Fluorescence primární (autofluorescence) častá u rostlinných pletiv chlorofyl lignin, suberin pryskyřice, sekundární metabolity sekundární fluorochromy specifická vazba na určité struktury (DNA - DAPI, Hoechst 33258) značení GMO fluoreskujícími proteiny (GFP,YFP) fluorescenční imunohistochemie spojuje sekundární fluorescenci s reakcí: antigen x protilátka (detekce určitých proteinů) fluorescenční in situ hybridizace detekce určitých sekvencí vysoká specificita a citlivost

Autofluorescence příčný řez kořenem trávy Cynodon dactylon A. Lux

Autofluorescence ligninu v xylému a sklerenchymu UV excitace snímek příčného řezu cévním svazkem foto-soutěž Nikon, 2004

Kalóza v pylových láčkách fluorochrom: anilínová modř UV excitace pylová zrna pylové láčky

Fluorescenční barviva fluorescein a rhodamin fluorescein emituje intenzivní zelenou fluorescenci po excitaci modrým světlem rhodamin emituje červenou fluorescenci po excitaci zelenožlutým světlem Různé složky buněk mohou být barveny oběma barvivy současně

Kombinace fluorochromů a filtrů FITC barví se mikrotubuly propidium jodid barví jádra kultura buněk A549 kombinovaný obraz simultánní emise

Kombinace fluorochromů a filtrů DAPI + FITC

Řez řapíkem listu

Stonek jedle v modrofialovém světle fluorochrom: akridinová oranž

Sledování životaschopnosti buněk kalus mrkve FDA substrát: FDA esterázy fluorescein + acetát

Sledování vývoje kalusu mrkve BF - DIC DAPI

Kombinace DAPI a fázového kontrastu DAPI fázový kontrast kombinovaný obraz

Historie GFP 1955 první popis luminiscence medůzy Osamu Shimomura (1962) fotoreceptory na okraji klobouku medůzy 2008 Nobelova cena za chemii http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/gfp-ww/shimomura.html

Modifikace GFP Roger Tsien La Jola, Kalifornie http://www.tsienlab.ucsd.edu/people.htm

GFP jellyfish Victoria aequorea GFP in cultured tobacco cells, confocal image http://www.plantsci.cam.ac.uk/haseloff/gfp/gfpbackgrnd.html

PtK1 cell with antibody staining for microtubules (green) and DNA (blue) (A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY) originální snímek snímek po úpravě http://www.aqi.com/index.php

Arabidopsis DR5::GFP Auxin Reporter využití GFP pro sledování auxinu J. Friml auxinem aktivovatelný promotor DR5rev kořen 35S min kořen + auxin GFP + DAPI 35S pa embryo

Příklady tříbarevné fluorescence Cell infected with poxvirus (630x) Honorable Mention, 2007 Nicon Competition Dr. Daniel Kalman Bovine Endothelial Cell Courtesy Leica Microsystems Imaging Solutions, Ltd., UK.

Fotostabilita OG514 1s Oregon Green 514 phalloidin fluorescein phalloidin 10s 20s 30s

Chemiluminiscence Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí Při deexcitaci dochází k vyzáření světla Bioluminiscence světluška Noctiluca scintillans ATP + luciferin + O2 luciferáza Mg 2+ AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světlo

Využití chemiluminiscence Stanovení NO NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + světlo Stanovení H2O2 Luminol + H2O2 peroxidáza 3-aminoftalát + světlo

Transformované rostlinky kasavy z embryogenní kultury signální gen = luciferáza rostlinky vizualizace aktivity luciferázy: postříkáno luciferinem světelná emise měřena luminometrem

Zajímavé adresy http://www.bioscience.org/lecture/molbiol/micro/frame.htm# s0076.htm http://dept.kent.edu/projects/cell/index.htm http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/ fluorhome.html http://www.plantsci.cam.ac.uk/haseloff/plantanatomy/index. html http://www.aqi.com/index.php http://www.probes.com/handbook/

Honorable Mention, 2007 Nikon Competition Carmen Laethem Aerie Pharmaceuticals Research Triangle Park, North Carolina, USA Primary porcine trabecular meshwork cells (20x)